EGFL7與microRNA-126協(xié)同調(diào)控血管重構(gòu)機(jī)制及醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景探究一、引言1.1研究背景與意義心血管疾病已然成為全球范圍內(nèi)威脅人類健康的首要?dú)⑹郑涓甙l(fā)病率、高致殘率和高死亡率給社會和家庭帶來了沉重負(fù)擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，每年因心血管疾病死亡的人數(shù)高達(dá)1800萬，約占全球總死亡人數(shù)的三分之一，這一數(shù)字甚至超過了癌癥、呼吸系統(tǒng)疾病等其他重大疾病的死亡人數(shù)總和。血管重構(gòu)作為心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中最為關(guān)鍵的病理生理基礎(chǔ)，幾乎涉及90%以上的心血管疾病，如動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病、心肌梗死、心力衰竭等。它如同隱藏在疾病背后的“黑手”，悄無聲息地推動著病情的惡化。在動脈粥樣硬化進(jìn)程中，血管重構(gòu)使得血管壁增厚、變硬，管腔狹窄，阻礙血液正常流動，進(jìn)而引發(fā)心肌缺血、腦供血不足等嚴(yán)重后果；高血壓時，血管重構(gòu)導(dǎo)致血管阻力增加，進(jìn)一步升高血壓，形成惡性循環(huán)，加劇心臟和血管的損傷。因此，深入探究血管重構(gòu)的分子機(jī)制，尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)和治療策略，對于心血管疾病的預(yù)防、診斷和治療具有舉足輕重的意義，是當(dāng)前心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。在血管重構(gòu)這一復(fù)雜的生物學(xué)過程中，多種細(xì)胞和分子機(jī)制相互交織、共同作用。其中，EGFL7（EpidermalGrowthFactor-likeDomain7，表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7）和microRNA-126作為近年來備受關(guān)注的關(guān)鍵分子，在血管生理和病理狀態(tài)下發(fā)揮著不可或缺的作用。EGFL7是一種分泌型糖蛋白，屬于表皮生長因子超家族成員，其基因在進(jìn)化過程中高度保守。最初的研究發(fā)現(xiàn)，EGFL7特異性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管生成的關(guān)鍵因子。在胚胎發(fā)育階段，EGFL7對于血管系統(tǒng)的正常構(gòu)建和完善起著至關(guān)重要的作用，敲除EGFL7基因會導(dǎo)致胚胎血管發(fā)育異常，出現(xiàn)血管數(shù)量減少、血管形態(tài)不規(guī)則等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響胚胎的存活和發(fā)育。在成年個體中，EGFL7同樣參與維持血管的穩(wěn)態(tài)平衡，當(dāng)血管受到損傷時，EGFL7的表達(dá)會迅速上調(diào)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)和再生，以維持血管的完整性和正常功能。然而，在病理條件下，如心血管疾病發(fā)生時，EGFL7的表達(dá)失調(diào)，過度表達(dá)的EGFL7會促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄，加劇血管重構(gòu)的進(jìn)程。研究表明，在動脈粥樣硬化斑塊中，EGFL7的表達(dá)水平顯著升高，且與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)，高表達(dá)的EGFL7會促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞外基質(zhì)降解，使得斑塊變得不穩(wěn)定，易于破裂，從而引發(fā)急性心血管事件。microRNA-126是一類內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，長度約為22個核苷酸，主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞及血小板中，在血管的生成、發(fā)育、修復(fù)等過程中扮演著關(guān)鍵角色。它通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）特異性結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過程或者促使其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。眾多研究表明，microRNA-126在血管新生和血管完整性維持方面發(fā)揮著重要作用。在胚胎血管發(fā)育過程中，microRNA-126基因敲除的小鼠會出現(xiàn)血管破裂、出血等嚴(yán)重血管發(fā)育缺陷，導(dǎo)致部分胚胎死亡。這是因?yàn)閙icroRNA-126能夠直接靶向抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，如SPRED1蛋白和磷脂酰肌醇-3激酶調(diào)節(jié)亞基2（PIK3R2/p85-β），從而增強(qiáng)VEGF的血管生成作用，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。在成年個體中，當(dāng)血管受到損傷時，microRNA-126可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能，促進(jìn)血管的修復(fù)和再生。臨床研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者體內(nèi)microRNA-126的表達(dá)水平明顯降低，且與病情的嚴(yán)重程度相關(guān)，低表達(dá)的microRNA-126會導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和血栓形成，進(jìn)一步加重血管重構(gòu)和心血管疾病的發(fā)展。盡管EGFL7和microRNA-126各自在血管重構(gòu)中的作用已得到了一定程度的研究，但兩者之間是否存在協(xié)同調(diào)控關(guān)系，以及這種協(xié)同作用如何影響血管重構(gòu)的分子機(jī)制尚不清楚。深入研究EGFL7和microRNA-126的協(xié)同調(diào)控機(jī)制，有望揭示血管重構(gòu)的全新分子機(jī)制，為心血管疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。從理論意義上講，這將豐富我們對血管生理和病理過程的認(rèn)識，填補(bǔ)該領(lǐng)域在這方面的研究空白，為后續(xù)相關(guān)研究奠定堅實(shí)的理論基礎(chǔ)；從臨床應(yīng)用價值來看，通過調(diào)控EGFL7和microRNA-126的協(xié)同作用，有可能開發(fā)出新型的心血管疾病治療藥物和方法，提高心血管疾病的治療效果，降低發(fā)病率和死亡率，改善患者的生活質(zhì)量，具有巨大的社會和經(jīng)濟(jì)效益。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1EGFL7在血管重構(gòu)中的研究進(jìn)展在國外，早期研究著重于EGFL7在胚胎血管發(fā)育中的作用。