中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布I請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。一鳴、蔣菲、耿玉靜、李鵬昊、肖開提.阿1口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC時間分辨熒光免疫層析抗體檢測方法本文件規(guī)定了口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC時間分辨熒光免疫層析抗體檢測方法的試NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范4技術(shù)原理采用時間分辨熒光免疫層析技術(shù)和雙抗原夾心法相結(jié)合，檢測口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3A通過樣品與熒光微球標(biāo)記物沿層析膜移動，樣品中口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體與熒光微球標(biāo)記物、檢測線（T線）上的抗原結(jié)合而產(chǎn)生熒光信號值（T值），熒光微球標(biāo)記物繼續(xù)移動與質(zhì)控線（C線）上的抗體結(jié)合產(chǎn)品熒光信號值（C值），熒光信號通過儀器收集轉(zhuǎn)換，計算出T/C值即為待檢樣品5.1口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC5.2相關(guān)試劑的配制，按照附錄B5.3便攜式免疫熒光分析儀及配套ID卡，能在熒光檢測波段365/610nm條件下檢測，25.6注射器（5mL）。按照NY/T541中的規(guī)定進行全血或血清樣品的采集與處理，并做好按照NY/T541中規(guī)定進行全血樣品的采集與處理將口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC時間分辨免疫熒光層析抗體檢測卡放于平整、潔將微量毛細采樣管取10μL全血或血清樣品按照1:10比例加入到樣品稀釋液中混勻，稀釋后的樣品應(yīng)在1h內(nèi)完成檢測?？砂凑找韵聝煞N方式稀釋：a)離心管稀釋：將檢測樣品在1.5mL離心管中做10倍稀釋并混勻。b)稀釋板稀釋：將檢測樣品在稀釋板上做10倍稀釋并混勻。讀數(shù)前先將產(chǎn)品配套ID卡插入便攜式熒光免疫分析儀，之后將完成反應(yīng)的39結(jié)果判定當(dāng)檢測值＜0.1時，判為口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體陰性。當(dāng)檢測值≥0.1時，判為口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體陽性4口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC熒光微球抗體檢測卡的制備A.1.1生產(chǎn)用菌液繁殖用接種環(huán)挑取-70℃保存的pKG-3ABC-E.coli菌株卡那霉素），在37℃(±2℃)條件下、以200r/min振蕩培養(yǎng)8hA.1.2重組蛋白的誘導(dǎo)表達A.1.33ABC蛋白的提取mmol/LTris-HCl，5mmol/L咪唑，0.5A.1.43ABC蛋白的純化取超聲裂解后的上清液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化3ABC蛋白，后的產(chǎn)物即為生產(chǎn)用重組蛋白，無菌定量分裝，-70℃A.2熒光微球墊的制備A.2.1.1洗滌），A.2.1.2熒光微球活化A.2.1.3熒光微球標(biāo)記5（15℃~25℃)避光反應(yīng)30min。離心棄去上清液，按A.2.1.1用硼酸鹽緩沖液清洗2次，并重懸已A.2.1.4熒光微球墊的制備用輔料切條機裁切成10cm×30cm規(guī)格。設(shè)置噴涂量為3μL/cm，每張玻璃纖維素膜（1A.3.1印膜溶液的制備A.3.1.2檢測線印膜溶液），干燥2h后。放入裝有干燥劑的鋁箔袋內(nèi)，A.4樣品墊的制備A.5檢測卡的制備A.5.1制備環(huán)境A.5.2貼條6依次按吸水墊、包被膜、熒光微球墊、樣品墊的順序?qū)⒏髦虚g制A.5.3切條在室溫（15℃~25℃)及濕度≤30%RH條件下，將已組裝條機將檢驗合格的半成