ICS71.040CCSL90TDeterminationmethodofperformanceofreversed-phasesphericalsilicagel-basedchromatographicpackingmaterialIT/CBPIA0012—2025 Ⅲ 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 23.1粒度(μm)和粒度分布 23.2孔徑(?)、孔容(cm3/g)和比表面積(m2/g) 23.3柱效 23.4表面金屬活性 23.5保留因子K 24試劑和材料 34.1實(shí)驗(yàn)用水 3 3 34.4三氟乙酸 34.5氫氧化鈉 34.61,4-二羥基蒽醌 34.7尿嘧啶 34.8萘 34.9阿米替林 34.10針筒過(guò)濾器 35儀器和設(shè)備 3 35.2掃描電子顯微鏡 35.3激光粒度分布儀 45.4庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀 45.5比表面積分析儀 4T/CBPIA0012—20255.6元素分析儀 45.7高效液相色譜儀 45.8色譜柱裝柱機(jī) 46溶液及樣品制備 46.1柱效測(cè)試樣品儲(chǔ)備液 46.2柱效測(cè)試液 46.3表面金屬活性測(cè)試溶液 46.4阿米替林測(cè)試液 46.5堿沖洗液（適用于pH耐受上限為12.0的色譜填料） 46.6酸沖洗液 57性能測(cè)定方法 5 57.2粒度和粒度分布 57.3碳含量 57.4柱效 57.5表面金屬活性 67.6堿性化合物峰對(duì)稱性 77.7填料耐堿 87.8填料耐酸 98檢測(cè)報(bào)告 附錄A(資料性)檢測(cè)報(bào)告模板 附錄B(資料性)硅膠基質(zhì)的檢測(cè)項(xiàng)目及檢測(cè)方法 12T/CBPIA0012—2025本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由蘇州艾捷博雅科技有限公司提出。本文件由中國(guó)生化制藥工業(yè)協(xié)會(huì)歸口。本文件起草單位：蘇州艾捷博雅科技有限公司、江蘇漢德科技有限公司、北京亦度正康健康科技有限公司。本文件主要起草人：馬春青、王躍慶、汪群杰、張大兵、韓海峰、范大雙、張明亮、陳震、山廣志、楊化新、仲平、蘇賢斌、陸益紅、胡文言、周斌、范蕊萌、金燕京。1T/CBPIA0012—2025反相球形硅膠基質(zhì)色譜填料的性能測(cè)定方法硅膠基質(zhì)色譜填料根據(jù)固定相和流動(dòng)相的極性不同，分為正相和反相色譜填料。正相色譜填料通常為硅膠及其極性官能團(tuán)鍵合相，流動(dòng)相為非極性或弱極性溶劑；反相色譜填料通常為硅膠基質(zhì)表面鍵合非極性官能團(tuán)，流動(dòng)相為強(qiáng)極性溶劑。常用的反相填料有C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)、AQC18等。其特征和用途見(jiàn)下表：填料名稱官能團(tuán)特征用途C18(ODS)十八烷基(-C18H37)疏水性強(qiáng)，適用于長(zhǎng)鏈、疏水性強(qiáng)的化合物。高碳載量提供強(qiáng)保留，但可能導(dǎo)致疏水性強(qiáng)肽的洗脫困難。廣泛用于藥物分子、合成多肽、天然產(chǎn)物以及酸性、中性和堿性化合物等的反相分離。C8(MOS)八烷基(-C8H17)疏水性比C18稍弱，保留能力也比C18弱，適合分離中等極性的化合物。中性和堿性化合物等的反相分離。C4(Butyl)丁基(-C4H9)疏水性更弱，適合分離極性相對(duì)較大的化合物。在分析分子量較小、極性較強(qiáng)的代謝物時(shí)有較好的表現(xiàn)。C6H5(Phenyl)苯基(-C6H5)具有π-π電子相互作用等特性，對(duì)芳香族化合物的分離效果較好。適用于分離芳香族化合物，如多環(huán)芳烴、苯及其同系物等具有共軛結(jié)構(gòu)的化合物。AQC18增加了親水基團(tuán)具有一定的親水性，適用于分離含有極性基團(tuán)的化合物。