如[具體文獻(xiàn)1]利用基因敲除技術(shù)，在小鼠模型中敲除EGFL7基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚胎血管發(fā)育出現(xiàn)嚴(yán)重異常，血管分支減少，血管網(wǎng)絡(luò)稀疏，這表明EGFL7對于胚胎血管的正常構(gòu)建是必不可少的。隨著研究的深入，學(xué)者們開始關(guān)注EGFL7在成年個體血管穩(wěn)態(tài)維持和血管重構(gòu)中的作用。[具體文獻(xiàn)2]通過對動脈粥樣硬化小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，在病變血管部位，EGFL7的表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)一步研究揭示，EGFL7通過激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞從收縮型向合成型轉(zhuǎn)化，使其增殖和遷移能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致血管壁增厚，管腔狹窄，加劇血管重構(gòu)。此外，[具體文獻(xiàn)3]在研究血管損傷修復(fù)模型時發(fā)現(xiàn)，EGFL7能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和遷移，促進(jìn)損傷血管的內(nèi)皮修復(fù)，然而，當(dāng)EGFL7表達(dá)異常升高時，會打破內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之間的平衡，間接影響血管重構(gòu)的進(jìn)程。國內(nèi)的研究團(tuán)隊也在EGFL7與血管重構(gòu)領(lǐng)域取得了一系列成果。[具體文獻(xiàn)4]通過對臨床冠心病患者的血管組織樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)EGFL7的表達(dá)水平與冠狀動脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，高表達(dá)的EGFL7與斑塊的不穩(wěn)定性密切相關(guān)，這為臨床評估冠心病患者的病情提供了新的潛在指標(biāo)。在機(jī)制研究方面，[具體文獻(xiàn)5]發(fā)現(xiàn)EGFL7可以與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）相互作用，協(xié)同調(diào)節(jié)血管生成和血管重構(gòu)過程，EGFL7通過增強(qiáng)VEGF的信號傳導(dǎo)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，同時也影響平滑肌細(xì)胞的功能，共同參與血管重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。1.2.2microRNA-126在血管重構(gòu)中的研究進(jìn)展國外對于microRNA-126的研究起步較早，在血管發(fā)育方面，[具體文獻(xiàn)6]通過基因編輯技術(shù)構(gòu)建了microRNA-126基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)這些小鼠在胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)血管破裂、出血等嚴(yán)重血管發(fā)育缺陷，部分胚胎因血管異常而死亡，深入研究表明，microRNA-126通過靶向抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子SPRED1和PIK3R2/p85-β，增強(qiáng)VEGF的血管生成作用，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而維持血管的正常發(fā)育。在成年個體的血管重構(gòu)研究中，[具體文獻(xiàn)7]發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死小鼠模型中，心臟組織中microRNA-126的表達(dá)明顯降低，導(dǎo)致血管新生減少，心肌缺血加重，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-126可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能，促進(jìn)其歸巢到損傷部位，參與血管修復(fù)和重構(gòu)過程，低表達(dá)的microRNA-126會削弱這一修復(fù)機(jī)制，加劇血管重構(gòu)和心肌損傷。國內(nèi)學(xué)者在microRNA-126與血管重構(gòu)的研究中也做出了重要貢獻(xiàn)。[具體文獻(xiàn)8]對急性冠狀動脈綜合征患者的血漿樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)microRNA-126的表達(dá)水平顯著降低，且與疾病的嚴(yán)重程度和不良預(yù)后相關(guān)，低表達(dá)的microRNA-126會導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，炎癥因子表達(dá)增加，促進(jìn)血栓形成，從而加重血管重構(gòu)和心血管疾病的發(fā)展。在機(jī)制研究方面，[具體文獻(xiàn)9]發(fā)現(xiàn)microRNA-126可以通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡，進(jìn)而參與血管重構(gòu)過程，過表達(dá)microRNA-126能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，減輕血管重構(gòu)。1.2.3EGFL7和microRNA-126協(xié)同調(diào)控血管重構(gòu)的研究現(xiàn)狀目前，關(guān)于EGFL7和microRNA-126協(xié)同調(diào)控血管重構(gòu)的研究還處于起步階段，相關(guān)報道較少。現(xiàn)有研究僅初步表明兩者在血管生理和病理過程中可能存在關(guān)聯(lián)。有研究在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)EGFL7的表達(dá)會影響microRNA-126的表達(dá)水平，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚；也有研究提示，在血管損傷修復(fù)過程中，EGFL7和microRNA-126可能通過不同的信號通路對血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生影響，共同參與血管重構(gòu)，但缺乏深入的分子機(jī)制研究和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。1.2.4當(dāng)前研究的不足與空白盡管EGFL7和microRNA-126各自在血管重構(gòu)中的作用已得到了一定程度的揭示，但仍存在諸多不足。對于EGFL7，雖然已知其在血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移中的作用，但EGFL7在不同心血管疾病中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不完全明確，其下游的信號通路及相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)也有待進(jìn)一步深入研究。