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文檔簡介

1T/XXXXXXX—XXXX臨床疾病診斷用血液來源外泌體質(zhì)量控制規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了血液來源外泌體用于臨床疾病診斷的技術(shù)流程,包括臨床樣本收集、外泌體提取、標(biāo)準(zhǔn)品制備及使用方法、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等要求。適用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)、第三方檢測機(jī)構(gòu)及科研單位開展血液來源外泌體相關(guān)分子標(biāo)志物(如蛋白、核酸)的檢測與分析。不適用于外泌體治療產(chǎn)品或法醫(yī)學(xué)鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T32131-2015辣根過氧化物酶活性檢測方法比色法WS399-2012血液儲存指南T/SBIAORG001-2023間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)T/CRHA002-2021人多功能來源的小細(xì)胞外囊泡T/SHMHZQ003-2022細(xì)胞外泌體通用技術(shù)要求T/GDMDMA0001-2022白細(xì)胞介素6測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1外泌體Exosome細(xì)胞分泌的直徑30~150nm的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡,攜帶母細(xì)胞特異性生物標(biāo)志物(如CD9、CD63、TSG101等),廣泛存在于血液、尿液、腦脊液等體液中,是細(xì)胞間通訊的重要媒介。3.2血液來源外泌體Blood-derivedexosomes血液中存在的所有外泌體:包括但不限于來自血小板、白細(xì)胞、紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及組織器官內(nèi)細(xì)胞的外泌體。3.3表面標(biāo)志物Surfacemarker膜表面表達(dá)的特殊蛋白質(zhì)或者碳水化合物,可用于細(xì)胞間通訊和識別。3.4陽性標(biāo)準(zhǔn)品Positivestandard經(jīng)過嚴(yán)格鑒定、特性明確,且膜結(jié)構(gòu)、膜組分、粒徑及電荷等均與血液來源外泌體類似的穩(wěn)定外泌體樣本或者模擬物,用于校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法、驗(yàn)證檢測流程、評估實(shí)驗(yàn)室間可比性,是外泌體研究及臨床檢測標(biāo)準(zhǔn)化的核心工具。3.5陰性標(biāo)準(zhǔn)品Negativestandard經(jīng)過嚴(yán)格驗(yàn)證、不含目標(biāo)分析物(血液來源外泌體)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),且為血漿/血清中主要成分,用于驗(yàn)證提取方法的特異性。3.6提取效率ExtractionefficiencyT/XXXXXXX—XXXX2又稱回收率,指從混合樣本中分離并回收目標(biāo)分析物(血液來源外泌體)的能力,以目標(biāo)物在提取前后的回收率百分比表示。3.7提取純度Extractionpurity從混合樣本中分離并回收目標(biāo)分析物的特異性,以非目標(biāo)雜質(zhì)(BSA、IgG、LDL/HDL顆粒、BSA聚集體)在最終提取產(chǎn)物中的占比表示。3.8提取重復(fù)性Extractionrepeatability在相同實(shí)驗(yàn)條件下(設(shè)備參數(shù)、試劑批次及操作流程等),多次獨(dú)立提取,其關(guān)鍵指標(biāo)(提取效率及提取純度等)的一致性程度。3.9標(biāo)準(zhǔn)差Standarddeviation離均差平方的算術(shù)平均數(shù)(即方差)。