植物組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)范和操作規(guī)定一、植物組織培養(yǎng)技術(shù)概述

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是指在無菌條件下，通過人為控制環(huán)境因素，利用植物器官、組織或細胞作為外植體，在特定的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)其生長、分化或再生完整植株的一種生物技術(shù)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物育種、快速繁殖、種質(zhì)資源保存等領(lǐng)域。

（一）技術(shù)原理

1.無菌操作：防止微生物污染，確保外植體正常生長。

2.培養(yǎng)基營養(yǎng)：提供植物生長所需的水分、無機鹽、有機物和激素。

3.環(huán)境控制：調(diào)節(jié)溫度、光照、濕度等條件，優(yōu)化生長環(huán)境。

（二）技術(shù)優(yōu)勢

1.高效繁殖：短時間內(nèi)獲得大量種苗。

2.純系保持：避免雜交污染，保證品種純度。

3.抗病育種：篩選抗病基因型，提高作物抗逆性。

二、植物組織培養(yǎng)實驗室規(guī)范

為保證培養(yǎng)效果，需嚴(yán)格遵守實驗室操作規(guī)范。

（一）實驗室環(huán)境要求

1.溫度控制：培養(yǎng)室溫度維持在22±2℃，搖床培養(yǎng)溫度為25±1℃。

2.濕度管理：空氣相對濕度控制在50%-70%。

3.光照條件：光照強度3000-5000Lux，光照周期12小時/12小時。

（二）設(shè)備與器材準(zhǔn)備

1.高壓滅菌鍋：滅菌溫度121℃，壓力1.05kg/cm2，滅菌時間15-20分鐘。

2.超凈工作臺：凈化效率≥99.97%，操作臺面使用70%酒精消毒。

3.培養(yǎng)容器：使用一次性三角瓶或玻璃培養(yǎng)皿，容積根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模選擇。

三、培養(yǎng)基制備與滅菌

培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)的核心，需按標(biāo)準(zhǔn)制備并嚴(yán)格滅菌。

（一）培養(yǎng)基配方

1.基本培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基（含硝酸鎂4.4mg/L、硝酸鉀1.65mg/L等）。