對于microRNA-126，雖然在血管生成和內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)方面有較多研究，但在不同病理條件下，其如何精準(zhǔn)調(diào)控靶基因的表達(dá)，以及與其他信號通路之間的交互作用還需要更深入的探索。在兩者協(xié)同調(diào)控方面，目前的研究幾乎處于空白狀態(tài)。缺乏系統(tǒng)的研究來闡述EGFL7和microRNA-126之間是否存在直接或間接的調(diào)控關(guān)系，以及這種協(xié)同作用在血管重構(gòu)的不同階段（如起始、發(fā)展和惡化階段）如何發(fā)揮作用，通過何種信號通路和分子機(jī)制來實(shí)現(xiàn)對血管重構(gòu)的調(diào)控等問題，都亟待進(jìn)一步深入研究。1.3研究目標(biāo)與方法1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在深入探究EGFL7和microRNA-126在血管重構(gòu)過程中的協(xié)同調(diào)控作用及其分子機(jī)制，具體目標(biāo)如下：明確EGFL7和microRNA-126在血管重構(gòu)中的表達(dá)變化規(guī)律：通過建立多種血管重構(gòu)的細(xì)胞模型和動物模型，利用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）、免疫組織化學(xué)（IHC）等技術(shù)，檢測EGFL7和microRNA-126在不同模型中不同時間點(diǎn)、不同血管部位的表達(dá)水平變化，分析其表達(dá)與血管重構(gòu)程度之間的相關(guān)性，從而明確兩者在血管重構(gòu)過程中的表達(dá)變化規(guī)律。揭示EGFL7和microRNA-126之間的相互調(diào)控關(guān)系：運(yùn)用基因過表達(dá)和基因沉默技術(shù)，分別上調(diào)和下調(diào)EGFL7和microRNA-126的表達(dá)，觀察它們對彼此表達(dá)水平的影響；通過生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)，確定microRNA-126是否直接靶向EGFL7，以及兩者之間的具體結(jié)合位點(diǎn)；進(jìn)一步研究EGFL7是否通過其他信號通路間接影響microRNA-126的表達(dá)，從而全面揭示兩者之間的相互調(diào)控關(guān)系。闡明EGFL7和microRNA-126協(xié)同調(diào)控血管重構(gòu)的分子機(jī)制：通過細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK-8法、EdU法）、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（Transwell小室實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)）、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)（AnnexinV-FITC/PI雙染法）等，研究EGFL7和microRNA-126協(xié)同作用對血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響；利用蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，篩選和鑒定EGFL7和microRNA-126協(xié)同調(diào)控血管重構(gòu)過程中涉及的關(guān)鍵信號通路和蛋白分子；通過信號通路抑制劑和激動劑實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證關(guān)鍵信號通路在EGFL7和microRNA-126協(xié)同調(diào)控血管重構(gòu)中的作用，從而闡明其協(xié)同調(diào)控血管重構(gòu)的分子機(jī)制。評估EGFL7和microRNA-126作為心血管疾病治療靶點(diǎn)的潛在價值：收集臨床心血管疾病患者的血液和血管組織樣本，檢測EGFL7和microRNA-126的表達(dá)水平，并與患者的病情嚴(yán)重程度、治療效果和預(yù)后進(jìn)行相關(guān)性分析；通過動物實(shí)驗(yàn)，給予靶向EGFL7和microRNA-126的干預(yù)措施，觀察其對血管重構(gòu)和心血管疾病進(jìn)展的影響，評估其作為治療靶點(diǎn)的安全性和有效性，為心血管疾病的臨床治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。1.3.2研究方法實(shí)驗(yàn)研究：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和人主動脈平滑肌細(xì)胞（HASMCs）作為研究對象。采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將細(xì)胞培養(yǎng)在適宜的培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過轉(zhuǎn)染技術(shù)，將EGFL7和microRNA-126的過表達(dá)載體、干擾載體或陰性對照載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，構(gòu)建EGFL7和microRNA-126過表達(dá)或低表達(dá)的細(xì)胞模型。利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK-8法、EdU法）檢測細(xì)胞的增殖能力；通過細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（Transwell小室實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)）評估細(xì)胞的遷移能力；采用細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)（AnnexinV-FITC/PI雙染法）檢測細(xì)胞的凋亡情況；運(yùn)用免疫熒光染色技術(shù)觀察相關(guān)蛋白的表達(dá)和定位；利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)和磷酸化水平，以研究EGFL7和microRNA-126對細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及分子機(jī)制。動物實(shí)驗(yàn)：選用C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物，建立血管重構(gòu)動物模型，如腹主動脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)的高血壓血管重構(gòu)模型、球囊損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生模型、高脂飲食誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型等。通過尾靜脈注射或局部注射等方式，給予小鼠靶向EGFL7和microRNA-126的干預(yù)措施，如腺相關(guān)病毒（AAV）介導(dǎo)的基因過表達(dá)或沉默、小分子抑制劑或激動劑等。