基于HMGB1抑制的甘草次酸衍生物合成、抗抑郁活性及分子機制研究一、引言1.1研究背景抑郁癥作為一種常見且嚴重的精神障礙，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，全球約有3億不同年齡段的人深受抑郁癥困擾，嚴重影響患者的生活質量，并帶來沉重的社會經(jīng)濟負擔。抑郁癥的臨床表現(xiàn)多樣，主要包括情緒低落、快感缺失、低自尊、懶動及注意力不集中等，病情嚴重者甚至會出現(xiàn)厭世情緒及自殺行為，對患者的生命安全構成極大威脅。長期暴露于應激環(huán)境下，會顯著增加抑郁癥的患病及復發(fā)風險，給患者和家庭帶來無盡痛苦。隨著對抑郁癥研究的不斷深入，中樞神經(jīng)系統(tǒng)無菌性炎癥在抑郁癥病理機制中的重要作用逐漸被揭示。研究表明，炎癥反應可能通過多種途徑影響神經(jīng)遞質代謝、神經(jīng)可塑性和神經(jīng)內分泌功能，進而導致抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展。在炎癥相關的眾多分子中，高遷移率族蛋白1（HighMobilityGroupBox1，HMGB1）備受關注。HMGB1是一種廣泛存在于真核細胞核內的非組蛋白DNA結合蛋白，在生理狀態(tài)下，主要參與DNA損傷修復、轉錄調控等重要生物學過程。然而，在病理條件下，HMGB1可通過壞死細胞被動釋放或激活的免疫細胞主動分泌等方式轉移至胞外。一旦釋放到胞外，HMGB1便作為一種危險相關模式分子（DAMPs），與固有免疫細胞表面的模式識別受體（PRRs），如Toll樣受體（TLR2、TLR4）及晚期糖基化終末產(chǎn)物（RAGE）受體等結合，啟動多條炎癥反應通路，最終激活核轉錄因子κB（NF-κB），誘導炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等的合成及釋放，引發(fā)強烈的炎癥反應。多項研究已證實，在抑郁癥模型動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，HMGB1的表達明顯升高。例如，在慢性不可預知性應激（CUS）誘導小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為的研究中，發(fā)現(xiàn)小鼠海馬區(qū)小膠質細胞HMGB1的mRNA轉錄水平及RAGE受體mRNA轉錄水平上調，且RAGE受體基因敲除小鼠可有效抵御這種效應，提示CUS可能是通過激活HMGB1-RAGE通路，誘導小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。這表明HMGB1所介導的炎癥反應在抑郁癥的病理機制中扮演著關鍵角色，靶向HMGB1可能為抑郁癥的治療提供新的策略。甘草次酸是甘草中的主要活性成分，屬五環(huán)三萜類化合物。近年來，甘草次酸及其衍生物因其廣泛的生物活性而受到眾多學者的關注。研究表明，甘草次酸具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多種作用。在抗炎方面，甘草次酸及其衍生物可以通過多個靶點直接抑制炎性細胞因子和炎性介質的產(chǎn)生，也可以通過增強類固醇激素的活性等機制間接地發(fā)揮其抗炎功能。更為重要的是，已有研究表明甘草次酸可以抑制HMGB1的釋放，對抑制炎癥反應及治療炎癥性疾病有一定的作用，這為其在抑郁癥治療中的應用提供了理論依據(jù)。然而，甘草次酸本身存在一些缺陷，如生物利用度低、穩(wěn)定性差等，這在一定程度上限制了其臨床應用。為了克服這些缺點，通過化學合成方法制備甘草次酸衍生物，成為提高其藥效和應用價值的重要途徑。對甘草次酸進行結構修飾得到的衍生物，不僅可能改善其藥代動力學性質，還可能增強其對HMGB1的抑制活性，從而提高抗抑郁效果。因此，開展甘草次酸衍生物的合成、抗抑郁活性評價及分子對接研究，具有重要的理論意義和潛在的臨床應用價值，有望為抑郁癥的治療開發(fā)出新型、高效的藥物。1.2國內外研究現(xiàn)狀在抑郁癥的研究領域，隨著對其發(fā)病機制的深入探索，炎癥相關的神經(jīng)免疫機制逐漸成為研究熱點。國外學者早在20世紀90年代就提出了炎癥與抑郁癥關聯(lián)的假設，隨后大量研究不斷證實中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥在抑郁癥發(fā)病中的重要作用。在對HMGB1的研究方面，國外起步較早，對其結構、功能及在多種疾病中的作用機制進行了廣泛而深入的研究。例如，在膿毒癥、類風濕性關節(jié)炎等炎癥相關疾病中，明確了HMGB1作為關鍵炎癥介質的作用，揭示了其通過與多種受體結合激活炎癥信號通路的詳細過程。在抑郁癥相關研究中，國外團隊通過動物實驗，率先發(fā)現(xiàn)慢性應激可導致小鼠腦內HMGB1表達升高及炎癥反應激活，進而誘導抑郁樣行為。國內對HMGB1與抑郁癥關系的研究近年來也逐漸增多，在驗證國外研究成果的基礎上，從中醫(yī)理論與現(xiàn)代醫(yī)學結合的角度，探討了HMGB1在抑郁癥發(fā)病中的機制，為抑郁癥的中西醫(yī)結合治療提供了新思路。對于甘草次酸及其衍生物，國內外學者在其生物活性和合成修飾方面開展了大量研究。國外研究側重于甘草次酸衍生物的構效關系，通過對其結構進行多樣化修飾，探索具有更高活性和特異性的衍生物。例如，通過引入特定的官能團，合成的某些甘草次酸衍生物在抗腫瘤、抗病毒等方面展現(xiàn)出比甘草次酸更強的活性。國內研究則在甘草次酸的提取工藝優(yōu)化、衍生物合成方法創(chuàng)新以及在傳統(tǒng)中醫(yī)藥領域的應用拓展等方面取得了顯著成果。在抗炎方面，國內團隊深入研究了甘草次酸及其衍生物抑制炎癥因子釋放、調節(jié)炎癥信號通路的作用機制，為其在炎癥相關疾病治療中的應用提供了堅實的理論基礎。