2.激素添加：生長素（IAA0.1mg/L）、細胞分裂素（KT0.5mg/L）。

3.糖分補充：蔗糖30g/L，pH值調(diào)節(jié)至5.8±0.2。

（二）制備步驟

1.稱量：精確稱取培養(yǎng)基粉末，溶于蒸餾水中。

2.混合：加入蔗糖和瓊脂（0.8g/L），攪拌至完全溶解。

3.調(diào)pH：使用精密pH計檢測，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)。

（三）滅菌操作

1.滅菌前：用75%酒精擦拭容器外壁，封口膜扎緊瓶口。

2.滅菌過程：高壓滅菌鍋程序滅菌，滅菌后冷卻至45℃以下。

3.檢查：滅菌后培養(yǎng)基透明無沉淀，無異味。

四、外植體處理與接種

外植體消毒是決定培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

（一）外植體選擇

1.材料來源：選擇健康植株的嫩葉、莖尖或腋芽。

2.剪取標(biāo)準(zhǔn)：外植體大小控制在0.5-1cm2，無病蟲害。

（二）消毒流程

1.清洗：流水沖洗30分鐘，去除表面污物。

2.浸泡：75%酒精浸泡30秒，無菌水沖洗3次。

3.消毒：0.1%升汞溶液浸泡5分鐘，無菌水沖洗8次。

（三）接種操作（StepbyStep）

1.戴無菌手套，超凈臺內(nèi)操作。

2.用滅過菌的鑷子剪取外植體，置于無菌培養(yǎng)皿。

3.用滅過菌的接種針剔除多余組織，蘸取誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

4.將外植體接種至三角瓶，每瓶接種3-5塊。

5.用封口膜扎緊瓶口，貼上標(biāo)簽（品種、日期、培養(yǎng)基類型）。

五、培養(yǎng)管理

接種后需定期觀察并調(diào)整培養(yǎng)條件。

（一）初期管理

1.第1-2周：每日觀察污染情況，剔除發(fā)霉外植體。

2.培養(yǎng)基補充：若水分蒸發(fā)超過5%，需補充無菌水。

（二）生長階段管理

1.愈傷組織形成：調(diào)整IAA濃度至0.2mg/L，促進增殖。

2.芽分化：更換培養(yǎng)基，添加KT0.3mg/L，誘導(dǎo)芽生長。

（三）移栽管理

1.試管苗煉苗：逐步降低濕度，適應(yīng)外界環(huán)境。

2.移栽步驟：

(1)用多菌靈溶液浸泡根系30分鐘。

(2)移栽至蛭石和珍珠巖混合基質(zhì)。

(3)遮光保濕7天，逐步見光。

六、記錄與保存

培養(yǎng)過程需詳細記錄，優(yōu)秀材料進行保存。

（一）實驗記錄

1.記錄內(nèi)容：外植體類型、污染率、增殖率、移栽成活率。

2.數(shù)據(jù)分析：計算平均增殖系數(shù)（APC=再生芽數(shù)/接種外植體數(shù)）。

（二）種質(zhì)保存

1.低溫保存：液氮中保存脫毒苗，存活率≥90%。

2.懸浮培養(yǎng)：選擇生長旺盛的愈傷組織，定期轉(zhuǎn)接。

七、安全注意事項

操作過程中需注意以下事項，確保人員與設(shè)備安全。

（一）個人防護

1.佩戴口罩和手套，避免接觸培養(yǎng)基。

2.消毒殘留物需用10%漂白水處理，不可隨意丟棄。

（二）設(shè)備維護

1.超凈工作臺定期更換濾網(wǎng)，每月消毒1次。

2.滅菌鍋壓力表需校準(zhǔn)，防止超壓損壞。

（三）廢棄物處理

1.培養(yǎng)基廢液需中和pH后排放。

2.污染器材需滅菌后深埋或焚燒。

八、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)

為保證培養(yǎng)質(zhì)量，需定期檢測以下指標(biāo)。

（一）污染率控制

1.初期污染率＜2%，需調(diào)整消毒流程。

2.中期污染率＜5%，需加強無菌操作。

（二）生長指標(biāo)

1.芽增殖率：≥1.5，說明培養(yǎng)基適宜。

2.移栽成活率：≥85%，符合繁殖標(biāo)準(zhǔn)。

（三）復(fù)檢要求

1.每季度抽檢10%樣品，檢測根系和葉片形態(tài)。

2.發(fā)現(xiàn)異常立即隔離，追溯原因并改進流程。

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一、植物組織培養(yǎng)技術(shù)概述

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是指在無菌條件下，通過人為控制環(huán)境因素，利用植物器官、組織或細胞作為外植體，在特定的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)其生長、分化或再生完整植株的一種生物技術(shù)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物育種、快速繁殖、種質(zhì)資源保存、脫毒復(fù)壯、基因工程以及植物生理生化研究等領(lǐng)域。其核心在于模擬植物自然生長環(huán)境中的關(guān)鍵因子，并在嚴(yán)格無菌條件下避免微生物干擾。

（一）技術(shù)原理

1.無菌操作：微生物污染是組織培養(yǎng)的主要障礙。外植體及其周圍環(huán)境（培養(yǎng)基、器皿、操作空間）必須保持無菌狀態(tài)，以防止細菌、真菌等雜菌生長，否則會競爭營養(yǎng)、產(chǎn)生毒素，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。這通常通過嚴(yán)格的消毒程序和使用超凈工作臺或生物安全柜來實現(xiàn)。

具體操作包括：外植體表面消毒、培養(yǎng)基滅菌、操作人員手部和工具消毒、工作環(huán)境凈化等環(huán)節(jié)的嚴(yán)格把控。

2.培養(yǎng)基營養(yǎng)：植物生長所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)必須以適宜的比例和形式添加到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基通常由基本培養(yǎng)基、大量元素、微量元素、有機添加物（如蔗糖、甘露醇）和植物生長調(diào)節(jié)劑（激素）組成。

基本培養(yǎng)基提供必需的無機鹽和微量元素，如MS、B5、White等配方，根據(jù)不同植物需求選擇。

有機添加物主要是碳源（蔗糖最常用），提供能量和前體物質(zhì)，濃度通常為20-30g/L。

植物生長調(diào)節(jié)劑（激素）是誘導(dǎo)和調(diào)控組織分化的關(guān)鍵，主要包括生長素（如IAA、NAA、IBA）和細胞分裂素（如KT、BA、ZT、6-BA），其種類和濃度對愈傷組織形成、芽增殖、生根等階段至關(guān)重要。

3.環(huán)境控制：植物的生長受到溫度、光照強度、光周期、濕度等多種環(huán)境因素的深刻影響。需要通過調(diào)控這些因素來優(yōu)化培養(yǎng)效果。

溫度：細胞分裂和代謝活動需要適宜的溫度。一般培養(yǎng)室溫度維持在22-26℃，黑暗或弱光培養(yǎng)階段溫度可稍低；光照培養(yǎng)階段溫度可稍高。搖床培養(yǎng)通常比靜態(tài)培養(yǎng)溫度稍高（如25±1℃）。

光照：光照不僅提供能量（光合作用），其強度和光周期也影響形態(tài)建成和激素反應(yīng)。光照強度通常在2000-4000Lux之間，光周期根據(jù)需求設(shè)定（如12小時光照/12小時黑暗，或連續(xù)光照）。