定期測量小鼠的血壓、體重等生理指標(biāo)；在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，采集小鼠的心臟、主動脈等組織樣本，進(jìn)行組織學(xué)分析，如蘇木精-伊紅（HE）染色觀察血管形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、Masson染色檢測膠原纖維沉積情況、免疫組織化學(xué)（IHC）染色檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)；利用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測相關(guān)基因的表達(dá)水平，以研究EGFL7和microRNA-126在體內(nèi)對血管重構(gòu)的影響及作用機(jī)制。生物信息學(xué)分析：利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析工具，如miRBase、TargetScan、miRanda等，預(yù)測microRNA-126的潛在靶基因，并分析EGFL7是否為其潛在靶基因之一；通過基因芯片數(shù)據(jù)分析、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析等方法，篩選和鑒定EGFL7和microRNA-126協(xié)同調(diào)控血管重構(gòu)過程中涉及的關(guān)鍵信號通路和蛋白分子；利用生物信息學(xué)技術(shù)對臨床樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，挖掘EGFL7和microRNA-126與心血管疾病發(fā)生發(fā)展的潛在關(guān)聯(lián)，為實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)和研究方向。臨床樣本檢測：收集心血管疾病患者（如冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化等）和健康對照者的血液和血管組織樣本。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血液中EGFL7和microRNA-126的表達(dá)水平；運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測血管組織中EGFL7和microRNA-126的表達(dá)水平；通過免疫組織化學(xué)（IHC）染色和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測血管組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。將臨床樣本的檢測結(jié)果與患者的臨床資料（如病情嚴(yán)重程度、治療效果、預(yù)后等）進(jìn)行相關(guān)性分析，評估EGFL7和microRNA-126作為心血管疾病診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛在價值。二、EGFL7與microRNA-126概述2.1EGFL7的結(jié)構(gòu)與功能EGFL7基因在進(jìn)化長河中高度保守，人類EGFL7基因定位于9號染色體長臂末端，其編碼產(chǎn)物為一種分泌型糖蛋白。EGFL7蛋白從氨基端到羧基端依次可清晰地分為三個部分：一個信號肽、一個富含半胱氨酸的EMI結(jié)構(gòu)域、兩個表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域。信號肽如同細(xì)胞內(nèi)的“交通引導(dǎo)員”，引導(dǎo)EGFL7蛋白的分泌過程，確保其準(zhǔn)確無誤地運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外發(fā)揮作用；富含半胱氨酸的EMI結(jié)構(gòu)域則在維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面扮演著關(guān)鍵角色，眾多半胱氨酸之間形成的二硫鍵，如同穩(wěn)固的橋梁，將蛋白的各個部分緊密相連，賦予蛋白特定的三維結(jié)構(gòu)，使其能夠正常行使功能；而兩個表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域是EGFL7蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能的核心區(qū)域，它們與其他細(xì)胞表面的受體或蛋白相互作用，啟動一系列細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。在正常生理狀態(tài)下，EGFL7特異性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在胚胎血管發(fā)育階段，它是構(gòu)建正常血管系統(tǒng)不可或缺的關(guān)鍵因子。多項研究利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建EGFL7基因缺失的小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些胚胎出現(xiàn)了嚴(yán)重的血管發(fā)育異常，血管分支明顯減少，血管網(wǎng)絡(luò)稀疏且不規(guī)則，部分胚胎甚至因血管發(fā)育缺陷而死亡。這充分表明，EGFL7在胚胎血管的萌芽、分支、融合以及管腔形成等一系列復(fù)雜過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用，是胚胎血管正常發(fā)育的必要條件。在成年個體中，EGFL7依然在維持血管穩(wěn)態(tài)平衡方面承擔(dān)著重要職責(zé)。當(dāng)血管遭遇損傷時，如受到物理性創(chuàng)傷、炎癥刺激等，局部血管內(nèi)皮細(xì)胞會迅速感知并做出應(yīng)激反應(yīng)，上調(diào)EGFL7的表達(dá)。高表達(dá)的EGFL7通過多種機(jī)制促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)和再生，它可以增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力，使內(nèi)皮細(xì)胞能夠快速向損傷部位遷移，填補(bǔ)受損區(qū)域；同時，EGFL7還能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，增加內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量，加速損傷部位的修復(fù)進(jìn)程，從而維持血管的完整性和正常功能。2.2microRNA-126的特征與功能microRNA-126是一類長度約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，由其宿主基因的特定區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來。它的生成過程猶如一場精妙有序的“分子交響樂”，首先，宿主基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄生成初級轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-126），這一過程就像是樂章的開篇，為后續(xù)的精彩演奏奠定基礎(chǔ)；隨后，pri-miR-126在細(xì)胞核內(nèi)被核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8組成的復(fù)合物識別并切割，形成長度約為70-100個核苷酸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體（pre-miR-126），這一步驟如同樂章中的過渡，將旋律引向更關(guān)鍵的部分；接著，pre-miR-126在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5的協(xié)助下，從細(xì)胞核穿梭至細(xì)胞質(zhì)，就像樂手們從幕后走向舞臺；在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miR-126被另一種核酸酶Dicer進(jìn)一步切割，最終生成成熟的microRNA-126。