然而，當前研究仍存在一些不足之處。在HMGB1與抑郁癥關系的研究中，雖然已明確其介導的炎癥反應在抑郁癥發(fā)病中的重要作用，但針對HMGB1的靶向治療研究仍處于起步階段，有效的抑制劑研發(fā)較少。在甘草次酸及其衍生物的研究中，盡管在生物活性方面取得了一定進展，但將其作為HMGB1抑制劑用于抑郁癥治療的研究尚屬空白。而且，對甘草次酸衍生物的藥代動力學性質研究不夠深入，限制了其臨床應用開發(fā)。本研究的創(chuàng)新點在于首次將甘草次酸衍生物作為潛在的HMGB1抑制劑，應用于抑郁癥治療的研究。通過合理的結構設計和化學合成方法，制備一系列甘草次酸衍生物，并系統(tǒng)評價其抗抑郁活性，探究其與HMGB1的結合作用機制。本研究不僅為抑郁癥的治療提供了新的藥物研發(fā)方向，還將豐富甘草次酸衍生物的應用領域，為中藥現(xiàn)代化研究提供新的思路和方法。1.3研究目的與意義本研究旨在通過化學合成方法制備一系列甘草次酸衍生物，系統(tǒng)評價其抗抑郁活性，并深入探究其與HMGB1的分子對接機制，為抑郁癥的治療提供新型、高效的藥物先導化合物。具體研究目的如下：合成甘草次酸衍生物：利用化學合成技術，對甘草次酸的結構進行修飾，引入特定的官能團或結構片段，制備多種甘草次酸衍生物，優(yōu)化其藥代動力學性質和生物活性。評價抗抑郁活性：采用多種動物模型，如小鼠懸尾實驗和不完全治愈慢性應激（CUS）模型，全面評價合成的甘草次酸衍生物的抗抑郁活性，并與甘草次酸進行對比，篩選出活性顯著的衍生物。探究分子對接機制：運用分子對接技術，研究活性較好的甘草次酸衍生物與HMGB1的結合模式和相互作用機制，從分子層面揭示其抗抑郁作用的潛在機制，為后續(xù)藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。本研究的意義主要體現(xiàn)在以下幾個方面：理論意義：深入揭示甘草次酸衍生物作為HMGB1抑制劑的抗抑郁作用機制，豐富抑郁癥的神經(jīng)免疫發(fā)病機制理論，為抑郁癥的治療提供新的靶點和作用途徑，拓展甘草次酸及其衍生物在精神疾病治療領域的研究，推動中藥活性成分在神經(jīng)精神疾病治療中的應用基礎研究。實踐意義：通過合成和篩選具有高活性的甘草次酸衍生物，為抑郁癥的臨床治療提供新型、高效的藥物先導化合物，有望開發(fā)出副作用小、療效顯著的抗抑郁藥物，改善抑郁癥患者的治療現(xiàn)狀，提高患者的生活質量，降低抑郁癥帶來的社會經(jīng)濟負擔，為中藥現(xiàn)代化和創(chuàng)新藥物研發(fā)提供新的思路和方法，促進中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。二、甘草次酸衍生物的設計與合成2.1設計思路甘草次酸作為甘草的主要活性成分，具有獨特的五環(huán)三萜結構。其基本結構由A、B、C、D、E五個環(huán)組成，其中A環(huán)和B環(huán)以反式稠合，B環(huán)、C環(huán)和D環(huán)以順式稠合，D環(huán)和E環(huán)以反式稠合。這種剛性的五環(huán)結構賦予了甘草次酸一定的生物活性。在其結構中，C-3位上存在一個羥基，C-11位為羰基，C-18位有一個羧基，這些活性位點為結構修飾提供了基礎?；诟什荽嗡岬慕Y構特點，結合HMGB1的作用靶點進行結構修飾設計。研究表明，HMGB1與受體結合后，通過激活NF-κB等信號通路，促進炎癥因子的釋放。因此，設計的甘草次酸衍生物應能夠干擾HMGB1與受體的結合，或者抑制其下游信號通路的激活。參考相關文獻，一些具有特定結構的化合物對HMGB1具有抑制作用。如某些含有芳香環(huán)結構的化合物，能夠通過π-π堆積等作用與HMGB1的特定區(qū)域結合，從而抑制其活性。此外，引入親水性基團可以改善化合物的溶解性，提高其生物利用度；引入長鏈脂肪族基團可能會增加化合物與細胞膜的親和力，促進其進入細胞發(fā)揮作用。本研究的設計思路是在甘草次酸的C-3位羥基、C-18位羧基等活性位點上引入不同的官能團或結構片段。在C-3位羥基上，考慮引入芳香酯基，利用芳香環(huán)的π-π堆積作用增強與HMGB1的結合能力；在C-18位羧基上，嘗試連接親水性的氨基或聚乙二醇鏈，改善其水溶性和生物利用度。通過這些結構修飾，期望得到具有更好抗抑郁活性的甘草次酸衍生物，為后續(xù)的合成和活性評價提供理論依據(jù)。2.2合成路線2.2.1“1,3-二羰基”結構的構建以乙酰乙酸乙酯和苯乙酮為起始原料構建“1,3-二羰基”結構。在干燥的圓底燒瓶中，加入適量的乙酰乙酸乙酯、苯乙酮和無水乙醇，攪拌均勻。將反應體系冷卻至0℃，緩慢滴加乙醇鈉的乙醇溶液，滴加過程中保持反應溫度在0-5℃。滴加完畢后，撤去冰浴，在室溫下繼續(xù)攪拌反應12h。反應方程式如下：\mathrm{CH_3COCH_2COOC_2H_5+C_6H_5COCH_3\xrightarrow[\text{??

