分子生物學課件詳解演示文稿第1頁，共137頁。優(yōu)選分子生物學課件第2頁，共137頁。RNApolynucleotidechain2’-OHmakes3’,5’phosphodiesterbondunstableDNApolynucleotidechain第3頁，共137頁?；蜣D(zhuǎn)錄的特點：1.基因轉(zhuǎn)錄是基因表達的第一步，也是基因表達調(diào)控中最重要的環(huán)節(jié)；2.部分遺傳信息的傳遞，只有部分作為模板，基因的轉(zhuǎn)錄有時間和空間的差異；3.轉(zhuǎn)錄中存在鏈的選擇、起點和終點的選擇。第4頁，共137頁。4.基因轉(zhuǎn)錄只利用DNA雙鏈中的一條鏈作為模板，而另一條鏈不參與合成過程。模板鏈為無意義鏈，互補鏈為有意義鏈（編碼鏈）。有意義鏈無意義鏈只針對已確定的某一基因而言第5頁，共137頁。原核生物的基因轉(zhuǎn)錄1.轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因轉(zhuǎn)錄的控制關(guān)鍵——起始控制控制轉(zhuǎn)錄起始的因素：起始調(diào)控序列（順式調(diào)控元件）——啟動子轉(zhuǎn)錄因子（反式調(diào)控元件）——RNA聚合酶第6頁，共137頁。順式調(diào)控元件cisactingelements位于基因周圍能與特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而影響轉(zhuǎn)錄的DNA序列，包括啟動子、增強子等反式調(diào)控元件transactingfactors與DNA上特異序列結(jié)合的蛋白因子，對轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用。如ＲＮＡ聚合酶第7頁，共137頁。RNA聚合酶E.coli中由一種RNA聚合酶催化所有RNA的合成（mRNA、tRNA、rRNA和其它小分子RNA）E.coli的RNA聚合酶全酶由核心酶(

2、、’、亞基)和亞基組成；核心酶的功能：轉(zhuǎn)錄合成RNA，與DNA結(jié)合（非特異性的、松弛的），在的幫助下識別起始序列。

第8頁，共137頁。E.coli聚合酶亞基第9頁，共137頁。ProkaryoticRNApolymerasestructureRNApolymeraseofE.coliisamultisubunitproteinSubunit

Number

Role

a 2 uncertainb 1 formsphosphodiesterbondsb’ 1 bindsDNAtemplate

s 1 recognizespromoterand facilitatesinitiationa2bb’sa2bb’+sholoenzymecorepolymerasesigmafactor第10頁，共137頁。第11頁，共137頁。亞基—催化磷酸二酯鍵的合成

利福平rifampicin和利福酶素rifamycin能結(jié)合在亞基上抑制RNA鏈的合成的起始而不抑制鏈的延長，阻止第一個磷酸二酯鍵的合成。鏈酶溶菌素，結(jié)合在亞基上，抑制鏈的延伸。’亞基——堿性極強，與DNA模板結(jié)合的亞基；第12頁，共137頁。RNA轉(zhuǎn)錄的抑制劑第13頁，共137頁。亞基——二聚體，可能與啟動子的識別有關(guān)；亞基——不能獨立存在，本身無催化活性，當與核心酶結(jié)合，引起a2bb’構(gòu)象變化，改變核心酶與DNA結(jié)合的親合性和特異性。（一旦起始識別后，

因子脫落，核心酶才能延伸）E.coli中有多種不同亞基；亞基在決定RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用