濕度：培養(yǎng)室空氣相對濕度控制在50%-70%，過高易導(dǎo)致外植體表面濕潤，利于雜菌滋生；過低則可能導(dǎo)致培養(yǎng)基過快失水。

（二）技術(shù)優(yōu)勢

1.高效繁殖：對于難于種子繁殖或扦插繁殖的植物，組織培養(yǎng)可在短時間內(nèi)從一個外植體獲得大量后代，繁殖系數(shù)高。例如，某些蘭花或藥用植物可通過腋芽增殖，數(shù)周內(nèi)即可獲得數(shù)百個植株。

2.純系保持：通過無菌操作，可避免環(huán)境中的雜菌和病毒污染，保證培養(yǎng)物的純度。這對于保持品種優(yōu)良性狀、進行無病毒種苗生產(chǎn)尤為重要。

3.種質(zhì)資源保存：對于瀕危植物或少量珍稀材料，可通過建立種質(zhì)圃（如莖尖培養(yǎng)）或使用超低溫冷凍（液氮保存）技術(shù)進行長期保存，有效防止種質(zhì)退化。

4.脫毒復(fù)壯：許多通過扦插或種子繁殖的植株容易感染病毒。通過培養(yǎng)無病毒的meristematictissues（分生組織，如莖尖），可以獲得健康無病的種苗。

5.遺傳轉(zhuǎn)化與分子研究：組織培養(yǎng)是植物基因工程中不可或缺的環(huán)節(jié)，用于外植體的選擇、遺傳轉(zhuǎn)化體的再生以及后續(xù)的篩選和鑒定。同時，它也為研究植物細胞分化、基因表達調(diào)控等提供了重要的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

6.周年生產(chǎn)：不受季節(jié)和氣候限制，可在室內(nèi)進行全年不間斷的生產(chǎn)。

二、植物組織培養(yǎng)實驗室規(guī)范

為保證培養(yǎng)效果，延長設(shè)備使用壽命，并確保操作人員安全，需嚴(yán)格遵守實驗室操作規(guī)范。

（一）實驗室環(huán)境要求

1.物理環(huán)境：

選址：應(yīng)遠離易產(chǎn)生污染源的區(qū)域（如動物房、微生物實驗室），最好位于建筑物的上層。

布局：功能區(qū)域劃分明確，包括準(zhǔn)備區(qū)（清洗、消毒）、接種區(qū)（超凈工作臺）、培養(yǎng)區(qū)、滅菌區(qū)、儀器室等，人流物流分開。

墻壁與地面：使用耐腐蝕、易清潔的材料（如瓷磚），地面應(yīng)防滑、無縫隙，易于消毒。

空氣凈化：培養(yǎng)區(qū)和接種區(qū)最好有空氣凈化系統(tǒng)，或至少保持良好通風(fēng)。

2.溫度控制：培養(yǎng)室溫度應(yīng)穩(wěn)定，一般維持在22±2℃。使用恒溫恒濕培養(yǎng)箱或空調(diào)系統(tǒng)進行調(diào)控，并配備溫度記錄儀進行監(jiān)測。搖床培養(yǎng)的溫度應(yīng)單獨控制，通常為25±1℃。

3.濕度管理：空氣相對濕度控制在50%-70%。濕度過高易導(dǎo)致霉菌滋生，過低則培養(yǎng)基易失水。可通過除濕機或加濕器進行調(diào)節(jié)。

4.光照條件：培養(yǎng)室需提供適宜的光照。通常使用LED植物生長燈或熒光燈，光照強度控制在3000-5000Lux，以滿足大多數(shù)植物的生長需求。光照周期需精確控制，常用12小時光照/12小時黑暗（LD）或連續(xù)光照（CC），根據(jù)不同培養(yǎng)階段和植物種類調(diào)整。

5.潔凈度：接種操作區(qū)域（超凈工作臺）應(yīng)保持極高的潔凈度。超凈工作臺應(yīng)定期進行維護和更換濾網(wǎng)，確?？諝鉂崈舳冗_到≥99.97%。

（二）設(shè)備與器材準(zhǔn)備

1.高壓滅菌鍋：用于培養(yǎng)基、器皿、工具等的滅菌。應(yīng)選擇壓力蒸汽滅菌鍋，能殺滅細菌、真菌芽孢等微生物。操作時需嚴(yán)格按照規(guī)程進行，包括預(yù)熱、滅菌、冷卻等步驟。定期檢查壓力表、安全閥等是否正常，并記錄滅菌參數(shù)（溫度、壓力、時間）。

