ICSBT/CALAS95—實驗動 肝螺桿菌環(huán)介導等溫擴Laboratoryanimal-DetectionofHelicobacterhepaticusbyloop-mediatedisothermal 發(fā) 實中國實驗動物學會 GB/T1.1—2020給出的規(guī)則起草。A為資料性附錄。本文件由全國實驗動物標準化技術委員會（SAC/TC281）實驗動物LAMP檢測方法。（包括所有的修改單）GB GB/T 《轉基因產品檢測環(huán)介導等溫擴增loop-mediatedisothermal聚合酶（BstDNApolymerase）60℃～65℃恒溫15min～60min109～1010倍的核酸擴增，擴增產物由一系列復雜的大DNA混合而成。 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic 環(huán)介導等溫擴增（loop-mediatedisothermalamplification） 磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline）fla B（flagellinB）DNAflaB基因序列保守區(qū)域設計一組LAMP引物，包括外引物F3和B3、內引物FIP和BIP以及環(huán)引物LB，對DNALAMP擴增結果判定樣品中是否含有肝螺桿菌。LAMPF3B3FIPBIP第三篇實驗動物檢測方法系列標準第三篇實驗動物檢測方法系列標準實驗動物肝螺桿菌環(huán)介導等溫擴增（LAMP）實驗動物肝螺桿菌環(huán)介導等溫擴增（LAMP）可特異性識別靶序列上的6BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase啟動循環(huán)鏈置換反應，在flaB基因序列啟動互補鏈合成，在同一鏈上互補序列周而復始形成有許多環(huán)的花椰菜結構的莖-DNADNA合成時，從脫氧核糖核酸三磷酸底物（dNTP）中析出的焦磷酸離子與反應溶液中的鎂離子反應，產生大量白色焦磷酸鎂沉淀。焦磷酸鎂沉淀與鈣黃綠素結合，產生黃綠色熒光。因此，可以把渾濁度作為反應的指標，僅用肉眼觀察反應液顏色變化，即可判定擴增與否，無需繁瑣的電泳和紫外觀察。離心機：2000r/min～13000r/min水浴鍋或恒溫孵育器：60℃～65℃冰箱：2℃～5℃、–20℃微量移液器（0.1L～2L、1L～10L、10L～100L、100L～1000L）及無無菌透明離心管：1.5mL、5mL、15mLLAMP反應管（透明）試劑除特殊說明外，實驗所用試劑均為分析純或符合生化試劑標準，各溶液按照附錄A所DNADNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，貨DP302]或其他等效試劑。LAMP試劑：LAMPDNA擴增試劑盒（SLP204）本文件給出試劑盒相關信息是為了方便本文件使用者，并不表示對該產品的認可。如果其他產品具有相同的效果，那么可使用這些等效產品。去離子水溶解，–20℃1LAMP2.0g5mL4mLPBS，經勻漿后充分振蕩，3000r/min離心10min，吸取上清液轉至干凈離心管中編號備用。1mLPBS1.5mLPBS30min5mL無菌離心管中。取實驗動物飲水直接轉移5L無菌離心管中，備用。15mL30min5mL無菌離心管中。3次。DNA1mL～5mL上述樣本，10000r/min1min200μLGA20μLK220μLGB15s，70℃10min，溶液應變清亮，簡短離心以CB3中（吸附柱放入收集管中12000r/min30sCB3CB3500μLGD，12000r/min30s，倒掉廢液，將吸CB3放入收集管中。CB3600μLPW，12000r/min30s，倒掉廢液，將吸CB3放入收集管中。7.2.8PW12CB3放入收集管中。CB3放回收集管中，12000r/min2minCB350200μLTE2min～5min，12000r/min2min，將溶液收集到離DNA應盡快進行下一步反應。若暫不能進行，應凍存于–20℃?zhèn)溆?。LAMPLAMP2。2LAMP F3（5B3（5FIP（40BIP（40LB（20BstDNA聚合酶DNA6345minLAMP擴增。LAMP擴增結束后，肉眼觀察樣品反應管液體顏色，顯示為黃綠色判為陽性，橙色則GB19489規(guī)定執(zhí)行，由具備相關資質的工作人員進行相應操作；檢測過程中防止交叉污染的過程控制按照GB/T19495.2要求執(zhí)行。附錄（資料性附錄磷酸鹽緩沖液A0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O）27.6g，適量去離子水1000mL，混勻。B（Na2HPO4·7H2O53.6g71.6gNa2HPO4·2H2O35.6g），1000mL0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH7.2）A14mL、B36mL，加氯化鈉（NaCl）8.5g800mL去離子水溶解稀釋，HClpH7.21000mL12115min，冷卻備用。50×TAE0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0） 18.61g滅菌去離子 805mol/L氫氧化鈉溶 調pH至100mL，121℃、15min50×TAE三羥甲基氨基甲烷 242乙 57.10.5mol/LEDTA溶液 100100mL，121℃、15min溴化乙錠（EB）溶液（10溴化乙 10滅菌去離子 1含0.5g/mL溴化乙錠的2.0%瓊脂 21×TAE電泳緩沖 加至10010mg/mLEB5L，輕輕混勻，避免產3mm～5mm，需確認梳齒下或梳齒間沒有氣泡，待凝固后取出梳子備用。FoxJG,DewhirstFE,TullJG,etal.1994.Helicobacterhepaticussp.nov.amicroaerophilicbacteriumisolatedfromliversandintestinalmucosalscrapingsfrommice[J].JClinMicrobiol,32(5):1238-1245.M?hlerConvenorM,BerardM,FeinsteinR,etal.2014.FELASArecommendationsforthehealthmonitoringofmouse,rat,hamster,guineapigandrabbitcoloniesinbreedingandexperimentalunits[J].LabAnimal,48(3):NotomiT,OkayamaH,TmitaN,etal.2000.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA[J].NucleicAcidsRes,28(12):e63.SuerbaumS,JosenhansC,SterzenbachT.2003.ThecompletegenomesequenceofthecarcinogenicbacteriumHelicobacterhepaticus[J]．ProcNatlAcadSciUSA,100(13):790