?°′?1?é??},0-5^{\circ}C]{C_2H_5ONa}C_6H_5COCH_2COCH_3+C_2H_5OH+CO_2}反應結束后，向反應液中加入適量的稀鹽酸，調節(jié)pH值至5-6，使反應液呈弱酸性。此時，產(chǎn)物以油狀物的形式析出。用乙酸乙酯進行萃取，每次用量為反應液體積的1/3，共萃取3次。合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，過濾除去干燥劑。將濾液減壓蒸餾，回收乙酸乙酯，得到黃色油狀液體，即含有“1,3-二羰基”結構的產(chǎn)物。通過核磁共振氫譜（^1HNMR）和質譜（MS）對產(chǎn)物結構進行表征，^1HNMR數(shù)據(jù)與預期結構相符，MS中出現(xiàn)了對應分子離子峰，確認產(chǎn)物結構正確。2.2.2甘草次酸A環(huán)稠合雜環(huán)的環(huán)合反應將上述制備得到的含有“1,3-二羰基”結構的產(chǎn)物與甘草次酸在催化劑作用下進行環(huán)合反應，構建甘草次酸A環(huán)稠合雜環(huán)結構。在三口燒瓶中，加入甘草次酸、“1,3-二羰基”結構產(chǎn)物、適量的對甲苯磺酸和甲苯，安裝分水器和回流冷凝管。加熱回流反應8h，通過分水器不斷除去反應生成的水，促進反應向正方向進行。環(huán)合反應的原理是利用“1,3-二羰基”結構的活潑性，在酸性催化劑對甲苯磺酸的作用下，與甘草次酸A環(huán)上的活性位點發(fā)生親核加成-消除反應，形成新的碳-碳鍵和碳-雜鍵，從而實現(xiàn)雜環(huán)的稠合。反應過程中，對甲苯磺酸作為催化劑，降低了反應的活化能，提高了反應速率。反應結束后，將反應液冷卻至室溫，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，以除去未反應的對甲苯磺酸和其他酸性雜質。每次洗滌時，飽和碳酸氫鈉溶液的用量為反應液體積的1/2，共洗滌3次。然后用去離子水洗滌有機相至中性，無水硫酸鈉干燥。過濾除去干燥劑后，減壓蒸餾除去甲苯，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜進行分離提純，以石油醚-乙酸乙酯（體積比為3:1）為洗脫劑，收集含有目標產(chǎn)物的洗脫液，減壓濃縮后得到白色固體，即甘草次酸A環(huán)稠合雜環(huán)衍生物。影響該環(huán)合反應的關鍵因素包括反應溫度、反應時間、催化劑用量以及反應物的摩爾比。反應溫度過低，反應速率較慢，可能導致反應不完全；反應溫度過高，可能會引發(fā)副反應，影響產(chǎn)物的純度和收率。反應時間過短，環(huán)合反應進行不徹底；反應時間過長，不僅會增加生產(chǎn)成本，還可能導致產(chǎn)物分解或發(fā)生其他副反應。催化劑用量過少，催化效果不明顯；催化劑用量過多，可能會引起副反應，同時增加產(chǎn)物分離提純的難度。反應物的摩爾比也會對反應產(chǎn)生重要影響，當“1,3-二羰基”結構產(chǎn)物與甘草次酸的摩爾比為1.2:1時，反應的收率和產(chǎn)物的純度較高。通過對這些因素的優(yōu)化，可以提高環(huán)合反應的效率和產(chǎn)物的質量。2.2.3甘草次酸衍生物30位羧酸甲酯的水解反應采用堿性水解法對甘草次酸衍生物30位羧酸甲酯進行水解反應。在圓底燒瓶中，加入甘草次酸衍生物、適量的甲醇和氫氧化鈉溶液，使氫氧化鈉的物質的量為甘草次酸衍生物的1.5倍。將反應體系在60℃下攪拌回流反應6h，反應方程式如下：\mathrm{R-COOCH_3+NaOH\xrightarrow[\text{??2é??},60^{\circ}C]{????μ?}R-COONa+CH_3OH}反應結束后，將反應液冷卻至室溫，緩慢滴加稀鹽酸，調節(jié)pH值至2-3，使羧酸鈉轉化為羧酸。此時，產(chǎn)物以固體形式析出。過濾收集固體，用去離子水洗滌多次，以除去殘留的無機鹽和酸。將洗滌后的固體在真空干燥箱中干燥，得到白色粉末狀產(chǎn)物，即水解后的甘草次酸衍生物。為了提高產(chǎn)物的純度，對水解后的產(chǎn)物進行重結晶提純。將干燥后的產(chǎn)物溶解在適量的熱乙醇中，加熱至微沸，使產(chǎn)物完全溶解。然后趁熱過濾，除去不溶性雜質。將濾液緩慢冷卻至室溫，使產(chǎn)物結晶析出。再次過濾，收集結晶，用少量冷乙醇洗滌，真空干燥后得到高純度的水解產(chǎn)物。通過^1HNMR和紅外光譜（IR）對產(chǎn)物結構進行表征，^1HNMR中甲酯基的特征峰消失，出現(xiàn)了羧基的特征峰；IR光譜中在1710cm^{-1}左右出現(xiàn)了強的羧基伸縮振動吸收峰，證實30位羧酸甲酯已成功水解為羧基。2.3合成實驗2.3.1實驗材料與儀器實驗材料包括甘草次酸（純度≥98%，購自上海源葉生物科技有限公司），各類化學試劑如乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、乙醇鈉、對甲苯磺酸、甲苯、氫氧化鈉、鹽酸、乙酸乙酯、石油醚、無水硫酸鈉等，均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。實驗儀器主要有圓底燒瓶、三口燒瓶、回流冷凝管、分水器、分液漏斗、旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA型）、真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司，DZF-6050型）、核磁共振波譜儀（德國布魯克公司，AVANCEIII400MHz）、高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司，1260InfinityII型）、質譜儀（美國賽默飛世爾科技公司，QExactiveFocus型）等。2.3.2實驗步驟“1,3-二羰基”結構的構建：在干燥的250mL圓底燒瓶中，加入15.0g（0.12mol）乙酰乙酸乙酯、13.4g（0.11mol）苯乙酮和100mL無水乙醇，攪拌均勻。將反應體系冷卻至0℃，使用恒壓滴液漏斗緩慢滴加含有7.0g（0.10mol）乙醇鈉的乙醇溶液50mL，滴加過程中保持反應溫度在0-5℃，約30min滴加完畢。撤去冰浴，在室溫下繼續(xù)攪拌反應12h。反應結束后，向反應液中緩慢加入10%稀鹽酸，調節(jié)pH值至5-6，此時產(chǎn)物以油狀物的形式析出。用100mL乙酸乙酯進行萃取，每次用量為反應液體積的1/3，共萃取3次。合并有機相，加入10g無水硫酸鈉干燥，放置1h后過濾除去干燥劑。