2.超凈工作臺/生物安全柜：用于外植體消毒、接種等無菌操作。使用前需開啟紫外燈照射30分鐘進行空間消毒，然后開啟通風(fēng)，待內(nèi)部塵埃粒子數(shù)降至規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)后方可使用。操作時需穿著無菌工作服、佩戴口罩和手套。操作結(jié)束后，關(guān)閉紫外燈，用70-75%酒精擦拭臺面和四周。

3.培養(yǎng)容器：根據(jù)培養(yǎng)目的選擇合適的容器。

三角瓶：容積有250mL、500mL、1000mL等，材質(zhì)為玻璃或塑料（聚乙烯、聚丙烯）。玻璃瓶耐高溫高壓，但易破碎；塑料瓶方便操作，不易破碎。瓶口需磨砂或使用棉塞、硅膠塞或封口膜封口。

培養(yǎng)皿：用于小規(guī)模培養(yǎng)、初代培養(yǎng)或觀察。有玻璃和塑料兩種。

試管：用于單外植體培養(yǎng)或小苗培養(yǎng)。

液體培養(yǎng)瓶：用于懸浮細胞培養(yǎng)。

所有容器在滅菌前均需用洗滌劑清洗干凈，并用70%酒精或去污劑浸泡消毒，最后清水沖洗干凈。

4.其他工具：

解剖鏡/顯微鏡：用于觀察外植體、愈傷組織、細胞等，選擇放大倍數(shù)可調(diào)的。

接種工具：滅過菌的鑷子（不同規(guī)格，用于夾取不同大小外植體）、接種針（用于剔除組織、轉(zhuǎn)移小塊組織）、解剖刀/剪刀（鋒利且易消毒）、藥匙（用于量取培養(yǎng)基粉末或激素）。

移液器：用于精確添加液體培養(yǎng)基或激素溶液。

標(biāo)簽：一次性塑料標(biāo)簽或玻璃標(biāo)簽，用于標(biāo)記培養(yǎng)信息（品種名稱、外植體類型、培養(yǎng)基成分、接種日期、處理編號等）。

封口膜：透氣性好且無菌的封口膜，如透氣性聚丙烯膜。

培養(yǎng)架：用于放置培養(yǎng)容器，確保各容器間有足夠間距，利于空氣流通和光照均勻。

搖床：用于液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)的振蕩，增加氧氣供應(yīng)和防止沉淀。需選擇無菌搖床。

三、培養(yǎng)基制備與滅菌

培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，其制備和滅菌過程必須嚴(yán)格規(guī)范。

（一）培養(yǎng)基配方

1.選擇基本培養(yǎng)基：根據(jù)培養(yǎng)目標(biāo)和植物種類選擇合適的配方。最常用的是MS（MurashigeandSkoog）培養(yǎng)基，其成分全面，適用于大多數(shù)植物組織培養(yǎng)。其他如B5（適用于需鹽量較低的植物）、White（早期常用，成分較簡單）、N6（適用于禾谷類作物）等。

大量元素：氮(N)、磷(P)、鉀(K)、鈣(Ca)、鎂(Mg)、硫(S)等，通常以硝酸鹽、磷酸鹽、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸鉀等形式存在。

微量元素：鐵(Fe)、錳(Mn)、鋅(Zn)、銅(Cu)、硼(B)、鉬(Mo)等，濃度較低，常以螯合態(tài)存在以提高吸收率（如EDTA-Fe）。

有機添加物：蔗糖（最常用，提供碳源和能量，濃度30g/L左右）或甘露醇（適用于某些對滲透壓敏感的植物）。有時也添加水解酪蛋白、椰子汁、硝基胍等作為有機氮源和生長促進劑。

2.添加植物生長調(diào)節(jié)劑（激素）：激素種類和濃度是調(diào)控組織分化方向的關(guān)鍵。

生長素類（Auxins）：如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）。主要誘導(dǎo)愈傷組織形成和生根。IAA和IBA相對溫和，NAA誘導(dǎo)生根能力強。

細胞分裂素類（Cytokinins）：如激動素（KT）、6-芐基腺嘌呤（BA）、玉米素（ZT）。主要誘導(dǎo)芽的分化和器官發(fā)生。BA效果較好且穩(wěn)定，KT對莖尖培養(yǎng)效果佳。

應(yīng)用示例：

初代培養(yǎng)/愈傷組織誘導(dǎo)：常用MS或B5培養(yǎng)基+IAA0.1-1.0mg/L+NAA0.1-0.5mg/L或單獨使用較高濃度的生長素。

芽增殖：常用MS或MS+蔗糖培養(yǎng)基+BA1.0-3.0mg/L+IBA0.1mg/L。

生根：常用1/2MS或1/2B5培養(yǎng)基+IBA0.5-2.0mg/L或NAA0.5-1.0mg/L。

3.調(diào)節(jié)pH值：植物生長最適pH范圍通常在5.6-5.8。使用精密pH計測量培養(yǎng)基溶液的pH值，用0.1mol/LNaOH或HCl溶液進行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)后的培養(yǎng)基需立即過濾除菌（如果使用濾膜）或直接滅菌。