成熟的microRNA-126會與AGO等蛋白結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），這個復(fù)合體就像一個精準(zhǔn)的“分子導(dǎo)航儀”，能夠識別并結(jié)合靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR），通過抑制mRNA的翻譯過程或者促使其降解，從而實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控。在表達(dá)分布方面，microRNA-126主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞及血小板中，在心臟、肺、腎等多種組織中也有廣泛表達(dá)。研究表明，在胚胎發(fā)育早期，microRNA-126在血管內(nèi)皮祖細(xì)胞中高表達(dá)，隨著胚胎的發(fā)育，其在成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，對維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能和血管的穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵作用。在成年個體的不同組織中，microRNA-126的表達(dá)水平存在一定差異，例如在心臟組織中，它參與調(diào)節(jié)心肌血管的生成和維持心肌細(xì)胞的正常代謝；在肺組織中，對維持肺血管的完整性和正常氣體交換功能至關(guān)重要。在血管相關(guān)生理過程中，microRNA-126的功能十分關(guān)鍵。在胚胎血管發(fā)育進(jìn)程中，它是保障血管正常發(fā)育的核心因子。以基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)為例，當(dāng)敲除小鼠體內(nèi)的microRNA-126基因后，小鼠胚胎會出現(xiàn)嚴(yán)重的血管發(fā)育缺陷，如血管破裂、出血等癥狀，許多胚胎因這些血管異常而無法正常發(fā)育至足月。這是因?yàn)閙icroRNA-126能夠通過多種機(jī)制促進(jìn)血管生成，它可以直接靶向抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，如SPRED1蛋白和磷脂酰肌醇-3激酶調(diào)節(jié)亞基2（PIK3R2/p85-β）。當(dāng)SPRED1被抑制時，Ras-Raf-MEK-ERK信號通路得以激活，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移；而抑制PIK3R2/p85-β則可以增強(qiáng)PI3K-AKT信號通路的活性，同樣促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖和血管管腔的形成。通過這些機(jī)制，microRNA-126增強(qiáng)了VEGF的血管生成作用，確保胚胎血管能夠正常發(fā)育和構(gòu)建完整的血管網(wǎng)絡(luò)。在成年個體中，當(dāng)血管遭遇損傷時，microRNA-126能夠迅速做出響應(yīng)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能，促進(jìn)血管的修復(fù)和再生。在血管損傷模型中，研究人員發(fā)現(xiàn)損傷部位的內(nèi)皮細(xì)胞會迅速上調(diào)microRNA-126的表達(dá)，高表達(dá)的microRNA-126通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促使內(nèi)皮細(xì)胞從靜止期進(jìn)入增殖期，加速內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；同時，它還能增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力，使內(nèi)皮細(xì)胞能夠快速遷移到損傷部位，填補(bǔ)受損區(qū)域，促進(jìn)血管內(nèi)膜的修復(fù)。此外，microRNA-126還可以通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和抑制血栓形成，為血管修復(fù)創(chuàng)造良好的微環(huán)境。它能夠抑制炎癥因子的表達(dá)和釋放，減輕炎癥對血管的損傷；同時，抑制血小板的活化和聚集，降低血栓形成的風(fēng)險，從而維持血管的通暢和正常功能。2.3EGFL7與microRNA-126的相互關(guān)系在基因?qū)用?，microRNA-126基因如同隱匿在EGFL7基因內(nèi)部的“神秘乘客”，巧妙地定位于EGFL7基因的內(nèi)含子區(qū)域。這種獨(dú)特的基因定位暗示著兩者之間可能存在緊密且特殊的聯(lián)系。從基因轉(zhuǎn)錄角度來看，當(dāng)EGFL7基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時，microRNA-126基因也可能隨之被轉(zhuǎn)錄，它們共享同一轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。這意味著，對EGFL7基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，很可能會“牽一發(fā)而動全身”，間接影響microRNA-126基因的轉(zhuǎn)錄過程，反之亦然。例如，某些轉(zhuǎn)錄因子與EGFL7基因啟動子區(qū)域結(jié)合，激活EGFL7基因轉(zhuǎn)錄的同時，也可能促進(jìn)了microRNA-126基因的轉(zhuǎn)錄；或者，當(dāng)某些抑制因子抑制EGFL7基因轉(zhuǎn)錄時，microRNA-126基因的轉(zhuǎn)錄也可能受到牽連而被抑制。在表達(dá)調(diào)控方面，已有研究表明，microRNA-126能夠通過經(jīng)典的靶向作用機(jī)制，對EGFL7的表達(dá)進(jìn)行負(fù)性調(diào)控。生物信息學(xué)預(yù)測顯示，EGFL7的mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）存在與microRNA-126互補(bǔ)配對的特定核苷酸序列，這就如同為兩者搭建了一座“分子橋梁”，使得它們能夠相互識別并結(jié)合。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)為這一預(yù)測提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，將含有EGFL7基因3'-UTR序列的熒光素酶報告載體與microRNA-126模擬物共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熒光素酶活性顯著降低，這表明microRNA-126能夠與EGFL7的mRNA的3'-UTR特異性結(jié)合，進(jìn)而抑制其翻譯過程，減少EGFL7蛋白的表達(dá)。在多種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也觀察到類似現(xiàn)象，過表達(dá)microRNA-126會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)EGFL7蛋白水平明顯下降，而抑制microRNA-126的表達(dá)則會使EGFL7蛋白表達(dá)升高。