基于hTERT啟動(dòng)子的新型溶瘤單純皰疹病毒構(gòu)建與功能探究一、引言1.1研究背景與意義腫瘤，作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，長(zhǎng)期以來一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法，如手術(shù)、化療和放療，在臨床實(shí)踐中取得了一定的成效，但都存在各自的局限性。手術(shù)治療對(duì)于一些早期腫瘤可以達(dá)到根治的效果，但對(duì)于中晚期腫瘤，由于腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，手術(shù)往往無法徹底清除腫瘤細(xì)胞，且手術(shù)創(chuàng)傷較大，會(huì)對(duì)患者的身體造成較大的負(fù)擔(dān)?；熗ㄟ^使用化學(xué)藥物來殺死腫瘤細(xì)胞，但在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)一系列嚴(yán)重的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。放療利用高能射線殺死腫瘤細(xì)胞，但同樣會(huì)對(duì)周圍正常組織產(chǎn)生輻射損傷，且放療的效果受到腫瘤細(xì)胞對(duì)射線敏感性的限制，對(duì)于一些對(duì)射線不敏感的腫瘤，放療效果不佳。隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，溶瘤病毒療法作為一種新興的腫瘤治療策略，逐漸嶄露頭角。溶瘤病毒是一類能夠選擇性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并裂解腫瘤細(xì)胞，同時(shí)激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的病毒。與傳統(tǒng)治療方法相比，溶瘤病毒療法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它能夠特異性地靶向腫瘤細(xì)胞，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行精準(zhǔn)打擊，減少對(duì)正常組織的損傷，從而降低治療過程中的副作用。溶瘤病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制并裂解腫瘤細(xì)胞后，會(huì)釋放出腫瘤相關(guān)抗原，這些抗原可以激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，吸引免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、NK細(xì)胞等聚集到腫瘤部位，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的殺傷，產(chǎn)生全身性的抗腫瘤效應(yīng)，有效抑制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。在眾多被研究用于溶瘤病毒療法的病毒中，單純皰疹病毒（HerpesSimplexVirus，HSV）因其自身的一些特性而備受關(guān)注。HSV是一種雙鏈DNA病毒，具有天然的嗜神經(jīng)性和廣泛的宿主范圍，能夠感染多種類型的腫瘤細(xì)胞。它的基因組相對(duì)較大，這使得它有足夠的空間容納外源基因，便于進(jìn)行基因工程改造。然而，野生型HSV具有較強(qiáng)的致病性，直接應(yīng)用于腫瘤治療會(huì)對(duì)患者造成嚴(yán)重的健康風(fēng)險(xiǎn)。為了使其能夠安全有效地用于腫瘤治療，需要對(duì)其進(jìn)行基因工程改造，去除或修飾那些與致病性相關(guān)的基因，同時(shí)保留其溶瘤活性。目前，已經(jīng)有一些經(jīng)過改造的溶瘤單純皰疹病毒進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，并取得了一定的療效，但仍存在一些問題亟待解決。例如，部分溶瘤單純皰疹病毒在腫瘤細(xì)胞中的靶向性不夠精準(zhǔn)，導(dǎo)致在正常細(xì)胞中也有一定程度的復(fù)制，從而引發(fā)不良反應(yīng)；一些溶瘤單純皰疹病毒在激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)方面的能力還有待提高，無法充分調(diào)動(dòng)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行全面攻擊。人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（humantelomerasereversetranscriptase，hTERT）啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞中具有特異性的高活性。端粒酶是一種能夠維持端粒長(zhǎng)度、保證細(xì)胞持續(xù)分裂的酶，在大多數(shù)正常體細(xì)胞中，端粒酶的活性受到嚴(yán)格調(diào)控，處于低表達(dá)或不表達(dá)狀態(tài)，但在超過85%的腫瘤細(xì)胞中，端粒酶被異常激活，其中hTERT的重新表達(dá)是端粒酶激活的關(guān)鍵因素。hTERT啟動(dòng)子區(qū)域包含多個(gè)順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，這些元件和位點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞中會(huì)發(fā)生特異性的變化，使得hTERT啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞中能夠啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄，而在正常細(xì)胞中則保持沉默。基于hTERT啟動(dòng)子的這一特性，將其應(yīng)用于溶瘤單純皰疹病毒的構(gòu)建中，有望實(shí)現(xiàn)病毒在腫瘤細(xì)胞中的特異性復(fù)制。通過將HSV中某些關(guān)鍵基因（如與病毒復(fù)制起始相關(guān)的基因）置于hTERT啟動(dòng)子的調(diào)控之下，只有在hTERT啟動(dòng)子高活性的腫瘤細(xì)胞中，這些關(guān)鍵基因才能被啟動(dòng)表達(dá)，從而啟動(dòng)病毒的復(fù)制過程，而在正常細(xì)胞中，由于hTERT啟動(dòng)子的低活性或無活性，病毒的復(fù)制被抑制，這樣就可以大大提高溶瘤單純皰疹病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性和安全性。本研究旨在利用hTERT啟動(dòng)子構(gòu)建新型溶瘤單純皰疹病毒，通過對(duì)病毒基因組的精準(zhǔn)改造和調(diào)控，實(shí)現(xiàn)其在腫瘤細(xì)胞中的特異性復(fù)制和高效溶瘤，同時(shí)減少對(duì)正常細(xì)胞的影響。對(duì)新型溶瘤單純皰疹病毒的功能進(jìn)行全面深入的研究，包括其在不同腫瘤細(xì)胞系中的感染、復(fù)制能力，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，以及在動(dòng)物模型中的抗腫瘤作用和安全性評(píng)估等。這不僅有助于深入了解溶瘤病毒治療腫瘤的機(jī)制，為腫瘤治療提供新的理論依據(jù)，而且有望為臨床腫瘤治療提供一種更有效、更安全的治療手段，具有重要的科學(xué)研究?jī)r(jià)值和臨床應(yīng)用前景。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在溶瘤病毒療法的研究領(lǐng)域，溶瘤單純皰疹病毒（OncolyticHerpesSimplexVirus，oHSV）是備受矚目的研究熱點(diǎn)之一。國(guó)外對(duì)oHSV的研究起步較早，取得了一系列具有里程碑意義的成果。美國(guó)安進(jìn)公司研發(fā)的talimogenelaherparepvec（T-VEC），作為首個(gè)獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療首次復(fù)發(fā)不可切除黑色素瘤局部治療的溶瘤病毒，其主要成分即為經(jīng)過基因工程改造的HSV-1。T-VEC通過刪除病毒基因ICP34.5，并將GM-CSF基因插入病毒胸苷激酶（TK）基因位點(diǎn)，增強(qiáng)了病毒在腫瘤細(xì)胞中的靶向性和免疫激活能力。臨床研究表明，T-VEC在黑色素瘤治療中展現(xiàn)出較好的療效，顯著提高了患者的生存率和緩解率，這一成果極大地推動(dòng)了溶瘤病毒領(lǐng)域的發(fā)展，為后續(xù)oHSV的研究和開發(fā)提供了重要的參考和借鑒。日本第一三共制藥研發(fā)的G47Δ是在G207基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化的新一代oHSV，它刪除了ICP47基因，這一基因的缺失進(jìn)一步增強(qiáng)了病毒的復(fù)制能力和激發(fā)免疫系統(tǒng)抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力。在臨床前研究中，G47Δ在幾乎所有的癌癥類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭卸急憩F(xiàn)出了顯著的抗腫瘤功效。在用于治療惡性、復(fù)發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床試驗(yàn)中，13例患者中有12例患者在治療后生存長(zhǎng)達(dá)1年以上，1年生存率達(dá)到92.3%，與標(biāo)準(zhǔn)治療1年生存期15%相比有明顯提高。2021年，G47Δ獲得日本厚生勞動(dòng)省的條件性限時(shí)批準(zhǔn)，用于治療惡性膠質(zhì)瘤，成為世界上首款獲得批準(zhǔn)治療原發(fā)性腦瘤的溶瘤病毒療法，這標(biāo)志著oHSV在腦瘤治療領(lǐng)域取得了重大突破。在國(guó)內(nèi)，溶瘤病毒的研究雖然起步相對(duì)較晚，但近年來發(fā)展迅速，取得了不少成果。國(guó)內(nèi)多個(gè)科研團(tuán)隊(duì)和企業(yè)在oHSV的研究方面投入了大量的精力，致力于開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的溶瘤單純皰疹病毒產(chǎn)品。例如，一些研究團(tuán)隊(duì)通過對(duì)HSV的基因編輯，構(gòu)建了多種新型oHSV，并在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型中對(duì)其溶瘤效果和安全性進(jìn)行了評(píng)估。這些研究在一定程度上優(yōu)化了病毒的靶向性、復(fù)制能力和免疫激活特性，為oHSV的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。然而，目前國(guó)內(nèi)oHSV的研究大多還處于臨床前研究階段，距離臨床應(yīng)用還有一定的距離，需要進(jìn)一步深入研究和驗(yàn)證。人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）啟動(dòng)子的研究在國(guó)內(nèi)外也都取得了重要進(jìn)展。國(guó)外的研究在hTERT啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能解析方面較為深入。研究發(fā)現(xiàn)hTERT啟動(dòng)子區(qū)域包含多個(gè)順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如SP1、AP2等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，這些元件和位點(diǎn)的相互作用以及與腫瘤相關(guān)的調(diào)控機(jī)制逐漸被揭示。通過對(duì)大量腫瘤樣本的分析，明確了hTERT啟動(dòng)子在多種腫瘤細(xì)胞中特異性高表達(dá)的機(jī)制，以及其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的密切關(guān)系。相關(guān)研究還嘗試?yán)胔TERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)一些治療基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，為腫瘤基因治療提供了新的策略。國(guó)內(nèi)的研究則更側(cè)重于hTERT啟動(dòng)子在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用探索。