4.加入固化劑：大多數(shù)組織培養(yǎng)采用固體培養(yǎng)基，需加入瓊脂作為固化劑，濃度通常為0.8-1.2g/L。對于某些對高滲透壓敏感的植物或特定研究（如原生質(zhì)體培養(yǎng)），也可使用凝膠狀聚合物（如GellanGum、Agar-Agar）。

（二）制備步驟

1.稱量：精確稱取各種培養(yǎng)基粉末（如MS粉）、激素、蔗糖等。對于貴重或少量成分，可使用萬分之一分析天平；對于大宗成分，可使用千分之一天平。將稱好的粉末依次放入燒杯中。

2.溶解：加入適量蒸餾水或去離子水（通常為培養(yǎng)基終體積的90%-95%）。用玻璃棒或磁力攪拌器充分?jǐn)嚢瑁_保粉末完全溶解。對于難溶成分（如某些激素），可適當(dāng)加熱（如60-70℃，避免沸騰）或長時間攪拌促進溶解。

3.添加瓊脂（如需）：待培養(yǎng)基主要成分溶解后，加入計算好的瓊脂量。再次攪拌，確保瓊脂完全溶解。注意觀察是否有未溶解的瓊脂顆粒，如有需過濾除去。

4.調(diào)節(jié)pH：用pH計檢測培養(yǎng)基溶液的pH值，用NaOH或HCl溶液進行精確調(diào)節(jié)至目標(biāo)范圍（如5.8±0.2）。

5.分裝：將制備好的培養(yǎng)基倒入三角瓶或其他培養(yǎng)容器中。分裝量不宜過多，通常占容器容積的1/2-2/3，以避免滅菌后培養(yǎng)基過滿導(dǎo)致溢出或凝固不均?？墒褂靡埔浩骰騼A倒法分裝。

6.封口：用棉塞、硅膠塞或硅膠圈塞緊瓶口，確保密封良好，防止滅菌時培養(yǎng)基蒸發(fā)和外界微生物污染。也可使用透氣封口膜扎緊瓶口。

7.標(biāo)記：在封口膜外或瓶身上清晰標(biāo)注培養(yǎng)基類型（如MS+BA1.0）、激素濃度、制備日期、制備人等信息。

（三）滅菌操作

1.滅菌前準(zhǔn)備：再次檢查所有培養(yǎng)基瓶是否封口良好，標(biāo)簽信息是否清晰完整。將裝有培養(yǎng)基的滅菌鍋置于水平位置，關(guān)閉鍋門。

2.滅菌程序：設(shè)定滅菌參數(shù)。通常采用高壓蒸汽滅菌法，程序如下：

升溫階段：關(guān)閉排氣閥，開始加熱。壓力從0上升，當(dāng)壓力達到所需值（通常1.05kg/cm2，即表壓約1.05kg/cm2或101.3kPa以上的飽和蒸汽壓力），溫度達到121℃。

保壓階段：達到121℃和相應(yīng)壓力后，保持該狀態(tài)。保壓時間根據(jù)培養(yǎng)基體積和成分決定，一般液體培養(yǎng)基為15-20分鐘，含瓊脂的固體培養(yǎng)基為20-25分鐘。對于體積較大或成分復(fù)雜的培養(yǎng)基，保壓時間需適當(dāng)延長。

冷卻階段：滅菌結(jié)束后，自然冷卻或開啟排氣閥，使壓力緩慢降至常壓，然后開蓋取出。

3.滅菌后檢查：檢查培養(yǎng)基是否凝固良好，有無大面積沉淀或顏色異常。合格的培養(yǎng)基應(yīng)澄清透明，無異物。

4.滅菌效果確認：定期進行滅菌效果驗證，常用方法有：

指示劑法：在培養(yǎng)基中加入對熱敏感的指示劑（如溴甲酚綠或中性紅），若滅菌不徹底，指示劑顏色會發(fā)生變化。

微生物平板法：取少量滅菌后的培養(yǎng)基（或滅菌后的水），接種已知數(shù)量的微生物（如細菌孢子），培養(yǎng)后觀察菌落數(shù)是否達到無菌標(biāo)準(zhǔn)（菌落數(shù)應(yīng)為零或低于某個設(shè)定值）。

5.儲存：滅菌后的培養(yǎng)基應(yīng)盡快使用。若需保存，應(yīng)置于陰涼干燥處，避免陽光直射和潮濕，防止微生物污染或培養(yǎng)基成分降解。一般建議在1-2周內(nèi)使用完畢。