3.10變異系數(shù)Coefficientofvariation標(biāo)準(zhǔn)差與平均值的比值,一般用百分?jǐn)?shù)表示。4縮略語下列縮略語適用于本文件PB:磷酸緩沖液(Phosphatebuffer)PBS:磷酸緩沖鹽溶液(Phosphatebufferedsaline)HSA:人血清白蛋白(Humanserumalbumin)IgG:免疫球蛋白G(ImmunoglobulinG)LDL:低密度脂蛋白膽固醇(Low-densitylipoproteincholesterol)HDL:高密度脂蛋白膽固醇(High-densitylipoproteincholesterol)BSA:牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin)AE:吖啶酯(Acridineester)QC:質(zhì)量控制(Qualitycontrol)Ee:提取效率(Extractionefficiency)Ep:提取純度(Extractionpurity)CV:變異系數(shù)(Coefficientofvariation)5儀器設(shè)備及試劑5.1主要儀器冰箱(4℃、-20℃、-80℃)高速冷凍離心機(jī)移液器(10μL、200μL、1mL、5mL)渦旋儀超速離心機(jī)細(xì)胞培養(yǎng)箱組織研磨儀玻璃組織研磨器化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)5.2主要試劑PB緩沖液(pH7.4,6.0,8.0)生理鹽水T/XXXXXXX—XXXX3PEG6000/8000賴氨酸Tris-HCl溶液HEK293F細(xì)胞系蛋白酶抑制劑牛血清白蛋白吖啶酯-NHS6樣本采集、驗(yàn)收及保存6.1樣本采集及處理a)乳糜微粒等大脂蛋白顆粒在飲食攝入后濃度升高,為了減少其對外泌體提取的影響,取血前建議禁食10個小時以上。b)推薦使用血清樣本或者EDTA抗凝劑采血管收集的血漿樣本。血液樣本按照GB/T38576-2020,WS/T661—2020的要求采集。c)采集后,避免過度攪拌和低溫,并盡快處理成血漿或血清(建議不超過2h),按照采血試管生產(chǎn)商建議方式進(jìn)行離心,并確保已去除了殘余的細(xì)胞類物質(zhì),最大限度地減少血小板活化和外泌體釋放。d)若離心后的樣本上覆蓋著脂質(zhì)層,需轉(zhuǎn)移清澈的樣本(不含脂質(zhì)層)至新的樣本管;樣本經(jīng)凍融操作后,或本身含有纖維蛋白或其它顆粒物質(zhì),須進(jìn)行離心處理;不建議使用嚴(yán)重溶血(血紅蛋白>500mg/dL)、微生物污染和熱滅活的樣本。6.2樣本驗(yàn)收a)血清/血漿樣本按照T/CSBT012-2024的要求驗(yàn)收。b)正常血清或血漿樣本應(yīng)為淡黃色,清澈透明,無肉眼可見乳白色或重度乳糜。為確??梢蕴崛∽懔客饷隗w,樣本量應(yīng)不低于2mL。6.3樣本保存a)血清/血漿樣本按照WS399-2012的要求保存。b)血清/血漿樣本在2℃~8℃保存不超過7天,在-25℃~-15℃保存不超過6個月;-80℃下可長期保存。7外泌體提取及鑒定7.1提取前處理a)血清/血漿樣本在4℃,12,000×g離心10min,使用移液管或移液槍從上往下抽取中間液體,留下最上層液體和底部沉淀,避免微顆粒(底部)和脂質(zhì)(上層)對外泌體提取產(chǎn)生的影響;b)將血清/血漿和PBS或生理鹽水按照1:1的比例稀釋,減少樣品粘度;c)使用0.45μm濾膜過濾經(jīng)過前處理的血清/血漿樣本。7.2外泌體提取基于外泌體的物理和生化特性差異(如粒徑、密度、表面標(biāo)志物等),目前已開發(fā)出多種基于差異化分離機(jī)制的商品化外泌體提取試劑盒。此外,實(shí)驗(yàn)室自主建立的優(yōu)化提取方案也被廣泛應(yīng)用,通過靈活調(diào)整多步驟分離技術(shù),以適配不同研究場景對提取效率、提取純度和穩(wěn)定性的差異化需求。不同分離方法原理及臨床適用性可參照附錄B。7.2.1商用化試劑盒提取:商品化試劑盒分離原理包括:包括聚合物沉淀法、免疫親和捕獲法、尺寸排阻色譜柱法、膜親和柱法、超聲納濾、離心微流控芯片等。