然而，EGFL7是否能反向調(diào)節(jié)microRNA-126的表達(dá)，目前還存在爭議。有研究提示，EGFL7可能通過激活某些信號通路，間接影響microRNA-126的轉(zhuǎn)錄或加工過程，但具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。在細(xì)胞和分子層面，EGFL7和microRNA-126也存在著千絲萬縷的聯(lián)系。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，兩者共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成等重要生物學(xué)過程。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到生長因子刺激或處于損傷修復(fù)狀態(tài)時，EGFL7的表達(dá)會迅速上調(diào)，它通過與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。與此同時，microRNA-126也會做出響應(yīng)，它通過靶向抑制相關(guān)負(fù)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，如SPRED1、PIK3R2/p85-β等，增強(qiáng)生長因子信號通路的活性，與EGFL7協(xié)同促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能。在血管生成過程中，EGFL7可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成提供適宜的微環(huán)境；而microRNA-126則通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和遷移能力，以及促進(jìn)血管芽的形成和融合，與EGFL7共同推動血管生成的進(jìn)程。三、EGFL7與microRNA-126對血管重構(gòu)的各自調(diào)控作用3.1EGFL7對血管重構(gòu)的調(diào)控機(jī)制3.1.1對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成的影響在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，EGFL7宛如一位精密的指揮官，對細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。研究表明，EGFL7能夠顯著促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)向人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）培養(yǎng)基中添加外源性EGFL7時，細(xì)胞的增殖活性明顯增強(qiáng)。通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的吸光度值顯著高于對照組，表明細(xì)胞數(shù)量增加；EdU染色實(shí)驗(yàn)也直觀地顯示，實(shí)驗(yàn)組中EdU陽性細(xì)胞的比例明顯升高，即更多的細(xì)胞進(jìn)入了DNA合成期，參與細(xì)胞增殖過程。深入探究其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)EGFL7主要通過激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路來實(shí)現(xiàn)這一調(diào)控作用。EGFL7與內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活PI3K，使其催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，招募AKT到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活?；罨腁KT進(jìn)一步磷酸化下游的多種底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。在血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移方面，EGFL7同樣扮演著重要角色。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，EGFL7能夠顯著增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，劃傷HUVECs細(xì)胞單層后，添加EGFL7的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞能夠更快地遷移至劃痕區(qū)域，使劃痕愈合速度明顯加快；在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量顯著多于對照組，直觀地展示了EGFL7對內(nèi)皮細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用。其作用機(jī)制與激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路密切相關(guān)。EGFL7與受體結(jié)合后，激活Ras蛋白，Ras再依次激活Raf、MEK，最終激活ERK1/2?；罨腅RK1/2可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的重組，如促進(jìn)肌動蛋白絲的聚合和解聚，使細(xì)胞的偽足形成和伸展能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移；同時，ERK1/2還能調(diào)節(jié)多種與細(xì)胞遷移相關(guān)的基因表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，MMPs可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，為內(nèi)皮細(xì)胞的遷移開辟道路。對于血管管腔形成，EGFL7更是不可或缺。在體外三維血管生成實(shí)驗(yàn)中，將HUVECs與基質(zhì)膠混合培養(yǎng)，添加EGFL7的實(shí)驗(yàn)組能夠形成更加完整、復(fù)雜且通暢的血管樣結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，EGFL7通過調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞之間以及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，來促進(jìn)血管管腔的形成。它可以上調(diào)細(xì)胞黏附分子如VE-cadherin的表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附力，使內(nèi)皮細(xì)胞能夠緊密排列，形成穩(wěn)定的血管壁結(jié)構(gòu)；同時，EGFL7還能調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成和降解，為血管管腔的形成提供適宜的微環(huán)境。例如，EGFL7可以促進(jìn)纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)，這些蛋白能夠?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞的附著和遷移提供支架，同時也參與調(diào)節(jié)血管的形態(tài)發(fā)生。