第14頁，共137頁。第15頁，共137頁。由含

70RNA多聚酶全酶識別的典型大腸桿菌啟動子第16頁，共137頁。

此外，RNA聚合酶可能還有解旋酶和重新螺旋化及校正的功能。——全功能酶（識別、解旋、螺旋、聚合延伸、校正等功能）第17頁，共137頁。2.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列啟動子promoter操縱基因operator啟動子：RNA聚合酶全酶以很高的親合性結(jié)合在基因調(diào)控區(qū)的特定位點。原核生物啟動子序列-10區(qū)和-35區(qū)——必需序列第18頁，共137頁。啟動子結(jié)構(gòu)第19頁，共137頁。Promoterstructureinprokaryotes5’PuPuPuPuPuPuPuPuAUGPromoter+1+20-7-12-31-365’mRNAmRNATTGACAAACTGT-30regionTATAATATATTA-10region84795345%82TTG64ACA79T44T96%T95A59A51Aconsensussequences-30-10transcriptionstartsitePribnowbox+1[]第20頁，共137頁。-10區(qū)：在-6~-13bp之間，共同序列為TATAAT，又稱pribnow框，酶在此處與DNA結(jié)合成穩(wěn)定的復合物，在轉(zhuǎn)錄方向上解開雙鏈形成開放型起始結(jié)構(gòu)。-35區(qū)：共同序列為TTGACA，是RNA聚合酶起始識別區(qū)，這一識別過程與因子有關(guān)。

第21頁，共137頁。-10區(qū)和-35區(qū)相距約20bp，大致是雙螺旋繞兩周的長度，兩個結(jié)合區(qū)在分子的同一側(cè)面，能感覺到溝底堿基的特異形態(tài)。第22頁，共137頁。上節(jié)回顧：1.DNA損傷修復

2.基因轉(zhuǎn)錄基本概念,特點

3.原核生物RNA聚合酶第23頁，共137頁。3.轉(zhuǎn)錄過程起始：RNA聚合酶全酶識別-35區(qū)，再識別-10區(qū)，形成封閉型起始復合物轉(zhuǎn)錄起始位點處DNA解鏈，形成開放型起始復合物第一個核苷酸結(jié)合上去（多數(shù)是G/A、C）合成7-8個核苷酸，起始過程完成第24頁，共137頁。RNApolymeraseholoenzyme(+sfactor)

closedpromotercomplex(moderatelystable)thesigmasubunitbindstothe-10regiononceinitiationtakesplace,RNApolymerasedoesnotneedveryhighaffinityforthepromotersigmafactordissociatesfromthecorepolymeraseafterafewelongationreactionselongationtakesplacewiththecoreRNApolymerase

openpromotercomplex(highlystable)theholoenzymehasveryhighaffinityforpromoterregionsbecauseofsigmafactorssigmacanre-bindothercoreenzymesThesigmacycless第25頁，共137頁。TranscriptionRNApolymeraseclosedpromotercomplexopenpromotercomplexinitiationelongationterminationRNAproduct第26頁，共137頁。延伸：起始結(jié)束后，因子脫落，由核心酶沿模板鏈移動，完成延伸過程。核心酶在DNA鏈上覆蓋大約80bp，其中解鏈部分只有~18bp，RNA-DNA雜交鏈長度約12bp，當酶分子離開這一區(qū)域向前移動，DNA又形成雙鏈，RNA游離出來。第27頁，共137頁。RNA轉(zhuǎn)錄延伸期轉(zhuǎn)錄泡模型第28頁，共137頁。第29頁，共137頁。終止：終止序列—DNA上轉(zhuǎn)錄到一定位置后，轉(zhuǎn)錄停止，又叫終止子。特征：使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生一個頸環(huán)（發(fā)夾結(jié)構(gòu)），富含嘌呤，使RNA聚合酶延伸速度減慢，甚至停止。第30頁，共137頁。終止子結(jié)構(gòu)第31頁，共137頁。1.不需要ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止——強終止子特點：DNA序列有雙重對稱，形成末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)，模板DNA上有一串A，RNA3’端有UUUU，使新合成的RNA脫落。

第32頁，共137頁。不依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止第33頁，共137頁。2.需要ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止終止子后無連續(xù)的A，在ρ因子作用下，ATP酶水解，釋放能量，使新生RNA與模板脫落。第34頁，共137頁。依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止第35頁，共137頁。終止子：提供轉(zhuǎn)錄終止信號的一段DNA序列。

終止因子：協(xié)助RNA聚合酶識別終止子的蛋白質(zhì)輔助因子。

第36頁，共137頁。轉(zhuǎn)錄調(diào)控原核生物基因表達調(diào)控模型——操縱子模型操縱子operon：由幾個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因及其控制區(qū)組成，是基因表達的協(xié)同單位。操縱子的兩個類型：誘導型阻遏型第37頁，共137頁。誘導型：正常情況下基因不表達或表達水平低，在環(huán)境改變或誘導物存在時，才開放轉(zhuǎn)錄。（乳糖操縱子、半乳糖操縱子）阻遏型：正常情況下開放，當阻遏物出現(xiàn)時操縱子關(guān)閉。（色氨酸操縱子、組氨酸操縱子—組氨酸抑制了組氨酸操縱子的表達，避免把原料用于不必要的合成。）第38頁，共137頁。大腸桿菌乳糖操縱子