當(dāng)使用專用于樣本處理、樣本提取或樣本富集的商品化試劑盒時,應(yīng)明確提取原理,根據(jù)實(shí)際應(yīng)用需求,嚴(yán)格遵循制造商的使用說明。T/XXXXXXX—XXXX47.2.2基于文獻(xiàn)調(diào)研的實(shí)驗(yàn)室自建方法提取基于差速離心法、聚合物沉淀法及免疫親和捕獲法等原理,可根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研形成實(shí)驗(yàn)室自建外泌體提取方法,需通過對實(shí)驗(yàn)條件系統(tǒng)性優(yōu)化確保分離效率與重復(fù)性。不同提取方法的技術(shù)要點(diǎn)可參照附錄7.3外泌體鑒定a)正常獲取得到的外泌體樣本應(yīng)為無色,清澈透明,無渾濁或顆粒物;外泌體均勻懸浮,無明顯分層或沉淀;為滿足后續(xù)檢測需要,樣本量應(yīng)不低于0.2mL。b)外泌體應(yīng)符合T/SBIAORG001-2023、T/CRHA002-2021、T/LNSI010-2024、T/SHMHZQ003-2022等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于外泌體電位、粒徑、形態(tài)、標(biāo)志蛋白及細(xì)菌/支原體/治病因子含量檢測標(biāo)準(zhǔn)。7.4外泌體保存提取后的外泌體樣本建議分裝,避免反復(fù)凍融(樣本凍融次數(shù)不超過3次)。外泌體在2℃~8℃保存不超過3天,-15℃~-25℃保存不超過6個月,-80℃下可長期保存。8外泌體質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)在臨床檢測中,外泌體作為液體活檢的核心靶標(biāo),外泌體的質(zhì)量控制(QC)是確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性、可比性及臨床決策安全性的前提,合成陰性與陽性標(biāo)準(zhǔn)品是外泌體質(zhì)量控制體系的核心,需通過精準(zhǔn)設(shè)計(jì)、嚴(yán)格驗(yàn)證和標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用確保其可靠性。陽性標(biāo)準(zhǔn)品用于評價外泌體提取方法對外泌體的提取效率;陰性標(biāo)準(zhǔn)品用于排除雜質(zhì)干擾,評價外泌體提取方法對外泌體的提取純度;陽性與陰性混合標(biāo)準(zhǔn)品,用于評價外泌體提取方法穩(wěn)定性,二者協(xié)同為外泌體臨床檢測的規(guī)范化提供技術(shù)保障。標(biāo)準(zhǔn)品合成和質(zhì)量控制符合國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(ISEV)發(fā)布的第三版細(xì)胞外囊泡國際指南《Minimalinformationforstudiesofextracellularvesicles(MISEV2023):Frombasictoadvancedapproaches》的規(guī)定。8.1標(biāo)準(zhǔn)品制備8.1.1陽性標(biāo)準(zhǔn)品制備使用差速離心方法分離HEK293F細(xì)胞外泌體作為陽性參考品,具體操作按照附錄D。8.1.2陰性標(biāo)準(zhǔn)品制備血液中影響外泌體提取純度的主要包括脂蛋白顆粒和游離的可溶性蛋白(包括白蛋白、免疫球蛋白和蛋白質(zhì)顆粒等)??墒褂没旌系鞍谆虻鞍最w粒作為陰性標(biāo)準(zhǔn)品,配方如下:表1陰性標(biāo)準(zhǔn)品配方成分濃度/比例模擬目標(biāo)來源BSA40~60mg/mL高豐度可溶性蛋白商業(yè)化無外泌體BSAIgG10-15mg/mL免疫球蛋白商業(yè)化IgGLDL/HDL顆粒1~5e12particles/mL脂蛋白自組裝法合成BSA聚集體0.1~0.5μg/mL白蛋白聚集體熱變性聚集方法合成緩沖液PBS(或生理鹽水)基質(zhì)pH7.4,過濾滅菌LDL/HDL顆粒、BSA聚集體合成方法參照附錄E。