四、外植體處理與接種

外植體是組織培養(yǎng)的起點，其選擇、消毒和接種操作的規(guī)范性直接影響培養(yǎng)成功率。

（一）外植體選擇

1.材料來源：選擇健康、無病蟲害、生長旺盛的植株。最好在植株的營養(yǎng)生長期進行取樣。

2.部位選擇：不同外植體類型其培養(yǎng)難度和成功率不同。

莖尖/分生組織：最易誘導(dǎo)分化，是獲得無病毒苗的常用材料。通常選擇0.5-2mm的莖尖。

腋芽：適合大量快速繁殖，尤其是在誘導(dǎo)芽增殖階段。

幼嫩葉片：適合誘導(dǎo)愈傷組織或直接生根（如某些蕨類）。

花瓣/花蕾：適合進行器官發(fā)生研究或花藥/花粉培養(yǎng)。

根尖：適合研究根的分化或脫毒。

3.生長狀況：避免選擇老化、黃化或受損傷的外植體。外植體大小應(yīng)適中，一般0.5-1cm2，過大或過小都不利于培養(yǎng)。

4.取樣時間：避免在雨天、露水未干或植株受到脅迫（如干旱、病蟲害）時取樣。

（二）消毒流程

消毒的目的是最大限度地殺死外植體表面的微生物，同時盡量減少對外植體自身造成的不良影響。

1.流水沖洗：用流動的清水沖洗外植體表面5-15分鐘，去除表面大部分的泥土、灰塵和部分微生物。

2.初步消毒（酒精）：將沖洗后的外植體放入盛有75%乙醇的容器中，浸泡30秒至2分鐘。酒精能迅速使微生物細胞脫水死亡，并具有一定的穿透性。操作需在超凈臺內(nèi)進行，避免外植體過度干燥。

3.酶處理（可選）：對于某些難以消毒的材料（如葉片），可在酒精處理后用1%-2%的洗滌劑或含表面活性劑的溶液浸泡5-10分鐘，有助于去除表面脂質(zhì)和粘液層，提高消毒效果。

4.主要消毒（升汞/次氯酸鈉）：這是關(guān)鍵步驟，能有效殺滅細菌和真菌。常用方法有兩種：

升汞（HgCl?）消毒：溶液濃度通常為0.1%-0.5%。優(yōu)點是殺菌力強。操作時需小心，避免接觸過多，并佩戴手套。消毒時間一般5-15分鐘，具體時間根據(jù)材料類型和污染程度調(diào)整。消毒后需用無菌水充分沖洗多次（至少5-8次，每次3-5分鐘），以去除殘留的升汞。

次氯酸鈉（NaClO）消毒：常用0.1%-0.3%的溶液，可加入少量吐溫-20（Tween-20）提高表面活性。優(yōu)點是對植物組織相對溫和。消毒時間通常為10-20分鐘。消毒后同樣需用無菌水充分沖洗。

5.無菌水沖洗：消毒后，用無菌水（或用無菌空氣吹干）對每個外植體進行仔細沖洗，徹底去除殘留的消毒劑。這是非常關(guān)鍵的一步，殘留的消毒劑會嚴(yán)重損傷外植體。沖洗通常在超凈臺內(nèi)進行，每次換一批外植體前需用70-75%酒精噴灑臺面和工具進行消毒。