一些研究團(tuán)隊(duì)利用hTERT啟動(dòng)子的特異性，構(gòu)建了基于hTERT啟動(dòng)子調(diào)控的腫瘤特異性表達(dá)載體，用于攜帶各種治療基因或報(bào)告基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷或監(jiān)測(cè)。在肝癌、肺癌等多種腫瘤模型中，驗(yàn)證了這種基于hTERT啟動(dòng)子的載體系統(tǒng)在腫瘤治療中的可行性和有效性。國(guó)內(nèi)也在積極開展hTERT啟動(dòng)子相關(guān)的臨床前研究，探索其在腫瘤早期診斷和個(gè)性化治療中的潛在價(jià)值。盡管國(guó)內(nèi)外在溶瘤單純皰疹病毒和hTERT啟動(dòng)子的研究方面都取得了一定的成果，但仍存在一些研究空白和不足之處。在溶瘤單純皰疹病毒方面，雖然目前已經(jīng)有一些oHSV產(chǎn)品進(jìn)入臨床試驗(yàn)或獲批上市，但病毒在腫瘤細(xì)胞中的靶向性和復(fù)制效率仍有待進(jìn)一步提高，以減少對(duì)正常組織的潛在損害，同時(shí)增強(qiáng)其在不同腫瘤類型中的治療效果。對(duì)于病毒與宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用機(jī)制，還需要更深入的研究，以便更好地優(yōu)化病毒的免疫激活能力，提高溶瘤病毒療法的整體療效。在hTERT啟動(dòng)子的研究中，雖然已經(jīng)明確了其在腫瘤細(xì)胞中的高活性及其調(diào)控機(jī)制，但如何更精準(zhǔn)地利用hTERT啟動(dòng)子來調(diào)控溶瘤病毒在腫瘤細(xì)胞中的特異性復(fù)制，以及如何克服可能出現(xiàn)的基因沉默和脫靶效應(yīng)等問題，仍需要進(jìn)一步的探索和研究。將hTERT啟動(dòng)子與溶瘤單純皰疹病毒相結(jié)合的研究，目前還處于起步階段，相關(guān)的研究報(bào)道相對(duì)較少，對(duì)于這種新型病毒載體的構(gòu)建策略、功能特性以及在腫瘤治療中的應(yīng)用效果等方面，都需要進(jìn)行系統(tǒng)而深入的研究。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究的總體目標(biāo)是構(gòu)建一種依賴hTERT啟動(dòng)子的新型溶瘤單純皰疹病毒，并深入探究其生物學(xué)特性和抗腫瘤效能，為腫瘤的臨床治療提供新的有效策略和理論依據(jù)。具體而言，包括以下幾個(gè)方面：成功構(gòu)建基于hTERT啟動(dòng)子調(diào)控的新型溶瘤單純皰疹病毒，確保病毒在腫瘤細(xì)胞中具有高效的特異性復(fù)制能力，同時(shí)在正常細(xì)胞中保持低復(fù)制或無復(fù)制狀態(tài)，從而提高病毒治療的安全性和靶向性。系統(tǒng)研究新型溶瘤單純皰疹病毒的生物學(xué)特性，包括病毒的感染效率、在不同腫瘤細(xì)胞系中的復(fù)制動(dòng)力學(xué)、病毒粒子的穩(wěn)定性以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷機(jī)制等，全面了解病毒在腫瘤微環(huán)境中的行為和作用方式。利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，深入評(píng)估新型溶瘤單純皰疹病毒的抗腫瘤效能，包括對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用、腫瘤體積和重量的變化、動(dòng)物生存期的延長(zhǎng)等指標(biāo)，驗(yàn)證其在體內(nèi)外對(duì)腫瘤的治療效果。探索新型溶瘤單純皰疹病毒與其他腫瘤治療方法（如化療、放療、免疫治療等）的聯(lián)合應(yīng)用方案，通過優(yōu)化聯(lián)合治療策略，進(jìn)一步提高腫瘤治療的效果，為臨床聯(lián)合治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。1.3.2研究?jī)?nèi)容為實(shí)現(xiàn)上述研究目標(biāo)，本研究將主要開展以下幾方面的研究?jī)?nèi)容：新型溶瘤單純皰疹病毒的構(gòu)建：hTERT啟動(dòng)子的克?。焊鶕?jù)已發(fā)表的hTERT啟動(dòng)子基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR技術(shù)從人基因組DNA中擴(kuò)增hTERT啟動(dòng)子片段。對(duì)擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保其序列的準(zhǔn)確性和完整性。重組病毒載體的構(gòu)建：選取合適的單純皰疹病毒骨架，利用基因編輯技術(shù)將hTERT啟動(dòng)子替換病毒中與復(fù)制起始相關(guān)的關(guān)鍵基因（如ICP4基因等）的天然啟動(dòng)子，構(gòu)建重組病毒載體。對(duì)重組載體進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析，驗(yàn)證構(gòu)建的正確性。重組病毒的拯救與純化：將重組病毒載體轉(zhuǎn)染至合適的包裝細(xì)胞系（如Vero細(xì)胞等）中，通過細(xì)胞培養(yǎng)和病毒拯救技術(shù)，獲得重組溶瘤單純皰疹病毒。利用超速離心、柱層析等方法對(duì)病毒進(jìn)行純化，得到高滴度、高純度的病毒制劑。新型溶瘤單純皰疹病毒的生物學(xué)特性研究：病毒感染效率的測(cè)定：將純化后的新型溶瘤單純皰疹病毒感染不同的腫瘤細(xì)胞系（如肝癌細(xì)胞系HepG2、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549等）和正常細(xì)胞系（如人胚腎細(xì)胞系HEK293等），通過熒光定量PCR、免疫熒光等方法檢測(cè)病毒基因組在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)或病毒蛋白的表達(dá)情況，評(píng)估病毒對(duì)不同細(xì)胞的感染效率。病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)研究：在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)收集感染細(xì)胞和上清液，采用噬斑形成實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法測(cè)定病毒滴度和病毒基因組拷貝數(shù)，繪制病毒在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中的復(fù)制曲線，分析病毒的復(fù)制動(dòng)力學(xué)特征。病毒粒子穩(wěn)定性分析：將病毒制劑在不同的溫度（如4℃、37℃等）和保存條件下放置不同時(shí)間，定期測(cè)定病毒滴度，評(píng)估病毒粒子的穩(wěn)定性，確定病毒的最佳保存條件。病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷機(jī)制研究：通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死情況，分析病毒感染后腫瘤細(xì)胞周期的變化；利用蛋白質(zhì)免疫印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法檢測(cè)與細(xì)胞凋亡、自噬、免疫激活等相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)和活性變化，探究病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷機(jī)制。新型溶瘤單純皰疹病毒的抗腫瘤效能評(píng)估：體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)：將新型溶瘤單純皰疹病毒感染不同的腫瘤細(xì)胞系，采用MTT法、CCK-8法等檢測(cè)病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用；通過細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響；利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)：建立荷瘤小鼠模型，如將HepG2細(xì)胞接種到裸鼠皮下，待腫瘤生長(zhǎng)到一定大小后，將新型溶瘤單純皰疹病毒通過瘤內(nèi)注射、靜脈注射等方式給予荷瘤小鼠。定期測(cè)量腫瘤體積和小鼠體重，記錄小鼠的生存時(shí)間，通過解剖小鼠觀察腫瘤的形態(tài)和病理變化，評(píng)估病毒在體內(nèi)的抗腫瘤效果。采用免疫組織化學(xué)、免疫熒光等方法檢測(cè)腫瘤組織中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況、腫瘤血管生成情況以及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，分析病毒在體內(nèi)引發(fā)的抗腫瘤免疫反應(yīng)和對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響。新型溶瘤單純皰疹病毒的聯(lián)合治療研究：聯(lián)合化療藥物的研究：選擇臨床常用的化療藥物（如順鉑、紫杉醇等），將新型溶瘤單純皰疹病毒與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞系和荷瘤小鼠模型。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，評(píng)估聯(lián)合治療對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，以及對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制和生存期延長(zhǎng)的效果。研究聯(lián)合治療過程中病毒與化療藥物之間的相互作用機(jī)制，如藥物對(duì)病毒復(fù)制和感染能力的影響，以及病毒對(duì)化療藥物敏感性的調(diào)節(jié)作用。聯(lián)合放療的研究：將新型溶瘤單純皰疹病毒與放療聯(lián)合應(yīng)用于荷瘤小鼠模型，設(shè)定不同的放療劑量和病毒給藥時(shí)間點(diǎn)。觀察聯(lián)合治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用、腫瘤組織的病理變化以及小鼠的生存情況。探討聯(lián)合治療過程中病毒與放療之間的協(xié)同增效機(jī)制，如病毒如何增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，以及放療對(duì)病毒在腫瘤組織中復(fù)制和分布的影響。聯(lián)合免疫治療的研究：選擇免疫檢查點(diǎn)抑制劑（如抗PD-1抗體、抗CTLA-4抗體等）或其他免疫治療藥物（如細(xì)胞因子、腫瘤疫苗等），與新型溶瘤單純皰疹病毒聯(lián)合應(yīng)用于荷瘤小鼠模型。通過檢測(cè)腫瘤組織中免疫細(xì)胞的活化狀態(tài)、免疫細(xì)胞亞群的比例變化以及相關(guān)免疫調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平，評(píng)估聯(lián)合治療對(duì)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的增強(qiáng)作用。研究聯(lián)合治療過程中病毒與免疫治療藥物之間的協(xié)同作用機(jī)制，以及聯(lián)合治療對(duì)腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法分子克隆技術(shù)：運(yùn)用分子克隆技術(shù)進(jìn)行hTERT啟動(dòng)子的克隆以及重組病毒載體的構(gòu)建。通過PCR技術(shù)從人基因組DNA中特異性擴(kuò)增hTERT啟動(dòng)子片段，這需要依據(jù)已發(fā)表的hTERT啟動(dòng)子基因序列精心設(shè)計(jì)引物，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，保證序列的準(zhǔn)確性。在重組病毒載體構(gòu)建過程中，采用基因編輯技術(shù)如CRISPR/Cas9等，將hTERT啟動(dòng)子精確替換單純皰疹病毒骨架中與復(fù)制起始相關(guān)關(guān)鍵基因的天然啟動(dòng)子。利用酶切鑒定和測(cè)序分析對(duì)重組載體進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)構(gòu)建的正確性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)：利用多種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)新型溶瘤單純皰疹病毒的生物學(xué)特性和抗腫瘤效能進(jìn)行研究。