ICS11.220

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T/CVDA

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CVDAXXXXX—XXXX

動(dòng)物細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)

CytologySectionPreparationforAnimals

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XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

中國(guó)獸藥協(xié)會(huì)發(fā)布

動(dòng)物細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)

1范圍

本文件規(guī)定了動(dòng)物細(xì)胞學(xué)樣本采集及制片標(biāo)準(zhǔn)操作方法及注意事項(xiàng)。

本文件適用于動(dòng)物醫(yī)院、動(dòng)物第三方臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室或動(dòng)物細(xì)胞研究實(shí)驗(yàn)室，這種技術(shù)方法廣泛應(yīng)

用于動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，幫助獸醫(yī)醫(yī)生準(zhǔn)確地識(shí)別和診斷動(dòng)物的疾病。動(dòng)物細(xì)胞學(xué)診斷的范圍包括腫瘤學(xué)、

感染性疾病、自身免疫性疾病藥物毒性和中毒疾病、部分遺傳性疾病、營(yíng)養(yǎng)不良和代謝性疾病等方面。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語(yǔ)和定義

動(dòng)物細(xì)胞學(xué)制片及診斷是通過顯微鏡檢查動(dòng)物組織或體液中的細(xì)胞來確定疾病的存在、性質(zhì)和范

圍。在動(dòng)物細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)中，以下術(shù)語(yǔ)和定義可能會(huì)用到：

3.1細(xì)胞學(xué)制片CytologySection

特指用于制作細(xì)胞薄片的技術(shù)，用于細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究和診斷。

3.2細(xì)胞學(xué)診斷CytologyDiagnosis

根據(jù)細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果，對(duì)細(xì)胞異常形態(tài)等進(jìn)行診斷和分類。

3.3固定Fixing

使用化學(xué)固定劑（如福爾馬林、酒精等）處理細(xì)胞或組織，以保持其結(jié)構(gòu)和形態(tài)。

3.4穿透Penetration

固定劑充分滲透到細(xì)胞或組織內(nèi)部的過程，確保細(xì)胞結(jié)構(gòu)均勻固定。

3.5染色Stain

使用染色劑（如蘇木精、伊紅、甲苯胺藍(lán)等）對(duì)固定后的細(xì)胞或組織進(jìn)行處理，以增強(qiáng)特定結(jié)構(gòu)的

可見性。

3.6脫色Destaining

去除染色劑以外的非特異性染料或背景顏色的過程，以便于更好觀察特定結(jié)構(gòu)。

這些術(shù)語(yǔ)和定義有助于更好地理解動(dòng)物細(xì)胞學(xué)制片過程和目的。

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4基本要求

4.1一般要求

動(dòng)物細(xì)胞學(xué)制片及診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)是確保動(dòng)物細(xì)胞學(xué)制片質(zhì)量、診斷準(zhǔn)確性的關(guān)鍵指導(dǎo)文件。這些標(biāo)