6.干燥：沖洗完畢后，將外植體置于無菌濾紙或無菌紗布上，在超凈臺內(nèi)自然晾干或在無菌條件下用無菌吸水紙輕輕吸干表面水分。注意避免用手直接接觸外植體。

（三）接種操作（StepbyStep）

接種操作必須在嚴(yán)格無菌條件下進行，通常在超凈工作臺內(nèi)完成。

1.準(zhǔn)備階段：

進入超凈工作臺前，更換潔凈工作服、口罩和手套。洗手并消毒。

開啟超凈工作臺紫外燈照射30分鐘進行空間消毒。同時，開啟通風(fēng)，讓空氣循環(huán)穩(wěn)定。

將滅菌后的培養(yǎng)容器、接種工具、培養(yǎng)基等放置在超凈工作臺操作臺面上。用70-75%酒精噴灑所有物品表面。

戴上無菌手套，檢查手套是否完好。

2.外植體轉(zhuǎn)移：

在酒精燈火焰（或超凈臺內(nèi)紫外燈）旁，用無菌鑷子夾取消毒后的外植體。

輕輕放入無菌培養(yǎng)皿中，避免碰撞和污染。

3.外植體處理：

根據(jù)需要，用滅過菌的解剖刀、剪刀或接種針，在超凈臺內(nèi)仔細去除外植體表面的污物、壞死組織或過大的部分。

對于莖尖，需用解剖針剔除周圍的葉片和皮下組織，保留最頂端0.5-2mm的莖尖。

確保每個外植體都處理干凈，形態(tài)完整。

4.接種：

用滅過菌的接種針或鑷子，將處理好的外植體小心地轉(zhuǎn)移到對應(yīng)的培養(yǎng)容器中。

每個容器接種的外植體數(shù)量和位置要合理，避免過于擁擠，保證各外植體間有足夠的生長空間和光照。

將外植體放置在培養(yǎng)基表面或按照預(yù)期方向固定（如莖尖倒置）。

5.添加激素（如需）：

對于需要額外激素誘導(dǎo)的情況，可用滅過菌的接種針蘸取適量的激素溶液（預(yù)先配好并過濾除菌），輕輕涂抹或滴加到外植體特定部位（如分生組織處）。

6.封口與標(biāo)記：

用滅過菌的封口膜輕輕蓋住培養(yǎng)容器口，或塞上棉塞/硅膠塞，確保密封良好但允許氣體交換。

在封口膜外或瓶身上粘貼/寫上標(biāo)簽，信息包括：品種名稱、外植體類型、培養(yǎng)基成分及濃度、接種日期、處理編號、制備人等。信息必須清晰、準(zhǔn)確、永久。

7.移出與記錄：

戴著無菌手套，小心地將接種好的培養(yǎng)容器移出超凈工作臺。

立即記錄接種的外植體數(shù)量、種類、容器編號等信息。

將培養(yǎng)容器放入培養(yǎng)室中，按照設(shè)定的光照和溫度條件進行培養(yǎng)。

五、培養(yǎng)管理

接種后的培養(yǎng)過程需要定期觀察、記錄和調(diào)整，以創(chuàng)造最佳生長環(huán)境。

（一）初期管理（0-4周）

1.環(huán)境適應(yīng)：剛接種的外植體需要適應(yīng)新環(huán)境。初期可適當(dāng)降低光照強度或延長黑暗時間，保持較高濕度，避免水分過快蒸發(fā)。

2.污染監(jiān)控：每日或隔日檢查培養(yǎng)容器，重點觀察外植體周圍是否有霉菌、細菌生長（表現(xiàn)為透明水漬狀、渾濁、顏色改變等）。一旦發(fā)現(xiàn)污染，立即隔離，分析原因，并按規(guī)定處理（如銷毀、記錄）。

3.培養(yǎng)基補充（如需）：如果培養(yǎng)基表面水分蒸發(fā)較多（如超過培養(yǎng)基體積的5%），可在超凈工作臺內(nèi)用注射器或移液器補充無菌水。注意避免帶入微生物。

4.生長觀察：觀察外植體是否存活，是否有愈傷組織開始形成，是否有污染跡象。記錄存活率。

（二）生長階段管理（5-8周或更長）

1.愈傷組織誘導(dǎo)與生長：如果是愈傷組織誘導(dǎo)階段，觀察愈傷組織的顏色、形態(tài)和生長速度。根據(jù)愈傷組織的生長情況，可能需要更換培養(yǎng)基（如從生長素為主轉(zhuǎn)向細胞分裂素為主）或調(diào)整培養(yǎng)基成分（如降低蔗糖濃度）。

2.芽分化：當(dāng)愈傷組織開始分化出芽原基或直接從外植體上長出不定芽時，需及時轉(zhuǎn)移（繼代培養(yǎng)）到芽增殖培養(yǎng)基上，以解除營養(yǎng)生長，促進芽的萌發(fā)和增殖。

3.生長調(diào)節(jié)劑調(diào)整：根據(jù)分化情況，可能需要調(diào)整培養(yǎng)基中激素的種類和比例。例如，增殖階段可增加細胞分裂素濃度，生根階段可增加生長素濃度。

