廣州市第六中學(xué)

谷小慧課題3分解纖維素的微生物的分離主講人：纖維素是地球上含量最豐富的的多糖類物

質(zhì)。地球上的植物每年產(chǎn)生的纖維素超過70

億噸，其中40%～60%能被土壤中某些微生物分解利用，這是因為它們能夠產(chǎn)生纖維素酶。對這些微生物的研究與應(yīng)用，使人們能夠

利用秸稈等廢棄物生產(chǎn)酒精，用纖維素酶處

理服裝面料等。而要研究這些微生物，首先

需要將它們從土壤中種類眾多的微生物中分

離出來。在本課題中，我們將探討如何分離

土壤中能夠分解纖維素的微生物。纖維素的結(jié)構(gòu)式課題背景

分布：植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖維素。棉花是

自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物，此外，木材、作物秸稈

等也富含纖維素。

類別：纖維素(C6H10O5)n

，一種由葡萄糖首尾相連而成的高分

子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)。一、基礎(chǔ)知識1.纖維素與纖維素酶

功能：纖維素是植物細胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分。（1）纖維素纖維素的結(jié)構(gòu)式一、基礎(chǔ)知識1.纖維素與纖維素酶（2）纖維素酶

來源：廣泛存在于自然界的生物體中。細菌、

真菌等都能產(chǎn)生

纖維素酶。

化學(xué)本質(zhì)：蛋白質(zhì)

組成：C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶

葡萄糖苷酶

葡萄糖

G酶、

CX酶

纖維二糖纖維素

纖維素酶分解纖維素的實驗

思考：甲試管的作用是什么?11

mL10

mL+1mL

酶④在乙試管中加入1mL纖維素酶。⑤兩支試管固定在50mL錐形瓶中，放在轉(zhuǎn)速

為140r/min的搖床上振蕩1h（人工振蕩）。⑥結(jié)果：乙試管的濾紙條消失。⑦結(jié)論：纖維素酶可以分解纖維素。一、基礎(chǔ)知識1.纖維素與纖維素酶①取2支20

mL的試管。②各加入一張濾紙條（富含纖維素）。③各加入pH4.8、物質(zhì)的量濃度為0.1mol/L

的醋酸－醋酸鈉緩沖液11mL和10mL。甲

乙一、基礎(chǔ)知識2.纖維素分解菌的篩選（1）篩選的方法剛果紅(簡稱CR)：是一種染料，CR能與纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。剛果紅染色法：該方法可以通過顏色反應(yīng)直接對微生物進行篩選。（2）篩選的原理一、基礎(chǔ)知識2.纖維素分解菌的篩選（1）篩選的方法在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物?，F(xiàn)象：當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的紅色復(fù)合物就無

法形成(消失)，培養(yǎng)基中就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。剛果紅染色法：該方法可以通過顏色反應(yīng)直接對微生物進行篩選。結(jié)論:可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。（2）篩選的原理思考：本實驗流程與課題2中的

實驗流程有何異同？1.土壤取樣4.培養(yǎng)與觀察3.涂布平板2.樣品梯度稀釋04

涂布到鑒別培養(yǎng)基05

挑選透明圈的菌落03

樣品梯度稀釋02

選擇培養(yǎng)01

土壤取樣二、實驗設(shè)計01

土壤取樣1.纖維素分解菌大多分布在富含纖維素的土壤環(huán)境中。思考：為什么要在富含纖維素的環(huán)境中

尋找纖維素分解菌？在富含纖維素的環(huán)境中，纖

維素分解菌的含量相對較高。二、實驗設(shè)計2.如果找不到適合的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中30d。思考：將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應(yīng)該埋進土壤多深？一般應(yīng)將濾紙埋于深約10cm的腐殖質(zhì)土壤中。將濾紙埋在土壤中能使纖

維素分解菌相對聚集,實際上

是人工設(shè)置纖維素分解菌生存

的適宜環(huán)境。1.大多分布在富含纖維素的土壤環(huán)境中。01

土壤取樣二、實驗設(shè)計纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基

配方纖維素粉5gNaNO3

·

1gKH2PO4·

0.9gKCl

0.5g酵母膏0.5g水解酪素0.5g將上述物質(zhì)溶解后,用蒸餾水

定容到1000mL1.目的：增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。2.制備纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基。思考：此培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基還是

固體培養(yǎng)基？為什么？液體培養(yǎng)基，因為配方中無凝固劑（瓊脂）。02

選擇培養(yǎng)MgSO4

7H2O0.5gNa2HPO4

7H2O

1.2g二、實驗設(shè)計纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基

配方纖維素粉5gNaNO3

·

1gKH2PO4·

0.9gKCl

0.5g酵母膏0.5g水解酪素0.5g將上述物質(zhì)溶解后,用蒸餾水

定容到1000mL思考：這個培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進行選擇的？有選擇作用，本配方中富含纖維素，更適合能夠分解纖維素的微生物大量繁殖。1.目的：增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。2.制備纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基。02

選擇培養(yǎng)MgSO4

7H2O0.5gNa2HPO4

7H2O

1.2g二、實驗設(shè)計思考：如何進一步純化纖維素分解菌呢？纖維素粉5gNaNO3

·

1gKH2PO4·

0.9gKCl

0.5g酵母膏0.5g水解酪素0.5g將上述物質(zhì)溶解后,用蒸餾水

定容到1000mL思考：你能否設(shè)計一個對照實驗，說明

選擇培養(yǎng)的作用？1.目的：增加纖維素分解菌的濃度，以

確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。2.制備纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基。用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物，若選擇培養(yǎng)