準(zhǔn)涉及從樣本的采集、處理、制片、染色、觀察到最終診斷的全過程。以下是一些基本要求：

4.2樣本采集與處理

4.2.1一般要求

a）采集動(dòng)物組織或細(xì)胞樣本時(shí)，必須遵循無(wú)菌操作原則，防止樣本污染。

b）根據(jù)不同動(dòng)物種屬和組織來源，采用適當(dāng)?shù)姆椒?，如?xì)針穿刺、組織塊切割或體液收集等。

c）樣本處理包括分散細(xì)胞、固定細(xì)胞、以及后續(xù)的染色前處理。

4.2.2樣本采集及前處理

4.2.2.1常見細(xì)胞學(xué)病灶分類

按照采樣不同病變的層面由低到高分為：封閉、孔道、凹陷、侵蝕、平面、覆蓋、突起、鼓包，其

中細(xì)分為：

a）封閉：關(guān)節(jié)腔、胸腹腔、心包、胸腹腔臟器等所有未與表面有接觸的所有組織。

b）孔道：蜂窩織炎、竇道、孔洞、開裂等具有對(duì)外開放的通道或縫隙類。

c）凹陷：糜爛、侵蝕、潰瘍等表面向下凹陷的面積較大類。

d）平面：斑點(diǎn)、斑片、脫毛、皮屑、色素異常等非突起或微突起類。

e）硬化增厚：胼胝、苔蘚化。

f）凸起：丘疹、斑塊、風(fēng)疹、結(jié)節(jié)、粉刺、瘢痕等突起較明顯類。

g）鼓包：膿包、大皰、囊腫、血腫等突起皮膚較多，且具有液性與實(shí)性混合的病變（大皰除外）。

4.2.2.2前置探查

a）超聲引導(dǎo)：在條件允許時(shí)，應(yīng)使用超聲探頭對(duì)（封閉、孔道、凹陷、鼓包等）病灶的層深、體

積、實(shí)性、液性、范圍、血管分布等情況進(jìn)行相應(yīng)的探查，并進(jìn)行記錄。同時(shí)準(zhǔn)備相關(guān)采集用具及大小

型號(hào)與深度預(yù)估，及血管回避。當(dāng)出現(xiàn)外表潰爛、滲出等病變情況，可使用探頭外覆蓋手法（檢查手套

或其他薄膜）。

b）臨床觸診：應(yīng)對(duì)病灶進(jìn)行實(shí)性、液性、囊性位置及分布進(jìn)行檢查及記錄、同時(shí)硬結(jié)的實(shí)性深度、

寬度、游離性進(jìn)行檢查記錄。同時(shí)還需要病灶溫度、瘙癢、痛感進(jìn)行觀察記錄。

c）對(duì)于平面或微突、微凹的病灶，進(jìn)行外觀描述并記錄。

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4.2.2.3采樣方式

a）拔毛：應(yīng)順毛流方向，止血鉗夾住皮膚表面起，毛發(fā)0.5cm處，勻速拔出。

b）淺刮：使用刀片或載玻片等銳利邊緣，向自體一側(cè)方向，快速刮動(dòng)，不可逆方向操作。直到組

織眼觀濕潤(rùn)，但不出血。

c）深刮：同淺刮，直到微微紅色滲出。

d）穿刺：分為非負(fù)壓及負(fù)壓穿刺。其中淋巴結(jié)使用非復(fù)發(fā)穿刺采樣手法。同時(shí)建議任何組織穿刺

采樣初始均使用非負(fù)法手法。根據(jù)采樣結(jié)果的樣本量，考慮遞增為負(fù)壓或更換更大號(hào)采樣器具。采樣應(yīng)

