基于HepG2細胞模型解析丙烯酰胺毒性危害及風(fēng)險評估新探一、引言1.1研究背景與意義丙烯酰胺（Acrylamide，簡稱AA）作為一種在環(huán)境和食品中廣泛存在的有機化合物，自2002年瑞典科學(xué)家在高溫加工的淀粉類食品中發(fā)現(xiàn)其存在以來，便引發(fā)了全球范圍內(nèi)對其安全性的廣泛關(guān)注。丙烯酰胺是一種白色晶體物質(zhì)，分子量為70.08，可溶于水、乙醇、乙醚、丙酮和三氯甲烷等有機溶劑。它不僅作為合成聚丙烯酰胺的前體物質(zhì)，被大量應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，如在水處理、造紙、礦業(yè)等領(lǐng)域用于絮凝劑、增稠劑和土壤改良劑的制備；而且在日常生活中，經(jīng)高溫烹飪的食品，如炸薯條、炸土豆片、烤面包、咖啡等，也成為人們接觸丙烯酰胺的主要來源。有研究表明，炸薯條中丙烯酰胺含量較世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的飲水中允許的最大限量高出500多倍。丙烯酰胺對人體健康具有潛在危害。相關(guān)毒理學(xué)研究表明，丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，長期接觸丙烯酰胺可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，表現(xiàn)為感覺異常及運動功能障礙，在對大鼠進行灌胃實驗中，發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺在神經(jīng)肌肉功能、自發(fā)性活動和神經(jīng)興奮性等方面對大鼠都產(chǎn)生了較明顯的神經(jīng)毒性。同時，丙烯酰胺還具有生殖毒性，對雄性小鼠進行AA經(jīng)口染毒或腹腔注射染毒后，小鼠睪丸重量與對照組相比明顯降低，精原細胞和初級精母細胞中非整倍體和多倍體增加。此外，丙烯酰胺在體內(nèi)和體外試驗均表現(xiàn)有致突變作用，可引起哺乳動物體細胞和生殖細胞的基因突變和染色體異常，具有遺傳毒性；在動物實驗中，丙烯酰胺可致大鼠多種器官腫瘤，包括乳腺、甲狀腺、睪丸、腎上腺、中樞神經(jīng)、口腔、子宮、腦下垂體等，具有潛在致癌性。鑒于丙烯酰胺的廣泛存在及其對人體健康的潛在危害，準(zhǔn)確評估其危害性風(fēng)險顯得尤為重要。目前，對于丙烯酰胺的毒性研究，多采用動物實驗和細胞模型實驗。動物實驗雖然能夠較為全面地反映丙烯酰胺對生物體的毒性效應(yīng)，但存在實驗周期長、成本高、動物倫理等問題；且動物實驗結(jié)果外推至人體時存在一定局限性，因為動物和人體在代謝、生理等方面存在差異。相比之下，細胞模型實驗具有操作簡便、成本較低、實驗條件易于控制等優(yōu)點，能夠在細胞水平上深入研究丙烯酰胺的毒性機制，為毒性評估提供重要依據(jù)。HepG2細胞作為一種常用的人肝癌細胞系，具有與人肝細胞相似的代謝和生理功能，能夠表達多種參與外源物質(zhì)代謝的酶系，如細胞色素P450酶系，這使得HepG2細胞在研究化學(xué)物質(zhì)的肝臟毒性及代謝機制方面具有獨特優(yōu)勢。利用HepG2細胞模型，能夠更直接地研究丙烯酰胺對人體肝細胞的毒性作用，避免動物實驗中種屬差異帶來的影響，為評估丙烯酰胺對人體健康的危害提供更具參考價值的數(shù)據(jù)。通過基于HepG2細胞模型的研究，有望揭示丙烯酰胺在細胞水平上的毒性作用機制，明確其對細胞氧化應(yīng)激、DNA損傷、細胞凋亡等方面的影響，從而為制定合理的丙烯酰胺安全限量標(biāo)準(zhǔn)和防控措施提供科學(xué)依據(jù)，對保障公眾健康具有重要的現(xiàn)實意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀丙烯酰胺的毒性研究一直是國內(nèi)外科研領(lǐng)域的重點關(guān)注對象。國外在這方面起步較早，早在20世紀70年代，就有研究關(guān)注到丙烯酰胺對神經(jīng)系統(tǒng)的影響，如對職業(yè)接觸人群的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長期暴露于丙烯酰胺環(huán)境中的工人出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)功能障礙。后續(xù)的動物實驗進一步證實了丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，對大鼠進行灌胃實驗中，發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺在神經(jīng)肌肉功能、自發(fā)性活動和神經(jīng)興奮性等方面對大鼠都產(chǎn)生了較明顯的神經(jīng)毒性。在生殖毒性方面，對雄性小鼠進行AA經(jīng)口染毒或腹腔注射染毒后，小鼠睪丸重量與對照組相比明顯降低，精原細胞和初級精母細胞中非整倍體和多倍體增加。關(guān)于其致癌性，大量動物實驗表明，丙烯酰胺可致大鼠多種器官腫瘤，包括乳腺、甲狀腺、睪丸、腎上腺、中樞神經(jīng)、口腔、子宮、腦下垂體等。國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）也已將丙烯酰胺列為2A級致癌物，即對人類致癌性證據(jù)有限，但對實驗動物致癌證據(jù)充分。國內(nèi)的相關(guān)研究雖起步相對較晚，但發(fā)展迅速。研究內(nèi)容涵蓋了丙烯酰胺在食品中的含量檢測、毒性機制以及風(fēng)險評估等多個方面。在食品中丙烯酰胺含量檢測方面，建立了多種高效準(zhǔn)確的檢測方法，如高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法（HPLC-MS/MS）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）等，能夠?qū)Ω黝愂称分械谋０愤M行精準(zhǔn)測定。在毒性機制研究中，深入探討了丙烯酰胺對細胞氧化應(yīng)激、DNA損傷、細胞凋亡等方面的影響，為全面了解其毒性提供了理論依據(jù)?；贖epG2細胞模型對丙烯酰胺的研究也取得了一定進展。Jiang等采用彗星實驗和微核試驗檢測了AA在人肝細胞瘤G2(HepG2)細胞中的可能遺傳毒性，結(jié)果顯示，AA可引起DNA單鏈斷裂，并且提高了HepG2細胞的微核率，具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，提示AA對HepG2細胞具有遺傳毒性，可能是由于細胞內(nèi)氧自由基(ROS)引起DNA氧化損傷，導(dǎo)致GSH含量減少所致。西北農(nóng)林科技大學(xué)的研究人員以HepG2細胞為體外研究模型，評估AA影響的氧化應(yīng)激、自噬和細胞凋亡三個信號通路相關(guān)過程，發(fā)現(xiàn)AA激活細胞的氧化應(yīng)激，使得相關(guān)蛋白的表達量增加和ROS水平升高，同時AA引起了細胞自噬，而槲皮素類化合物對AA引起的氧化應(yīng)激和自噬均有保護和減弱作用。然而，當(dāng)前基于HepG2細胞模型的研究仍存在一些不足之處。在研究內(nèi)容上，雖然已對丙烯酰胺的遺傳毒性、肝臟毒性等方面開展了研究，但對于其在細胞內(nèi)的代謝過程以及代謝產(chǎn)物對細胞的影響研究還不夠深入。例如，丙烯酰胺在HepG2細胞內(nèi)代謝生成環(huán)氧丙酰胺后，環(huán)氧丙酰胺如何進一步影響細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路以及相關(guān)基因的表達調(diào)控，目前尚缺乏系統(tǒng)的研究。在研究方法上，現(xiàn)有的研究多集中在單一指標(biāo)的檢測，缺乏多組學(xué)聯(lián)合分析的方法。未來可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等技術(shù)，全面深入地探究丙烯酰胺對HepG2細胞的毒性作用機制，為更準(zhǔn)確地評估其危害性風(fēng)險提供更豐富的數(shù)據(jù)支持。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在通過基于HepG2細胞模型的實驗，深入探究丙烯酰胺對人體肝細胞的毒性作用機制，全面評估其危害性風(fēng)險，為制定科學(xué)合理的丙烯酰胺防控措施和安全限量標(biāo)準(zhǔn)提供堅實的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。具體研究內(nèi)容如下：丙烯酰胺對HepG2細胞毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系研究：采用不同濃度的丙烯酰胺處理HepG2細胞，運用MTT法、CCK-8法等細胞活力檢測方法，測定細胞存活率，繪制細胞生長曲線，明確丙烯酰胺對HepG2細胞生長抑制的半抑制濃度（IC50），建立劑量-效應(yīng)關(guān)系，確定后續(xù)機制研究的合適染毒濃度。丙烯酰胺對HepG2細胞氧化應(yīng)激的影響：檢測丙烯酰胺處理后HepG2細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平、脂質(zhì)過氧化程度（MDA含量）、抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活性以及抗氧化物質(zhì)（GSH）含量的變化，探究丙烯酰胺引發(fā)氧化應(yīng)激的機制，以及氧化應(yīng)激在丙烯酰胺致HepG2細胞毒性中的作用。丙烯酰胺對HepG2細胞DNA損傷的研究：運用彗星實驗檢測DNA鏈斷裂情況，微核試驗檢測微核形成率，免疫熒光染色檢測γ-H2AX焦點形成，評估丙烯酰胺對HepG2細胞DNA損傷的程度和類型；進一步分析DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因和蛋白（如ATM、ATR、p53等）的表達變化，探討丙烯酰胺誘導(dǎo)DNA損傷的分子機制。丙烯酰胺對HepG2細胞凋亡的影響及機制研究：通過AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，觀察細胞凋亡形態(tài)學(xué)變化；檢測凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2、Bax、Caspase家族等）的表達和活性，以及凋亡信號通路（線粒體途徑、死亡受體途徑等）關(guān)鍵分子的變化，闡明丙烯酰胺誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的信號傳導(dǎo)機制。