8.1.3標(biāo)準(zhǔn)品檢測探針標(biāo)記為了能夠?qū)?biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法定量分析,可將吖啶酯(AE)標(biāo)記到陽性/陰性標(biāo)準(zhǔn)品上,標(biāo)記方法參照附錄F。測試方法需滿足T/GDMDMA0001-2022(化學(xué)發(fā)光檢測方法)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢測要求,包括但不限于檢出限、準(zhǔn)確度及精密度等。。8.2標(biāo)準(zhǔn)品鑒定8.2.1陽性標(biāo)準(zhǔn)品鑒定T/XXXXXXX—XXXX5陽性標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)符合T/SBIAORG001-2023、T/CRHA002-2021、T/LNSI010-2024、T/SHMHZQ003-2022等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于外泌體電位、粒徑、形態(tài)及細(xì)菌/支原體/治病因子含量檢測標(biāo)準(zhǔn)。8.2.2陰性標(biāo)準(zhǔn)品鑒定陰性性標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)符合T/SBIAORG001-2023、T/CRHA002-2021、T/LNSI010-2024、T/SHMHZQ003-2022等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中細(xì)菌/支原體/治病因子含量檢測標(biāo)準(zhǔn)。其中陰性標(biāo)準(zhǔn)品主要成分應(yīng)符合血液樣本成分特征和《Minimalinformationforstudiesofextracellularvesicles(MISEV2023):Frombasictoadvancedapproaches》相關(guān)規(guī)定,具體如下:(1)LDL顆粒關(guān)鍵驗(yàn)證指標(biāo):粒徑(15~25nm);電位(-20~-10mV);(2)HDL顆粒關(guān)鍵驗(yàn)證指標(biāo):粒徑(5~12nm);電位(-5~5mV);(3)BSA聚集體關(guān)鍵驗(yàn)證指標(biāo):粒徑(50~100nm);電位(<-15mV)。8.3質(zhì)量控制指標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和需求,選取7.2中外泌體提取方法或其他實(shí)驗(yàn)室自建方法分別提取8.1合成及標(biāo)記后的陽性標(biāo)準(zhǔn)品試劑和陰性標(biāo)準(zhǔn)品試劑,并通過化學(xué)發(fā)光測試,計(jì)算提取效率(Ee%)、提取純度(Ep%)及提取重復(fù)性(CV%),評價外泌體提取方法在臨床檢測中的適用度。測試方法和計(jì)算方法分別參照附錄G、附錄H和附錄I。8.3.1質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)表2中列出了關(guān)于外泌體提取效率、提取純度和提取重復(fù)性的評價標(biāo)注與臨床意義,推薦使用表2中建議的質(zhì)量控制指標(biāo)評價外泌體提取方法在臨床檢測中的適用度,提高疾病檢測的準(zhǔn)確度和靈敏度。表2建議外泌體質(zhì)量控制指標(biāo)質(zhì)控指標(biāo)合格閾值判定邏輯與臨床意義備注提取效率Ee%>40%回收率過低導(dǎo)致檢測靈敏度不足;確保低濃度樣本檢出能力;即為擬使用的外泌體提取方對陽性標(biāo)準(zhǔn)品提取效率大于40%;提取純度Ep%>60%高純度減少假陽性干擾;提高檢測特異性;即為擬使用的外泌體提取方對陰性標(biāo)準(zhǔn)品提取效率小于60%;提取重復(fù)性同一樣本提取重復(fù)性:CV<10%不同樣本提取重復(fù)性:CV<12%高重復(fù)性是臨床檢測結(jié)果可比較性的基礎(chǔ);支持多中心研究和預(yù)后監(jiān)測即為擬使用的外泌體提取方法對同一比例陽性/陰性混合標(biāo)準(zhǔn)品提取結(jié)果的CV%小于10%;對不同比例陽性/陰性混合標(biāo)準(zhǔn)品提取結(jié)果的CV%小于12%;T/XXXXXXX—XXXX6附錄A(規(guī)范性附錄)血液來源外泌體用于疾病臨床診斷的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)流程示意圖T/XXXXXXX—XXXX7(規(guī)范性附錄)外泌體提取方法對比提取方法技術(shù)原理優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)臨床診斷適用性聚合物沉淀法加入高分子聚合物沉淀外泌體操作簡便已產(chǎn)品化蛋白污染高適用性強(qiáng)尺寸排阻色譜柱法利用凝膠過濾按粒徑分離囊泡與蛋白外泌體結(jié)構(gòu)完整純度適中已產(chǎn)品化難以分離尺寸相近的脂蛋白適用性強(qiáng)膜親和柱法結(jié)合膜材質(zhì)選擇性結(jié)合外泌體操作簡便重復(fù)性好已產(chǎn)品化成本高自動化程度低適用性強(qiáng)芯片法利用外泌體物理/生化性質(zhì)設(shè)計(jì)芯片用于外泌體富集自動化程度高速度快分離原理多需篩選使用適用性強(qiáng)免疫親和捕獲法利用CD63、CD81等表面蛋白抗體捕獲外泌體特異性高產(chǎn)量低成本高適用性弱差速離心法通過逐步增加離心力沉降不同大小組分操作方法成熟成本低時間長對設(shè)備需求高適用性弱超濾法通過不同孔徑的超濾膜離心,截留外泌體操作方法成熟設(shè)備成本低純度低重復(fù)性差適用性弱T/XXXXXXX—XXXX8(規(guī)范性附錄)實(shí)驗(yàn)室自建外泌體提取方法1.儀器和試劑高速離心機(jī)超高速離心機(jī)磁力架PBSPEG6000/8000磁珠外泌體靶標(biāo)抗體(如抗CD63、CD81、CD9抗體等)2.操作方法(1)差速離心法a)使用高速離心機(jī)將經(jīng)過前處理的血清/血漿樣本在4℃條件下100,000×g離心70min;b)棄上清,使用PBS重懸沉淀,再次在4℃條件下100,000×g離心100min(此步驟可選);c)棄上清,沉淀重懸于100μLPBS中,冰上保存。(2)聚合物沉淀法a)向經(jīng)過前處理的血清/血漿樣本中加入適量體積的PEG6000/8000溶液(終濃度為10%),充分混勻后于4℃孵育12h;b)經(jīng)3,000×g離心60min后收集沉淀,重懸于100μLPBS中,冰上保存。(3)免疫親和捕獲法a)將抗靶標(biāo)抗體(如抗CD63、CD81、CD9抗體等)與經(jīng)過活化磁珠室溫孵育1h,PBS洗滌去除未結(jié)合抗體,獲得偶聯(lián)靶向外泌體表面標(biāo)志物抗體的磁珠;b)將經(jīng)過前處理的血清/血漿樣本與磁珠混合,4℃輕柔震蕩孵育2h,使磁珠與外泌體結(jié)合;c)用磁力架吸附磁珠,棄上清,用PBS洗滌;d)加入洗脫液(甘氨酸-HCl、競爭性多肽或高鹽溶液)洗脫并富集外泌體,冰上保存。9(規(guī)范性附錄)陽性標(biāo)準(zhǔn)品制備方法1.儀器和試劑細(xì)胞培養(yǎng)箱超高速離心機(jī)HEK293F細(xì)胞HEK293F細(xì)胞專用無血清培養(yǎng)基PBS2.操作方法(1)使用細(xì)胞外泌體作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。細(xì)胞外泌體陽性標(biāo)準(zhǔn)品制備方法如下:a)使用HEK293F細(xì)胞專用無血清培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2,120rpm環(huán)境中,懸浮培養(yǎng),使細(xì)胞密度保持在0.5~5e6cells/mL;b)為了增加外泌體產(chǎn)量,可以添加金屬離子螯合劑或者0.5%低濃度血清(此步驟可選);c)按照附錄C外泌體分離方法中超速離心法收集外泌體;d)外泌體與凍干保護(hù)劑混合后冷凍干燥,密封保存于-20℃且不超過24個月;e)使用時加入PBS將其配置為濃度范圍在0.5~5e11particles/mL陽性標(biāo)準(zhǔn)品試劑。T/XXXXXXX—XXXX(規(guī)范性附錄)陰性標(biāo)準(zhǔn)品制備方法1.