由三個結(jié)構(gòu)基因和一個調(diào)節(jié)基因構(gòu)成。

Z基因——編碼b-半乳糖苷酶Y基因——編碼b-半乳糖苷透性酶A基因——編碼b-半乳糖苷乙?；刚{(diào)節(jié)基因I——編碼阻遏蛋白操縱基因Ｏ第39頁，共137頁。lacIPOpromoter-operatorlacrepressorlacZlacYlacAThelactoseoperoninE.colib-galactosidasepermeaseacetylaseLACTOSEGLUCOSE+GALACTOSEb-galactosidasethefunctionofthelactose(lac)operonistoproducetheenzymesrequiredtometabolizelactoseforenergywhenitisrequiredbythecellpromoterbindsCAPandRNApolymeraseoperatorbindsthelacrepressor第40頁，共137頁。誘導表達：當培養(yǎng)基中無乳糖及其它誘導物時，抑制基因表達產(chǎn)生阻遏蛋白，與操縱基因結(jié)合，阻止結(jié)合在啟動子上的RNA聚合酶向前移動，轉(zhuǎn)錄不能進行；當培養(yǎng)基中有乳糖及其它誘導物時，誘導物與阻遏蛋白結(jié)合而不能與操縱基因結(jié)合，基因轉(zhuǎn)錄。第41頁，共137頁。第42頁，共137頁。葡萄糖效應：當細菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中生長時，通常優(yōu)先利用葡萄糖而不利用乳糖；只有當葡萄糖耗盡后，經(jīng)一段停滯期，在乳糖誘導下b-半乳糖苷酶開始合成，細菌才能充分利用乳糖的現(xiàn)象。大腸桿菌生長在含葡萄糖的培養(yǎng)基上時，b-半乳糖苷酶等分解代謝的活性很低，研究發(fā)現(xiàn)cAMP能解除葡萄糖的阻遏作用。第43頁，共137頁。CAP-環(huán)腺苷酸受體蛋白cAMP-環(huán)腺苷酸環(huán)化酶當CAP與cAMP結(jié)合后酶被活化，作用于啟動子前的CAP結(jié)合位點上，使RNA聚合酶容易結(jié)合到啟動子上，促進轉(zhuǎn)錄的進行。第44頁，共137頁。第45頁，共137頁。Regulationofthelactoseoperon-negativecontrollacIPOpromoter-operatorlacrepressorlacIPlacZlacYlacAtherepressortetramer

bindstotheoperatorandpreventsRNApolymerasefrombindingtothepromoterlacZlacYlacANOTRANSCRIPTIONRNApolRNApolymeraseisblockedfromthepromoter第46頁，共137頁。NOTRANSCRIPTIONwhenlactosebecomesavailable,itistakenupbythecellallolactose(anintermediateinthehydrolysisoflactose)isproducedonemoleculeofallolactosebindstoeachoftherepressorsubunitsbindingofallolactoseresultsinaconformationalchangeintherepressortheconformationalchangeresultsindecreasedaffinityoftherepressorfortheoperatoranddissociationoftherepressorfromtheDNAAlleviationofnegativecontrol-actionoftheinducerofthelacoperonallolactoselacIPlacZlacYlacAlacIPlacZlacYlacAIPTG(isopropylthiogalactoside)isalsousedasa(non-physiological)inducer第47頁，共137頁。lacIPlacZlacYlacANOTRANSCRIPTIONRNApolOrepressor(withboundallolactose)dissociatesfromtheoperatornegativecontrol(repression)isalleviated,however...RNApolymerasecannotformastablecomplexwiththepromoter第48頁，共137頁。lacIPOlacZlacYlacARegulationofthelactoseoperon-positivecontrolinthepresenceofbothlactoseandglucoseitisnotnecessaryforthecelltometabolizelactoseforenergyintheabsenceofglucoseandinthepresenceoflactoseitbecomesadvantageoustomakeuseoftheavailablelactoseforenergyintheabsenceofglucosecellssynthesizecyclicAMP(cAMP)cAMP1servesasapositiveregulatorofcataboliteoperons(lacoperon)cAMPbindsthedimericcAMPbindingprotein(CAP)2bindingofcAMPincreasestheaffinityofCAPforthepromoterbindingofCAPtothepromoterfacilitatesthebindingofRNApolymerase