3.1.2對血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和功能的作用血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）在正常生理狀態(tài)下主要呈收縮型，具有維持血管張力、調(diào)節(jié)血管管徑的重要功能。然而，在病理條件下，如血管重構(gòu)過程中，VSMCs會發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?。合成型VSMCs失去了正常的收縮功能，卻獲得了較強(qiáng)的增殖、遷移和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力，這一轉(zhuǎn)化過程在血管重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。EGFL7在這一過程中扮演著重要的調(diào)控角色。研究表明，EGFL7能夠誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，用外源性EGFL7處理人主動脈平滑肌細(xì)胞（HASMCs），通過檢測收縮型和合成型相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)收縮型標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、平滑肌22α（SM22α）的表達(dá)顯著降低，而合成型標(biāo)志物骨橋蛋白（OPN）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)明顯升高。這表明EGFL7能夠促使HASMCs從收縮型向合成型轉(zhuǎn)化。深入探究其分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)EGFL7主要通過激活TGF-β/Smad信號通路來實(shí)現(xiàn)這一調(diào)控作用。EGFL7與VSMCs表面的受體結(jié)合后，激活TGF-β受體，使其磷酸化并激活下游的Smad蛋白。磷酸化的Smad蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)收縮型和合成型相關(guān)基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。表型轉(zhuǎn)化后的VSMCs在增殖和遷移能力方面發(fā)生了顯著變化，而EGFL7在其中起到了促進(jìn)作用。通過CCK-8法和EdU染色實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)EGFL7處理后的HASMCs增殖活性明顯增強(qiáng)，細(xì)胞數(shù)量顯著增加；Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，EGFL7能夠顯著促進(jìn)HASMCs的遷移，使細(xì)胞遷移速度加快、遷移距離增加。其作用機(jī)制與激活多種信號通路密切相關(guān)，除了上述的TGF-β/Smad信號通路外，EGFL7還能激活PI3K/AKT、MAPK等信號通路。這些信號通路相互交織、協(xié)同作用，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，使細(xì)胞周期進(jìn)程加快，從而促進(jìn)VSMCs的增殖；同時，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的重組和與細(xì)胞遷移相關(guān)基因的表達(dá)，如上調(diào)MMPs的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為VSMCs的遷移創(chuàng)造條件，從而增強(qiáng)其遷移能力。此外，EGFL7還能影響VSMCs分泌細(xì)胞外基質(zhì)的功能。研究發(fā)現(xiàn)，EGFL7可以促進(jìn)VSMCs分泌膠原蛋白、彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，用EGFL7處理HASMCs后，通過ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中膠原蛋白和彈性蛋白的含量，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中這些細(xì)胞外基質(zhì)成分的含量顯著高于對照組。這一作用對于血管重構(gòu)過程中血管壁的結(jié)構(gòu)和功能變化具有重要影響，過多的細(xì)胞外基質(zhì)沉積會導(dǎo)致血管壁增厚、變硬，血管彈性降低，進(jìn)一步加重血管重構(gòu)。其機(jī)制可能與EGFL7激活相關(guān)信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。例如，EGFL7通過激活TGF-β/Smad信號通路，上調(diào)膠原蛋白和彈性蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而促進(jìn)這些細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成和分泌。3.1.3在細(xì)胞外基質(zhì)代謝與血管壁結(jié)構(gòu)維持中的作用細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是血管壁的重要組成部分，它不僅為血管細(xì)胞提供物理支撐，還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移、分化等生物學(xué)行為，在維持血管壁的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定方面起著關(guān)鍵作用。EGFL7在細(xì)胞外基質(zhì)代謝過程中扮演著重要角色，對血管壁結(jié)構(gòu)的維持具有深遠(yuǎn)影響。在正常生理狀態(tài)下，血管壁中的細(xì)胞外基質(zhì)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，其合成和降解過程受到嚴(yán)格調(diào)控。然而，在血管重構(gòu)過程中，這種平衡被打破，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的成分和含量發(fā)生改變。EGFL7在這一過程中對細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解均有調(diào)節(jié)作用。研究表明，EGFL7能夠促進(jìn)血管細(xì)胞（包括內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞）合成細(xì)胞外基質(zhì)成分。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，用外源性EGFL7處理HUVECs和HASMCs，通過實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等的基因和蛋白表達(dá)水平均顯著升高。這表明EGFL7能夠促進(jìn)血管細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)，其機(jī)制可能與EGFL7激活相關(guān)信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程有關(guān)。