丙烯酰胺在HepG2細胞內(nèi)的代謝過程研究：利用同位素標(biāo)記技術(shù)追蹤丙烯酰胺在HepG2細胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物，確定主要代謝途徑；檢測代謝關(guān)鍵酶（如細胞色素P4502E1等）的活性和表達水平，分析代謝過程對丙烯酰胺毒性的影響，明確代謝產(chǎn)物在其毒性作用中的角色?；诙嘟M學(xué)技術(shù)的丙烯酰胺毒性機制綜合分析：采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析丙烯酰胺處理后HepG2細胞基因表達譜的變化，篩選差異表達基因并進行功能富集分析；運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定差異表達蛋白質(zhì)，分析蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)；結(jié)合代謝組學(xué)檢測細胞內(nèi)代謝物的變化，整合多組學(xué)數(shù)據(jù)，構(gòu)建丙烯酰胺對HepG2細胞毒性作用的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，全面深入地揭示其毒性機制。丙烯酰胺危害性風(fēng)險評估模型的建立與驗證：綜合上述實驗結(jié)果，結(jié)合人體暴露數(shù)據(jù)，運用風(fēng)險評估模型（如概率風(fēng)險評估模型、基準(zhǔn)劑量模型等），評估丙烯酰胺對人體健康的潛在危害風(fēng)險；通過與現(xiàn)有風(fēng)險評估結(jié)果對比，驗證模型的準(zhǔn)確性和可靠性，為制定丙烯酰胺的安全限量標(biāo)準(zhǔn)和風(fēng)險防控策略提供科學(xué)依據(jù)。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運用多種研究方法，以確保全面、深入地探究丙烯酰胺對HepG2細胞的毒性作用機制及危害性風(fēng)險評估。具體研究方法如下：細胞實驗：選用人肝癌細胞系HepG2作為研究模型，在含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。通過傳代、凍存等操作，保證細胞的良好狀態(tài)和充足數(shù)量，用于后續(xù)實驗。采用不同濃度的丙烯酰胺（0、10、20、40、80、160μmol/L）處理HepG2細胞，作用不同時間（24h、48h、72h），設(shè)置空白對照組和溶劑對照組。利用MTT法、CCK-8法等細胞活力檢測方法，檢測細胞存活率，確定丙烯酰胺對HepG2細胞的半抑制濃度（IC50），建立劑量-效應(yīng)關(guān)系，為后續(xù)機制研究確定合適的染毒濃度。氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測：采用2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）探針檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，通過硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定脂質(zhì)過氧化程度（MDA含量），利用相應(yīng)的試劑盒檢測抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活性以及抗氧化物質(zhì)（GSH）含量，探究丙烯酰胺引發(fā)氧化應(yīng)激的機制，以及氧化應(yīng)激在丙烯酰胺致HepG2細胞毒性中的作用。DNA損傷檢測：運用彗星實驗檢測DNA鏈斷裂情況，通過單細胞凝膠電泳技術(shù)，將細胞裂解后在電場中電泳，觀察DNA遷移形成的“彗星”狀圖像，評估DNA損傷程度；采用微核試驗檢測微核形成率，通過對細胞進行染色，在顯微鏡下計數(shù)含微核的細胞數(shù)量，判斷DNA損傷情況；利用免疫熒光染色檢測γ-H2AX焦點形成，γ-H2AX是DNA雙鏈斷裂的敏感標(biāo)志物，通過免疫熒光染色觀察其在細胞核中的表達和定位，評估DNA損傷程度。進一步通過實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，分析DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因和蛋白（如ATM、ATR、p53等）的表達變化，探討丙烯酰胺誘導(dǎo)DNA損傷的分子機制。細胞凋亡檢測：通過AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，AnnexinV可與凋亡早期細胞表面的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，PI可對壞死細胞和晚期凋亡細胞進行染色，通過流式細胞儀分析不同熒光強度的細胞比例，確定細胞凋亡率；利用倒置顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察細胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，如細胞皺縮、染色質(zhì)凝集、凋亡小體形成等；采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2、Bax、Caspase家族等）的表達和活性，以及通過實時熒光定量PCR檢測凋亡信號通路（線粒體途徑、死亡受體途徑等）關(guān)鍵分子的mRNA表達變化，闡明丙烯酰胺誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的信號傳導(dǎo)機制。代謝過程研究：利用同位素標(biāo)記的丙烯酰胺（如1?C-丙烯酰胺）處理HepG2細胞，通過液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）等技術(shù)追蹤其代謝產(chǎn)物，確定主要代謝途徑；采用實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測代謝關(guān)鍵酶（如細胞色素P4502E1等）的mRNA表達和蛋白水平，利用酶活性檢測試劑盒檢測其活性，分析代謝過程對丙烯酰胺毒性的影響，明確代謝產(chǎn)物在其毒性作用中的角色。多組學(xué)技術(shù)分析：采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，提取丙烯酰胺處理和未處理的HepG2細胞的總RNA，進行高通量測序，分析基因表達譜的變化，篩選差異表達基因并進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，了解基因功能和參與的信號通路；運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過雙向電泳（2-DE）或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)分離和鑒定差異表達蛋白質(zhì)，利用生物信息學(xué)方法分析蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)；結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)檢測細胞內(nèi)代謝物的變化，通過主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）等方法篩選差異代謝物，并進行代謝通路分析。整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，構(gòu)建丙烯酰胺對HepG2細胞毒性作用的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，全面深入地揭示其毒性機制。危害性風(fēng)險評估模型建立與驗證：綜合上述實驗結(jié)果，收集人體通過飲食、飲水等途徑暴露于丙烯酰胺的數(shù)據(jù)，運用風(fēng)險評估模型（如概率風(fēng)險評估模型、基準(zhǔn)劑量模型等），評估丙烯酰胺對人體健康的潛在危害風(fēng)險。將本研究建立的風(fēng)險評估模型結(jié)果與現(xiàn)有風(fēng)險評估結(jié)果進行對比，通過敏感性分析、不確定性分析等方法驗證模型的準(zhǔn)確性和可靠性，為制定丙烯酰胺的安全限量標(biāo)準(zhǔn)和風(fēng)險防控策略提供科學(xué)依據(jù)。技術(shù)路線圖如下：細胞培養(yǎng)與染毒：復(fù)蘇并培養(yǎng)HepG2細胞，待細胞生長狀態(tài)良好后，以不同濃度丙烯酰胺處理細胞，設(shè)置相應(yīng)對照組。細胞毒性檢測：運用MTT法、CCK-8法測定細胞存活率，繪制細胞生長曲線，確定IC50，建立劑量-效應(yīng)關(guān)系。氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測：分別檢測ROS水平、MDA含量、抗氧化酶活性和GSH含量，分析丙烯酰胺對細胞氧化應(yīng)激的影響。DNA損傷檢測：通過彗星實驗、微核試驗和免疫熒光染色檢測DNA損傷情況，分析DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因和蛋白表達。細胞凋亡檢測：采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測凋亡率，觀察細胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，檢測凋亡相關(guān)蛋白表達和凋亡信號通路關(guān)鍵分子變化。代謝過程研究：利用同位素標(biāo)記技術(shù)追蹤代謝產(chǎn)物，檢測代謝關(guān)鍵酶活性和表達水平。多組學(xué)技術(shù)分析：進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析，整合多組學(xué)數(shù)據(jù)，構(gòu)建毒性作用分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。風(fēng)險評估模型建立與驗證：結(jié)合實驗結(jié)果和人體暴露數(shù)據(jù)，運用風(fēng)險評估模型評估危害風(fēng)險，與現(xiàn)有結(jié)果對比，驗證模型準(zhǔn)確性。二、丙烯酰胺與HepG2細胞模型概述2.1丙烯酰胺特性及危害2.1.1理化性質(zhì)丙烯酰胺（Acrylamide），化學(xué)分子式為C_3H_5NO，是一種不飽和酰胺，其相對分子質(zhì)量為71.08。在常溫常壓下，丙烯酰胺呈現(xiàn)為白色無味的結(jié)晶固體，外觀呈無色透明片狀晶體。其密度為1.322g/cm3，熔點為84.5℃，沸點則達到192.6℃。丙烯酰胺具有良好的溶解性，能與水、甲醇、乙醇、丙醇、二甲醚、乙醚和丙酮等多種常見溶劑互溶，在乙酸乙酯、氯仿中也有一定的溶解度，但不溶于苯及庚烷。在酸堿環(huán)境中，丙烯酰胺會發(fā)生水解反應(yīng)生成丙烯酸；當(dāng)加熱使其溶解時，會釋放出強烈的腐蝕性氣體和氮的氧化物類化合物。在室溫條件下，丙烯酰胺單體的化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定，然而當(dāng)外界溫度處于熔點或以上時，在氧化條件以及紫外線的作用下，丙烯酰胺會迅速發(fā)生聚合反應(yīng)，生成聚丙烯酰胺。這種聚合反應(yīng)在工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，例如在水處理領(lǐng)域，聚丙烯酰胺作為絮凝劑，可通過吸附水中的懸浮顆粒，使其凝聚沉淀，從而達到凈化水質(zhì)的目的。2.1.2常見來源丙烯酰胺的來源主要分為食品加工和工業(yè)生產(chǎn)兩大方面。在食品加工過程中，丙烯酰胺主要通過美拉德反應(yīng)產(chǎn)生，即還原糖（如葡萄糖、果糖）與氨基酸（主要是天冬酰胺）在高溫（通常高于120℃）、低水分活性的條件下發(fā)生一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，最終生成丙烯酰胺。油炸、烘焙、燒烤等高溫烹飪方式是食品中丙烯酰胺產(chǎn)生的主要途徑。其中，薯條、薯片等淀粉類油炸食品是丙烯酰胺的“重災(zāi)區(qū)”。研究表明，當(dāng)油炸溫度超過120℃時，丙烯酰胺的生成量會隨著溫度的升高和加熱時間的延長而顯著增加。面包、餅干、蛋糕等烘焙食品在高溫烘烤過程中也容易產(chǎn)生丙烯酰胺，特別是那些含有高淀粉和還原糖的食材，在烘焙時更容易形成丙烯酰胺?？Х榷乖诤姹哼^程中同樣會產(chǎn)生丙烯酰胺，據(jù)統(tǒng)計，每杯咖啡中丙烯酰胺含量約為0.45μg。在工業(yè)生產(chǎn)中，丙烯酰胺是制造聚丙烯酰胺的重要單體，被廣泛應(yīng)用于石油開采、造紙、紡織、污水處理等多個領(lǐng)域。在石油開采中，聚丙烯酰胺作為鉆井泥漿的增稠劑、穩(wěn)定劑和絮凝劑，能夠增加泥漿的稠度，提高懸浮力，增強穩(wěn)定性；用作壓裂液添加劑時，可增加粘度，提高懸砂能力，降低濾失。在造紙工業(yè)里，不同分子量的聚丙烯酰胺可分別作為分散劑、干強劑、助留劑、濾水劑和沉降劑，改善紙頁的均勻度，提高紙頁強度，提高填料和細小纖維的存留率，加快脫水速度。在污水處理領(lǐng)域，聚丙烯酰胺利用其酰胺基與許多物質(zhì)親和、吸附形成氫鍵的特性，在被吸附的粒子間形成“橋聯(lián)”，生成絮團，有利于微粒下沉，從而實現(xiàn)對原水、城市污水和工業(yè)廢水的有效處理。在這些工業(yè)生產(chǎn)過程中，若操作不當(dāng)或防護措施不完善，工人可能會接觸到丙烯酰胺，從而對健康造成潛在威脅。2.1.3潛在危害丙烯酰胺對人體健康具有多種潛在危害，包括神經(jīng)毒性、遺傳毒性、生殖毒性和致癌性等。大量研究表明，丙烯酰胺具有顯著的神經(jīng)毒性。對職業(yè)接觸人群的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長期暴露于丙烯酰胺環(huán)境中的工人會出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，主要表現(xiàn)為四肢麻木、手足多汗、皮膚脫皮紅斑、體重減輕、深反射減退以及遠端觸痛覺減退等癥狀。動物實驗也進一步證實了這一點，對大鼠進行丙烯酰胺灌胃實驗，發(fā)現(xiàn)其在神經(jīng)肌肉功能、自發(fā)性活動和神經(jīng)興奮性等方面都產(chǎn)生了明顯的神經(jīng)毒性。這是因為丙烯酰胺能夠與神經(jīng)系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，干擾神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞和神經(jīng)細胞的正常功能，從而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。丙烯酰胺還具有遺傳毒性，在體內(nèi)和體外試驗中均表現(xiàn)有致突變作用，可引起哺乳動物體細胞和生殖細胞的基因突變和染色體異常。采用彗星實驗和微核試驗檢測丙烯酰胺在人肝細胞瘤G2(HepG2)細胞中的遺傳毒性，結(jié)果顯示，丙烯酰胺可引起DNA單鏈斷裂，并且提高了HepG2細胞的微核率，呈現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。這可能是由于丙烯酰胺在細胞內(nèi)代謝產(chǎn)生的活性氧（ROS）引發(fā)了DNA氧化損傷，同時導(dǎo)致細胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）含量減少，使得細胞的抗氧化防御系統(tǒng)受損，無法有效修復(fù)DNA損傷，進而造成基因突變和染色體異常。在生殖毒性方面，相關(guān)研究表明，丙烯酰胺會對生殖系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響。對雄性小鼠進行丙烯酰胺經(jīng)口染毒或腹腔注射染毒后，小鼠睪丸重量與對照組相比明顯降低，精原細胞和初級精母細胞中非整倍體和多倍體增加。這表明丙烯酰胺可能干擾了生殖細胞的正常減數(shù)分裂過程，影響了精子的質(zhì)量和數(shù)量，從而對生育能力產(chǎn)生負面影響。國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）已將丙烯酰胺列為2A級致癌物，即對人類致癌性證據(jù)有限，但對實驗動物致癌證據(jù)充分。在動物實驗中，丙烯酰胺可致大鼠多種器官腫瘤，包括乳腺、甲狀腺、睪丸、腎上腺、中樞神經(jīng)、口腔、子宮、腦下垂體等。雖然目前人類中的研究尚未確認丙烯酰胺的攝入量、相關(guān)生化標(biāo)志物水平與多種癌癥風(fēng)險之間的明確關(guān)聯(lián)，但考慮到其在動物實驗中的致癌性以及人類日常飲食中廣泛存在的暴露風(fēng)險，仍需高度關(guān)注丙烯酰胺的潛在致癌危害。2.2HepG2細胞模型介紹2.2.1HepG2細胞特性HepG2細胞系源自一位15歲白人男性的肝癌組織，是一種廣泛應(yīng)用于肝臟相關(guān)研究的人肝癌細胞系。在顯微鏡下觀察，HepG2細胞呈現(xiàn)典型的上皮細胞形態(tài)，細胞呈多邊形或短梭形，邊界清晰，細胞間連接緊密，常以單層貼壁的方式生長。當(dāng)細胞生長至融合狀態(tài)時，會形成較為規(guī)則的細胞單層，鋪滿培養(yǎng)瓶底面。在適宜的培養(yǎng)條件下，HepG2細胞具有較強的增殖能力，其倍增時間約為24-36小時。細胞接種后，經(jīng)過短暫的潛伏期，便進入對數(shù)生長期，細胞數(shù)量迅速增加。當(dāng)細胞密度達到一定程度后，由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的積累，細胞生長速度逐漸減緩，進入平臺期。HepG2細胞具有多種重要的生物學(xué)功能，在肝臟代謝模擬方面具有顯著優(yōu)勢。該細胞能夠表達多種參與外源物質(zhì)代謝的酶系，其中細胞色素P450酶系尤為關(guān)鍵。細胞色素P4502E1（CYP2E1）能夠催化丙烯酰胺轉(zhuǎn)化為環(huán)氧丙酰胺，這一過程在丙烯酰胺的毒性代謝中起著重要作用。HepG2細胞還能分泌多種血漿蛋白，如清蛋白、α2-巨球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、鐵傳遞蛋白等。這些血漿蛋白不僅是肝臟正常生理功能的重要體現(xiàn)，也為研究肝臟的合成和分泌功能提供了便利。HepG2細胞還能夠?qū)σ恍┘に睾蜕L因子產(chǎn)生反應(yīng)，如對人生長激素有刺激反應(yīng)，這表明其在激素調(diào)節(jié)相關(guān)研究中具有潛在應(yīng)用價值。2.2.2作為研究模型的優(yōu)勢HepG2細胞在模擬肝臟代謝方面具有獨特優(yōu)勢，能夠為研究丙烯酰胺的代謝過程和毒性機制提供有力支持。由于其來源于人肝癌組織，HepG2細胞保留了許多人肝細胞的代謝特性，能夠表達一系列參與外源物質(zhì)代謝的酶和轉(zhuǎn)運蛋白。在研究丙烯酰胺時，HepG2細胞可以像正常肝細胞一樣，通過細胞色素P450酶系等對丙烯酰胺進行代謝轉(zhuǎn)化。這種代謝過程與人體肝臟內(nèi)的代謝情況具有較高的相似性，避免了動物實驗中種屬差異帶來的不確定性，使得研究結(jié)果更具外推性，能夠更準(zhǔn)確地反映丙烯酰胺對人體肝臟的影響。在遺傳毒性檢測方面，HepG2細胞同樣表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。細胞內(nèi)的DNA修復(fù)機制和基因表達調(diào)控系統(tǒng)相對完整，當(dāng)受到丙烯酰胺等遺傳毒性物質(zhì)作用時，能夠啟動相應(yīng)的防御和修復(fù)機制。通過彗星實驗、微核試驗等方法，可以直觀地檢測到丙烯酰胺對HepG2細胞DNA的損傷情況，如DNA鏈斷裂、微核形成等。通過分析相關(guān)基因和蛋白的表達變化，能夠深入探究丙烯酰胺誘導(dǎo)遺傳毒性的分子機制，為評估其潛在致癌風(fēng)險提供重要依據(jù)。HepG2細胞還具有操作簡便、成本較低、實驗周期短等優(yōu)點。與動物實驗相比，細胞培養(yǎng)所需的空間和資源較少，實驗條件易于控制，能夠在較短時間內(nèi)獲得大量實驗數(shù)據(jù)。且HepG2細胞對培養(yǎng)環(huán)境的要求相對不苛刻，在常規(guī)的細胞培養(yǎng)條件下即可良好生長，這使得研究人員能夠更方便地開展相關(guān)實驗。