演講人：日期:激光共聚焦顯微鏡原理講解contents目錄系統(tǒng)核心結(jié)構(gòu)技術(shù)原理基礎(chǔ)成像工作機(jī)制關(guān)鍵組件解析應(yīng)用領(lǐng)域適配操作規(guī)范要點(diǎn)020103040506contentscontents01技術(shù)原理基礎(chǔ)激光光源特性單色性好相干性強(qiáng)亮度高方向性好激光光源發(fā)出的光波具有非常窄的波長(zhǎng)范圍，因此單色性非常好，使得激光光束具有很高的相干性。激光光束的波前振動(dòng)方向、振幅和相位都是一致的，這使得激光具有很好的相干性，可以進(jìn)行干涉和衍射等光學(xué)現(xiàn)象。激光光束的能量密度非常高，因此亮度也很高，可以使得樣品在非常短的時(shí)間內(nèi)被激發(fā)并發(fā)出熒光或拉曼散射光。激光光束的發(fā)散角非常小，具有很好的方向性，這使得激光光束可以被精確地聚焦到非常小的光點(diǎn)。共聚焦光學(xué)原理共聚焦成像非線性光學(xué)效應(yīng)激光掃描通過物鏡和聚光鏡將激光光束聚焦到樣品上的同一點(diǎn)，并收集樣品發(fā)出的熒光或反射光，只有來自焦點(diǎn)附近的光才能被探測(cè)器接收，從而提高了圖像的分辨率和對(duì)比度。激光光束在樣品上進(jìn)行掃描，通過移動(dòng)樣品或激光光束的位置，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品不同區(qū)域的逐點(diǎn)成像。當(dāng)激光光束的強(qiáng)度足夠高時(shí)，樣品會(huì)發(fā)生非線性光學(xué)效應(yīng)，如雙光子吸收、二次諧波生成等，這些效應(yīng)可以提供更豐富的樣品信息。光學(xué)層析技術(shù)優(yōu)勢(shì)無損檢測(cè)激光共聚焦顯微鏡可以在不破壞樣品的情況下對(duì)樣品進(jìn)行三維成像，這對(duì)于生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的活體檢測(cè)非常重要。01高分辨率由于激光光束的波長(zhǎng)非常短，因此可以實(shí)現(xiàn)很高的分辨率，可以觀察到樣品內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)。02三維成像激光共聚焦顯微鏡可以逐層掃描樣品，并通過圖像重建技術(shù)得到樣品的三維圖像，這對(duì)于研究樣品的立體結(jié)構(gòu)和空間分布非常有幫助。03定量測(cè)量激光共聚焦顯微鏡可以通過測(cè)量熒光或反射光的強(qiáng)度、波長(zhǎng)等參數(shù)，對(duì)樣品進(jìn)行定量分析和測(cè)量，為科學(xué)研究提供更加準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。0402系統(tǒng)核心結(jié)構(gòu)激光發(fā)射模塊產(chǎn)生高亮度、單色性好、相干性強(qiáng)的激光光束。激光器將激光光束進(jìn)行準(zhǔn)直，以保證光束的平行度和穩(wěn)定性。激光準(zhǔn)直系統(tǒng)調(diào)節(jié)激光的功率、偏振方向等參數(shù)，以滿足實(shí)驗(yàn)需求。激光調(diào)節(jié)裝置掃描振鏡系統(tǒng)通過電磁驅(qū)動(dòng)或壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)激光光束在樣品表面快速掃描。振鏡掃描透鏡掃描控制系統(tǒng)將振鏡反射的激光光束聚焦到樣品上，形成光斑并進(jìn)行掃描?？刂普耒R的振動(dòng)頻率、幅度等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)激光光束在樣品表面的精確控制。熒光檢測(cè)通道檢測(cè)器將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并進(jìn)行放大和處理，以便進(jìn)行后續(xù)成像和分析。03選擇性地透過特定波長(zhǎng)的熒光，濾除其他雜散光干擾。02熒光濾光片熒光收集系統(tǒng)收集樣品被激光激發(fā)產(chǎn)生的熒光，并將其傳輸?shù)綑z測(cè)器。0103成像工作機(jī)制點(diǎn)掃描成像模式激光逐點(diǎn)掃描激光束在樣品上逐點(diǎn)掃描，通過收集每個(gè)點(diǎn)的熒光信號(hào)來形成圖像。01高分辨率由于激光束的直徑非常小，可以實(shí)現(xiàn)高分辨率的成像。02適用于厚樣品可以對(duì)較厚的樣品進(jìn)行成像，因?yàn)榧す饪梢源┩笜悠繁砻妗?3通過物鏡將激光束聚焦到樣品內(nèi)部的某一層面，使得只有該層面的熒光分子被激發(fā)。激光束聚焦收集從被激發(fā)的熒光分子發(fā)出的熒光信號(hào)，并通過共聚焦系統(tǒng)將其傳輸?shù)教綔y(cè)器。熒光信號(hào)收集通過調(diào)整激光束的聚焦深度，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品不同層面的切片成像。切片厚度控制光學(xué)切片實(shí)現(xiàn)原理三維重構(gòu)技術(shù)路徑圖像采集圖像處理三維重建定量分析在樣品的不同層面進(jìn)行二維掃描，獲取一系列切片圖像。對(duì)采集的圖像進(jìn)行去噪、增強(qiáng)等處理，以提高圖像質(zhì)量。利用三維重建算法將處理后的二維圖像疊加起來，形成樣品的三維圖像。在三維圖像上進(jìn)行測(cè)量、分析等操作，獲取樣品的形態(tài)、結(jié)構(gòu)等信息。