1

cAMP=3’,5’cyclicadenosinemonophosphateactiveCAPinactiveCAPcAMP+NOTRANSCRIPTION2

alsotermedcataboliteactivatorprotein第49頁，共137頁。lacIlacrepressorlacZlacYlacAb-galactosidasepermeaseacetylaseRNApolTRANSCRIPTIONANDTRANSLATIONOCCURinactiverepressorActivationoflacoperontranscriptionthefunctionofthelactose(lac)operonistoproducetheenzymesrequiredtometabolizelactoseforenergywhenitisrequiredbythecell第50頁，共137頁。第51頁，共137頁。半乳糖苷酶基因表達的條件：CAP結(jié)合位點——CAP與cAMP結(jié)合，使RNA聚合酶識別-35和-10區(qū)；啟動子識別——RNA聚合酶識別啟動子序列；操縱基因——阻遏蛋白結(jié)合乳糖或類似物第52頁，共137頁。結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控方式：負調(diào)控——沒有調(diào)節(jié)蛋白時操縱子內(nèi)結(jié)構(gòu)基因表達，加入調(diào)節(jié)蛋白后操縱子內(nèi)結(jié)構(gòu)基因的活性被關(guān)閉。（阻遏蛋白對乳糖操縱子的負調(diào)控）正調(diào)控——沒有調(diào)節(jié)蛋白時結(jié)構(gòu)基因的活性關(guān)閉，加入調(diào)節(jié)蛋白后結(jié)構(gòu)基因的活性被開啟。（cAMP-CAP是一個正調(diào)節(jié)因子）第53頁，共137頁。調(diào)控序列：轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子：啟動子：-10、-35區(qū)RNA聚合酶（

）操縱基因阻遏蛋白CAP結(jié)合位點CAP+cAMP終止序列ρ因子第54頁，共137頁。真核生物基因轉(zhuǎn)錄特點：1.轉(zhuǎn)錄啟動子結(jié)構(gòu)復雜，不同類型的RNA有不同的啟動序列；2.多種RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄不同的RNA產(chǎn)物；3.多個調(diào)節(jié)因子參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；4.轉(zhuǎn)錄和翻譯在時間和空間上分隔，轉(zhuǎn)錄后存在廣泛的加工。第55頁，共137頁。RNA聚合酶１.種類真核生物中有三種RNA聚合酶(RNA聚合酶I、II、III),每一種RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄不同的RNA產(chǎn)物。酶酶活產(chǎn)物RNA聚合酶I50-70%rRANRNA聚合酶II20-40%hnRNA（mRNA的前體）RNA聚合酶III~10%tRNA和snRNA第56頁，共137頁。真核生物三種RNA聚合酶的比較第57頁，共137頁。２.ＲＮＡ聚合酶沒有全能性，必需有轉(zhuǎn)錄因子參與才有活性。３.特異性不同的ＲＮＡ聚合酶所識別的啟動子結(jié)構(gòu)不同。RNA聚合酶I——類型IRNA聚合酶II——類型IIRNA聚合酶III——類型III

第58頁，共137頁。RNA聚合酶I：由２～１３個亞基組成，其中最大的亞基約１６７０個氨基酸組成，具有結(jié)合模板－ＲＮＡ鏈和轉(zhuǎn)錄延伸的作用，位于核仁，轉(zhuǎn)錄ｒＲＮＡ,對抗生素ａ－鵝膏蕈堿不敏感。RNA聚合酶II：約５５０～６５０ＫＤ，８～１１個亞基，對低濃度的ａ－鵝膏蕈堿敏感。RNA聚合酶III：含鋅蛋白質(zhì)，由９～１５種亞基組成。第59頁，共137頁。真核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)1.類型I基因的調(diào)控區(qū)RNA聚合酶I作用的區(qū)域，產(chǎn)物rRNARNA聚合酶I只合成一種產(chǎn)物（40sRNA—未經(jīng)加工的rRNA初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物），只識別一種啟動子區(qū)和一種終止信號，能有效的轉(zhuǎn)錄有活性的rRNA基因，其活性是三種RNA聚合酶中最高的。