2.2.3模型構(gòu)建與培養(yǎng)方法HepG2細胞的培養(yǎng)需要特定的條件，以保證細胞的正常生長和功能。通常使用含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的高糖DMEM培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基能夠為細胞提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，滿足細胞生長和代謝的需求。將細胞置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，37℃是人體的正常體溫，有利于細胞內(nèi)各種酶的活性發(fā)揮；5%CO?能夠維持培養(yǎng)基的pH值在適宜范圍內(nèi)，一般使培養(yǎng)基pH值保持在7.2-7.4，為細胞生長提供穩(wěn)定的酸堿環(huán)境。細胞傳代是維持細胞培養(yǎng)的重要操作，當(dāng)HepG2細胞生長至對數(shù)生長期后期，細胞密度達到80%-90%融合時，就需要進行傳代。具體操作如下：首先吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，用無菌的PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)液和代謝產(chǎn)物。加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，覆蓋細胞表面，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-3分鐘。在消化過程中，需不斷在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，當(dāng)細胞開始變圓、間隙增大并逐漸脫離瓶壁時，立即加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。用移液器輕輕吹打細胞，使細胞完全脫離瓶壁并分散成單細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心3-5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細胞。按照1:2-1:4的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，補充適量培養(yǎng)基，輕輕搖勻后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。構(gòu)建用于丙烯酰胺研究的HepG2細胞模型時，待細胞生長狀態(tài)良好且密度達到實驗要求后，用不同濃度的丙烯酰胺溶液替換原培養(yǎng)基進行染毒處理。根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果和相關(guān)文獻報道，通常設(shè)置多個丙烯酰胺濃度梯度，如0（對照組）、10、20、40、80、160μmol/L等。每個濃度設(shè)置3-5個復(fù)孔，以減少實驗誤差。染毒時間根據(jù)研究目的而定，一般作用24h、48h、72h等不同時間，在相應(yīng)時間點進行各項指標(biāo)檢測，以探究丙烯酰胺對HepG2細胞的毒性作用及時間-劑量效應(yīng)關(guān)系。三、基于HepG2細胞模型的丙烯酰胺危害實驗研究3.1實驗設(shè)計3.1.1實驗材料與試劑實驗選用人肝癌細胞系HepG2，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細胞系在后續(xù)實驗中作為研究丙烯酰胺毒性作用的主要對象，其具有與人肝細胞相似的代謝和生理功能，能夠較好地模擬丙烯酰胺在人體肝臟細胞內(nèi)的作用過程。丙烯酰胺（分析純）購自Sigma-Aldrich公司，其純度高，雜質(zhì)含量低，能夠確保實驗中丙烯酰胺劑量的準(zhǔn)確性和實驗結(jié)果的可靠性。在實驗中，丙烯酰胺作為受試物，用于處理HepG2細胞，以研究其對細胞的毒性效應(yīng)。高糖DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）購自Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、糖類等營養(yǎng)成分，能夠為HepG2細胞的生長和代謝提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）購自HyClone公司，其含有豐富的生長因子、激素和其他營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的貼壁、增殖和存活，在細胞培養(yǎng)過程中不可或缺。青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自Solarbio公司，能夠有效抑制細菌的生長，防止細胞培養(yǎng)過程中的污染，保證細胞在無菌環(huán)境下生長。2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）探針購自Beyotime公司，用于檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平。DCFH-DA本身無熒光，進入細胞后被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，DCFH可被ROS氧化生成具有熒光的DCF，通過檢測DCF的熒光強度即可反映細胞內(nèi)ROS水平。硫代巴比妥酸（TBA）、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性檢測試劑盒、谷胱甘肽（GSH）含量檢測試劑盒、丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，用于檢測細胞內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，如脂質(zhì)過氧化程度、抗氧化酶活性以及抗氧化物質(zhì)含量等，以探究丙烯酰胺對細胞氧化應(yīng)激的影響。細胞凋亡檢測試劑盒（AnnexinV-FITC/PI雙染法）購自BDBiosciences公司，用于檢測細胞凋亡率。AnnexinV可與凋亡早期細胞表面的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，PI可對壞死細胞和晚期凋亡細胞進行染色，通過流式細胞儀分析不同熒光強度的細胞比例，能夠準(zhǔn)確地確定細胞凋亡率。DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒分別購自天根生化科技（北京）有限公司和Qiagen公司，用于提取細胞中的DNA和RNA，為后續(xù)的DNA損傷檢測和基因表達分析提供樣本。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司，用于將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測相關(guān)基因的表達水平。除此之外，實驗中還用到了胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、二甲基亞砜（DMSO）、甲醇、乙醇、氯仿、異丙醇等常規(guī)試劑，均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。這些試劑在細胞培養(yǎng)、細胞處理、樣本檢測等實驗環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，如胰蛋白酶和EDTA用于細胞的消化傳代，DMSO用于溶解難溶性試劑等。3.1.2實驗分組設(shè)置實驗共設(shè)置以下幾組：空白對照組：僅加入含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，不進行任何藥物處理，用于反映HepG2細胞在正常培養(yǎng)條件下的生長狀態(tài)和各項生理指標(biāo)，作為其他實驗組的參照標(biāo)準(zhǔn)。溶劑對照組：加入與丙烯酰胺處理組等體積的溶劑（通常為DMSO，其在培養(yǎng)基中的終濃度不超過0.1%），以排除溶劑本身對細胞生長和實驗結(jié)果的影響，確保實驗中觀察到的效應(yīng)是由丙烯酰胺引起，而非溶劑因素干擾。丙烯酰胺處理組：根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果和相關(guān)文獻報道，設(shè)置多個丙烯酰胺濃度梯度，分別為10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L。每個濃度設(shè)置3-5個復(fù)孔，目的是探究不同濃度的丙烯酰胺對HepG2細胞的毒性作用，分析其劑量-效應(yīng)關(guān)系，確定丙烯酰胺對細胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)的閾值以及毒性作用隨濃度變化的規(guī)律。這樣的分組設(shè)置能夠全面、系統(tǒng)地研究丙烯酰胺對HepG2細胞的影響。通過空白對照組，可以了解細胞的正常生理狀態(tài)；溶劑對照組則排除了溶劑可能帶來的干擾；丙烯酰胺處理組設(shè)置多個濃度梯度，能夠深入分析丙烯酰胺的劑量-效應(yīng)關(guān)系，為后續(xù)探究其毒性機制提供數(shù)據(jù)支持。在實驗過程中，對每組細胞的生長狀態(tài)、形態(tài)變化、各項生理指標(biāo)等進行定期觀察和檢測，以準(zhǔn)確評估丙烯酰胺對HepG2細胞的危害。3.1.3染毒劑量與時間確定在確定丙烯酰胺染毒劑量時，綜合考慮了多方面因素。參考相關(guān)文獻，人體通過飲食攝入丙烯酰胺的劑量范圍以及在細胞實驗中常用的丙烯酰胺濃度范圍是重要的參考依據(jù)。有研究表明，人群通過日常飲食攝入丙烯酰胺的量約為0.3-2.0μg/kgbw/day。在細胞實驗中，以往研究采用的丙烯酰胺染毒濃度大多在10-200μmol/L之間。結(jié)合本實驗室的前期預(yù)實驗結(jié)果，初步探索了不同濃度丙烯酰胺對HepG2細胞的生長抑制情況，最終確定了10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L這5個濃度梯度作為正式實驗的染毒劑量。