04關(guān)鍵組件解析針孔空間濾波器針孔直徑與深度針孔直徑需與波長(zhǎng)匹配，深度一般大于直徑的幾倍，以確保濾波效果。03可調(diào)式針孔濾波器、固定式針孔濾波器等，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。02濾波器類型針孔作用通過針孔對(duì)光束進(jìn)行空間濾波，消除非焦點(diǎn)光線干擾，提高分辨率。01光電倍增管作用光電轉(zhuǎn)換將接收到的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電子信號(hào)，進(jìn)行放大和檢測(cè)。01增益調(diào)節(jié)通過調(diào)節(jié)光電倍增管電壓等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)信號(hào)的放大倍數(shù)調(diào)節(jié)。02高靈敏度具有高靈敏度和低噪聲特點(diǎn)，適用于微弱熒光信號(hào)的檢測(cè)。03物鏡數(shù)值孔徑要求物鏡的數(shù)值孔徑（NA）是物鏡的重要參數(shù)，表示物鏡收集光的能力。數(shù)值孔徑定義數(shù)值孔徑越大，分辨率越高，成像質(zhì)量越好。數(shù)值孔徑與分辨率數(shù)值孔徑越大，景深越小，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適數(shù)值孔徑。數(shù)值孔徑與景深05應(yīng)用領(lǐng)域適配活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀測(cè)實(shí)時(shí)觀測(cè)高分辨率成像多層次觀測(cè)長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)通過激光共聚焦顯微鏡可以實(shí)時(shí)觀測(cè)活細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)過程，如細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂等。激光共聚焦顯微鏡具有高分辨率成像能力，可以清晰地觀測(cè)到細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)。通過調(diào)整焦距，可以對(duì)細(xì)胞的不同層面進(jìn)行觀測(cè)，從而獲得更加全面的細(xì)胞結(jié)構(gòu)信息。激光共聚焦顯微鏡對(duì)活細(xì)胞的損傷較小，可以進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)觀測(cè)。材料表面形貌分析三維形貌重建表面缺陷檢測(cè)粗糙度測(cè)量納米級(jí)分辨率激光共聚焦顯微鏡可以通過逐層掃描樣品表面，獲得樣品表面的三維形貌信息。通過對(duì)樣品表面的掃描，可以計(jì)算出表面的粗糙度參數(shù)，如平均粗糙度、最大粗糙度等。激光共聚焦顯微鏡可以檢測(cè)出樣品表面的微小缺陷，如裂紋、凸起、凹坑等。激光共聚焦顯微鏡的分辨率可以達(dá)到納米級(jí)別，可以應(yīng)用于納米材料的表面形貌分析。神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)研究突觸形態(tài)觀測(cè)激光共聚焦顯微鏡可以清晰地觀測(cè)到神經(jīng)突觸的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，包括突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜等。01突觸功能分析通過熒光標(biāo)記等技術(shù)，可以觀察神經(jīng)突觸的傳遞過程，研究突觸的功能和機(jī)制。02神經(jīng)元連接研究激光共聚焦顯微鏡可以觀測(cè)到神經(jīng)元之間的連接情況，研究神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成和功能。03神經(jīng)退行性疾病研究激光共聚焦顯微鏡可以用于研究神經(jīng)退行性疾病的病理過程，如阿爾茨海默病、帕金森病等。0406操作規(guī)范要點(diǎn)挑選符合實(shí)驗(yàn)要求的樣品，確保其表面平整、無劃痕、無污漬。樣品選擇對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)處理，如清洗、切割、染色等，以消除背景干擾，提高圖像清晰度。樣品處理將樣品放置在載物臺(tái)上，確保樣品平整、穩(wěn)固，避免在觀測(cè)過程中發(fā)生移動(dòng)或傾斜。樣品安裝樣品制備標(biāo)準(zhǔn)激光功率控制根據(jù)樣品特性及實(shí)驗(yàn)需求，選擇合適的激光功率，避免過高或過低的激光功率對(duì)樣品造成損傷或影響圖像質(zhì)量。激光功率調(diào)節(jié)激光穩(wěn)定性激光防護(hù)確保激光系統(tǒng)的穩(wěn)定性，避免激光功率波動(dòng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。在操作激光共聚焦顯微鏡時(shí)，需佩戴適當(dāng)?shù)募す夥雷o(hù)眼鏡，以保護(hù)眼睛免受激光傷害。圖像參數(shù)優(yōu)化分辨率設(shè)置根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選擇合適的分辨