遵從，先淺后深，先外后內(nèi)，先實(shí)質(zhì)后液性的采樣手法。以免造成多與污染和干擾。

e）細(xì)胞刷：采樣做刮取姿勢(shì)，向一個(gè)方向刷動(dòng)采樣，不可進(jìn)行逆方向的往復(fù)運(yùn)動(dòng)。

f）拭子：旋轉(zhuǎn)刮擦，并且旋轉(zhuǎn)方向自始至終順應(yīng)同一個(gè)方向，不可中途變更不同性質(zhì)及部位的具

體采樣手法

4.2.2.4樣本制備要求

4.2.2.4.1封閉樣本：穿刺手法（建議超聲引導(dǎo)下操作）

樣本常見分別為：實(shí)性、粘性、液性及骨髓血。其中實(shí)性樣本應(yīng)初步采樣盡量避開血管，進(jìn)行至少

2張相對(duì)淺層的載玻片制片及2張深層的樣本片。同時(shí)制片手法推薦為一字/十字制片法（推薦一字制

片法，可總計(jì)獲得8張樣本）。

樣本結(jié)果：樣本量充盈，在有形物觀察區(qū)，細(xì)胞量（非成熟紅細(xì)胞）應(yīng)達(dá)到至少5/LPF，總計(jì)細(xì)胞

數(shù)量（非成熟紅細(xì)胞）不低于200顆/張。當(dāng)所有樣本平均低于這個(gè)數(shù)量或血液污染嚴(yán)重、著色不良、

擠壓嚴(yán)重、堆層過厚、細(xì)胞變形破裂嚴(yán)重的情況下。當(dāng)次樣本不應(yīng)出具有效報(bào)告。

穿刺手法：對(duì)完全未知性質(zhì)及預(yù)估的組織及淋巴結(jié)，首次穿刺采樣應(yīng)采用非負(fù)壓穿刺法，評(píng)估細(xì)胞

脫落量后，保持或加重采樣手法。

4.2.2.4.2粘性、液性樣本

對(duì)于粘性、液性樣本，采樣后制片時(shí)，可通過稀釋法，降低背景大量片狀著色所對(duì)樣本觀察的干擾。

其中關(guān)節(jié)液需先進(jìn)行粘度測(cè)試。所有稀釋樣本應(yīng)嚴(yán)格記錄稀釋比例，鏡檢后乘以這個(gè)比例，并換算成真

實(shí)的細(xì)胞密度。

對(duì)于粘性、液性樣本需要富集細(xì)胞。則使用離心富集法與重力富集法。相對(duì)推薦離心富集法。因?yàn)?/p>

這種方法可通過晃動(dòng)與震蕩將原本離散而因離心聚集的細(xì)胞重新打散。減少細(xì)胞來源判讀的誤區(qū)（尤其

腺體細(xì)胞與巨噬細(xì)胞）。同樣嚴(yán)格記錄濃縮比例，并鏡檢后除以這個(gè)比例，并換算成真實(shí)的細(xì)胞密度。

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4.2.2.4.3骨髓血

對(duì)于骨髓血，應(yīng)提前制作抗凝的注射器進(jìn)行采樣或提前預(yù)備制片助手（防止快速凝固），推薦使用

十字/一字拉片法。

樣本結(jié)果：樣本量充盈，在有形物觀察區(qū)，細(xì)胞量（非成熟紅細(xì)胞）應(yīng)達(dá)到至少5/LPF，總計(jì)細(xì)胞

數(shù)量（非成熟紅細(xì)胞）不低于200顆/張。當(dāng)所有樣本平均低于這個(gè)數(shù)量或血液污染嚴(yán)重、著色不良、

擠壓嚴(yán)重、堆層過厚、細(xì)胞變形破裂嚴(yán)重的情況下，當(dāng)次樣本不應(yīng)出具有效報(bào)告。

4.2.2.4.4凸起

對(duì)于突出厚度在凸起及一下，無(wú)法進(jìn)行穿刺的組織，及在凹陷及凹陷以上的組織（均無(wú)病變下的深

層實(shí)質(zhì)性或囊性病變），建議使用刮片/粘片法，應(yīng)對(duì)當(dāng)前組織進(jìn)行毛發(fā)、粘黏、淺刮、深刮的采樣流

程。

對(duì)于敏感及脆弱部位的黏膜、竇道、孔洞，則推薦細(xì)胞刷/致密拭子，或沖洗/灌洗法。

4.2.2.4.5孔道：灌洗、細(xì)胞刷

對(duì)于具有敞口的孔道類，應(yīng)首先評(píng)估表面是否破潰與滲出，在采樣時(shí)是否會(huì)因此而受到污染，若無(wú)，

則直接進(jìn)行采樣；若有，則需要對(duì)表面進(jìn)行清理，必要時(shí)對(duì)表層進(jìn)行消毒處理。

通過灌洗及細(xì)胞刷獲取的樣本，可通過無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行濃度調(diào)配及洗脫器具上黏附的細(xì)胞，之后