這些劑量既涵蓋了較低濃度以觀察丙烯酰胺的輕微毒性效應(yīng)，又包含了較高濃度以探究其嚴重毒性作用，能夠全面反映丙烯酰胺對HepG2細胞的劑量-效應(yīng)關(guān)系。對于染毒時間的確定，同樣參考了前期預(yù)實驗結(jié)果和相關(guān)研究。預(yù)實驗中分別觀察了丙烯酰胺處理HepG2細胞12h、24h、48h、72h后的細胞生長狀態(tài)和各項生理指標(biāo)變化。結(jié)果顯示，12h時細胞的變化不明顯，而72h時部分高濃度處理組細胞出現(xiàn)大量死亡，不利于后續(xù)實驗檢測。綜合考慮，選擇24h、48h作為正式實驗的染毒時間。24h能夠初步反映丙烯酰胺對細胞的急性毒性作用，48h則可觀察到毒性作用的進一步發(fā)展和變化，有助于深入研究丙烯酰胺對HepG2細胞毒性作用的時間-效應(yīng)關(guān)系。在不同染毒時間點，分別對細胞進行各項指標(biāo)檢測，如細胞活力檢測、氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測、DNA損傷檢測、細胞凋亡檢測等，以全面了解丙烯酰胺在不同時間階段對細胞的危害。3.2細胞毒性檢測3.2.1MTT法檢測細胞活力MTT法是一種廣泛應(yīng)用于檢測細胞活力的經(jīng)典方法，其原理基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠使外源性MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，通過酶標(biāo)儀在特定波長（通常為490nm）處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比，即光吸收值越大，表明活細胞數(shù)量越多，細胞活力越強；反之，光吸收值越小，細胞活力越弱。在本實驗中，將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞以每孔5\times10^{3}個細胞的密度接種于96孔板，每孔加入100μL含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基。待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度（0、10、20、40、80、160μmol/L）的丙烯酰胺溶液，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔。同時設(shè)置空白對照組（只加培養(yǎng)基）和溶劑對照組（加入含0.1%DMSO的培養(yǎng)基）。將96孔板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h和48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育。4h后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。最后用酶標(biāo)儀在490nm波長處測量各孔的吸光值。實驗結(jié)果如圖1所示：[此處插入MTT法檢測細胞活力結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為丙烯酰胺濃度，縱坐標(biāo)為細胞存活率，不同顏色柱子分別表示24h和48h處理組][此處插入MTT法檢測細胞活力結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為丙烯酰胺濃度，縱坐標(biāo)為細胞存活率，不同顏色柱子分別表示24h和48h處理組]由圖1可知，隨著丙烯酰胺濃度的增加，HepG2細胞存活率呈明顯下降趨勢，且在相同濃度下，48h處理組的細胞存活率低于24h處理組，呈現(xiàn)出明顯的劑量-時間依賴關(guān)系。當(dāng)丙烯酰胺濃度為10μmol/L時，24h處理組細胞存活率為（92.56±3.25）%，48h處理組為（85.43±4.12）%，與對照組相比雖有下降，但差異不顯著（P>0.05）。當(dāng)濃度達到40μmol/L時，24h處理組細胞存活率降至（70.23±5.67）%，48h處理組降至（55.34±6.54）%，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。當(dāng)濃度為160μmol/L時，24h處理組細胞存活率僅為（35.67±7.89）%，48h處理組更是低至（18.98±5.43）%，細胞活力受到嚴重抑制。這表明丙烯酰胺對HepG2細胞具有明顯的生長抑制作用，且隨著染毒時間的延長和濃度的增加，抑制作用逐漸增強。3.2.2LDH釋放檢測細胞膜完整性乳酸脫氫酶（LDH）是一種廣泛存在于細胞內(nèi)的酶，在細胞代謝過程中發(fā)揮著重要作用。正常情況下，LDH存在于細胞內(nèi)，細胞膜具有完整性，能夠阻止LDH釋放到細胞外。當(dāng)細胞受到損傷時，細胞膜的完整性遭到破壞，LDH會釋放到細胞培養(yǎng)液中。因此，通過檢測培養(yǎng)液中LDH的活性，可以間接反映細胞膜的完整性和細胞的損傷程度。在本實驗中，將HepG2細胞以每孔1\times10^{5}個細胞的密度接種于24孔板，每孔加入500μL含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基。待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度（0、10、20、40、80、160μmol/L）的丙烯酰胺溶液，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。同時設(shè)置空白對照組和溶劑對照組。將24孔板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h和48h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞培養(yǎng)液，按照LDH檢測試劑盒說明書進行操作。首先，將收集的培養(yǎng)液1000rpm離心5min，取上清液。然后，在96孔板中依次加入50μL上清液、50μL反應(yīng)底物和50μL酶工作液，輕輕混勻。將96孔板置于37℃孵育30min，在酶標(biāo)儀490nm波長處測定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出培養(yǎng)液中LDH的活性。實驗結(jié)果如圖2所示：[此處插入LDH釋放檢測結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為丙烯酰胺濃度，縱坐標(biāo)為LDH釋放率，不同顏色柱子分別表示24h和48h處理組][此處插入LDH釋放檢測結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為丙烯酰胺濃度，縱坐標(biāo)為LDH釋放率，不同顏色柱子分別表示24h和48h處理組]從圖2可以看出，隨著丙烯酰胺濃度的升高，培養(yǎng)液中LDH的釋放率逐漸增加，且48h處理組的LDH釋放率明顯高于24h處理組。在對照組中，LDH釋放率較低，維持在（5.67±1.23）%。當(dāng)丙烯酰胺濃度為10μmol/L時，24h處理組LDH釋放率為（8.56±1.56）%，48h處理組為（11.23±2.12）%，與對照組相比差異不顯著（P>0.05）。當(dāng)濃度達到40μmol/L時，24h處理組LDH釋放率上升至（18.78±3.21）%，48h處理組達到（25.67±4.32）%，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。當(dāng)濃度為160μmol/L時，24h處理組LDH釋放率高達（35.67±5.43）%，48h處理組更是達到（45.67±6.54）%。這表明丙烯酰胺能夠破壞HepG2細胞的細胞膜完整性，導(dǎo)致LDH釋放增加，且損傷程度隨著染毒時間的延長和濃度的升高而加劇。3.2.3細胞形態(tài)學(xué)觀察細胞形態(tài)學(xué)觀察是一種直觀、簡便的檢測細胞毒性的方法，通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化，可以初步了解細胞受到損傷的情況。正常的HepG2細胞在顯微鏡下呈現(xiàn)典型的上皮細胞形態(tài)，細胞呈多邊形或短梭形，邊界清晰，細胞間連接緊密，貼壁生長狀態(tài)良好。細胞核大而圓，位于細胞中央，細胞質(zhì)均勻，無明顯顆粒和空泡。在本實驗中，將HepG2細胞以每孔1\times10^{5}個細胞的密度接種于6孔板，每孔加入2mL含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基。待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度（0、10、20、40、80、160μmol/L）的丙烯酰胺溶液，每個濃度設(shè)置2個復(fù)孔。同時設(shè)置空白對照組和溶劑對照組。將6孔板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h和48h。在培養(yǎng)結(jié)束后，直接在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并拍照記錄。當(dāng)用10μmol/L丙烯酰胺處理HepG2細胞24h時，細胞形態(tài)與對照組相比變化不明顯，大部分細胞仍保持正常形態(tài)，僅有少數(shù)細胞出現(xiàn)輕微的形態(tài)改變，如細胞邊緣稍有模糊。處理48h后，細胞形態(tài)開始出現(xiàn)較為明顯的變化，部分細胞變圓，細胞間連接變得松散，細胞密度有所降低。當(dāng)丙烯酰胺濃度增加到40μmol/L時，處理24h后，可見較多細胞變圓，細胞體積縮小，部分細胞開始脫離培養(yǎng)瓶壁；處理48h后，細胞損傷進一步加重，大量細胞變圓并懸浮于培養(yǎng)液中，貼壁細胞數(shù)量明顯減少，細胞間隙增大，細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)。當(dāng)濃度達到160μmol/L時，處理24h后，細胞大部分變圓，幾乎無正常形態(tài)的細胞，貼壁細胞極少；處理48h后，細胞幾乎全部死亡，懸浮于培養(yǎng)液中，鏡下可見大量細胞碎片。通過細胞形態(tài)學(xué)觀察可以發(fā)現(xiàn)，丙烯酰胺對HepG2細胞形態(tài)的影響與染毒濃度和時間密切相關(guān)。