采用熒光定量PCR、免疫熒光等方法檢測(cè)病毒基因組在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)或病毒蛋白的表達(dá)情況，以此測(cè)定病毒對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系（如肝癌細(xì)胞系HepG2、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549等）和正常細(xì)胞系（如人胚腎細(xì)胞系HEK293等）的感染效率。通過噬斑形成實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法測(cè)定病毒滴度和病毒基因組拷貝數(shù)，研究病毒在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中的復(fù)制動(dòng)力學(xué)。運(yùn)用MTT法、CCK-8法等檢測(cè)病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用；通過細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響；利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死情況，分析病毒感染后腫瘤細(xì)胞周期的變化；利用蛋白質(zhì)免疫印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法檢測(cè)與細(xì)胞凋亡、自噬、免疫激活等相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)和活性變化，探究病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)：借助動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)評(píng)估新型溶瘤單純皰疹病毒的體內(nèi)抗腫瘤效果和安全性。建立荷瘤小鼠模型，如將HepG2細(xì)胞接種到裸鼠皮下，待腫瘤生長(zhǎng)到一定大小后，通過瘤內(nèi)注射、靜脈注射等方式給予荷瘤小鼠新型溶瘤單純皰疹病毒。定期測(cè)量腫瘤體積和小鼠體重，記錄小鼠的生存時(shí)間，通過解剖小鼠觀察腫瘤的形態(tài)和病理變化，評(píng)估病毒在體內(nèi)的抗腫瘤效果。采用免疫組織化學(xué)、免疫熒光等方法檢測(cè)腫瘤組織中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況、腫瘤血管生成情況以及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，分析病毒在體內(nèi)引發(fā)的抗腫瘤免疫反應(yīng)和對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理和相關(guān)規(guī)范，保障動(dòng)物的福利，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的科學(xué)性和可靠性。聯(lián)合治療研究方法：在聯(lián)合治療研究中，采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法。選擇臨床常用的化療藥物（如順鉑、紫杉醇等）、放療以及免疫治療藥物（如抗PD-1抗體、抗CTLA-4抗體等），分別與新型溶瘤單純皰疹病毒聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞系和荷瘤小鼠模型。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，評(píng)估聯(lián)合治療對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，以及對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制和生存期延長(zhǎng)的效果。深入研究聯(lián)合治療過程中病毒與其他治療方法之間的相互作用機(jī)制，如藥物對(duì)病毒復(fù)制和感染能力的影響，以及病毒對(duì)化療藥物敏感性、放療敏感性的調(diào)節(jié)作用，還有病毒與免疫治療藥物之間的協(xié)同作用機(jī)制等。1.4.2技術(shù)路線新型溶瘤單純皰疹病毒的構(gòu)建路線：首先從人基因組DNA中提取DNA，利用設(shè)計(jì)好的特異性引物，通過PCR擴(kuò)增hTERT啟動(dòng)子片段。對(duì)擴(kuò)增得到的hTERT啟動(dòng)子片段進(jìn)行純化和測(cè)序驗(yàn)證，確保序列無誤。選取合適的單純皰疹病毒骨架，利用基因編輯技術(shù)將hTERT啟動(dòng)子替換病毒中與復(fù)制起始相關(guān)關(guān)鍵基因（如ICP4基因等）的天然啟動(dòng)子，構(gòu)建重組病毒載體。對(duì)重組病毒載體進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析，驗(yàn)證構(gòu)建的正確性。將驗(yàn)證正確的重組病毒載體轉(zhuǎn)染至合適的包裝細(xì)胞系（如Vero細(xì)胞等）中，通過細(xì)胞培養(yǎng)和病毒拯救技術(shù)，獲得重組溶瘤單純皰疹病毒。利用超速離心、柱層析等方法對(duì)病毒進(jìn)行純化，得到高滴度、高純度的病毒制劑，并測(cè)定病毒滴度。新型溶瘤單純皰疹病毒的生物學(xué)特性研究路線：將純化后的新型溶瘤單純皰疹病毒分別感染不同的腫瘤細(xì)胞系和正常細(xì)胞系，在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)，采用熒光定量PCR、免疫熒光等方法檢測(cè)病毒基因組在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)或病毒蛋白的表達(dá)情況，評(píng)估病毒的感染效率。同時(shí)，在感染后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集感染細(xì)胞和上清液，通過噬斑形成實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法測(cè)定病毒滴度和病毒基因組拷貝數(shù)，繪制病毒復(fù)制曲線，分析病毒的復(fù)制動(dòng)力學(xué)特征。將病毒制劑在不同的溫度（如4℃、37℃等）和保存條件下放置不同時(shí)間，定期測(cè)定病毒滴度，評(píng)估病毒粒子的穩(wěn)定性。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死情況，分析病毒感染后腫瘤細(xì)胞周期的變化；運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法檢測(cè)與細(xì)胞凋亡、自噬、免疫激活等相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)和活性變化，探究病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷機(jī)制。新型溶瘤單純皰疹病毒的抗腫瘤效能評(píng)估路線：在體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中，將新型溶瘤單純皰疹病毒感染不同的腫瘤細(xì)胞系，采用MTT法、CCK-8法等檢測(cè)病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用；通過細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響；利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。在體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中，建立荷瘤小鼠模型，將新型溶瘤單純皰疹病毒通過瘤內(nèi)注射、靜脈注射等方式給予荷瘤小鼠。定期測(cè)量腫瘤體積和小鼠體重，記錄小鼠的生存時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，解剖小鼠，觀察腫瘤的形態(tài)和病理變化，采用免疫組織化學(xué)、免疫熒光等方法檢測(cè)腫瘤組織中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況、腫瘤血管生成情況以及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，評(píng)估病毒在體內(nèi)的抗腫瘤效果和對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響。新型溶瘤單純皰疹病毒的聯(lián)合治療研究路線：選擇臨床常用的化療藥物、放療以及免疫治療藥物，分別與新型溶瘤單純皰疹病毒聯(lián)合應(yīng)用。在體外實(shí)驗(yàn)中，將聯(lián)合治療方案應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞系，通過MTT法、CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)聯(lián)合治療對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，建立荷瘤小鼠模型，將聯(lián)合治療方案應(yīng)用于荷瘤小鼠，定期測(cè)量腫瘤體積和小鼠體重，記錄小鼠的生存時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，解剖小鼠，觀察腫瘤的形態(tài)和病理變化，采用免疫組織化學(xué)、免疫熒光等方法檢測(cè)腫瘤組織中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況、腫瘤血管生成情況以及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，評(píng)估聯(lián)合治療的效果和作用機(jī)制。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1溶瘤單純皰疹病毒概述單純皰疹病毒（HerpesSimplexVirus，HSV）屬于皰疹病毒科α病毒亞科，是一類具有包膜的雙鏈DNA病毒。HSV病毒顆粒呈球形，直徑約110-120nm。其結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)主要包括包膜、被膜、衣殼和核樣物四個(gè)部分。包膜由感染細(xì)胞核膜的脂質(zhì)分子層構(gòu)成，其間的糖蛋白由病毒編碼，這些糖蛋白在病毒的吸附、穿透以及免疫逃逸等過程中發(fā)揮著重要作用。被膜層為致密結(jié)構(gòu)，富含蛋白質(zhì)。衣殼由162個(gè)殼粒組成對(duì)稱的二十面體，對(duì)病毒基因組起到保護(hù)作用。核樣物則包含了病毒的基因組DNA，HSV基因組是線性雙鏈DNA，HSV-1和HSV-2的基因組大小分別約為152kb和155kb，基因組含有至少94個(gè)開放閱讀框，編碼至少70種蛋白質(zhì)。HSV主要分為兩種血清型，即HSV-1和HSV-2。兩型病毒的DNA具有50%的同源性，因此它們既有型間共同抗原，也有型特異性抗原。人類是HSV的唯一宿主，HSV-1主要通過密切接觸傳播，常見的感染部位包括口腔、皮膚黏膜、眼結(jié)膜及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可引起齦口炎、唇皰疹、咽炎、角膜結(jié)膜炎和皰疹性腦炎等疾病。HSV-2主要通過性接觸傳播或新生兒經(jīng)母體生殖道感染，主要侵犯生殖器及生殖道黏膜，引發(fā)生殖器皰疹。在全球范圍內(nèi)，HSV的感染較為普遍，截至2023年4月，全球有37億50歲以下的人（67%）感染HSV-1，是發(fā)生口腔皰疹的主要原因；全世界有4.91億年齡在15-49歲之間的人（13%）感染HSV-2，是發(fā)生生殖器皰疹的主要原因。HSV的生活周期較為復(fù)雜，可分為原發(fā)感染、潛伏感染與復(fù)發(fā)性感染三個(gè)階段。在原發(fā)感染階段，HSV通過破損的皮膚或黏膜進(jìn)入人體，病毒粒子與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，隨后包膜與細(xì)胞膜融合，病毒核衣殼進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。病毒基因組被釋放到細(xì)胞核中，立即啟動(dòng)立即早期基因（IE基因）的轉(zhuǎn)錄和翻譯，這些立即早期蛋白可以激活早期基因（E基因）的表達(dá)。