rDNA40sRNA18s、5.8、28srRNA加工RNApolI轉(zhuǎn)錄第60頁，共137頁。研究發(fā)現(xiàn)，不同真核生物的rRNA轉(zhuǎn)錄起始位點鄰近的序列完全不同——RNA聚合酶I啟動子區(qū)有較大變異。rRNA基因具有轉(zhuǎn)錄的種屬特異性。第61頁，共137頁。rRNA基因的特點：以基因家族、基因簇的形式串聯(lián)排列，外顯子較為保守，內(nèi)含子的長度和序列有較大差異。18S、28S,5.8SrRNA拷貝區(qū)ETS區(qū)ITS區(qū)NTS（IGS）——啟動子區(qū)rRNA前體第62頁，共137頁。第63頁，共137頁。NTS區(qū)的作用：轉(zhuǎn)錄起始識別含啟動子序列——核心元件人位于-45~+20小鼠-39~+9

3’端含增強子——-150~-170bp間上游調(diào)控區(qū)（UCE）5’端轉(zhuǎn)錄終止序列包含了起始位點，決定轉(zhuǎn)錄起始明顯增強核心啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，決定轉(zhuǎn)錄強弱第64頁，共137頁。第65頁，共137頁。非洲爪蟾非轉(zhuǎn)錄區(qū)的結(jié)構(gòu)第66頁，共137頁。類型II基因調(diào)控區(qū)：由三部分組成核心元件區(qū)：——決定是否轉(zhuǎn)錄由-30bp左右的TATAbox和起始位點（INR）組成上游調(diào)控區(qū)UPE：具多種調(diào)控元件CCAAT框、GC框、GCCACACCC框等，含其中一種或多種，決定轉(zhuǎn)錄強弱（轉(zhuǎn)錄活化和轉(zhuǎn)錄起始頻率），啟動子的強弱起決于UPE的類型。決定轉(zhuǎn)錄起始的選擇，絕大多數(shù)真核基因正確表達所必需確定真正的起始位點第67頁，共137頁。第68頁，共137頁。Sequenceelementswithinatypicaleukaryoticgene1GCTATACAATGC-25-50-80-95-1301

basedonthethymidinekinasegeneoctamertranscriptionelementpromoterTATAbox(TATAAAA)

locatedapproximately25-30bpupstreamofthe+1startsitedeterminestheexactstartsite(notinallpromoters)bindstheTATAbindingprotein(TBP)whichisasubunitofTFIIDGCbox(CCGCCC)

bindsSp1(Specificityfactor1)CAATbox(GGCCAATCT)

bindsCTF(CAATboxtranscriptionfactor)Octamer(ATTTGCAT)

bindsOTF(Octamertranscriptionfactor)+1ATTTGCAT第69頁，共137頁。調(diào)控區(qū)的模塊模型（調(diào)控因子模塊）調(diào)控區(qū)由一些獨立的功能元件組成，每個單元約7~20bp的小段，這些序列又稱模塊（元件）。每個元件可以與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合，多個元件組合構(gòu)成某個基因的調(diào)控區(qū)。啟動子：多個元件，從特定的位點以一定方向指導RNA合成；增強子：若干元件作為整體促進遠端的轉(zhuǎn)錄。第70頁，共137頁。RNA聚合酶II啟動子第71頁，共137頁。遠端調(diào)控區(qū)：位于轉(zhuǎn)錄起始位點更上游；如β–珠蛋白基因的遠端調(diào)控區(qū)在-1300—-3300間增強子：使與它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增強的DNA序列，作為基因表達的重要調(diào)節(jié)元件。特點：1.增強效應明顯（10–200倍）；2.增強效應與其位置和取向無關(guān)；3.大多為重復序列，一般50bp；