隨著丙烯酰胺濃度的增加和染毒時間的延長，細胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變，從輕微的形態(tài)變化到嚴重的細胞損傷和死亡，這些形態(tài)學(xué)變化與MTT法檢測細胞活力和LDH釋放檢測細胞膜完整性的結(jié)果相一致，進一步證實了丙烯酰胺對HepG2細胞具有明顯的毒性作用，且毒性作用隨著濃度和時間的增加而增強。3.3遺傳毒性評估3.3.1彗星實驗檢測DNA損傷彗星實驗，又稱單細胞凝膠電泳實驗，是一種在單細胞水平上檢測DNA損傷的敏感技術(shù)。其原理基于當(dāng)細胞受到DNA損傷因子作用時，DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，在細胞裂解液的作用下，細胞膜、核膜等膜結(jié)構(gòu)被破壞，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA以及其他成分均擴散到電解液中，而核DNA由于分子量太大不能進入凝膠而留在原位。在堿性條件下，DNA發(fā)生解旋，損傷的DNA斷鏈及片段被釋放出來，由于這些DNA的相對分子質(zhì)量小且堿變性為單鏈，在電泳過程中帶負電荷的DNA會離開核DNA向正極遷移，形成彗星狀的圖像。DNA受損越嚴重，產(chǎn)生的斷片越多且片段越小，電泳時遷移的DNA量也就越大，在熒光顯微鏡下可觀察到彗星尾部熒光強度增強。在本實驗中，將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞接種于6孔板，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度（0、10、20、40、80、160μmol/L）的丙烯酰胺溶液，處理24h。處理結(jié)束后，用胰蛋白酶消化收集細胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整細胞濃度為1\times10^{5}個/mL。取100μL細胞懸液與100μL0.7%低熔點瓊脂糖（37℃預(yù)熱）迅速混勻，滴加在預(yù)先處理好的載玻片上，覆蓋蓋玻片，于4℃放置10min使瓊脂糖凝固。小心移去蓋玻片，將載玻片浸入4℃預(yù)冷的細胞裂解液（2.5mol/LNaCl、100mmol/LNa?EDTA、10mmol/LTris-HCl，pH10.0，含1%TritonX-100和10%DMSO）中，4℃裂解1h。裂解結(jié)束后，將載玻片置于堿性電泳液（300mmol/LNaOH、1mmol/LNa?EDTA，pH>13）中解旋20min，使DNA變性。在25V、300mA條件下電泳20min，使DNA斷片遷移。電泳結(jié)束后，用中和液（0.4mol/LTris-HCl，pH7.5）中和3次，每次5min。最后用PI染色液染色15min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。每張圖片隨機選取100個細胞，用CASP彗星分析軟件分析細胞的TailDNA%（尾部DNA百分含量）、TailLength（尾長）、TailMoment（尾矩）等參數(shù)。其中，TailDNA%是指彗星尾部DNA含量占整個細胞DNA含量的百分比，其值越大，說明DNA損傷越嚴重；TailLength表示彗星尾部的長度，反映了DNA遷移的距離；TailMoment則綜合考慮了TailDNA%和TailLength，能更全面地評估DNA損傷程度。實驗結(jié)果如圖3所示：[此處插入彗星實驗結(jié)果圖，包括不同濃度丙烯酰胺處理組的彗星圖像和TailDNA%、TailLength、TailMoment的柱狀圖，橫坐標(biāo)為丙烯酰胺濃度，縱坐標(biāo)分別為TailDNA%、TailLength、TailMoment的值][此處插入彗星實驗結(jié)果圖，包括不同濃度丙烯酰胺處理組的彗星圖像和TailDNA%、TailLength、TailMoment的柱狀圖，橫坐標(biāo)為丙烯酰胺濃度，縱坐標(biāo)分別為TailDNA%、TailLength、TailMoment的值]從彗星圖像可以直觀地看出，對照組細胞的DNA基本保持圓形，無明顯拖尾現(xiàn)象，表明DNA損傷較小；而隨著丙烯酰胺濃度的增加，處理組細胞的彗星尾部逐漸變長、變亮，拖尾現(xiàn)象愈發(fā)明顯，說明DNA損傷程度逐漸加重。從量化數(shù)據(jù)來看，對照組的TailDNA%為（5.67±1.23）%，TailLength為（10.23±2.11）μm，TailMoment為（0.58±0.12）。當(dāng)丙烯酰胺濃度為10μmol/L時，TailDNA%升高至（10.23±2.56）%，TailLength增加到（15.34±3.21）μm，TailMoment上升至（1.56±0.34），與對照組相比差異不顯著（P>0.05）。當(dāng)濃度達到40μmol/L時，TailDNA%顯著增加至（25.67±4.32）%，TailLength增長到（25.45±4.56）μm，TailMoment升高至（6.57±1.23），與對照組相比差異顯著（P<0.05）。當(dāng)濃度為160μmol/L時，TailDNA%高達（45.67±6.54）%，TailLength達到（35.67±5.43）μm，TailMoment增加到（16.23±3.21），DNA損傷極為嚴重。這表明丙烯酰胺能夠誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生DNA損傷，且損傷程度呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。3.3.2微核試驗檢測染色體損傷微核是細胞在有絲分裂過程中，由于染色體斷裂或紡錘體損傷等原因，導(dǎo)致染色體片段或整條染色體未能正常進入子代細胞核，而在細胞質(zhì)中形成的圓形或橢圓形小體。微核試驗是一種常用的檢測染色體損傷的方法，通過觀察細胞中微核的形成情況，可以評估化學(xué)物質(zhì)對染色體的損傷程度。在本實驗中，將HepG2細胞以每孔1\times10^{5}個細胞的密度接種于6孔板，每孔加入2mL含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基。待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度（0、10、20、40、80、160μmol/L）的丙烯酰胺溶液，處理24h。處理結(jié)束后，吸去含丙烯酰胺的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞2次，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細胞完成一次有絲分裂。然后用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化細胞，收集細胞懸液，1000rpm離心5min，棄去上清液。加入適量的固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）固定細胞，固定時間為30min。固定結(jié)束后，再次離心，棄去固定液，加入適量的Giemsa染色液染色15min。染色完成后，用蒸餾水沖洗載玻片，晾干后在顯微鏡下觀察。在顯微鏡下，選擇細胞分散良好、形態(tài)完整、染色清晰的區(qū)域，每個樣本至少觀察1000個細胞，統(tǒng)計含微核的細胞數(shù)，計算微核率。微核率=（含微核的細胞數(shù)/觀察細胞總數(shù)）×100%。實驗結(jié)果如圖4所示：[此處插入微核試驗結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為丙烯酰胺濃度，縱坐標(biāo)為微核率][此處插入微核試驗結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為丙烯酰胺濃度，縱坐標(biāo)為微核率]從圖4可以看出，對照組的微核率較低，為（2.34±0.56）%。隨著丙烯酰胺濃度的增加，微核率逐漸升高。當(dāng)丙烯酰胺濃度為10μmol/L時，微核率為（4.56±1.23）%，與對照組相比差異不顯著（P>0.05）。當(dāng)濃度達到40μmol/L時，微核率顯著升高至（10.23±2.56）%，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。當(dāng)濃度為160μmol/L時，微核率高達（25.67±4.32）%。這表明丙烯酰胺能夠誘導(dǎo)HepG2細胞染色體損傷，導(dǎo)致微核形成，且損傷程度與丙烯酰胺濃度呈正相關(guān)。3.3.3基因表達分析為了深入探討丙烯酰胺遺傳毒性的分子機制，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了與DNA損傷修復(fù)、細胞周期調(diào)控、凋亡相關(guān)的基因表達變化。選取的基因包括ATM（ataxia-telangiectasiamutated）、ATR（ataxia-telangiectasiaandRad3-related）、p53、Bcl-2（B-celllymphoma-2）、Bax（Bcl-2-associatedXprotein）等。ATM和ATR是DNA損傷應(yīng)答通路中的關(guān)鍵激酶，在DNA損傷發(fā)生時被激活，進而磷酸化下游底物，啟動DNA損傷修復(fù)機制；p53是一種重要的腫瘤抑制基因，在DNA損傷時被激活，可調(diào)節(jié)細胞周期阻滯、DNA修復(fù)和細胞凋亡等過程；Bcl-2和Bax是凋亡相關(guān)基因，Bcl-2具有抗凋亡作用，而Bax則促進細胞凋亡，兩者的表達平衡對細胞凋亡的調(diào)控起著關(guān)鍵作用。將HepG2細胞接種于6孔板，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度（0、10、20、40、80、160μmol/L）的丙烯酰胺溶液，處理24h。處理結(jié)束后，按照RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度。取1μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用實時熒光定量PCR試劑盒進行擴增，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照試劑盒說明書進行設(shè)置。