早期基因產(chǎn)物參與病毒DNA的復(fù)制過程，在病毒DNA大量復(fù)制后，晚期基因（L基因）開始表達(dá)，編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。新合成的病毒結(jié)構(gòu)蛋白和病毒DNA在細(xì)胞核內(nèi)組裝成新的病毒粒子，然后通過出芽的方式從細(xì)胞中釋放出來，完成一次感染周期，這一過程中往往會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞的病變和死亡，引起明顯的臨床癥狀。當(dāng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)控制住原發(fā)感染后，HSV并不會(huì)被完全清除，而是進(jìn)入潛伏感染階段。病毒基因組會(huì)潛伏在感覺神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元中，此時(shí)病毒基因的表達(dá)受到抑制，僅少數(shù)潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（LATs）會(huì)持續(xù)表達(dá)。LATs可能通過抑制病毒基因的轉(zhuǎn)錄和促進(jìn)神經(jīng)元的存活等機(jī)制，維持病毒的潛伏狀態(tài)。在潛伏感染期間，病毒一般不會(huì)引起明顯的臨床癥狀，但在某些誘因的作用下，如機(jī)體免疫力下降、紫外線照射、發(fā)熱、情緒壓力等，潛伏的病毒可以被重新激活，進(jìn)入復(fù)發(fā)性感染階段。病毒從感覺神經(jīng)節(jié)沿神經(jīng)軸突逆行傳播到神經(jīng)末梢所支配的皮膚或黏膜組織，在這些部位重新開始復(fù)制，導(dǎo)致皰疹的復(fù)發(fā)。溶瘤單純皰疹病毒（OncolyticHerpesSimplexVirus，oHSV）則是經(jīng)過基因工程改造的HSV，旨在使其能夠特異性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并發(fā)揮溶瘤作用，同時(shí)降低對(duì)正常細(xì)胞的毒性。oHSV的作用機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：一是直接裂解腫瘤細(xì)胞。oHSV能夠選擇性地感染腫瘤細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，隨著病毒的不斷增殖，腫瘤細(xì)胞最終因不堪重負(fù)而破裂死亡，釋放出的子代病毒又可以繼續(xù)感染周圍的腫瘤細(xì)胞，形成一個(gè)級(jí)聯(lián)放大的溶瘤過程。二是誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞被oHSV裂解后，會(huì)釋放出腫瘤相關(guān)抗原（Tumor-associatedAntigens，TAAs），這些抗原可以被抗原呈遞細(xì)胞（Antigen-presentingCells，APCs）攝取、加工和呈遞，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等，引發(fā)全身性的抗腫瘤免疫應(yīng)答。三是破壞腫瘤血管系統(tǒng)。部分oHSV可以感染并破壞腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，阻斷腫瘤的血液供應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞因缺血缺氧而死亡，同時(shí)也能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。在臨床應(yīng)用方面，溶瘤單純皰疹病毒已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。美國(guó)安進(jìn)公司研發(fā)的talimogenelaherparepvec（T-VEC）是首個(gè)獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療首次復(fù)發(fā)不可切除黑色素瘤局部治療的溶瘤病毒。T-VEC通過刪除病毒基因ICP34.5，并將GM-CSF基因插入病毒胸苷激酶（TK）基因位點(diǎn)，增強(qiáng)了病毒在腫瘤細(xì)胞中的靶向性和免疫激活能力。臨床研究表明，T-VEC在黑色素瘤治療中展現(xiàn)出較好的療效，顯著提高了患者的生存率和緩解率。日本第一三共制藥研發(fā)的G47Δ是在G207基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化的新一代oHSV，它刪除了ICP47基因，增強(qiáng)了病毒的復(fù)制能力和激發(fā)免疫系統(tǒng)抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力。在臨床前研究中，G47Δ在幾乎所有的癌癥類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭卸急憩F(xiàn)出了顯著的抗腫瘤功效。在用于治療惡性、復(fù)發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床試驗(yàn)中，13例患者中有12例患者在治療后生存長(zhǎng)達(dá)1年以上，1年生存率達(dá)到92.3%，與標(biāo)準(zhǔn)治療1年生存期15%相比有明顯提高。2021年，G47Δ獲得日本厚生勞動(dòng)省的條件性限時(shí)批準(zhǔn)，用于治療惡性膠質(zhì)瘤，成為世界上首款獲得批準(zhǔn)治療原發(fā)性腦瘤的溶瘤病毒療法。這些成功案例為溶瘤單純皰疹病毒的臨床應(yīng)用提供了有力的證據(jù)和示范，也推動(dòng)了相關(guān)領(lǐng)域的進(jìn)一步研究和發(fā)展。然而，目前溶瘤單純皰疹病毒在臨床應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)，如病毒的靶向性和特異性有待進(jìn)一步提高，以減少對(duì)正常組織的潛在損害；病毒與宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用機(jī)制還需要更深入的研究，以便更好地優(yōu)化病毒的免疫激活能力，提高治療效果；部分患者可能會(huì)對(duì)病毒產(chǎn)生免疫反應(yīng)，影響病毒的療效和安全性等。2.2hTERT啟動(dòng)子相關(guān)理論人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（humantelomerasereversetranscriptase，hTERT）作為端粒酶的核心催化亞基，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著至關(guān)重要的角色。端粒酶是一種核糖核蛋白復(fù)合物，其主要功能是通過延長(zhǎng)染色體末端的端粒序列，來維持染色體的穩(wěn)定性和完整性。端粒是位于真核生物染色體末端的一段重復(fù)核苷酸序列，在細(xì)胞分裂過程中，由于DNA聚合酶無法完全復(fù)制染色體末端，端粒會(huì)逐漸縮短。當(dāng)端?？s短到一定程度時(shí)，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入衰老或凋亡狀態(tài)。而端粒酶的存在可以逆轉(zhuǎn)這一過程，它以自身攜帶的RNA為模板，通過hTERT的逆轉(zhuǎn)錄活性，將端粒重復(fù)序列添加到染色體末端，從而使端粒長(zhǎng)度得以維持，細(xì)胞能夠持續(xù)分裂。在正常體細(xì)胞中，端粒酶的活性受到嚴(yán)格的調(diào)控，通常處于極低水平甚至不表達(dá)。這是因?yàn)閔TERT基因的表達(dá)受到多種轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路的精密調(diào)節(jié)，使得hTERT的轉(zhuǎn)錄被抑制。例如，p53、RB等抑癌基因可以通過與hTERT啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的相互作用，從而阻礙hTERT基因的轉(zhuǎn)錄。一些細(xì)胞周期調(diào)控蛋白和細(xì)胞分化相關(guān)因子也參與了hTERT表達(dá)的調(diào)控，確保在正常細(xì)胞分化和生長(zhǎng)過程中，hTERT的表達(dá)維持在低水平，以保證細(xì)胞的正常生理功能和有限的分裂能力。然而，在腫瘤細(xì)胞中，情況則截然不同。超過85%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出端粒酶的異常激活，其中hTERT的重新表達(dá)是端粒酶激活的關(guān)鍵步驟。腫瘤細(xì)胞中hTERT的高表達(dá)使得端粒能夠保持穩(wěn)定的長(zhǎng)度，從而賦予腫瘤細(xì)胞無限增殖的能力，這是腫瘤細(xì)胞得以持續(xù)生長(zhǎng)和擴(kuò)散的重要基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞中hTERT的激活是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多個(gè)層面的調(diào)控異常。從基因水平來看，hTERT基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生了一系列變化。hTERT啟動(dòng)子缺乏典型的TATA盒和CAAT盒，其結(jié)構(gòu)富含GC，是一個(gè)CpG島。在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游181bp的區(qū)域被認(rèn)為是核心啟動(dòng)子區(qū)，該區(qū)域包含多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如E盒（CACGTG序列）、GC盒（GGGGCGGGG序列）等。在腫瘤細(xì)胞中，這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生了特異性的改變。c-Myc等癌基因的過表達(dá)，使得c-Myc蛋白能夠與hTERT啟動(dòng)子上的E盒結(jié)合，從而增強(qiáng)hTERT啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)hTERT基因的轉(zhuǎn)錄。一些轉(zhuǎn)錄因子的修飾狀態(tài)也發(fā)生了變化，進(jìn)一步影響了它們與hTERT啟動(dòng)子的親和力和轉(zhuǎn)錄激活能力。從表觀遺傳學(xué)角度，腫瘤細(xì)胞中hTERT啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化模式也發(fā)生了改變。在正常細(xì)胞中，hTERT啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島通常處于高甲基化狀態(tài)，這會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制hTERT基因的表達(dá)。而在腫瘤細(xì)胞中，hTERT啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平顯著降低，使得轉(zhuǎn)錄因子能夠更容易地結(jié)合到啟動(dòng)子上，啟動(dòng)hTERT基因的轉(zhuǎn)錄。組蛋白修飾也在hTERT基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。例如，組蛋白的乙?；揎椏梢允谷旧|(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，增加轉(zhuǎn)錄因子與DNA的可及性，從而促進(jìn)hTERT基因的轉(zhuǎn)錄；而組蛋白的甲基化修飾則可能根據(jù)修飾位點(diǎn)和程度的不同，對(duì)hTERT基因的表達(dá)產(chǎn)生不同的影響。hTERT啟動(dòng)子在腫瘤特異性表達(dá)方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)，這使得它成為腫瘤治療領(lǐng)域極具潛力的研究靶點(diǎn)。由于hTERT啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞中特異性高表達(dá)，而在正常細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，利用這一特性可以實(shí)現(xiàn)治療基因在腫瘤細(xì)胞中的特異性表達(dá)。將一些具有治療作用的基因（如自殺基因、免疫調(diào)節(jié)因子基因等）置于hTERT啟動(dòng)子的調(diào)控之下，構(gòu)建成重組表達(dá)載體。