第72頁，共137頁。4.增強效應有嚴密的組織和細胞特異性，只有特定的蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子）參與才能發(fā)揮其功能；5.沒有基因?qū)Ｒ恍?。作用機制：通過改變模板DNA的整體結(jié)構(gòu)（影響DNA-Pro復合物的結(jié)構(gòu)或改變DNA超螺旋密度）eg.形成Z-DNA，增強子才有功能。一個增強子并不限于促進某一特殊啟動子的轉(zhuǎn)錄，它能刺激附近的任一啟動子。第73頁，共137頁。第74頁，共137頁。第75頁，共137頁。類型III——tRNA、5srRNA、小分子RNARNA聚合酶III的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都是短的RNA，不編碼蛋白質(zhì)，以RNA的形式執(zhí)行生物學功能，多數(shù)作為蛋白質(zhì)合成機器的組分（tRNA）tRNA基因結(jié)構(gòu)特點：串聯(lián)重復排列，多拷貝。啟動子有三種類型：基因內(nèi)啟動子基因外啟動子混合啟動子第76頁，共137頁?；騼?nèi)啟動子：轉(zhuǎn)錄起始識別區(qū)位于轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)部，轉(zhuǎn)錄起始頻率由轉(zhuǎn)錄起始位點負責。5srRNA基因啟動子（Ａ、Ｃ框）位于+55～+80bp之間非洲爪蟾tRNA基因啟動子位于+8～+72間，其中Ａ框+8～+30，Ｂ框+51～+72。第77頁，共137頁。第78頁，共137頁。5SrRNA基因啟動子在轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)第79頁，共137頁。基因外啟動子：位于轉(zhuǎn)錄序列上游TATA結(jié)構(gòu)——類似于類型Ⅱ的TATA框近端序列元件PSE–60bp遠端序列元件DSE–250bp（增強子）混合啟動子：具有基因內(nèi)和基因外混合啟動子元件。如：海膽硒代半胱氨酸t(yī)RNA基因第80頁，共137頁。真核生物基因的轉(zhuǎn)錄因子真核生物RNA聚合酶不具有全能性，需嚴格依賴一些蛋白因子才能識別并結(jié)合到啟動子特定序列上，啟動轉(zhuǎn)錄反應（調(diào)控區(qū)的模塊模型—每一個元件都是一種或多種蛋白因子特異識別的序列——一個元件叫一個模塊，很多模塊組成一個調(diào)控區(qū)）。第81頁，共137頁。轉(zhuǎn)錄因子通用轉(zhuǎn)錄因子／普遍性轉(zhuǎn)錄因子主要與啟動子核心元件ＴＡＴＡ框結(jié)合，是同類基因轉(zhuǎn)錄都必須的轉(zhuǎn)錄因子，如TFⅡA、B、D、E等。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與上游調(diào)控區(qū)和遠端調(diào)控區(qū)（增強子）結(jié)合，影響轉(zhuǎn)錄水平，在一些特定的基因轉(zhuǎn)錄中起作用。（不同基因的特殊轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子）轉(zhuǎn)錄因子：以反式作用影響轉(zhuǎn)錄的因子。第82頁，共137頁。

轉(zhuǎn)錄因子一般有兩種結(jié)構(gòu)域，一種是與DNA特異序列結(jié)合的結(jié)構(gòu)域；一種是與相鄰蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。如：亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)、鋅指結(jié)構(gòu)有的蛋白因子只具有蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域，在兩種不同的蛋白質(zhì)間起橋梁作用。第83頁，共137頁。亮氨酸拉鏈模型及它在轉(zhuǎn)錄因子兩個分子二聚體化中的作用第84頁，共137頁。二聚體化轉(zhuǎn)錄因子C/EBP的亮氨酸拉鏈和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)模型第85頁，共137頁。三類基因的轉(zhuǎn)錄因子1.類型IrRNAUBF上游結(jié)合因子與上游調(diào)控元件UCE結(jié)合SL1與核心元件結(jié)合，具有種屬特異性，能使RNA聚合酶I正確的與起始位點結(jié)合，作用類似于σ因子，又叫“定位因子”TFIARNA聚合酶I的激活因子第86頁，共137頁。第87頁，共137頁。UBF與UCE結(jié)合，SL1與UBF結(jié)合，使UBF向前移動改善UBF與核心元件結(jié)合，形成一個跨越核心元件—UCE的蛋白質(zhì)-DNA復合體RNA聚合酶I結(jié)合上去，形成開放性起始復合物轉(zhuǎn)錄開始第88頁，共137頁。類型Ⅲ基因轉(zhuǎn)錄因子tRNA、5sRNA、SnRNA