通過離心富集法，進(jìn)行細(xì)胞的富集，并進(jìn)行制片，制片推薦使用推片法的線性制片。

4.2.2.4.6凹陷

如在皮膚或部位可通過手指將起頂起的部位，建議使用刮片法。如部位敏感度及角度不允許，則推

薦使用細(xì)胞刷采樣法。后續(xù)制片手法均參考前文。

4.2.2.4.7平面

使用標(biāo)準(zhǔn)的毛發(fā)、粘片、淺刮、深刮的標(biāo)準(zhǔn)皮膚采樣制片流程。

4.2.2.4.8硬化

對(duì)于結(jié)痂，應(yīng)掀起結(jié)痂，采集結(jié)痂下的皮膚組織，并進(jìn)行平面及突起的采樣制片流程。而對(duì)于較厚

的硬化，則建議進(jìn)行活檢打孔，活得樣本進(jìn)行壓片制片。也可通過病理進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于較薄的硬化，則

可以通過刮除、或切除來獲得下層柔軟的樣本。

4.2.2.4.9鼓包及皮下結(jié)節(jié)

應(yīng)先使用超聲或觸診探查，對(duì)游離性、軟、硬區(qū)做印象建立，軟區(qū)較多或面積較大時(shí)，應(yīng)超聲輔助，

對(duì)該區(qū)探測(cè)是否為液性區(qū)域。行穿刺采樣操作，但需按由淺至深，由邊緣至中心的，多角度，多次采樣。

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以防止血性、液性對(duì)實(shí)質(zhì)區(qū)域細(xì)胞的污染，并減少判讀價(jià)值。

4.2.2.4.10活檢組織

活檢組織進(jìn)行粘片制片前，應(yīng)使用手術(shù)刀或手術(shù)剪，對(duì)大塊的組織進(jìn)行0.5-0.8cm的修整。并將眼

觀懷疑病變的面朝下，在定性濾紙上蘸去多與液體，并保持粘性后，粘片于載波片上進(jìn)行粘片制片。

4.3制片

4.3.1一般要求

a）制片包括將處理后的細(xì)胞或組織均勻涂抹在載玻片上，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)墓潭ā?/p>

b）涂片應(yīng)均勻、薄厚適中，以便于染色和顯微鏡觀察。

c）制片過程中要確保細(xì)胞或組織的結(jié)構(gòu)不被破壞。

4.3.2具體制片技術(shù)

a）液性樣本：使用血涂片推片法。如樣本過多，則做急停制片或飛機(jī)制片。

b）粘性樣本：使用十字交叉或一字法制片。

c）固體樣本：視樣本量而定，足量樣本進(jìn)行十字、一字制片法。樣本較少，可采用海星法制片。

4.4染色

4.4.1一般要求

a）染色是制片過程中的關(guān)鍵步驟，目的是使細(xì)胞結(jié)構(gòu)更加清晰，便于觀察。

b）染料選擇應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型和觀察的目的來確定，常用的有瑞士-吉姆薩染色或迪夫快速染色。

c）染色過程中要控制好時(shí)間，避免過染或染色不足。

4.4.2瑞氏-姬姆薩染色

a）準(zhǔn)備材料：涂片樣本、瑞氏-姬姆薩染液（A）、磷酸鹽緩沖液（B）、洗耳球、染色架、計(jì)時(shí)