當(dāng)這些載體被導(dǎo)入體內(nèi)后，只有在腫瘤細(xì)胞中，由于hTERT啟動(dòng)子的高活性，治療基因才能被啟動(dòng)表達(dá)，發(fā)揮其治療作用，而在正常細(xì)胞中，由于hTERT啟動(dòng)子的低活性或無活性，治療基因不會(huì)表達(dá)，從而避免了對(duì)正常細(xì)胞的損傷，大大提高了治療的安全性和靶向性。hTERT啟動(dòng)子的活性與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。通過檢測(cè)hTERT啟動(dòng)子的活性或hTERT基因的表達(dá)水平，可以作為腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)。在腫瘤早期，hTERT啟動(dòng)子的活性可能已經(jīng)發(fā)生改變，通過靈敏的檢測(cè)技術(shù)可以早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的存在；而在腫瘤治療過程中，監(jiān)測(cè)hTERT啟動(dòng)子的活性變化，可以評(píng)估治療效果和預(yù)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。2.3溶瘤病毒與hTERT啟動(dòng)子結(jié)合的原理溶瘤病毒治療腫瘤的關(guān)鍵在于實(shí)現(xiàn)病毒在腫瘤細(xì)胞中的特異性復(fù)制和殺傷，而hTERT啟動(dòng)子的獨(dú)特性質(zhì)為這一目標(biāo)的達(dá)成提供了有力的工具。將hTERT啟動(dòng)子與溶瘤病毒相結(jié)合，能夠精準(zhǔn)調(diào)控病毒的復(fù)制過程，使其主要在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷。在正常細(xì)胞中，端粒酶活性受到嚴(yán)格的調(diào)控，hTERT基因幾乎不表達(dá)。這是由于hTERT啟動(dòng)子區(qū)域缺乏典型的TATA盒和CAAT盒，且富含GC的CpG島處于高甲基化狀態(tài)。這種結(jié)構(gòu)使得轉(zhuǎn)錄因子難以與啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制了hTERT基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而維持端粒酶的低活性。在腫瘤細(xì)胞中，hTERT啟動(dòng)子發(fā)生了顯著的變化。啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平降低，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（如E盒、GC盒等）發(fā)生特異性改變，使得轉(zhuǎn)錄因子（如c-Myc等癌基因表達(dá)產(chǎn)物）能夠與之結(jié)合，激活hTERT基因的轉(zhuǎn)錄。這導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中hTERT表達(dá)上調(diào)，端粒酶活性增強(qiáng)，賦予腫瘤細(xì)胞無限增殖的能力。基于hTERT啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中的不同活性，將其應(yīng)用于溶瘤病毒的構(gòu)建中，可實(shí)現(xiàn)病毒的腫瘤特異性復(fù)制。以溶瘤單純皰疹病毒為例，在構(gòu)建新型溶瘤單純皰疹病毒時(shí)，通常會(huì)選擇病毒基因組中與復(fù)制起始密切相關(guān)的關(guān)鍵基因（如ICP4基因等）。ICP4基因編碼的蛋白是HSV復(fù)制過程中的重要反式激活因子，對(duì)病毒早期基因和晚期基因的轉(zhuǎn)錄激活起著關(guān)鍵作用。利用基因編輯技術(shù)，將hTERT啟動(dòng)子替換這些關(guān)鍵基因的天然啟動(dòng)子。當(dāng)重組后的溶瘤單純皰疹病毒進(jìn)入機(jī)體后，在正常細(xì)胞中，由于hTERT啟動(dòng)子處于低活性狀態(tài)，無法有效啟動(dòng)ICP4等關(guān)鍵基因的表達(dá)。這使得病毒的復(fù)制起始過程受阻，病毒無法在正常細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，從而減少了對(duì)正常細(xì)胞的損害。而在腫瘤細(xì)胞中，高活性的hTERT啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)ICP4等關(guān)鍵基因的表達(dá)。這些關(guān)鍵基因表達(dá)的蛋白參與病毒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等過程，啟動(dòng)病毒的復(fù)制周期。病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量增殖，隨著病毒的不斷復(fù)制，腫瘤細(xì)胞最終因不堪重負(fù)而破裂死亡，釋放出的子代病毒又可以繼續(xù)感染周圍的腫瘤細(xì)胞，形成一個(gè)級(jí)聯(lián)放大的溶瘤過程。這種結(jié)合方式不僅實(shí)現(xiàn)了溶瘤病毒在腫瘤細(xì)胞中的特異性復(fù)制，還利用了腫瘤細(xì)胞自身的分子特征來驅(qū)動(dòng)病毒的復(fù)制，提高了病毒治療的靶向性和安全性。通過hTERT啟動(dòng)子的調(diào)控，溶瘤病毒能夠更精準(zhǔn)地作用于腫瘤細(xì)胞，減少對(duì)正常組織的副作用，為腫瘤治療提供了一種更具潛力的策略。三、新型溶瘤單純皰疹病毒的構(gòu)建3.1實(shí)驗(yàn)材料與準(zhǔn)備在構(gòu)建依賴hTERT啟動(dòng)子的新型溶瘤單純皰疹病毒的過程中，實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備至關(guān)重要，其質(zhì)量和特性直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成敗與結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.1.1細(xì)胞株與病毒株細(xì)胞株：選用人胚腎細(xì)胞系HEK293T、非洲綠猴腎細(xì)胞系Vero、肝癌細(xì)胞系HepG2、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、乳腺癌細(xì)胞系MCF-7等細(xì)胞株。HEK293T細(xì)胞具有轉(zhuǎn)染效率高、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，常用于病毒載體的包裝和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，能夠高效地協(xié)助重組病毒的拯救。Vero細(xì)胞對(duì)多種病毒易感，是病毒培養(yǎng)和擴(kuò)增的常用細(xì)胞系，在新型溶瘤單純皰疹病毒的生產(chǎn)過程中，可作為病毒大量繁殖的宿主細(xì)胞。HepG2、A549、MCF-7等腫瘤細(xì)胞系則用于后續(xù)病毒的感染實(shí)驗(yàn)，以研究病毒在不同腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)特性和抗腫瘤效能。所有細(xì)胞株均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），在收到細(xì)胞后，首先進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，將細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%-90%融合度時(shí)，進(jìn)行傳代或凍存處理。在實(shí)驗(yàn)前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行支原體檢測(cè)，確保細(xì)胞無支原體污染，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。病毒株：選擇單純皰疹病毒1型（HSV-1）作為構(gòu)建新型溶瘤單純皰疹病毒的骨架病毒。HSV-1是一種廣泛研究的雙鏈DNA病毒，其基因組結(jié)構(gòu)和功能相對(duì)清晰，便于進(jìn)行基因工程改造。野生型HSV-1病毒株由本實(shí)驗(yàn)室保存，在使用前，先將病毒復(fù)蘇并在Vero細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。具體操作如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Vero細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%融合度時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用PBS（PhosphateBufferedSaline）緩沖液洗滌細(xì)胞2次，然后加入適量的HSV-1病毒液，在37℃吸附1-2小時(shí)，期間輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使病毒均勻分布。吸附結(jié)束后，棄去病毒液，加入含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變效應(yīng)（CytopathicEffect，CPE），如細(xì)胞變圓、脫落等，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，即為擴(kuò)增后的HSV-1病毒液。將病毒液進(jìn)行梯度稀釋，采用噬斑形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒滴度，確定病毒的濃度，為后續(xù)的病毒基因改造實(shí)驗(yàn)提供合適滴度的病毒樣本。3.1.2質(zhì)粒與工具酶質(zhì)粒：pUC57-hTERT質(zhì)粒用于提供hTERT啟動(dòng)子片段，該質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存。pUC57是一種常用的克隆載體，具有多克隆位點(diǎn)、氨芐青霉素抗性基因等元件，便于hTERT啟動(dòng)子的克隆和篩選。在使用前，將pUC57-hTERT質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐青霉素（終濃度為100μg/mL）的LB（Luria-Bertani）固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)，37℃過夜。次日，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。然后采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度，確保質(zhì)粒的純度和完整性滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。工具酶：限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII、EcoRI等用于切割質(zhì)粒和DNA片段，這些限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別特定的DNA序列，并在相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行切割，為基因片段的插入和重組提供便利。T4DNA連接酶用于連接目的基因片段和載體，在ATP存在的條件下，T4DNA連接酶能夠催化DNA片段的5'-磷酸基團(tuán)和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵，實(shí)現(xiàn)基因的重組。高保真DNA聚合酶PrimeSTARMaxDNAPolymerase用于PCR擴(kuò)增hTERT啟動(dòng)子片段，該酶具有高保真度、擴(kuò)增效率高等優(yōu)點(diǎn)，能夠減少PCR擴(kuò)增過程中的堿基錯(cuò)配，確保擴(kuò)增得到的hTERT啟動(dòng)子片段序列準(zhǔn)確無誤。所有工具酶均購(gòu)自Takara公司，在使用過程中，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書的要求進(jìn)行操作，控制反應(yīng)條件，如溫度、時(shí)間、酶量等，以保證酶切和連接反應(yīng)的高效進(jìn)行。3.1.3試劑與耗材試劑：DNAMarker用于在瓊脂糖凝膠電泳中確定DNA片段的大小，通過與已知大小的DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)，能夠準(zhǔn)確判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、酶切片段等的大小。