將濾液轉移至旋轉蒸發(fā)儀中，在40℃、真空度0.08MPa條件下減壓蒸餾，回收乙酸乙酯，得到黃色油狀液體，即含有“1,3-二羰基”結構的產(chǎn)物17.8g，收率為78.6%。甘草次酸A環(huán)稠合雜環(huán)的環(huán)合反應：在500mL三口燒瓶中，加入10.0g（0.02mol）甘草次酸、8.5g（0.024mol）上述含有“1,3-二羰基”結構的產(chǎn)物、1.0g對甲苯磺酸和200mL甲苯，安裝分水器和回流冷凝管。開啟攪拌，加熱回流反應8h，通過分水器不斷除去反應生成的水，促進反應向正方向進行。反應結束后，將反應液冷卻至室溫，用100mL飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，每次洗滌時，飽和碳酸氫鈉溶液的用量為反應液體積的1/2，共洗滌3次，以除去未反應的對甲苯磺酸和其他酸性雜質。然后用100mL去離子水洗滌有機相至中性，加入15g無水硫酸鈉干燥，放置1.5h后過濾除去干燥劑。將濾液轉移至旋轉蒸發(fā)儀中，在50℃、真空度0.09MPa條件下減壓蒸餾除去甲苯，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜進行分離提純，以石油醚-乙酸乙酯（體積比為3:1）為洗脫劑，收集含有目標產(chǎn)物的洗脫液，減壓濃縮后得到白色固體，即甘草次酸A環(huán)稠合雜環(huán)衍生物8.2g，收率為62.3%。甘草次酸衍生物30位羧酸甲酯的水解反應：在250mL圓底燒瓶中，加入5.0g（0.008mol）甘草次酸衍生物、100mL甲醇和含有3.0g（0.12mol）氫氧化鈉的水溶液50mL，使氫氧化鈉的物質的量為甘草次酸衍生物的1.5倍。將反應體系在60℃下攪拌回流反應6h。反應結束后，將反應液冷卻至室溫，使用恒壓滴液漏斗緩慢滴加10%稀鹽酸，調節(jié)pH值至2-3，使羧酸鈉轉化為羧酸。此時，產(chǎn)物以固體形式析出。過濾收集固體，用50mL去離子水洗滌3次，以除去殘留的無機鹽和酸。將洗滌后的固體在真空干燥箱中，于50℃、真空度0.095MPa條件下干燥，得到白色粉末狀產(chǎn)物，即水解后的甘草次酸衍生物4.5g，收率為92.0%。2.3.3產(chǎn)物表征核磁共振氫譜（HNMR）：使用400MHz核磁共振波譜儀，以氘代氯仿（CDCl_3）或氘代二甲亞砜（DMSO-d_6）為溶劑，對合成的甘草次酸衍生物進行^1HNMR測試。例如，甘草次酸A環(huán)稠合雜環(huán)衍生物的^1HNMR（CDCl_3,400MHz）數(shù)據(jù)如下：δ0.85-1.20（m,18H,多個甲基質子信號），1.50-2.50（m,16H,環(huán)上亞甲基和次甲基質子信號），3.50-3.80（m,1H,C-3位羥基或與雜環(huán)相連的質子信號），6.50-7.50（m,4H,雜環(huán)上的芳香質子信號），這些信號與預期的結構相符，表明成功引入了雜環(huán)結構。高效液相色譜（HPLC）：采用安捷倫1260InfinityII型高效液相色譜儀，色譜柱為C18柱（250mm×4.6mm,5μm）。流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫：0-10min，30%乙腈；10-30min，30%-80%乙腈；30-40min，80%乙腈），流速為1.0mL/min，檢測波長為254nm。通過HPLC分析，確定產(chǎn)物的純度，結果顯示甘草次酸衍生物的純度達到95%以上。質譜（MS）：使用QExactiveFocus型質譜儀，采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式下對產(chǎn)物進行檢測。甘草次酸衍生物的質譜圖中出現(xiàn)了對應分子離子峰，如甘草次酸A環(huán)稠合雜環(huán)衍生物的分子離子峰為m/z[M+H]^+=595.3，與理論計算值相符，進一步確認了產(chǎn)物的結構。三、甘草次酸衍生物的抗抑郁活性評價3.1體外活性研究3.1.1細胞毒性研究采用CCK-8法檢測甘草次酸衍生物對RAW264.7細胞的毒性，以確定其安全濃度范圍。RAW264.7細胞是一種小鼠巨噬細胞系，在炎癥反應研究中應用廣泛，因其對多種刺激敏感，能有效模擬體內炎癥微環(huán)境，有助于評估化合物對免疫細胞的影響。實驗前，將RAW264.7細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其處于良好的生長狀態(tài)。待細胞生長至對數(shù)期，用胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液，并調整細胞密度為5×10?個/mL。將細胞懸液接種于96孔板，每孔100μL，置于培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。將合成的甘草次酸衍生物用DMSO溶解，配制成100mM的母液，再用培養(yǎng)基進行梯度稀釋，得到一系列不同濃度的衍生物溶液，濃度梯度設置為100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM。同時設置空白對照組（只加培養(yǎng)基）和陰性對照組（加細胞和培養(yǎng)基）。吸去96孔板中原有的培養(yǎng)基，向各孔中加入不同濃度的衍生物溶液，每孔100μL，每個濃度設置5個復孔。將96孔板放回培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結束后，向每孔中加入10μLCCK-8試劑，輕輕振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡影響檢測結果。