儀器和試劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀高速離心機(jī)擠出器水浴鍋超濾管膽固醇酯磷脂游離膽固醇氯仿ApoB-100ApoA-I2.制備方法(1)LDL/HDL顆粒合成需滿足以下條件:a)脂質(zhì)薄膜的制備:通過調(diào)整膽固醇酯,磷脂和游離膽固醇的比例,分別合成LDL和HDL的核心脂質(zhì)薄膜,LDL合成比例可參考:膽固醇酯:磷脂:游離膽固醇=65:25:10(w/w/wHDL合成比例可參考:膽固醇酯:磷脂:游離膽固醇=15:60:25(w/w/w將以上主要成分溶于氯仿,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成均勻薄膜;b)加入含ApoB-100(LDL合成)或ApoA-I(HDL合成)的緩沖液(pH7.4),超聲處理(37°C,30min~2h),形成乳濁液,隨后通過擠出器(根據(jù)粒徑需求選擇不同孔徑的聚碳酸酯膜)進(jìn)行均質(zhì)化;d)使用pH7.4的PBS重懸LDL/HDL顆粒后,與凍干保護(hù)劑混合后冷凍干燥,密封保存于-20℃且不超過24個月。(2)BSA聚集體合成需滿足以下條件:a)將BSA溶解在pH6.0的PB中,濃度范圍在1~10mg/mL;b)置于恒溫水浴鍋中加熱攪拌2~6h(70-80℃);d)使用pH7.4的PBS重懸BSA聚集體后,與凍干保護(hù)劑混合后冷凍干燥,密封保存于-20℃且不超過24個月。T/XXXXXXX—XXXX(規(guī)范性附錄)外泌體檢測探針標(biāo)記1.儀器和設(shè)備攪拌器二甲亞砜吖啶酯衍生物(AE-NHS)賴氨酸碳酸氫鈉(NaHCO3)2.標(biāo)記方法化學(xué)發(fā)光法憑借超高靈敏度、高通量及自動化成為臨床實(shí)驗(yàn)室的首選。以吖叮脂AE為例,采用直接化學(xué)偶聯(lián)法在陽性/陰性標(biāo)準(zhǔn)品表面標(biāo)記AE,為了提高標(biāo)記效率,選擇吖啶酯衍生物(AE-NHS)進(jìn)行外泌標(biāo)記。直接化學(xué)偶聯(lián)標(biāo)記方法應(yīng)滿足以下要求:a)陽性/陰性標(biāo)準(zhǔn)品分散在pH為8.0的PB中,濃度范圍在0.5~2e7particles/mL;b)AE-NHS溶于二甲亞砜(DMSO)溶液中,濃度范圍在1-20mM;c)將陽性標(biāo)準(zhǔn)品溶液和AE-NHS以不小于1:3(w/w)的比例混合(標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量/蛋白含量(μgAE-NHS(μg));d)避光反應(yīng)時間0.5~2h;e)加入10%賴氨酸0.2MNaHCO3(pH=9.0)溶液共孵育15~30min,終止反應(yīng);f)使用透析袋(25kD)進(jìn)行純化,去除游離AE-NHS;g)將標(biāo)記后的標(biāo)準(zhǔn)品使用動物血清(100,000×g超速離心6h去除外泌體)稀釋至0.5~2e7particles/mL,進(jìn)行保存;T/XXXXXXX—XXXX(規(guī)范性附錄)提取效率測試方法1.儀器和試劑化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)吖啶酯標(biāo)記的陽性標(biāo)準(zhǔn)品2.檢測步驟 提取效率是為了驗(yàn)證外泌體提取方法對外泌體的回收能力,測試方法如下: a)使用化學(xué)發(fā)光法測定3個以上檢測探針標(biāo)記的陽性標(biāo)準(zhǔn)品溶液,計(jì)算測試結(jié)果的平均值(Xa b)采用7.2中外泌體提取方法或其他實(shí)驗(yàn)室自建方法對陽性標(biāo)準(zhǔn)品樣本進(jìn)行3次及以上提?。?c)使用化學(xué)發(fā)光法對陽性標(biāo)準(zhǔn)品提取液進(jìn)行測定,計(jì)算測試結(jié)果的平均值(Ya3.計(jì)算方法按公式(1)計(jì)算Ee:式中:陽性標(biāo)準(zhǔn)品原液測試平均值;陽性標(biāo)準(zhǔn)品提取液測試平均值;V1―陽性標(biāo)準(zhǔn)品原液的體積;V2―陽性標(biāo)準(zhǔn)品提取液收集液體積;Ee―提取效率。(規(guī)范性附錄)提取純度測試方法1.