普遍性轉(zhuǎn)錄因子：TFⅢB、C轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子：TFⅢA——卵母細胞5sRNA特異蛋白因子A框TFⅢBTFⅢCTFⅢARNApolⅢ

激活因子增強子結(jié)合因子使RNApolⅢ正確定位于起始位點第89頁，共137頁。第90頁，共137頁。類型Ⅱ基因轉(zhuǎn)錄因子TFⅡA、B、D、E等第91頁，共137頁。類型Ⅱ基因調(diào)控區(qū)域與各種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位置第92頁，共137頁。第93頁，共137頁。類型Ⅱ基因轉(zhuǎn)錄的起始第94頁，共137頁。第95頁，共137頁。第96頁，共137頁。轉(zhuǎn)錄終止：目前對真核基因轉(zhuǎn)錄了解較少，RNApolⅠ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是大分子RNA，經(jīng)剪切加工成成熟rRNA；RNApolⅡ的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)加工后為mRNA；RNApolⅢ的體外轉(zhuǎn)錄與體內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有相同的末端，因此是研究真核基因轉(zhuǎn)錄終止的較好對象。

第97頁，共137頁。

SV40的終止有類似與大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄終止子（不依賴于p因子），轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，末端有一串U，終止序列產(chǎn)物中有特定的剪切和修飾信號。第98頁，共137頁。真核基因轉(zhuǎn)錄后的加工

1.真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特點：含內(nèi)含子，需經(jīng)剪接去除；需要修飾（加帽、加尾，稀有堿基）；轉(zhuǎn)錄和翻譯是兩個相對獨立的過程。

2.加工類型:加帽、加尾修飾——甲基化、?；艚覴NA編輯第99頁，共137頁。3.RNA加工的意義：活化——使無活性的前體RNA加工成有活性的成熟RNA；（rRNA、tRNA的剪接、修飾）改變基因的編碼產(chǎn)物——同一轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，不同剪接方式，編輯方式，蛋白產(chǎn)物不同；調(diào)節(jié)方式——加工會影響RNA的活性、半衰期、運輸?shù)?，影響RNA功能的發(fā)揮；第100頁，共137頁。StepsinmRNAprocessing(hnRNAistheprecursorofmRNA)capping(occursco-transcriptionally)cleavageandpolyadenylation(formsthe3’end)splicing(occursinthenucleuspriortotransport)exon1intron1exon2capcapcappoly(A)cappoly(A)Transcriptionofpre-mRNAandcappingatthe5’endCleavageofthe3’endandpolyadenylationSplicingtoremoveintronsequencesTransportofmaturemRNAtothecytoplasm第101頁，共137頁。加帽(Cap0、CapI、CapII三種帽子結(jié)構(gòu))在細胞核中進行，hnRNA的5’端常為GTP，帽子化過程后，形成m7G5’ppp5’Np結(jié)構(gòu)。5’帽子的功能：保護mRNA免受5’-核酸外切酶降解；使mRNA進入細胞質(zhì)；對翻譯起識別作用（m7G5’ppp5’Np優(yōu)先與核糖體結(jié)合）。第102頁，共137頁。三種帽結(jié)構(gòu)第103頁，共137頁。三種帽結(jié)構(gòu)第104頁，共137頁。初級轉(zhuǎn)錄物的切除與多聚腺苷酸化第105頁，共137頁。Cappingoccursco-transcriptionallyshortlyafterinitiationguanylyltransferase(nuclear)transfersGresidueto5’endmethyltransferases(nuclearandcytoplasmic)addmethyl groupsto5’terminalGandattwo2’ribosepositionson thenexttwonucleotidescappinginvolvesformationofa5’-5’triphosphatebondcapfunctionprotects5’endofmRNA(increasesmRNAstability)requiredforinitiationofproteinsynthesispppNpNmGpppNmpNm第106頁，共137頁。Polyadenylationcleavageoftheprimarytranscriptoccursapproximately10-30nucleotides3’-wardoftheAAUAAAconsensussitepolyadenylationcatalyzedby