4.光照與溫度：按照預(yù)定方案提供光照和溫度。對于需要光照的階段，確保光照強度和光周期正確。對于黑暗培養(yǎng)，需確保環(huán)境黑暗。

5.通風(fēng)與濕度：保持培養(yǎng)室空氣流通，防止?jié)穸冗^高。定期檢查培養(yǎng)架和容器，確保無霉菌滋生。

（三）移栽管理（8周后或根據(jù)需要）

當(dāng)培養(yǎng)的試管苗長到一定大小（如莖高1-3cm，具有幾片真葉），且根系初步形成時，即可進行煉苗和移栽。

1.煉苗（馴化）：試管苗長期處于無菌高濕環(huán)境，需逐步適應(yīng)外界環(huán)境。移栽前7-10天開始煉苗：

第1-3天：打開封口膜一半，每天逐漸增加開敞時間。

第4-7天：完全打開封口膜，放置在培養(yǎng)室或溫室中，降低濕度（如60%左右），逐步增加光照強度，并適當(dāng)通風(fēng)。

目標(biāo)是使試管苗適應(yīng)較低濕度、正常光照和可能存在的微生物環(huán)境。

2.移栽步驟：

準(zhǔn)備基質(zhì)：使用清潔、疏松、透氣、保水性好的基質(zhì)，如蛭石、珍珠巖、泥炭土與沙的混合物，可預(yù)先用殺菌劑消毒。

移栽操作：戴手套，小心地從試管中取出試管苗。注意保護幼嫩的根系和莖葉。如有條件，可先用多菌靈溶液或生根粉溶液浸泡根系幾分鐘。

(1)將試管苗栽入基質(zhì)中，深度以埋住根部為宜，注意不要損傷莖基。

(2)輕輕壓實基質(zhì)，使根系與基質(zhì)緊密接觸。

(3)每盆栽1-2株，保證生長空間。

緩苗管理：移栽后立即澆透水（使用無菌水），放置在陰涼、濕潤、散射光處緩苗。初期遮光50%-70%，保持基質(zhì)濕潤，避免強光直射和高溫。

(1)緩苗期間每天噴霧1-2次，保持空氣和基質(zhì)濕度。

(2)3-5天后，若試管苗狀態(tài)良好，可逐漸增加光照，移至正常光照環(huán)境。

(3)7-10天后，若生長正常，可停止遮光，正常管理。

日常管理：緩苗成功后，按常規(guī)植物進行澆水、施肥（少量緩釋肥）、病蟲害防治等管理。

六、記錄與保存

詳細、準(zhǔn)確的記錄是組織培養(yǎng)工作的重要環(huán)節(jié)，有助于分析結(jié)果、優(yōu)化流程和知識產(chǎn)權(quán)保護。同時，優(yōu)秀的培養(yǎng)物需要進行保存。

（一）實驗記錄

1.記錄內(nèi)容：建立完善的實驗記錄本或數(shù)據(jù)庫，記錄以下信息：

基本信息：植物品種名稱、學(xué)名、來源、采集時間、編號。

外植體信息：外植體類型、大小、數(shù)量、消毒方法、消毒時間、存活率。

培養(yǎng)基信息：培養(yǎng)基名稱（如MS+BA1.0）、配方（各種成分濃度）、pH值、滅菌條件（溫度、壓力、時間）。

接種信息：接種日期、接種量、接種人。

培養(yǎng)信息：培養(yǎng)條件（溫度、光照強度、光周期）、繼代培養(yǎng)次數(shù)、培養(yǎng)基更換時間。

生長觀察：各階段生長情況（如愈傷組織形成時間、芽增殖系數(shù)APC=再生芽數(shù)/接種外植體數(shù)、生根率、移栽成活率）、污染情況及處理措施。

照片/視頻：對典型生長階段、畸形現(xiàn)象等拍照或錄像，便于存檔和對比。

2.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析：定期對記錄的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計算關(guān)鍵指標(biāo)（如APC、成活率），比較不同處理間的差異，總結(jié)規(guī)律，為后續(xù)實驗提供依據(jù)。

3.結(jié)果歸檔：實驗結(jié)束后，將所有記錄整理歸檔，電子版和紙質(zhì)版妥善保存。

（二）種質(zhì)保存

對于有價值的培養(yǎng)物（如無病毒種苗、優(yōu)良變異體、特定基因型），需要進行長期保存，防止丟失。

1.低溫保存（超低溫冷凍）：將生長旺盛的愈傷組織、原生質(zhì)體或幼嫩植株（如莖尖、腋芽）置于冷凍保護劑（如甘露醇、DMSO）溶液中預(yù)處理，然后快速投入液氮（-196℃）中保存。

優(yōu)點：保存時間長，操作相對簡單，存活率較高（通過優(yōu)化程序可達90%以上）。

缺點：需要專用設(shè)備（液氮罐、冷凍儀），對操作技術(shù)要求較高。

2.種質(zhì)圃保存（繼代培養(yǎng)）：對于需要保持活性的材料，可定期（如每3-6個月）進行繼代培養(yǎng)，更新培養(yǎng)物，防止老化。

優(yōu)點：操作簡單，可隨時取用。

缺點：容易發(fā)生變異或污染，保存時間相對較短。

3.干燥保存（種質(zhì)資源庫）：對于某些耐旱的種子或組織，可在特定干燥條件下（如低溫干燥）進行保存，但技術(shù)要求更高。

七、安全注意事項

組織培養(yǎng)工作涉及化學(xué)品、微生物和可能產(chǎn)生尖銳廢棄物，必須嚴(yán)格遵守安全規(guī)范。

（一）個人防護

1.防護用品：操作時必須穿戴潔凈工作服、口罩、手套。處理有毒有害試劑（如升汞）或進行