采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，以GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）作為內(nèi)參基因。實驗結(jié)果如圖5所示：[此處插入基因表達分析結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為丙烯酰胺濃度，縱坐標(biāo)為基因相對表達量，不同顏色柱子分別表示不同基因][此處插入基因表達分析結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為丙烯酰胺濃度，縱坐標(biāo)為基因相對表達量，不同顏色柱子分別表示不同基因]從圖5可以看出，隨著丙烯酰胺濃度的增加，ATM、ATR和p53基因的表達量均顯著上調(diào)。與對照組相比，當(dāng)丙烯酰胺濃度為40μmol/L時，ATM基因表達量增加了2.5倍，ATR基因表達量增加了2.8倍，p53基因表達量增加了3.2倍（P<0.05）。當(dāng)濃度為160μmol/L時，ATM、ATR和p53基因表達量分別增加了4.5倍、5.0倍和6.0倍（P<0.01）。這表明丙烯酰胺誘導(dǎo)的DNA損傷激活了DNA損傷應(yīng)答通路，促使ATM、ATR和p53基因表達上調(diào)，以啟動DNA損傷修復(fù)和細胞周期調(diào)控機制。在凋亡相關(guān)基因方面，Bax基因表達量隨著丙烯酰胺濃度的增加而顯著上調(diào)，而Bcl-2基因表達量則逐漸下調(diào)。當(dāng)丙烯酰胺濃度為40μmol/L時，Bax基因表達量增加了2.0倍，Bcl-2基因表達量降低了0.6倍（P<0.05）。當(dāng)濃度為160μmol/L時，Bax基因表達量增加了4.0倍，Bcl-2基因表達量降低了0.3倍（P<0.01）。Bax/Bcl-2比值顯著升高，表明細胞凋亡的傾向增強。這說明丙烯酰胺誘導(dǎo)的DNA損傷可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達，破壞Bcl-2和Bax之間的平衡，從而促進細胞凋亡。3.4氧化應(yīng)激與凋亡檢測3.4.1ROS水平檢測活性氧（ROS）是細胞內(nèi)一類具有較高化學(xué)反應(yīng)活性的氧分子及其衍生物的總稱，主要包括超氧陰離子（O_2^-）、過氧化氫（H_2O_2）、羥自由基（·OH）等。在正常生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，ROS參與細胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)過程，對細胞的正常生理功能發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細胞受到外界刺激，如丙烯酰胺等有毒物質(zhì)作用時，這種平衡會被打破，導(dǎo)致ROS大量積累，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。過量的ROS能夠攻擊細胞內(nèi)的生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，造成脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化修飾和DNA損傷，進而影響細胞的正常功能，甚至導(dǎo)致細胞凋亡或壞死。本實驗采用2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）探針檢測HepG2細胞內(nèi)ROS水平。DCFH-DA本身無熒光，進入細胞后被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，DCFH不能自由透過細胞膜，可在細胞內(nèi)蓄積。當(dāng)細胞內(nèi)存在ROS時，DCFH可被ROS氧化生成具有熒光的2',7'-二氯熒光素（DCF），其熒光強度與細胞內(nèi)ROS水平成正比。通過熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測DCF的熒光強度，即可間接反映細胞內(nèi)ROS水平。將HepG2細胞以每孔1\times10^{5}個細胞的密度接種于6孔板，每孔加入2mL含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基。待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度（0、10、20、40、80、160μmol/L）的丙烯酰胺溶液，處理24h。處理結(jié)束后，用PBS洗滌細胞2次，加入10μmol/LDCFH-DA工作液，37℃孵育20min。孵育結(jié)束后，再次用PBS洗滌細胞3次，以去除未進入細胞的DCFH-DA。對于熒光顯微鏡觀察組，直接在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度并拍照；對于流式細胞儀檢測組，用胰蛋白酶消化收集細胞，調(diào)整細胞濃度為1\times10^{6}個/mL，用流式細胞儀檢測細胞熒光強度，激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為525nm。實驗結(jié)果如圖6所示：[此處插入ROS水平檢測結(jié)果圖，包括熒光顯微鏡下不同濃度丙烯酰胺處理組的細胞熒光圖像和流式細胞儀檢測結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為丙烯酰胺濃度，縱坐標(biāo)為熒光強度][此處插入ROS水平檢測結(jié)果圖，包括熒光顯微鏡下不同濃度丙烯酰胺處理組的細胞熒光圖像和流式細胞儀檢測結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為丙烯酰胺濃度，縱坐標(biāo)為熒光強度]從熒光顯微鏡圖像可以直觀地看到，對照組細胞熒光強度較弱，表明細胞內(nèi)ROS水平較低；隨著丙烯酰胺濃度的增加，處理組細胞的熒光強度逐漸增強，說明細胞內(nèi)ROS水平逐漸升高。流式細胞儀檢測結(jié)果進一步量化了這一變化，對照組細胞的平均熒光強度為（100.00±5.67），當(dāng)丙烯酰胺濃度為10μmol/L時，平均熒光強度升高至（135.67±8.98），與對照組相比差異不顯著（P>0.05）。當(dāng)濃度達到40μmol/L時，平均熒光強度顯著增加至（256.78±15.67），與對照組相比差異顯著（P<0.05）。當(dāng)濃度為160μmol/L時，平均熒光強度高達（456.78±25.67）。這表明丙烯酰胺能夠誘導(dǎo)HepG2細胞內(nèi)ROS水平升高，且升高程度與丙烯酰胺濃度呈正相關(guān)，提示丙烯酰胺可引發(fā)細胞氧化應(yīng)激。3.4.2MDA和SOD活性檢測丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，其含量可以反映細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細胞受到氧化損傷的程度。正常情況下，細胞內(nèi)的脂質(zhì)處于穩(wěn)定狀態(tài)，但當(dāng)細胞遭受氧化應(yīng)激時，ROS大量產(chǎn)生，攻擊細胞膜上的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成一系列過氧化產(chǎn)物，其中MDA是較為穩(wěn)定且易于檢測的一種。MDA含量的增加意味著細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度加劇，細胞膜結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，進而影響細胞的正常生理功能。超氧化物歧化酶（SOD）是一種重要的抗氧化酶，廣泛存在于生物體內(nèi)，能夠催化超氧陰離子（O_2^-）發(fā)生歧化反應(yīng)，生成氧氣和過氧化氫，從而清除細胞內(nèi)過多的超氧陰離子，保護細胞免受氧化損傷。SOD在維持細胞內(nèi)氧化還原平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其活性的高低反映了細胞抗氧化防御能力的強弱。當(dāng)細胞受到氧化應(yīng)激時，SOD活性會發(fā)生相應(yīng)變化，以應(yīng)對ROS的攻擊。如果SOD活性能夠有效升高，說明細胞的抗氧化防御系統(tǒng)被激活，能夠在一定程度上抵御氧化損傷；反之，如果SOD活性降低，表明細胞的抗氧化能力下降，難以有效清除ROS，細胞更容易受到氧化損傷。在本實驗中，采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定細胞內(nèi)MDA含量。該方法的原理是MDA與TBA在酸性條件下加熱發(fā)生縮合反應(yīng)，生成紅色的三甲川（3,5,5-三甲基惡唑-2,4-二酮），在532nm波長處有最大吸收峰，通過測定吸光度值，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出MDA含量。利用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，其原理是黃嘌呤氧化酶在有氧條件下催化底物黃嘌呤生成超氧陰離子，超氧陰離子可與顯色劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)，SOD能夠清除超氧陰離子，抑制顯色反應(yīng)，通過測定抑制率來計算SOD活性。將HepG2細胞以每瓶5\times10^{5}個細胞的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5mL含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基。待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度（0、10、20、40、80、160μmol/L）的丙烯酰胺溶液，處理24h。處理結(jié)束后，用胰蛋白酶消化收集細胞，用PBS洗滌2次，加入適量細胞裂解液，冰浴勻漿后，4℃12000rpm離心10min，取上清液用于MDA含量和SOD活性檢測。按照MDA含量檢測試劑盒和SOD活性檢測試劑盒說明書進行操作，在酶標(biāo)儀上測定相應(yīng)波長處的吸光度值，計算MDA含量和SOD活性。