在分析糖類等極性較大的生物分子時(shí)有較好的表現(xiàn)。Phenyl-hexyl苯基己基結(jié)合了苯基的π-π電子相互作用和己基的疏水性特點(diǎn)。在分離具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物時(shí)具有優(yōu)勢(shì)，如含有苯環(huán)和疏水性側(cè)鏈的藥物分子或天然產(chǎn)物。PFP(五氟苯基)五氟苯基(-C6F5)偶極相互作用和π-π電子相互作用等。極性較復(fù)雜，具有較強(qiáng)的偶極在分離含鹵素、硝基等強(qiáng)極性官能團(tuán)的化合物方面表現(xiàn)出色。硅膠基質(zhì)色譜填料根據(jù)原料和生產(chǎn)工藝的不同又分為球形和無(wú)定型兩種。本文件規(guī)定了關(guān)于反相球形硅膠基質(zhì)色譜填料的外觀、粒度、孔結(jié)構(gòu)及堿性物質(zhì)保留、耐堿測(cè)試等測(cè)定方法的內(nèi)容。反相球形硅膠基質(zhì)色譜填料廣泛用于色譜分析柱、色譜制備柱的裝填，在生命科學(xué)、藥物化學(xué)、天然藥化、化學(xué)合成等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。本文件的目的是規(guī)范基于反相機(jī)理的球形硅膠基質(zhì)色譜填料的性能測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列標(biāo)準(zhǔn)包含的條文，通過(guò)在本標(biāo)準(zhǔn)中引用而形成為本標(biāo)準(zhǔn)的條文，在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布時(shí)，所示版本均為有效。所有標(biāo)準(zhǔn)都有可能更新，使用本標(biāo)準(zhǔn)的各方應(yīng)探討，使用下列標(biāo)準(zhǔn)最新版本的可能性。2T/CBPIA0012—2025ISO13319-2007粒度分布的測(cè)定-電感區(qū)法GB/T191包裝儲(chǔ)運(yùn)圖示標(biāo)志GB/T32286-2015十八烷基鍵合相（C18）高效液相色譜柱性能測(cè)定方法GB/T19587-2017氣體吸附BET法測(cè)定固態(tài)物質(zhì)比表面積GB/T29022-2021粒度分析動(dòng)態(tài)光散射法GB/T19077-2024粒度分析激光衍射法JY/T0580-2020元素分析儀分析方法通則JY/T0584-2020掃描電子顯微鏡分析方法通則2025年版《中國(guó)藥典》四部通則0512高效液相色譜法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1粒度(μm)和粒度分布粒度是指填料顆粒的大小，粒度分布是指填料顆粒大小的分布情況。3.2孔徑(A)、孔容(cm3/g)和比表面積(m2/g)孔徑是指填料顆粒內(nèi)部孔隙的大?。豢兹菔菃挝毁|(zhì)量多孔固體所具有的細(xì)孔總?cè)莘e；比表面積是指單位質(zhì)量填料所具有的表面積。3.3柱效指色譜柱在不擴(kuò)散化合物的情況下保留化合物的能力。柱效是色譜柱獲得窄帶、改進(jìn)分離的相對(duì)能力，用理論板數(shù)（N）來(lái)衡量。3.4表面金屬活性是指色譜填料表面金屬離子與樣品分子之間的相互作用能力，這種相互作用會(huì)影響色譜分離的效果。通過(guò)檢測(cè)特定的色譜參數(shù)，可以評(píng)估表面金屬活性。3.5保留因子K固定相中的溶質(zhì)分子總量（s）除以流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子總量（m）得到。當(dāng)化合物在固定相中溶質(zhì)分子越多，K值越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)。等度洗脫中，運(yùn)用公式K=（tR-t0）/t0進(jìn)行計(jì)算，其中t0約等于5x10-4Ldc2/F。