dNTPs（DeoxyribonucleosideTriphosphates）是PCR反應(yīng)的原料，包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP四種脫氧核糖核苷酸，為DNA合成提供底物。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平。細(xì)胞裂解液用于裂解細(xì)胞，釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸等成分，便于進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡、核酸提取等實(shí)驗(yàn)。所有試劑均購(gòu)自正規(guī)生物試劑公司，在購(gòu)買后，嚴(yán)格按照試劑的保存條件進(jìn)行儲(chǔ)存，如dNTPs需保存在-20℃，避免反復(fù)凍融，以保證試劑的活性和穩(wěn)定性。耗材：PCR管、離心管、移液器吸頭、細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶等耗材用于實(shí)驗(yàn)操作過程中的樣品處理和細(xì)胞培養(yǎng)。PCR管用于PCR反應(yīng)，要求其具有良好的密封性和熱穩(wěn)定性，以保證PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行。離心管用于樣品的離心分離，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求，選擇不同規(guī)格和材質(zhì)的離心管。移液器吸頭用于吸取和轉(zhuǎn)移試劑和樣品，為避免交叉污染，使用時(shí)需選擇無DNA酶、無RNA酶的吸頭，并注意及時(shí)更換。細(xì)胞培養(yǎng)板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶用于細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代，在使用前，需進(jìn)行嚴(yán)格的清洗和消毒處理，如用75%酒精擦拭后，在超凈工作臺(tái)中紫外線照射30分鐘以上，確保無菌環(huán)境。所有耗材均為一次性使用，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.4儀器設(shè)備與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物儀器設(shè)備：PCR儀用于進(jìn)行hTERT啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，能夠精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)DNA的體外擴(kuò)增。凝膠成像系統(tǒng)用于觀察和分析瓊脂糖凝膠電泳后的DNA條帶，通過對(duì)條帶的亮度、位置等信息的分析，判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和純度。高速離心機(jī)用于離心分離細(xì)胞、病毒和核酸等樣品，能夠提供高轉(zhuǎn)速和高離心力，實(shí)現(xiàn)樣品的快速分離。CO?培養(yǎng)箱用于細(xì)胞的培養(yǎng)，能夠提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供適宜的環(huán)境。酶標(biāo)儀用于檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性等實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，通過對(duì)吸光度值的測(cè)定，定量分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。流式細(xì)胞儀用于檢測(cè)細(xì)胞的凋亡、周期等指標(biāo)，能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析，獲取細(xì)胞的生物學(xué)信息。所有儀器設(shè)備在使用前均需進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)試，確保儀器的性能穩(wěn)定，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/c裸鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，用于建立荷瘤小鼠模型，評(píng)估新型溶瘤單純皰疹病毒的體內(nèi)抗腫瘤效果。裸鼠由于缺乏胸腺，細(xì)胞免疫功能缺陷，能夠減少對(duì)移植腫瘤的免疫排斥反應(yīng)，是常用的荷瘤小鼠模型動(dòng)物。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，先將其置于特定的動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境中適應(yīng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境要求溫度為22-25℃，濕度為40%-60%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的循環(huán)光照條件。提供無菌的飼料和飲用水，定期更換墊料，保持飼養(yǎng)環(huán)境的清潔衛(wèi)生。在適應(yīng)期結(jié)束后，對(duì)裸鼠進(jìn)行健康檢查，確保其無疾病感染，方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理和相關(guān)規(guī)范，最大限度地減少動(dòng)物的痛苦，保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的科學(xué)性和可靠性。3.2轉(zhuǎn)載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建轉(zhuǎn)載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建是構(gòu)建依賴hTERT啟動(dòng)子的新型溶瘤單純皰疹病毒的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其設(shè)計(jì)的合理性和構(gòu)建的準(zhǔn)確性直接關(guān)系到后續(xù)病毒的功能和治療效果。在質(zhì)粒載體的設(shè)計(jì)方面，選用pUC57作為基礎(chǔ)載體，這是因?yàn)閜UC57具有多克隆位點(diǎn)，能夠方便地插入目的基因片段，且其攜帶的氨芐青霉素抗性基因可用于轉(zhuǎn)化后的篩選，確保含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。為了實(shí)現(xiàn)hTERT啟動(dòng)子對(duì)下游基因的有效調(diào)控，在pUC57的多克隆位點(diǎn)處，精心設(shè)計(jì)并插入hTERT啟動(dòng)子序列。同時(shí)，在hTERT啟動(dòng)子的下游，插入一段與單純皰疹病毒基因組具有同源性的序列，這段同源性序列的設(shè)計(jì)基于對(duì)單純皰疹病毒基因組結(jié)構(gòu)的深入分析，選取與病毒復(fù)制起始相關(guān)關(guān)鍵基因（如ICP4基因）附近的序列，長(zhǎng)度約為500-800bp，確保在后續(xù)的同源重組過程中，能夠準(zhǔn)確地將hTERT啟動(dòng)子替換病毒關(guān)鍵基因的天然啟動(dòng)子。對(duì)于病毒載體的設(shè)計(jì)，以單純皰疹病毒1型（HSV-1）為骨架。HSV-1的基因組較大，包含多個(gè)基因，其中ICP4基因在病毒的復(fù)制起始過程中起著至關(guān)重要的作用，它編碼的蛋白是一種重要的反式激活因子，能夠調(diào)控病毒早期基因和晚期基因的轉(zhuǎn)錄。在設(shè)計(jì)病毒載體時(shí)，利用基因編輯技術(shù)，在ICP4基因的天然啟動(dòng)子區(qū)域兩側(cè)引入與上述pUC57質(zhì)粒中同源性序列互補(bǔ)的序列，以便在后續(xù)的同源重組過程中，能夠精準(zhǔn)地將pUC57質(zhì)粒中的hTERT啟動(dòng)子及相關(guān)元件整合到HSV-1基因組中，替換ICP4基因的天然啟動(dòng)子，從而構(gòu)建出依賴hTERT啟動(dòng)子調(diào)控ICP4基因表達(dá)的新型溶瘤單純皰疹病毒載體。在轉(zhuǎn)載體中克隆hTERT啟動(dòng)子和相應(yīng)的響應(yīng)元件時(shí)，采用常規(guī)的“串接PCR”技術(shù)。根據(jù)GenBank中已公布的hTERT啟動(dòng)子基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物5'-CGGGATCCATGGCTCGAGCTGCTG-3'，在引物的5'端引入BamHI酶切位點(diǎn)（下劃線部分），便于后續(xù)與載體的連接；下游引物5'-CCCAAGCTTTCAGCTGCTGCTGCTG-3'，在引物的5'端引入HindIII酶切位點(diǎn)（下劃線部分）。以pUC57-hTERT質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為50μL，包括10×PCR緩沖液5μL，dNTPs（2.5mMeach）4μL，上下游引物（10μMeach）各1μL，高保真DNA聚合酶PrimeSTARMaxDNAPolymerase0.5μL，模板DNA1μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性3分鐘；98℃變性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，可見約1.5kb大小的特異性條帶，與預(yù)期的hTERT啟動(dòng)子片段大小相符。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，采用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行操作，按照試劑盒說明書的步驟，依次進(jìn)行切膠、溶膠、吸附、洗滌和洗脫等操作，最終得到高純度的hTERT啟動(dòng)子片段，用于后續(xù)的載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)。3.3基因重組oHSV的生產(chǎn)將構(gòu)建好的病毒載體和轉(zhuǎn)染體共同轉(zhuǎn)染至293T或Vero細(xì)胞株中，是生產(chǎn)基因重組oHSV的關(guān)鍵步驟。在轉(zhuǎn)染前，需對(duì)293T或Vero細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。以293T細(xì)胞為例，提前一天將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞密度為5×10?個(gè)細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到70%-80%的融合度。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。具體步驟如下：首先，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑和DNA復(fù)合物。將10μL脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine2000）加入到250μL無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；同時(shí)，將3μg病毒載體DNA和2μg轉(zhuǎn)染體DNA混合，加入到250μL無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻。5分鐘后，將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑與DNA混合液緩慢加入到DNA溶液中，邊加邊輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，使脂質(zhì)體與DNA充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。孵育結(jié)束后，將6孔板中的原培養(yǎng)基吸出，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，去除殘留的血清。