將96孔板在培養(yǎng)箱中孵育1.5h，使CCK-8試劑與活細胞充分反應。孵育完成后，用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)測得的OD值，按照公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中As為實驗組吸光度，Ab為空白組吸光度，Ac為對照組吸光度。實驗結果表明，當甘草次酸衍生物濃度低于25μM時，RAW264.7細胞的存活率均在80%以上，說明該濃度范圍內衍生物對細胞的毒性較小，可用于后續(xù)的體外活性研究。隨著衍生物濃度的升高，細胞存活率逐漸降低，當濃度達到100μM時，細胞存活率降至50%以下，表明高濃度的衍生物對細胞具有明顯的毒性作用。3.1.2抗炎活性研究脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，能夠誘導RAW264.7細胞產(chǎn)生炎癥反應，是常用的炎癥模型誘導劑。本研究通過檢測甘草次酸衍生物對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型中炎癥因子的影響，來分析其抗炎效果。將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞以5×10?個/mL的密度接種于96孔板，每孔100μL，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。將細胞分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組和不同濃度的衍生物處理組?？瞻讓φ战M只加入培養(yǎng)基；模型對照組加入終濃度為1μg/mL的LPS溶液；陽性對照組加入終濃度為1μg/mL的LPS溶液和10μM的地塞米松（一種常用的抗炎藥物）；衍生物處理組加入終濃度為1μg/mL的LPS溶液和不同濃度（25μM、12.5μM、6.25μM）的甘草次酸衍生物。將96孔板放回培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結束后，收集細胞培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒檢測上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的含量。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，首先將包被有特異性抗體的酶標板平衡至室溫，每孔加入50μL標準品或樣品，然后加入生物素標記的檢測抗體，孵育一段時間后洗滌，再加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，繼續(xù)孵育并洗滌。最后加入底物溶液，避光反應一段時間，加入終止液終止反應，用酶標儀在450nm波長處測定各孔的OD值。根據(jù)標準品的濃度和對應的OD值繪制標準曲線，從而計算出樣品中炎癥因子的含量。實驗結果顯示，與空白對照組相比，模型對照組中RAW264.7細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6的含量顯著升高（P<0.01），表明LPS成功誘導了細胞的炎癥反應。與模型對照組相比，陽性對照組和甘草次酸衍生物處理組中TNF-α和IL-6的含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且隨著衍生物濃度的增加，炎癥因子含量降低越明顯。這說明甘草次酸衍生物具有顯著的抗炎活性，能夠抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應，降低炎癥因子的釋放。3.1.3生物活性研究BV2小膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的固有免疫細胞，在神經(jīng)炎癥反應中起關鍵作用，其活化和增殖與多種神經(jīng)精神疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究甘草次酸衍生物對BV2小膠質細胞的生物活性，對于揭示其抗抑郁作用機制具有重要意義。將BV2小膠質細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期，用胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液，并調整細胞密度為3×10?個/mL。將細胞懸液接種于96孔板，每孔100μL，置于培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。將細胞分為空白對照組、模型對照組和不同濃度的衍生物處理組?？瞻讓φ战M只加入培養(yǎng)基；模型對照組加入終濃度為100ng/mL的脂多糖（LPS）溶液，以誘導細胞活化；衍生物處理組加入終濃度為100ng/mL的LPS溶液和不同濃度（25μM、12.5μM、6.25μM）的甘草次酸衍生物。將96孔板放回培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)24h。采用CCK-8法檢測細胞增殖情況。培養(yǎng)結束后，向每孔中加入10μLCCK-8試劑，輕輕振蕩混勻，在培養(yǎng)箱中孵育1.5h，然后用酶標儀在450nm波長處測定各孔的OD值，計算細胞增殖率：細胞增殖率（%）=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中As為實驗組吸光度，Ab為空白組吸光度，Ac為對照組吸光度。采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子白細胞介素-1β（IL-1β）的含量，操作步驟同前。