基上微生物數(shù)量明顯少于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上

微生物的數(shù)量,則說明培養(yǎng)基起到了選擇作用。MgSO4

7H2O0.5gNa2HPO4

7H2O

1.2g二、實驗設(shè)計鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基配方CMC-Na酵母膏KH2PO4瓊脂土豆汁5-10g1g0.25g15g100

mL將上述物質(zhì)溶解后,用蒸餾水

定容到1000mL纖維素衍生物將選擇培養(yǎng)后的菌液進行梯度稀釋:1.制備鑒別培養(yǎng)基：03

樣品梯度稀釋04

涂布到鑒別培養(yǎng)基二、實驗設(shè)計方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛

果紅進行顏色反應(yīng)。方法二：在倒平板時就加入剛果紅。1.制備鑒別培養(yǎng)基：2.涂布平板：3.剛果紅染色法：04

涂布到鑒別培養(yǎng)基03

樣品梯度稀釋將選擇培養(yǎng)后的菌液進行梯度稀釋:二、實驗設(shè)計方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅

進行顏色反應(yīng)。3.剛果紅染色法：漂洗作用：洗去結(jié)合不牢的剛果紅。10-15min后

倒去CR溶液15min后倒

去NaCl溶液1mg/mLCR溶液透明圈二、實驗設(shè)計菌體

透明圈方法二：在倒平板時就加入剛果紅。3.剛果紅染色法：二、實驗設(shè)計將選擇培養(yǎng)后的菌液進行梯度稀釋:1.制備鑒別培養(yǎng)基：2.涂布平板：3.剛果紅染色法：思考：這兩種方法各有哪些優(yōu)點和不足？方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛

果紅進行顏色反應(yīng)。方法二：在倒平板時就加入剛果紅。04

涂布到鑒別培養(yǎng)基03

樣品梯度稀釋二、實驗設(shè)計方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅

進行顏色反應(yīng)。方法二：在倒平板時就加入剛果紅。3.剛果紅染色法：二、實驗設(shè)計思考：如何確定透明圈內(nèi)的菌落是纖維素分解菌？在產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，用接種針挑

取并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基，在30℃

左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，即實現(xiàn)了菌株的純化培養(yǎng)。05

挑選透明圈的菌落二、實驗設(shè)計纖維素酶測定方法：對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的葡萄糖進行定量測定。四、課題延伸纖維素酶

葡萄糖苷酶

葡萄糖

G酶、

CX酶

纖維二糖纖維素[2014年新課標(biāo)I卷]植物秸稈中的纖維素可被某些微生物分解。

回答下列問題:(1)分解秸稈中纖維素的微生物能分泌纖維素酶,該酶是由3種組

分組成的復(fù)合酶,其中的葡萄糖苷酶可將__纖維二糖__分解成__葡__萄_糖__。(2)在含纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅(CR)時,CR可與纖維素形

成紅__色復(fù)合物。用含有CR的該種培養(yǎng)基培養(yǎng)纖維素分解菌

時,培養(yǎng)基上會出現(xiàn)以該菌的菌落為中心的透明圈_。纖維素

纖維二糖

葡萄糖酵母膏無機鹽淀粉纖維素粉瓊脂CR溶液水培養(yǎng)基甲++++-++培養(yǎng)基乙+++-+++注

:“+”表示有,“-”表示無。據(jù)表判斷,培養(yǎng)基甲

不能_

(填“能”或“不能”)用于分離和鑒別纖

維素分解菌,原因是______液體培養(yǎng)基不能分離單菌落__________

;(3)為從富含纖維素的土壤中分離獲得纖維素分解菌的單菌落,某同學(xué)設(shè)計了甲、乙兩種培養(yǎng)基(成分見下表):酵母膏無機鹽淀粉纖維素粉瓊脂CR溶液水培養(yǎng)基甲++++-++培養(yǎng)基乙+++-+++注

:“+”表示有,“-”表示無。培養(yǎng)基乙

不能

__

(填“能”或“不能”)用于分離和鑒別纖維素分

解菌,原因是_培_養(yǎng)_基乙_中沒有纖_維素粉_,不_會_形_成_CR-纖_維_素紅色_復(fù)_合物_，____即_使__出_現(xiàn)_單_菌__落_也_不__能_確_定_其__為_纖_維__素_分_解_菌_。__________(3)為從富含纖維素的土壤中分離獲得纖維素分解菌的單菌落,某同學(xué)設(shè)計了甲、乙兩種培養(yǎng)基(成分見下表):（1）在過程④的選擇培養(yǎng)基是

固體____培養(yǎng)基，過程⑧的選擇培養(yǎng)基是

液體____培養(yǎng)基

(填“固體”或“液體”)。④的

選擇措施是

以尿素為唯一氮源___；⑧的選擇措施以纖維素為唯一碳源。2．從土壤中分離尿素分解菌和纖維素分解菌，具有下列類似

的操作過程：（2）在過程③樣品梯度稀釋后，一般只將稀釋度為

104～106

倍的菌液分別接種到