儀器和試劑化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)吖啶酯標(biāo)記的陰性標(biāo)準(zhǔn)品2.檢測步驟 提取純度是為了驗(yàn)證外泌體提取方法區(qū)分外泌體與污染物的能力,測試方法如下: a)使用化學(xué)發(fā)光法測定3個以上檢測探針標(biāo)記的陰性標(biāo)準(zhǔn)品溶液,計(jì)算測試結(jié)果的平均值(Xb b)采用7.2中外泌體提取方法或其他實(shí)驗(yàn)室自建方法對陰性標(biāo)準(zhǔn)品樣本進(jìn)行3次及以上提??; c)使用化學(xué)發(fā)光法對陰性標(biāo)準(zhǔn)品提取液進(jìn)行測定,計(jì)算測試結(jié)果的平均值(Yb3.計(jì)算方法按公式(2)計(jì)算Ep:式中:―陰性標(biāo)準(zhǔn)品原液測試平均值;―陰性標(biāo)準(zhǔn)品提取液測試平均值;V3―陰性標(biāo)準(zhǔn)品原液的體積;V4―陰性標(biāo)準(zhǔn)品提取液收集液體積;Ep―提取純度。T/XXXXXXX—XXXX(規(guī)范性附錄)附錄提取重復(fù)性測試方法1.儀器和試劑化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)吖啶酯標(biāo)記的陽性標(biāo)準(zhǔn)品吖啶酯標(biāo)記的陰性標(biāo)準(zhǔn)品2.檢測步驟提取重復(fù)性是為了驗(yàn)證外泌體提取方法的穩(wěn)定性和一致性,包括對同一樣本提取重復(fù)性和對不同樣本提取重復(fù)性。對同一樣本提取重復(fù)性反映提取方法對實(shí)驗(yàn)操作的精細(xì)度要求,需通過標(biāo)準(zhǔn)化流程和自動化設(shè)備優(yōu)化;對不同樣本重復(fù)性體現(xiàn)方法的魯棒性,需通過樣本預(yù)處理優(yōu)化、提取方法改進(jìn)進(jìn)行優(yōu)化,一般使用變異系數(shù)(CV)進(jìn)行評價,測試方法如下:(1)對同一樣本提取重復(fù)性:a)將陽性標(biāo)準(zhǔn)品與陰性標(biāo)準(zhǔn)品按照某一固定比例混合(不小于1:1且不大于5:1;v/v),其中陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測探針的標(biāo)記; b)采用7.2中外泌體提取方法或其他實(shí)驗(yàn)室自建方法對不少于20個上述同一比例混合標(biāo)準(zhǔn)品樣本進(jìn)行提取; c)使用化學(xué)發(fā)光法對混合標(biāo)準(zhǔn)品提取液進(jìn)行測定,計(jì)算測試結(jié)果的平均值(X(2)對不同樣本提取重復(fù)性:d)將陽性標(biāo)準(zhǔn)品與陰性標(biāo)準(zhǔn)品按照不同比例混合(不小于1:1且不大于5:1;v/v),其中陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測探針的標(biāo)記;e)采用7.2中外泌體提取方法或其他實(shí)驗(yàn)室自建方法對不少于20個上述不同比例混合標(biāo)準(zhǔn)品樣本進(jìn) 行提取, f)使用化學(xué)發(fā)光法對混合標(biāo)準(zhǔn)品提取液進(jìn)行測定,計(jì)算測試結(jié)果的平均值(X3.計(jì)算方法分別按公式(3)和(4)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV式中:n―測定重復(fù)次數(shù);Xi―第i次的測定值;X―測定結(jié)果平均值;SD―標(biāo)準(zhǔn)差;CV―變異系數(shù)。T/XXXXXXX—XXXX參考文獻(xiàn)[1]GB/T38576-2020人類血液樣本采集與處理[2]WS/T661-2020靜脈血液標(biāo)本采集指南[3]T/CSBT012-2024全血及成分血外觀檢查和處置指南[4]WS399-2012血液儲存指南[5]Thebiology,function,a

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