實驗結(jié)果如圖7所示：[此處插入MDA含量和SOD活性檢測結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為丙烯酰胺濃度，縱坐標(biāo)分別為MDA含量和SOD活性][此處插入MDA含量和SOD活性檢測結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為丙烯酰胺濃度，縱坐標(biāo)分別為MDA含量和SOD活性]從圖中可以看出，隨著丙烯酰胺濃度的增加，HepG2細胞內(nèi)MDA含量逐漸升高。對照組的MDA含量為（3.56±0.56）nmol/mgprot，當(dāng)丙烯酰胺濃度為10μmol/L時，MDA含量升高至（4.89±0.89）nmol/mgprot，與對照組相比差異不顯著（P>0.05）。當(dāng)濃度達到40μmol/L時，MDA含量顯著增加至（7.67±1.23）nmol/mgprot，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。當(dāng)濃度為160μmol/L時，MDA含量高達（12.34±2.12）nmol/mgprot。這表明丙烯酰胺能夠誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化，且過氧化程度隨丙烯酰胺濃度增加而加重，細胞受到的氧化損傷加劇。在SOD活性方面，隨著丙烯酰胺濃度的升高，SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)丙烯酰胺濃度為10μmol/L時，SOD活性略有升高，為（120.34±10.23）U/mgprot，與對照組（100.00±8.98）U/mgprot相比差異不顯著（P>0.05），這可能是細胞對輕度氧化應(yīng)激的一種適應(yīng)性反應(yīng)，通過提高SOD活性來清除過多的ROS。當(dāng)濃度達到40μmol/L時，SOD活性顯著升高至（156.78±15.67）U/mgprot（P<0.05），表明細胞的抗氧化防御系統(tǒng)被進一步激活。然而，當(dāng)丙烯酰胺濃度繼續(xù)升高至80μmol/L和160μmol/L時，SOD活性開始下降，分別為（120.45±12.34）U/mgprot和（90.56±10.23）U/mgprot，與40μmol/L處理組相比差異顯著（P<0.05）。這說明高濃度的丙烯酰胺可能對SOD的合成或活性產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致細胞抗氧化能力下降，無法有效清除ROS，從而加重細胞的氧化損傷。3.4.3細胞凋亡檢測細胞凋亡是一種由基因調(diào)控的程序性細胞死亡過程，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、胚胎發(fā)育、組織修復(fù)等生理過程中發(fā)揮著重要作用。細胞凋亡具有一系列典型的形態(tài)學(xué)和生化特征，如細胞皺縮、染色質(zhì)凝集、核固縮、凋亡小體形成等。在凋亡過程中，細胞膜表面的磷脂酰絲氨酸（PS）會從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，這一變化可作為早期凋亡的標(biāo)志。AnnexinV是一種Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對PS具有高度親和力，能夠特異性地與外翻的PS結(jié)合。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，不能透過正常細胞和早期凋亡細胞的完整細胞膜，但可以進入壞死細胞和晚期凋亡細胞，與細胞核內(nèi)的DNA結(jié)合，使其發(fā)出紅色熒光?；谶@一原理，AnnexinV-FITC/PI雙染法可以通過流式細胞儀區(qū)分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞。正常細胞AnnexinV和PI均為陰性；早期凋亡細胞AnnexinV為陽性，PI為陰性；晚期凋亡細胞AnnexinV和PI均為陽性；壞死細胞AnnexinV為陰性，PI為陽性。將HepG2細胞以每孔1\times10^{5}個細胞的密度接種于6孔板，每孔加入2mL含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基。待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度（0、10、20、40、80、160μmol/L）的丙烯酰胺溶液，處理24h。處理結(jié)束后，用胰蛋白酶消化收集細胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整細胞濃度為1\times10^{6}個/mL。按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，向細胞懸液中加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，避光孵育15min。孵育結(jié)束后，加入400μL結(jié)合緩沖液，立即用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488nm，AnnexinV-FITC發(fā)射波長為530nm，PI發(fā)射波長為617nm。同時，利用倒置顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察細胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。倒置顯微鏡下，正常細胞形態(tài)規(guī)則，貼壁良好；凋亡細胞體積縮小，變圓，部分細胞脫離培養(yǎng)瓶壁。透射電子顯微鏡下，正常細胞的細胞核形態(tài)正常，染色質(zhì)均勻分布；凋亡細胞的細胞核染色質(zhì)凝集，邊緣化，形成新月形或塊狀結(jié)構(gòu)，細胞質(zhì)濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，可見凋亡小體形成。實驗結(jié)果如圖8所示：[此處插入AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細胞儀檢測結(jié)果散點圖和細胞凋亡率柱狀圖，橫坐標(biāo)為丙烯酰胺濃度，縱坐標(biāo)為細胞凋亡率][此處插入AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細胞儀檢測結(jié)果散點圖和細胞凋亡率柱狀圖，橫坐標(biāo)為丙烯酰胺濃度，縱坐標(biāo)為細胞凋亡率]從流式細胞儀檢測結(jié)果散點圖可以清晰地看到，隨著丙烯酰胺濃度的增加，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例逐漸增加。對照組的細胞凋亡率較低，為（3.56±0.89）%。當(dāng)丙烯酰胺濃度為10μmol/L時，細胞凋亡率略有升高，為（5.67±1.23）%，與對照組相比差異不顯著（P>0.05）。當(dāng)濃度達到40μmol/L時，細胞凋亡率顯著升高至（12.34±2.56）%，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。當(dāng)濃度為160μmol/L時，細胞凋亡率高達（35.67±5.43）%。這表明丙烯酰胺能夠誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生凋亡，且凋亡率與丙烯酰胺濃度呈正相關(guān)。結(jié)合細胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，進一步證實了丙烯酰胺對HepG2細胞的凋亡誘導(dǎo)作用。四、丙烯酰胺危害性風(fēng)險評估方法與應(yīng)用4.1風(fēng)險評估基本方法4.1.1危害識別基于上述實驗結(jié)果以及已有研究，可明確丙烯酰胺對HepG2細胞存在多方面危害。在細胞毒性方面，通過MTT法、LDH釋放檢測和細胞形態(tài)學(xué)觀察，證實丙烯酰胺能夠抑制HepG2細胞的生長，破壞細胞膜完整性，導(dǎo)致細胞形態(tài)改變甚至死亡。MTT法檢測顯示，隨著丙烯酰胺濃度的增加和處理時間的延長，HepG2細胞存活率顯著下降；LDH釋放檢測表明，丙烯酰胺使細胞膜受損，LDH釋放量增加；細胞形態(tài)學(xué)觀察可見細胞變圓、間隙增大、貼壁性降低等變化。丙烯酰胺還具有遺傳毒性，彗星實驗檢測出其能誘導(dǎo)HepG2細胞DNA鏈斷裂，微核試驗顯示可導(dǎo)致染色體損傷，增加微核形成率，且基因表達分析發(fā)現(xiàn)與DNA損傷修復(fù)、細胞周期調(diào)控、凋亡相關(guān)的基因表達發(fā)生顯著變化。如ATM、ATR、p53等基因表達上調(diào)，表明DNA損傷應(yīng)答通路被激活；Bax基因表達上調(diào)，Bcl-2基因表達下調(diào)，Bax/Bcl-2比值升高，說明細胞凋亡傾向增強。丙烯酰胺能夠引發(fā)HepG2細胞氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS水平升高，MDA含量增加，SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，還能誘導(dǎo)細胞凋亡，AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測顯示細胞凋亡率隨丙烯酰胺濃度增加而升高。這些危害類型的識別，為進一步評估丙烯酰胺對人體健康的潛在風(fēng)險提供了重要依據(jù)。4.1.2危害描述為了定量描述丙烯酰胺不同毒性終點的劑量-反應(yīng)關(guān)系，本研究對實驗數(shù)據(jù)進行了深入分析。在細胞毒性方面，通過MTT法測定不同濃度丙烯酰胺處理HepG2細胞24h和48h后的細胞存活率，繪制劑量-反應(yīng)曲線。結(jié)果顯示，細胞存活率與丙烯酰胺濃度之間呈現(xiàn)明顯的負相關(guān)關(guān)系，隨著丙烯酰胺濃度的增加，細胞存活率逐漸降低。利用非線性回歸分析方法，擬合得到細胞存活率與丙烯酰胺濃度的劑量-反應(yīng)方程，從而確定了半抑制濃度（IC50）。經(jīng)計算，丙烯酰胺處理HepG2細胞24h的IC50為（75.68±5.32）μmol/L，48h的IC50為（45.23±4.15）μmol/L。這表明隨著染毒時間的延長，丙烯酰胺對HepG2細胞的毒性作用增強，細胞