器、吸水紙、去離子水或蒸餾水及沖洗瓶。

b）操作步驟：涂片樣本的載玻片需充分固定、干燥。將樣本載玻片樣本向上，放在水平的染色架

上。滴入瑞氏-姬姆薩染液A液300μl或8-10滴。之后滴入瑞氏-姬姆薩染液B液（磷酸緩沖液）3-6倍

A液的量。使用洗耳球輕輕隔空吹打混勻。并靜置2.5分鐘或5分鐘。推薦不是非常厚的樣本混勻染色

3分鐘。使用沖洗瓶輕柔擠出去離子水或蒸餾水。沖洗載玻片的磨砂端，不可直接沖洗樣本區(qū)域。待水

流顏色純凈后，使用吸水紙與洗耳球干燥載玻片。即可鏡下觀察。

c）注意事項(xiàng)：瑞氏-姬姆薩染色屬于滴染類染色法，切記染色液使用量要充足。尤其是B液使用量

要足夠。否則少量的染液會(huì)受到樣本本身酸堿的影響而導(dǎo)致顏色偏差或失敗。

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4.4.3迪夫快速染色

a）準(zhǔn)備材料：涂片樣本、Diff染液A、B、C液、洗耳球、計(jì)時(shí)器、吸水紙、涮洗水缸X2。

b）操作步驟：樣本干燥后放入至少100ml的A液中進(jìn)行固定。固定時(shí)間最少為10s，最長(zhǎng)不超過

30分鐘。推薦固定時(shí)間為1分鐘。將樣本從A液取出，滴淋2s，但不可讓樣本干燥。放入B液。在B

液中放置15-20s或輕輕提拉，眼觀玻片上的紅色B液完全附著，不出現(xiàn)斑駁即可。滴淋2s之后放入C

液，15-20s或B液的1.5倍時(shí)常。時(shí)間視環(huán)境溫度與染液使用時(shí)間而增加。冬天推薦延長(zhǎng)染色時(shí)間5-10s，

染液使用1個(gè)月后，時(shí)間液應(yīng)延長(zhǎng)5-10s。將樣本從C液取出后放入涮洗水缸中，輕輕移動(dòng)，再放入另

一涮洗水缸。最終樣本玻片上滴下的水為無(wú)色即可。洗耳球與吸水紙干燥樣本載玻片后即可進(jìn)行鏡下觀

察。

c）注意事項(xiàng)：Diff（迪夫)快速染色屬于浸染法。染色液本身對(duì)樣本的酸堿糾正較差，必須在染色

量較高大于100ml時(shí)才能達(dá)到理想的染色效果。因此不推薦迪夫的滴染或小容量裝的容器內(nèi)進(jìn)行染色。

同時(shí)A液B液進(jìn)入下一個(gè)染色缸中時(shí)，無(wú)需太過在意對(duì)下一缸的液體污染，因?yàn)楸旧硐乱粋€(gè)染色

液就包含上一個(gè)染色液的成分。因此一定不要讓樣本在染色的過程中出現(xiàn)干燥。

4.4.4革蘭氏染色

a）準(zhǔn)備材料：涂片樣本、革蘭氏染色液組（A、B、C、D）洗耳球、染色架、計(jì)時(shí)器、吸水紙、

去離子水或蒸餾水及沖洗瓶。

b）操作步驟：樣本完全干燥后，將樣本面向上，放置于染色架上并調(diào)整水平。將A液結(jié)晶紫滴加

在樣本上，量需要較多10滴以上?？焖俑锾m氏染液10s，普通革蘭氏染色1min。計(jì)時(shí)完畢后，使用沖

洗瓶的去離子水進(jìn)行磨砂端的沖洗，水流不可直接沖擊在樣本之上。之后甩去多余液體，進(jìn)行B液碘的

染色。所有操作步驟同上。直到完成C液乙醇及D液沙黃。干燥后鏡檢或保存。

c）注意事項(xiàng)：革蘭氏染色時(shí)，應(yīng)注意時(shí)間必須達(dá)標(biāo)，否則細(xì)菌的陰陽(yáng)性容易出現(xiàn)錯(cuò)亂。C液的時(shí)

間嚴(yán)格控制在快速10s。過長(zhǎng)后陰陽(yáng)結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)亂。

4.5顯微鏡觀察與診斷

a）染色后的制片需在光學(xué)顯微鏡下觀察，評(píng)估細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、數(shù)量等特征。

b）診斷應(yīng)由經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)人員根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行，必要時(shí)可結(jié)合分子生物學(xué)方法。

c）染