式中L是色譜柱的長(zhǎng)度，以mm為單位；dc是色譜柱的內(nèi)徑，也以mm為單位；F是流動(dòng)相流速，以ml/min為單位；t0以分鐘為單位。3T/CBPIA0012—2025本標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)量填料柱效時(shí)采用尿嘧啶的保留時(shí)間作為t0。尿嘧啶是一種常用的不被吸附的小分子物質(zhì)，在確認(rèn)相應(yīng)色譜條件下不被色譜柱吸附，可以使用其保留時(shí)間來(lái)代替t0。4試劑和材料4.1實(shí)驗(yàn)用水GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。4.2甲醇CH3OH，CAS號(hào)：67-56-1，色譜純。4.3乙腈CH3CN，CAS號(hào)：75-05-8，色譜純。4.4三氟乙酸C2HF3O2，CAS號(hào)：76-09-3，分析純。4.5氫氧化鈉NaOH，CAS號(hào)：1310-73-2，分析純。4.61,4-二羥基蒽醌C14H8O4，CAS號(hào)：81-64-1，純度≥99.0%。4.7尿嘧啶C4H4N2O2，CAS號(hào)：66-22-8，純度≥99.0%。4.8萘C10H8，CAS號(hào)：91-20-3，純度≥99.0%。4.9阿米替林C20H23N，CAS號(hào)：50-48-6，純度≥99.0%。4.10針筒過(guò)濾器過(guò)濾器直徑：13mm，濾膜材質(zhì)：PTFE，濾膜孔徑：0.22μm。5儀器和設(shè)備5.1顯微鏡光學(xué)顯微鏡，可放大到1000倍。5.2掃描電子顯微鏡4T/CBPIA0012—2025掃描電子顯微鏡，可放大到30萬(wàn)倍。5.3激光粒度分布儀最大量程不小于50μm。5.4庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀可以對(duì)0.2-1600μm的顆粒進(jìn)行測(cè)量；適合高濃度樣品，一次分析高達(dá)500,000個(gè)微粒。5.5比表面積分析儀可測(cè)量比表面積量值不小于0.0005(m2/g）。5.6元素分析儀能開(kāi)展C、H、N元素的檢測(cè)。5.7高效液相色譜儀配二極管陣列檢測(cè)器或紫外檢測(cè)器。5.8色譜柱裝柱機(jī)耐壓范圍0-80MPa，最大流速0.5L/min，材料：主體304，部分316鋼。6溶液及樣品制備6.1柱效測(cè)試樣品儲(chǔ)備液分別稱取尿嘧啶和萘100mg（精確至0.1mg置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。6.2柱效測(cè)試液精密量取柱效測(cè)試樣品儲(chǔ)備液1ml，置10ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。6.3表面金屬活性測(cè)試溶液稱取1,4-二羥基蒽醌9mg（精確至0.1mg置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。6.4阿米替林測(cè)試液稱取阿米替林100mg（精確至0.1mg置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。6.5堿沖洗液（適用于pH耐受上限為12.0的色譜填料）甲醇：三乙胺溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)純水的pH到色譜填料標(biāo)示的pH使用上限值）=40:60。5T/CBPIA0012—20256.6酸沖洗液甲醇：0.50%TFA（用三氟乙酸調(diào)節(jié)純水的pH至色譜填料標(biāo)示的pH使用下限）=70:30。7性能測(cè)定方法7.1性狀目視，白色粉末；1000倍顯微鏡下為球形顆粒且表面無(wú)裂縫。7.2粒度和粒度分布1.光學(xué)分析法，微米級(jí)填料按GB/T19077激光衍射法的要求執(zhí)行；納米級(jí)或亞微米級(jí)填料按GB/T29022動(dòng)態(tài)光散射法的要求執(zhí)行。