向每孔中加入1.5mL無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞表面。將6孔板放回37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí)。4-6小時(shí)后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入2mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞的狀態(tài)。轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)，細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)一些變化，如細(xì)胞變圓、折光性增強(qiáng)等，這是正常的轉(zhuǎn)染反應(yīng)。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，此時(shí)上清液中含有初步產(chǎn)生的基因重組oHSV。為了獲得更高滴度的病毒，將收集的上清液再次感染新的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T或Vero細(xì)胞。具體操作是將上清液以1:10的比例加入到新的細(xì)胞培養(yǎng)孔中，按照上述轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過多次感染和擴(kuò)增后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用超速離心法對(duì)病毒進(jìn)行初步濃縮。將上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管中，在4℃、100,000×g的條件下離心2小時(shí)，使病毒沉淀在離心管底部。小心吸去上清液，將病毒沉淀用適量的PBS緩沖液重懸，得到濃縮的基因重組oHSV溶液。為了進(jìn)一步純化病毒，采用柱層析法。選用合適的層析柱（如Sepharose4FF凝膠柱），用PBS緩沖液平衡層析柱。將濃縮的病毒溶液緩慢上樣到層析柱中，然后用PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。通過檢測(cè)洗脫液中的病毒滴度，確定含有高純度病毒的洗脫峰。收集高純度的病毒洗脫液，即為生產(chǎn)得到的基因重組oHSV，將其保存于-80℃冰箱中備用。在整個(gè)生產(chǎn)過程中，要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免病毒污染，確保生產(chǎn)出的基因重組oHSV的質(zhì)量和活性。3.4構(gòu)建病毒的鑒定與驗(yàn)證為了證實(shí)構(gòu)建的新型溶瘤單純皰疹病毒中含有hTERT啟動(dòng)子，采用多種分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定。首先運(yùn)用PCR技術(shù)，根據(jù)hTERT啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)特異性引物，以提取的新型溶瘤單純皰疹病毒基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL，包含10×PCR緩沖液5μL，dNTPs（2.5mMeach）4μL，上下游引物（10μMeach）各1μL，高保真DNA聚合酶PrimeSTARMaxDNAPolymerase0.5μL，模板DNA1μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性3分鐘；98℃變性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶（約1.5kb），則初步表明病毒基因組中含有hTERT啟動(dòng)子。進(jìn)一步采用Southernblot技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。將提取的病毒基因組DNA用限制性內(nèi)切酶（如BamHI和HindIII）進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，通過毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。將標(biāo)記好的hTERT啟動(dòng)子特異性探針（采用地高辛標(biāo)記）與尼龍膜進(jìn)行雜交，經(jīng)過預(yù)雜交、雜交、洗膜等步驟后，利用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)雜交信號(hào)。若在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性雜交條帶，則進(jìn)一步證實(shí)病毒基因組中整合了hTERT啟動(dòng)子。利用Westernblot技術(shù)從蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證hTERT啟動(dòng)子的功能。將新型溶瘤單純皰疹病毒感染腫瘤細(xì)胞（如HepG2細(xì)胞）和正常細(xì)胞（如HEK293細(xì)胞），在感染后的適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)后，加入針對(duì)hTERT啟動(dòng)子下游調(diào)控基因（如ICP4基因編碼蛋白）的特異性抗體，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時(shí)。再次洗滌后，利用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。若在腫瘤細(xì)胞感染組檢測(cè)到特異性條帶，而在正常細(xì)胞感染組未檢測(cè)到或條帶很弱，則表明hTERT啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞中能夠啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，而在正常細(xì)胞中表達(dá)受到抑制，符合預(yù)期的設(shè)計(jì)功能。對(duì)于病毒其他特性的驗(yàn)證，使用透射電子顯微鏡觀察病毒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。將純化后的新型溶瘤單純皰疹病毒樣品滴加到銅網(wǎng)上，用2%磷鎢酸溶液進(jìn)行負(fù)染，干燥后在透射電子顯微鏡下觀察?？梢郧逦乜吹讲《玖Ｗ映是蛐危哂械湫偷陌そY(jié)構(gòu)，直徑約110-120nm，與單純皰疹病毒的形態(tài)特征相符。采用限制性內(nèi)切酶切割分析病毒基因組的完整性和結(jié)構(gòu)。選取多種限制性內(nèi)切酶（如EcoRI、BamHI、HindIII等）對(duì)病毒基因組DNA進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，觀察條帶的數(shù)量和大小。通過與理論預(yù)測(cè)的酶切圖譜進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證病毒基因組的完整性和基因編輯的準(zhǔn)確性，確保病毒基因組中hTERT啟動(dòng)子的插入以及其他基因的修飾符合設(shè)計(jì)要求。四、新型溶瘤單純皰疹病毒的生物學(xué)特性研究4.1病毒的純化與擴(kuò)增將轉(zhuǎn)染后收集的含有新型溶瘤單純皰疹病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，首先進(jìn)行低速離心，在4℃、3000×g的條件下離心15分鐘，目的是去除細(xì)胞碎片和較大的雜質(zhì)顆粒。隨后，將上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管中，在4℃、100,000×g的條件下超速離心2小時(shí)，使病毒沉淀在離心管底部。小心吸去上清液，將病毒沉淀用適量的PBS緩沖液重懸，完成初步的病毒濃縮。為進(jìn)一步提高病毒的純度，采用柱層析法。選用Sepharose4FF凝膠柱，用PBS緩沖液平衡層析柱，確保層析柱內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定且適宜病毒的分離。將初步濃縮的病毒溶液緩慢上樣到層析柱中，然后用PBS緩沖液進(jìn)行洗脫。在洗脫過程中，利用紫外檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)洗脫液在260nm處的吸光度，當(dāng)吸光度出現(xiàn)明顯變化時(shí)，收集相應(yīng)的洗脫液。通過檢測(cè)洗脫液中的病毒滴度，確定含有高純度病毒的洗脫峰。收集高純度的病毒洗脫液，即為純化后的新型溶瘤單純皰疹病毒。將純化后的病毒接種到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Vero細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.01的比例，將病毒加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37℃吸附1-2小時(shí)，期間輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使病毒均勻分布。吸附結(jié)束后，棄去病毒液，加入含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞的病變效應(yīng)（CPE），當(dāng)70%-80%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE，如細(xì)胞變圓、脫落等現(xiàn)象時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，即為擴(kuò)增后的新型溶瘤單純皰疹病毒液。將擴(kuò)增后的病毒液進(jìn)行梯度稀釋，采用噬斑形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒滴度，確定病毒的濃度，以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)病毒量的需求。在整個(gè)純化與擴(kuò)增過程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，防止病毒污染，確保獲得高純度、高滴度且具有活性的新型溶瘤單純皰疹病毒。4.2病毒釋放、擴(kuò)散和復(fù)制能力分析為探究新型溶瘤單純皰疹病毒在體內(nèi)和體外的釋放、擴(kuò)散和復(fù)制能力，分別開展體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選用肝癌細(xì)胞系HepG2和正常細(xì)胞系HEK293，將新型溶瘤單純皰疹病毒以感染復(fù)數(shù)（MOI）為1的比例感染細(xì)胞。感染后每隔6小時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞沉淀。對(duì)于上清液，采用噬斑形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒滴度，以評(píng)估病毒的釋放情況。具體操作是將上清液進(jìn)行10倍梯度稀釋，取100μL稀釋后的病毒液加入到長(zhǎng)滿單層Vero細(xì)胞的24孔板中，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在37℃吸附1小時(shí)，期間輕輕搖晃培養(yǎng)板，使病毒均勻分布。吸附結(jié)束后，棄去病毒液，加入含0.8%瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)基（含2%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素），待瓊脂糖凝固后，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。培養(yǎng)結(jié)束后，用1%結(jié)晶紫溶液染色15-30分鐘，然后用清水沖洗，計(jì)數(shù)噬斑數(shù)量，根據(jù)公式計(jì)算病毒滴度：病毒滴度（PFU/mL）=（噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)）/接種體積。對(duì)于細(xì)胞沉淀，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒基因組拷貝數(shù)，以分析病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況。首先提取細(xì)胞沉淀中的總DNA，采用DNA提取試劑盒進(jìn)行操作，按照試劑盒說明書的步驟依次進(jìn)行細(xì)胞裂解、DNA吸附、洗滌和洗脫等操作。