poly(A)polymeraseapproximately200adenylateresiduesareaddedpoly(A)isassociatedwithpoly(A)bindingprotein(PBP)functionofpoly(A)tailistostabilizemRNAmGpppNmpNmAAUAAAmGpppNmpNmAAUAAAAAAAAA3’cleavagepolyadenylation第107頁，共137頁。編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因在核漿中被轉(zhuǎn)錄，RNA分子很大，且很不穩(wěn)定，由于大小很不一致，稱為核內(nèi)不均一RNA（hnRNA），其中mRNA是由hnRNA加工成的。hnRNA25%——mRNA75%——在核內(nèi)降解hnRNA先加帽，hnRNA尾端被切去一段后，加poly（A）尾，切除內(nèi)含子成為mRNA，進入細胞漿內(nèi)。第108頁，共137頁。剪接——把斷裂基因轉(zhuǎn)錄本中的內(nèi)含子除去真核生物基因是斷裂基因(splitgene)外顯子(exon)與內(nèi)含子(intron)內(nèi)含子的剪接方式自我剪接（由RNA分子本身完成）：Ⅰ型Ⅱ型剪接體SnRNP參與——mRNA酶蛋白參與的剪接——tRNA第109頁，共137頁。-珠蛋白的mRNA與基因雜交-珠蛋白的pre-mRNA與基因的雜交第110頁，共137頁。雞卵清蛋白mRNA與基因雜交圖第111頁，共137頁。自我剪接Ⅰ型內(nèi)含子rRNA特點：需要鳥苷酸參與（GTP、GMP、GDP），G的2’或3’-OH對5’端剪接點親核攻擊，通過構(gòu)象上的拉力或電子丟失，使剪接點上鏈的削弱和斷裂。此反應不需要ATP，由GTP提供能量，RNA有自行剪接能力，又稱自身催化作用。

核酸酶Ribozyme——具有催化活性的RNA分子。第112頁，共137頁。GroupI內(nèi)含子剪接第113頁，共137頁。四膜蟲rRNA的自我剪接第114頁，共137頁。Ⅱ型內(nèi)含子剪接過程：離下游外顯子7~8bp處有一分支點A，A的3’-OH進攻外顯子5’端磷酸，使剪接點上鏈斷裂。此反應不需要鳥苷酸參與第115頁，共137頁。ChemistryofmRNAsplicingtwocleavage-ligationreactionstransesterificationreactions-exchangeofone phosphodiesterbondforanother-notcatalyzedby traditionalenzymesbranchsiteadenosineforms2’,5’phosphodiesterbond withguanosineat5’endofintronG-p-G-UA-G-p-G2’OH-A-5’3’intron1exon1exon2Pre-mRNAFirstclevage-ligation(transesterification)reactionbranchsiteadenosine第116頁，共137頁。G-OH3’A-G-p-GU-G-5’-p-2’-A5’3’AAO-G-p-G5’3’U-G-5’-p-2’-AA3’G-ASplicingintermediateLariatexon1exon1exon2exon2intron1intron1Secondclevage-ligationreactionSplicedmRNAligationofexonsreleaseslariatRNA(intron)第117頁，共137頁。GroupII內(nèi)含子剪接第118頁，共137頁。剪接體的剪接——真核mRNA前體內(nèi)含子的剪接

hnRNA的3’和5’剪接點具有保守的結(jié)構(gòu)序列，提供了正確的剪接信號。哺乳動物或酵母mRNA的剪接只有形成剪接體后才能進行。剪接體——包括mRNA前體、細胞核小分子RNA（snRNA）和蛋白因子組成的復合體。細胞核小分子核糖核蛋白snRNP

第119頁，共137頁。真核生物內(nèi)含子5’剪接位點和3’剪接位點的保守順序第120頁，共137頁。snRNP至少有五種：U1——與5’剪接點結(jié)合U2——與內(nèi)含子分支點結(jié)合U4/U6

U5——與3’剪接點結(jié)合第121頁，共137頁。剪接過程：U1與5’剪接點結(jié)合，U2與分支點結(jié)合，U4/U6復合物結(jié)合，形成完整的“剪接體”

5’剪接點被切開，形成5’-外顯子和套索中間產(chǎn)物U4離開剪接體，3’剪接點切開兩個外顯子共價連接，形成成熟mRNA和套索狀內(nèi)含子第122頁，共137頁。RecognitionofsplicesitesinvariantGUandAGdin