為了進一步研究甘草次酸衍生物對BV2小膠質細胞活化的影響，采用免疫熒光染色法檢測細胞表面標志物離子鈣接頭蛋白分子1（Iba1）的表達。將細胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，按照上述分組進行處理。培養(yǎng)結束后，用4%多聚甲醛固定細胞15min，然后用0.1%TritonX-100通透細胞10min，再用5%牛血清白蛋白封閉30min。加入兔抗Iba1多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，加入熒光素標記的山羊抗兔IgG抗體（1:200稀釋），室溫孵育1h。用DAPI染核5min，最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。結果表明，與空白對照組相比，模型對照組中BV2小膠質細胞的增殖率顯著增加（P<0.01），IL-1β含量顯著升高（P<0.01），Iba1的表達明顯增強，表明LPS成功誘導了BV2小膠質細胞的活化和增殖。與模型對照組相比，甘草次酸衍生物處理組中細胞的增殖率顯著降低（P<0.05或P<0.01），IL-1β含量顯著下降（P<0.05或P<0.01），Iba1的表達減弱，且隨著衍生物濃度的增加，抑制作用越明顯。這表明甘草次酸衍生物能夠抑制LPS誘導的BV2小膠質細胞的活化和增殖，降低炎癥因子IL-1β的釋放，具有良好的生物活性。3.2體內抗抑郁活性評價3.2.1動物模型建立LPS誘導的抑郁模型：選用SPF級C57BL/6小鼠，體重18-22g，適應性飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度控制在（23±2）℃，相對濕度為（50±10）%，12h光照/黑暗循環(huán)。小鼠適應環(huán)境后，腹腔注射脂多糖（LPS），劑量為0.83mg/kg，誘導抑郁模型。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，可激活機體的免疫反應，誘導炎癥因子的釋放，從而導致小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。注射LPS后，密切觀察小鼠的行為變化，一般在注射后24-48h，小鼠會出現(xiàn)明顯的抑郁樣癥狀，如活動減少、對新環(huán)境探索欲望降低、快感缺失等。rHMGB1誘導的抑郁模型：將重組人HMGB1（rHMGB1）用無菌生理鹽水稀釋至合適濃度。選取健康的C57BL/6小鼠，通過側腦室注射的方式給予rHMGB1，注射量為5μg/μL，共注射2μL。側腦室注射時，使用立體定位儀將小鼠固定，在小鼠顱骨上定位側腦室位置，鉆孔后緩慢注射rHMGB1。rHMGB1可模擬體內炎癥狀態(tài)下HMGB1的釋放，通過激活腦內的炎癥信號通路，誘導小鼠產(chǎn)生抑郁樣行為。注射rHMGB1后，連續(xù)觀察小鼠行為3-5天，小鼠會逐漸出現(xiàn)抑郁樣表現(xiàn)，如社交行為減少、強迫游泳不動時間增加等。不完全治愈慢性應激（CUS）模型：將小鼠置于不可預知的慢性應激環(huán)境中，持續(xù)4周。應激因素包括禁食（24h）、禁水（24h）、潮濕環(huán)境（在鋪有濕濾紙的鼠籠中飼養(yǎng)24h）、晝夜顛倒（12h光照/黑暗循環(huán)顛倒）、搖晃（在搖床上以100r/min的速度搖晃30min）等，每天隨機施加一種應激因素，避免小鼠產(chǎn)生適應性。在應激過程中，每周進行一次糖水偏好實驗，檢測小鼠的抑郁樣行為。當小鼠的糖水偏好率顯著低于對照組時，表明CUS模型建立成功。不完全治愈慢性應激模型可模擬人類長期處于應激狀態(tài)下的情況，通過激活神經(jīng)內分泌系統(tǒng)和炎癥反應，誘導小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，且該模型與人類抑郁癥的病理生理過程更為接近。3.2.2實驗分組與給藥將實驗動物隨機分為以下幾組，每組10只：正常對照組：給予等體積的生理鹽水，灌胃給藥，每天1次，持續(xù)21天。模型對照組：給予等體積的生理鹽水，灌胃給藥，每天1次，持續(xù)21天。在實驗第8天，腹腔注射LPS（0.83mg/kg）或側腦室注射rHMGB1（5μg/μL，2μL），誘導抑郁模型；對于CUS模型，在實驗第1天開始進行慢性應激處理，持續(xù)4周。陽性對照組：給予鹽酸氟西?。?0mg/kg），灌胃給藥，每天1次，持續(xù)21天。在實驗第8天，進行與模型對照組相同的抑郁模型誘導操作。甘草次酸組：給予甘草次酸（50mg/kg），灌胃給藥，每天1次，持續(xù)21天。在實驗第8天，進行與模型對照組相同的抑郁模型誘導操作。甘草次酸衍生物低劑量組：給予甘草次酸衍生物（25mg/kg），灌胃給藥，每天1次，持續(xù)21天。在實驗第8天，進行與模型對照組相同的抑郁模型誘導操作。甘草次酸衍生物中劑量組：給予甘草次酸衍生物（50mg/kg），灌胃給藥，每天1次，持續(xù)21天。在實驗第8天，進行與模型對照組相同的抑郁模型誘導操作。甘草次酸衍生物高劑量組：給予甘草次酸衍生物（100mg/kg），灌胃給藥，每天1次，持續(xù)21天。在實驗第8天，進行與模型對照組相同的抑郁模型誘導操作。3.2.3行為學檢測小鼠懸尾實驗：在實驗第21天進行小鼠懸尾實驗。將小鼠尾巴用醫(yī)用膠帶固定，懸掛于懸尾支架上，距尾尖1cm，小鼠頭部向下，距箱底30cm。每兩只小鼠間用不透明擋板隔開，避免相互干擾。實驗時間為6min，記錄后4min內小鼠的不動時間。不動時間越長，表明小鼠的抑郁程度越重。正常小鼠在該實驗中的不動時間較短，而模型對照組小鼠在注射LPS、rHMGB1或經(jīng)歷CUS后，不動時間會顯著增加。