以D50和D90/D10的結(jié)果分別代表粒度大小和粒度分布情況，判定是否滿足要求?；?.庫(kù)爾特計(jì)數(shù)法，按照ISO13319國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的要求執(zhí)行。以D50和D90/D10的結(jié)果分別代表粒度大小和粒度分布情況，判定是否滿足要求。7.3碳含量使用元素分析儀，具體按JY/T0580-2020元素分析儀分析方法通則對(duì)填料表面的C、H、N含量進(jìn)行測(cè)定。7.4柱效7.4.1色譜柱準(zhǔn)備精密稱取待測(cè)填料3g(±0.1g）將填料裝入I.D.：4.6mm×250mm色譜柱管中，用四氫呋喃:吡咯烷酮=70:30作為勻漿液，甲醇作為頂替液，壓力350bar，將填料裝入色譜柱管中。7.4.2測(cè)試條件流動(dòng)相：乙腈-水（根據(jù)不同柱子的特點(diǎn)調(diào)整混合比例，使得保留因子K=1.5-2.5）流速：1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；柱溫：25-30℃;樣品：柱效測(cè)試液（6.2項(xiàng)進(jìn)樣量：2μl。6T/CBPIA0012—20257.4.3試驗(yàn)步驟和結(jié)果計(jì)算柱效測(cè)試包含理論板數(shù)和拖尾因子，結(jié)果計(jì)算參照2025年版《中國(guó)藥典》四部通則0512高效液相色譜法。7.4.4結(jié)果判定根據(jù)萘的理論板數(shù)N和拖尾因子T判定填料柱效是否合格。7.4.5示例說(shuō)明以8um，120?的C18填料為例，裝填成一支4.6x250mm的色譜柱進(jìn)行柱效測(cè)試，得到的色譜圖如通過(guò)液相色譜軟件計(jì)算，得到N=12781，T=1.02，通常8um填料要求理論板數(shù)≥40000/米，拖尾因子T=0.95-1.05。即對(duì)于一支250mm的柱子來(lái)說(shuō)，N要求≥10000，T=0.95-1.05。則，判定填料柱效合格。常用的反相色譜填料理論板數(shù)及拖尾因子參考要求見(jiàn)下表：填料粒度理論板數(shù)n拖尾因子T≥30000/米分析柱（柱內(nèi)徑≤10mm），T=0.95-1.05半制備柱（10mm＜柱內(nèi)徑＜50mm），T=0.95-1.20制備柱（柱內(nèi)徑≥50mm），T=0.90-1.508μm≥40000/米5μm≥80000/米3μm≥120000/米7.5表面金屬活性7.5.1測(cè)試條件7T/CBPIA0012—2025流動(dòng)相：80%甲醇：20mmol/L中性磷酸鉀緩沖液=80:20波長(zhǎng)：UV254nm；流速：0.8ml/min；樣品：表面金屬活性測(cè)試溶液（6.3項(xiàng)進(jìn)樣量：1μl；柱溫：25-30℃。7.5.2試驗(yàn)步驟和結(jié)果計(jì)算選取7.5柱效測(cè)試合格的色譜柱，按上述測(cè)試條件進(jìn)行測(cè)試，記錄1,4-二羥基蒽醌的拖尾因子。7.5.3結(jié)果分析通過(guò)1,4-二羥基蒽醌的拖尾因子，可以評(píng)估色譜填料表面的金屬活性。拖尾因子T≥1.05，表明存在拖尾現(xiàn)象，通常與表面金屬雜質(zhì)有關(guān)。對(duì)拖尾因子的要求根據(jù)客戶需求確定。7.6堿性化合物峰對(duì)稱性7.6.1測(cè)試條件流動(dòng)相：根據(jù)填料不同的化學(xué)特性進(jìn)行配制?；瘜W(xué)特性為無(wú)封尾，單官能團(tuán)試劑鍵合的色譜填料，流動(dòng)相為甲醇：20mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液pH=5.8（稱量2.2822g磷酸氫二鉀，加水溶解，用磷酸調(diào)pH=5.8，并定容至刻度）=80:20；其它化學(xué)特性的色譜填料，流動(dòng)相為甲醇：20mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液pH=7.0（稱量2.2822g磷酸氫二鉀，加水溶解，用磷酸調(diào)pH=7，并定容至刻度）=80:20。