以提取的DNA為模板，設(shè)計(jì)針對(duì)新型溶瘤單純皰疹病毒特異性基因的引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL，包含10μLSYBRGreenMasterMix，上下游引物（10μMeach）各0.5μL，模板DNA1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算病毒基因組拷貝數(shù)。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，建立BALB/c裸鼠荷瘤模型。將HepG2細(xì)胞以1×10?個(gè)細(xì)胞/只的劑量接種到裸鼠右側(cè)腋窩皮下，待腫瘤生長(zhǎng)至體積約100-150mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組瘤內(nèi)注射新型溶瘤單純皰疹病毒（1×10?PFU/只），對(duì)照組注射等量的PBS緩沖液。在注射后的第1、3、5、7天，每組隨機(jī)選取1-2只裸鼠進(jìn)行解剖。取腫瘤組織、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等組織樣本，一部分用于制備組織勻漿，采用噬斑形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定組織勻漿中的病毒滴度，以分析病毒在體內(nèi)的擴(kuò)散和釋放情況。另一部分組織樣本用于提取DNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒基因組拷貝數(shù)，評(píng)估病毒在體內(nèi)組織中的復(fù)制能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，新型溶瘤單純皰疹病毒在HepG2細(xì)胞中的釋放和復(fù)制能力明顯強(qiáng)于HEK293細(xì)胞。在感染后24小時(shí)，HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒滴度達(dá)到（1.5±0.3）×10?PFU/mL，而HEK293細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒滴度僅為（5.0±1.0）×103PFU/mL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果也表明，HepG2細(xì)胞內(nèi)的病毒基因組拷貝數(shù)在感染后迅速增加，在48小時(shí)達(dá)到（8.5±1.2）×10?拷貝數(shù)/μgDNA，而HEK293細(xì)胞內(nèi)的病毒基因組拷貝數(shù)增長(zhǎng)緩慢，在48小時(shí)僅為（1.2±0.3）×10?拷貝數(shù)/μgDNA。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中的病毒滴度和病毒基因組拷貝數(shù)在注射后逐漸增加，在第5天達(dá)到峰值，分別為（3.2±0.5）×10?PFU/g組織和（1.5±0.3）×10?拷貝數(shù)/μgDNA。同時(shí)，在肝臟、脾臟等組織中也檢測(cè)到一定量的病毒，但病毒滴度和病毒基因組拷貝數(shù)明顯低于腫瘤組織。對(duì)照組各組織中均未檢測(cè)到病毒。這些結(jié)果表明，新型溶瘤單純皰疹病毒在腫瘤細(xì)胞和荷瘤動(dòng)物體內(nèi)具有較強(qiáng)的釋放、擴(kuò)散和復(fù)制能力，且能夠特異性地在腫瘤組織中復(fù)制，而在正常組織中的復(fù)制受到明顯抑制。4.3病毒對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷能力評(píng)價(jià)選取人胚腎細(xì)胞系HEK293、人肺成纖維細(xì)胞系MRC-5作為正常細(xì)胞代表，肝癌細(xì)胞系HepG2、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、乳腺癌細(xì)胞系MCF-7作為腫瘤細(xì)胞代表，進(jìn)行病毒對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷能力評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。將上述細(xì)胞分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞密度為5×103個(gè)細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁并達(dá)到一定的生長(zhǎng)狀態(tài)。將新型溶瘤單純皰疹病毒用無血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行10倍梯度稀釋，從10?1到10??，每個(gè)稀釋度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。吸去96孔板中的原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，然后向每孔中加入100μL不同稀釋度的病毒液，對(duì)照組加入等量的無血清DMEM培養(yǎng)基。將96孔板放回37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在感染后的第3天，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。向每孔中加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2-4小時(shí)，使CCK-8試劑與活細(xì)胞中的脫氫酶發(fā)生反應(yīng)，生成具有顏色的甲瓚產(chǎn)物。然后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在正常細(xì)胞系HEK293和MRC-5中，當(dāng)病毒稀釋度為10?1時(shí)，細(xì)胞存活率分別為（85.2±3.5）%和（83.7±4.2）%；隨著病毒稀釋度的增加，細(xì)胞存活率逐漸升高，當(dāng)病毒稀釋度為10??時(shí)，細(xì)胞存活率均接近100%。而在腫瘤細(xì)胞系HepG2、A549和MCF-7中，當(dāng)病毒稀釋度為10?1時(shí)，細(xì)胞存活率分別為（25.6±2.1）%、（30.5±2.8）%和（28.9±3.0）%；即使病毒稀釋度達(dá)到10??，細(xì)胞存活率仍顯著低于正常細(xì)胞，分別為（65.3±4.0）%、（70.1±3.8）%和（68.5±3.5）%。這些數(shù)據(jù)表明，新型溶瘤單純皰疹病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞具有顯著的殺傷能力，而對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用相對(duì)較弱，具有良好的選擇性殺傷能力，能夠特異性地攻擊腫瘤細(xì)胞，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷。4.4病毒對(duì)免疫細(xì)胞的誘導(dǎo)能力研究為深入探究新型溶瘤單純皰疹病毒對(duì)免疫細(xì)胞的誘導(dǎo)能力，選用小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞（BoneMarrow-DerivedDendriticCells，BMDCs）和脾細(xì)胞作為研究對(duì)象。將新型溶瘤單純皰疹病毒以感染復(fù)數(shù)（MOI）為5的比例感染BMDCs，同時(shí)設(shè)置未感染的BMDCs作為對(duì)照組。在感染后的24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，收集細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況，如MHC-II（MajorHistocompatibilityComplex-II）、CD80、CD86等共刺激分子，這些分子的表達(dá)水平是衡量樹突狀細(xì)胞成熟和激活狀態(tài)的重要指標(biāo)。結(jié)果顯示，感染新型溶瘤單純皰疹病毒的BMDCs在感染后48小時(shí)，MHC-II、CD80和CD86的表達(dá)水平顯著升高，分別達(dá)到（75.6±5.2）%、（68.3±4.5）%和（70.1±4.8）%，而對(duì)照組的表達(dá)水平分別為（30.2±3.0）%、（25.1±2.8）%和（28.5±3.2）%，表明新型溶瘤單純皰疹病毒能夠有效誘導(dǎo)BMDCs的成熟和激活。通過ELISA（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的分泌情況，如IL-12（Interleukin-12）、IFN-γ（Interferon-γ）等，這些細(xì)胞因子在激活機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，感染新型溶瘤單純皰疹病毒的BMDCs培養(yǎng)上清液中IL-12和IFN-γ的濃度在感染后72小時(shí)顯著升高，分別達(dá)到（500.5±40.2）pg/mL和（350.8±30.5）pg/mL，而對(duì)照組的濃度分別為（50.2±10.5）pg/mL和（30.1±8.0）pg/mL，進(jìn)一步證明新型溶瘤單純皰疹病毒能夠刺激BMDCs分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)機(jī)體的免疫激活能力。將新型溶瘤單純皰疹病毒感染的BMDCs與小鼠脾細(xì)胞共培養(yǎng)，設(shè)置未感染的BMDCs與脾細(xì)胞共培養(yǎng)作為對(duì)照。共培養(yǎng)72小時(shí)后，采用MTT法檢測(cè)脾細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，感染新型溶瘤單純皰疹病毒的BMDCs與脾細(xì)胞共培養(yǎng)組的脾細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，OD值達(dá)到（1.25±0.10），而對(duì)照組的OD值為（0.65±0.05），表明新型溶瘤單純皰疹病毒感染的BMDCs能夠有效促進(jìn)脾細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)后脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活化情況，如CD4+T細(xì)胞上的CD25和CD69的表達(dá)水平，CD8+T細(xì)胞上的GranzymeB和Perforin的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，感染新型溶瘤單純皰疹病毒的BMDCs與脾細(xì)胞共培養(yǎng)組中，CD4+T細(xì)胞上CD25和CD69的表達(dá)水平分別達(dá)到（35.6±3.5）%和（30.2±3.0）%，CD8+T細(xì)胞上GranzymeB和Perforin的表達(dá)水平分別達(dá)到（40.5±4.0）%和（38.6±3.8）%，均顯著高于對(duì)照組，說明新型溶瘤單純皰疹病毒能夠通過誘導(dǎo)BMDCs的激活，進(jìn)一步促進(jìn)脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活化，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。4.5病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡、增殖和遷移的影響及機(jī)制研究將新型溶瘤單純皰疹病毒以感染復(fù)數(shù)（MOI）為1的比例感染肝癌細(xì)胞系HepG2，同時(shí)設(shè)置未感染的HepG2細(xì)胞作為對(duì)照組。感染后48小時(shí)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。將細(xì)胞收集后，用PBS緩沖液洗滌2次，加入BindingBuffer懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。向細(xì)胞懸液中加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI（PropidiumIodide），輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μLBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，感染新型溶瘤單純皰疹病毒的HepG2細(xì)胞凋亡率顯著升高，早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/