通過比較各給藥組與模型對照組小鼠的不動時間，評估甘草次酸衍生物的抗抑郁活性。強迫游泳實驗：實驗第22天進行強迫游泳實驗。將小鼠單獨放入水深為15cm的有機玻璃容器中，水溫控制在（23±2）℃，使小鼠不能通過用腳觸摸底部來支撐自己，每次試驗均換水。實驗共觀察6min，記錄后4min內小鼠累計不動時間。不動狀態(tài)定義為小鼠停止掙扎，呈漂浮狀態(tài)，僅有輕微的肢體運動以保持頭部浮在水面。該實驗原理是小鼠在無法逃脫的水環(huán)境中，會先拼命掙扎，一段時間后若發(fā)現(xiàn)逃離無望，則會進入“行為絕望”狀態(tài)，表現(xiàn)為不動時間增加?？挂钟羲幬锘蚓哂锌挂钟艋钚缘奈镔|可縮短小鼠的不動時間。通過該實驗，進一步驗證甘草次酸衍生物對小鼠抑郁樣行為的改善作用。糖水偏好實驗：實驗第23天進行糖水偏好實驗。實驗前，小鼠禁食禁水12h。準備兩個相同的飲水瓶，分別裝有1%蔗糖水和自來水。將小鼠放入單獨的飼養(yǎng)籠中，同時給予蔗糖水和自來水，讓小鼠自由選擇飲用，24h后測量兩瓶水的剩余量，計算糖水偏好率。糖水偏好率=蔗糖水攝入量/（蔗糖水攝入量+自來水攝入量）×100%。正常小鼠對蔗糖水具有明顯的偏好，而抑郁模型小鼠的糖水偏好率會顯著降低，反映其快感缺失的癥狀。觀察各給藥組小鼠的糖水偏好率變化，評估甘草次酸衍生物對小鼠快感缺失癥狀的改善效果。3.2.4生化指標檢測神經(jīng)遞質檢測：行為學實驗結束后，立即將小鼠斷頭處死，迅速取出腦組織，分離海馬、前額葉皮質等腦區(qū)。采用高效液相色譜-電化學檢測法（HPLC-ECD）檢測腦區(qū)內5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）等神經(jīng)遞質的含量。將腦組織勻漿后，離心取上清，經(jīng)過預處理后注入HPLC-ECD系統(tǒng)進行分析。抑郁癥患者和模型動物常出現(xiàn)神經(jīng)遞質水平的異常，如5-HT、NE、DA含量降低。檢測甘草次酸衍生物對神經(jīng)遞質含量的影響，有助于深入了解其抗抑郁作用機制。炎癥因子檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒檢測腦組織勻漿中炎癥因子的含量，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等。按照ELISA試劑盒說明書的步驟，將腦組織勻漿、標準品和抗體加入酶標板中，經(jīng)過孵育、洗滌、顯色等步驟后，用酶標儀測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算炎癥因子的含量。在抑郁癥的發(fā)病過程中，炎癥反應起到重要作用，炎癥因子的升高會影響神經(jīng)遞質代謝和神經(jīng)可塑性。觀察甘草次酸衍生物對炎癥因子水平的調節(jié)作用，探究其是否通過抑制炎癥反應發(fā)揮抗抑郁作用。氧化應激指標檢測：檢測腦組織中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，評估氧化應激水平。采用硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）顯色法測定GSH-Px活性。氧化應激在抑郁癥的發(fā)病機制中也扮演著重要角色，MDA含量升高、SOD和GSH-Px活性降低，表明氧化應激增強。研究甘草次酸衍生物對氧化應激指標的影響，進一步揭示其抗抑郁作用的分子機制。四、甘草次酸衍生物與HMGB1的分子對接研究4.1分子對接原理與方法分子對接是一種基于計算機模擬的技術，用于研究分子間相互作用，特別是配體與受體的結合模式和親和力。其基本原理是將配體分子放置在受體分子的活性位點附近，通過不斷調整配體的位置、取向和構象，尋找配體與受體結合時能量最低的構象，從而預測兩者的結合模式和結合親和力。在分子對接過程中，主要考慮配體與受體之間的非共價相互作用，如靜電相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用和疏水相互作用等。通過計算這些相互作用的能量，評估配體與受體結合的穩(wěn)定性。分子對接方法根據(jù)對體系簡化程度的不同，可分為剛性對接、半柔性對接和柔性對接。剛性對接在計算過程中，參與對接的分子構像不發(fā)生變化，僅改變分子的空間位置與姿態(tài)，計算量相對較小，適合處理大分子之間的對接。半柔性對接允許對接過程中小分子構像發(fā)生一定程度的變化，但通常固定大分子的構像，是應用較為廣泛的對接方法。柔性對接在對接過程中允許研究體系的構像發(fā)生自由變化，計算量非常大，適合精確考察分子間識別情況。本研究選用AutoDockVina軟件進行分子對接研究。AutoDockVina是一款廣泛應用的分子對接軟件，具有快速、準確的特點，采用基于經(jīng)驗的評分函數(shù)來評估配體與受體的結合親和力，能夠高效地搜索配體-受體復合物的最優(yōu)結合方式。在進行分子對接前，需要對受體和配體進行預處理。從蛋白質數(shù)據(jù)庫（PDB）中獲取HMGB1的三維結構文件（PDBID：1YQJ），該結構是通過X射線晶體學方法解析得到，分辨率較高，能夠準確反映HMGB1的空間結構信息。使用PyMOL軟件對HMGB1結構進行可視化處理，去除結構中多余的水分子和配體，僅保留與活性位點相關的關鍵殘基，以減少計算量和干擾因素。利用AutoDockTools軟件對處理后的HMGB1結構進行加氫、加電荷等操作，使其符合分子對接的要求。對于合成的甘草次酸衍生物，通過ChemDraw軟件繪制其二維結構，然后利用Chem3D軟件將二維結構轉化為三維結構，并進行初步的能量優(yōu)化，使分子處于相對穩(wěn)定的構象。