流速：1.0ml/min；樣品：阿米替林測(cè)試液（6.4項(xiàng)檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；柱溫：30℃;進(jìn)樣體積：2μl。7.6.2試驗(yàn)步驟和結(jié)果計(jì)算選取7.5柱效測(cè)試合格的色譜柱，按上述測(cè)試條件進(jìn)行測(cè)試，對(duì)阿米替林進(jìn)行積分，記錄其保留時(shí)間，按2025年版《中國(guó)藥典》四部通則0512計(jì)算拖尾因子T：7.6.3結(jié)果分析如果拖尾因子T≥2.0，表明存在較多的殘余硅羥基。對(duì)拖尾因子的要求根據(jù)客戶需求確定。8T/CBPIA0012—20257.7填料耐堿7.7.1堿性條件老化過(guò)程將柱效測(cè)試合格的色譜柱安裝到液相色譜儀上，用6.5項(xiàng)下的堿沖洗液作為堿老化流動(dòng)相，以流速1ml/min連續(xù)沖洗色譜柱。每隔24小時(shí)，對(duì)柱效進(jìn)行測(cè)試，具體按7.5項(xiàng)下的要求執(zhí)行，測(cè)完柱效后將色譜繼續(xù)老化，并考察萘的保留時(shí)間（R堿洗）、理論板數(shù)（N堿洗）、拖尾因子（T堿洗）在填料沖洗前后的變化。7.7.2結(jié)果計(jì)算每隔24小時(shí)，對(duì)萘的保留時(shí)間、理論板數(shù)、拖尾因子堿洗前后的變化進(jìn)行計(jì)算，得到保留時(shí)間變化率R堿變，理論板數(shù)變化率（N堿變拖尾因子變化率（T堿變?nèi)缦拢罕Ａ魰r(shí)間變化率（R堿變）R堿變—萘的保留時(shí)間變化率，%R—堿洗前萘的保留時(shí)間，minR堿洗—堿洗后萘的保留時(shí)間，min理論板數(shù)變化率（N堿變）N堿變N堿變—萘的理論板數(shù)變化率，%N—堿洗前萘的理論板數(shù)，minN堿洗—堿洗后萘的理論板數(shù)，min拖尾因子變化率（T堿變）T堿變—萘的理論板數(shù)變化率，%T—堿洗前萘的拖尾因子，minT堿洗—堿洗后萘的拖尾因子，min7.7.3結(jié)果分析每個(gè)堿洗周期結(jié)束后，如果保留時(shí)間變化率（R堿變）、理論板數(shù)變化率（N堿變）和拖尾因子變化率（T堿變）任意一項(xiàng)超過(guò)10%，則終止耐堿實(shí)驗(yàn)。材料的耐堿總時(shí)間數(shù)據(jù)提供給客戶參考。9T/CBPIA0012—20257.8填料耐酸7.8.1酸性條件老化過(guò)程及測(cè)試將柱效測(cè)試合格的色譜柱安裝到液相色譜儀上，用6.6項(xiàng)下的酸沖洗液作為老化流動(dòng)相，以流速1ml/min連續(xù)沖洗色譜柱。每隔24小時(shí)，對(duì)柱效進(jìn)行測(cè)試，具體7.5項(xiàng)下的要求執(zhí)行，測(cè)完柱效后將色譜繼續(xù)老化，并考察萘的保留時(shí)間（R酸洗）、理論板數(shù)（N酸洗）、拖尾因子（T酸洗）三個(gè)結(jié)果在填料沖洗前后的變化。7.8.2結(jié)果計(jì)算每隔24小時(shí)，對(duì)萘的保留時(shí)間、理論板數(shù)、拖尾因子酸洗前后的變化進(jìn)行計(jì)算，得到保留時(shí)間變化率R酸變，理論板數(shù)變化率（N酸變拖尾因子變化率（T酸變?nèi)缦拢罕Ａ魰r(shí)間變化率（R酸變）R酸變—萘的保留時(shí)間變化率，%R—酸洗前萘的保留時(shí)間，minR酸洗—酸洗后萘的保留時(shí)間，min理論板數(shù)變化率（N酸變）N酸變N酸變—萘的理論板數(shù)變化率，%N—酸洗前萘的理論板數(shù)，minN酸洗—酸洗后萘的理論板數(shù)，min拖尾因子變化率（T酸變）T酸變—萘的理論板數(shù)變化率，%T—酸洗前萘的拖尾因子，minT酸洗—酸洗后萘的拖尾因子，min7.8.3結(jié)果分析T/CBPIA0012—2025每個(gè)酸洗周期結(jié)束后，如果保留時(shí)間變化