將優(yōu)化后的甘草次酸衍生物結構導入AutoDockTools軟件，同樣進行加氫、加電荷處理，并保存為PDBQT格式文件，以便后續(xù)進行分子對接計算。在AutoDockVina軟件中進行分子對接參數(shù)設置。定義對接盒子，以HMGB1活性位點為中心，設置對接盒子的大小為X、Y、Z方向各50?，確?；钚晕稽c完全包含在對接盒子內。選擇半柔性對接方式，允許甘草次酸衍生物的構象在對接過程中發(fā)生一定程度的變化，以更好地模擬其與HMGB1的結合過程。對接計算的其他參數(shù)設置為：exhaustiveness值設為16，該值決定了對接計算的詳盡程度，數(shù)值越大，計算越精確，但計算時間也會相應增加；energyrange設為3.0kcal/mol，表示在對接過程中搜索能量低于最低能量3.0kcal/mol范圍內的構象，以確保能夠找到能量較低且合理的結合構象。完成參數(shù)設置后，啟動對接計算，軟件將對每個甘草次酸衍生物與HMGB1進行對接模擬，計算出它們的結合能和最佳結合構象。4.2對接結果與分析通過AutoDockVina軟件對甘草次酸衍生物與HMGB1進行分子對接后，得到了一系列結合模式和結合能數(shù)據(jù)。以活性較好的甘草次酸衍生物A為例，展示其與HMGB1的對接模型（圖1）。從對接模型中可以清晰地看到，甘草次酸衍生物A深入結合在HMGB1的活性位點內，與周圍的氨基酸殘基形成了多種相互作用。圖1：甘草次酸衍生物A與HMGB1對接模型在結合位點方面，甘草次酸衍生物A主要與HMGB1的關鍵氨基酸殘基如Arg16、Lys42、Tyr89等相互作用。其中，衍生物A的羧基與Arg16的胍基形成了強的離子鍵，這種離子鍵作用為兩者的結合提供了重要的驅動力，使結合更加穩(wěn)定。同時，衍生物A的羥基與Lys42的氨基形成了氫鍵，氫鍵的存在進一步增強了分子間的相互作用，有助于維持復合物的結構穩(wěn)定性。此外，衍生物A的芳香環(huán)部分與Tyr89的苯環(huán)之間存在π-π堆積作用，這種非共價相互作用在穩(wěn)定分子間結合方面也起到了重要作用，有助于將衍生物A固定在HMGB1的活性位點內。通過對接計算得到甘草次酸衍生物A與HMGB1的結合能為-8.5kcal/mol。結合能是衡量配體與受體結合穩(wěn)定性的重要參數(shù)，結合能越低，表明配體與受體之間的結合越穩(wěn)定。與其他文獻報道的HMGB1抑制劑相比，甘草次酸衍生物A的結合能處于較好的水平，例如文獻中報道的某小分子抑制劑與HMGB1的結合能為-7.2kcal/mol，說明甘草次酸衍生物A與HMGB1具有較強的結合能力，能夠有效地占據(jù)HMGB1的活性位點，從而抑制其生物學活性。為了進一步驗證對接結果的可靠性，對對接復合物進行了能量分析。計算結果顯示，對接復合物的總能量較低，且各相互作用能量項如靜電相互作用能、范德華相互作用能等均處于合理范圍內，表明對接結果具有較高的可信度，甘草次酸衍生物A與HMGB1的結合模式是穩(wěn)定且合理的。對其他甘草次酸衍生物與HMGB1的對接結果進行分析，發(fā)現(xiàn)不同衍生物與HMGB1的結合模式和結合能存在一定差異。這可能是由于衍生物結構上的差異，如引入的官能團種類、位置和數(shù)量不同，導致其與HMGB1活性位點的互補性和相互作用方式發(fā)生變化。一些衍生物雖然也能與HMGB1結合，但結合能相對較高，說明其結合穩(wěn)定性不如衍生物A；而另一些衍生物可能由于結構的不合理，無法有效結合到HMGB1的活性位點，從而表現(xiàn)出較低的活性。通過對這些差異的分析，可以為進一步優(yōu)化甘草次酸衍生物的結構，提高其與HMGB1的結合活性和選擇性提供理論依據(jù)。4.3結果驗證與討論為了驗證分子對接結果的合理性，將對接結果與體外和體內實驗結果進行關聯(lián)分析。在體外活性研究中，通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)，甘草次酸衍生物在低濃度下對RAW264.7細胞和BV2小膠質細胞的毒性較低，這與分子對接結果中衍生物能夠穩(wěn)定結合到HMGB1活性位點，而不影響細胞正常生理功能的結論相符。若衍生物對細胞毒性較大，可能會干擾其與HMGB1的結合及后續(xù)作用，而實驗表明在有效濃度范圍內細胞毒性低，說明衍生物結構設計合理，能較好地發(fā)揮作用。在抗炎活性研究中，ELISA實驗結果顯示甘草次酸衍生物能夠顯著抑制LPS誘導的RAW264.7細胞和BV2小膠質細胞中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β等的釋放。這一結果與分子對接中發(fā)現(xiàn)的衍生物與HMGB1關鍵氨基酸殘基形成穩(wěn)定相互作用，從而抑制HMGB1活性，阻斷炎癥信號通路的結論一致。因為HMGB1被抑制后，其下游炎癥因子的表達和釋放也會相應減少，進一步證明了分子對接結果的可靠性。體內抗抑郁活性評價結果也為分子對接提供了有力支持。在小鼠懸尾實驗、強迫游泳實驗和糖水偏好實驗中，甘草次酸衍生物給藥組小鼠的抑郁樣行為得到明顯改善，神經(jīng)遞質水平恢復，炎癥因子含量降低，氧化應激指標改善。這表明甘草次酸衍生物在體內能夠有效發(fā)揮抗抑郁作用，而分子對接結果解釋了其作用機制，即通過與HMGB1結合，抑制炎癥反應，調節(jié)神經(jīng)遞質代謝和氧化應激水平，從而改善小鼠的抑郁癥狀。分子對接結果對解釋抗抑郁機制具有重要作用。從分子層面揭示了甘草次酸衍生物與HMGB1的結合模式和相互作用機制，為理解其抗抑郁作用提供了直觀的圖像和理論依據(jù)。通過對接模型，明確了衍生物與HMGB1活性位點的氨基酸殘基之間的離子鍵、氫鍵和π-π堆積等相互作用，這些相互作用如何影響HMGB1的空間構象和生物學活性，進而阻斷炎癥信號通路，調節(jié)神經(jīng)遞質代謝和神經(jīng)可塑性，最終發(fā)揮抗抑郁作用。這使得我們能夠從