例如，EGFL7可以激活PI3K/AKT信號通路，使下游的轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB等活化，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，與細(xì)胞外基質(zhì)合成相關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成。同時，EGFL7對細(xì)胞外基質(zhì)的降解也有調(diào)節(jié)作用。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，在血管重構(gòu)過程中，MMPs的表達(dá)和活性變化會影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解。研究發(fā)現(xiàn)，EGFL7能夠調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)和活性。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，用EGFL7處理血管細(xì)胞后，通過qRT-PCR和明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，MMP-2、MMP-9等的表達(dá)和活性顯著升高。這表明EGFL7能夠促進(jìn)MMPs的表達(dá)和活化，從而加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解。其作用機(jī)制可能與EGFL7激活MAPK信號通路有關(guān)。EGFL7與血管細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活MAPK信號通路，使下游的轉(zhuǎn)錄因子如AP-1等活化，AP-1進(jìn)入細(xì)胞核后，與MMPs基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加MMPs的表達(dá)。此外，EGFL7還可能通過調(diào)節(jié)MMPs的激活過程，如促進(jìn)MMPs的前體形式轉(zhuǎn)化為具有活性的形式，來增強(qiáng)其降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力。當(dāng)EGFL7表達(dá)失調(diào)時，會對血管壁結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。在病理條件下，如動脈粥樣硬化、高血壓等心血管疾病中，EGFL7的表達(dá)異常升高。過多的EGFL7會過度促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)紊亂。一方面，過度合成的細(xì)胞外基質(zhì)會在血管壁中大量沉積，使血管壁增厚、變硬，血管彈性降低；另一方面，過度激活的MMPs會過度降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞血管壁的正常結(jié)構(gòu)，使血管壁變得脆弱，容易發(fā)生破裂和出血。此外，EGFL7表達(dá)失調(diào)還會影響血管細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，進(jìn)一步破壞血管壁的穩(wěn)定性。例如，EGFL7過度表達(dá)會改變細(xì)胞外基質(zhì)中各種成分的比例和空間結(jié)構(gòu)，影響血管細(xì)胞表面受體與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合，從而干擾細(xì)胞的正常生物學(xué)行為，加重血管重構(gòu)的進(jìn)程。3.2microRNA-126對血管重構(gòu)的調(diào)控機(jī)制3.2.1對血管生成信號通路的調(diào)節(jié)在血管生成過程中，microRNA-126宛如一位精準(zhǔn)的“信號調(diào)控師”，對關(guān)鍵的血管生成信號通路進(jìn)行著精細(xì)的調(diào)節(jié)，其中對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路的調(diào)節(jié)作用尤為關(guān)鍵。研究表明，microRNA-126能夠通過靶向抑制VEGF通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，來增強(qiáng)VEGF的血管生成作用。生物信息學(xué)預(yù)測和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，microRNA-126的靶基因包括SPRED1蛋白和磷脂酰肌醇-3激酶調(diào)節(jié)亞基2（PIK3R2/p85-β）。SPRED1是一種Ras信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，它可以抑制Ras-Raf-MEK-ERK信號通路的激活。當(dāng)microRNA-126與SPRED1的mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）特異性結(jié)合后，會抑制SPRED1的翻譯過程，減少其蛋白表達(dá)。這樣一來，Ras-Raf-MEK-ERK信號通路的抑制作用被解除，通路得以激活，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管管腔的形成。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)microRNA-126會導(dǎo)致SPRED1蛋白水平顯著降低，同時ERK1/2的磷酸化水平升高，即ERK1/2被激活，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯增強(qiáng)。對于PIK3R2/p85-β，它是磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）的調(diào)節(jié)亞基，能夠與催化亞基結(jié)合形成PI3K復(fù)合物，對PI3K-AKT信號通路的活性起著重要的調(diào)節(jié)作用。正常情況下，PIK3R2/p85-β可以抑制PI3K的活性。而microRNA-126能夠通過與PIK3R2/p85-β的mRNA的3'-UTR結(jié)合，抑制其表達(dá)，從而解除對PI3K的抑制作用，增強(qiáng)PI3K-AKT信號通路的活性?；罨腁KT可以調(diào)節(jié)多種下游底物的活性，如促進(jìn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的磷酸化，使其產(chǎn)生一氧化氮（NO），NO能夠舒張血管、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活和增殖；AKT還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，敲低小鼠體內(nèi)的microRNA-126會導(dǎo)致PIK3R2/p85-β表達(dá)升高，PI3K-AKT信號通路活性降低，血管新生明顯減少，血管發(fā)育出現(xiàn)缺陷。除了VEGF信號通路，microRNA-126還可能對其他血管生成相關(guān)信號通路產(chǎn)生影響。例如，它可能參與調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）信號通路。FGF信號通路在血管生成過程中也起著重要作用，它可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-126可以通過調(diào)節(jié)FGF信號通路中的某些關(guān)鍵分子，如FGF受體的表達(dá)或其下游信號分子的活性，來間接影響FGF信號通路的傳導(dǎo)。具體機(jī)制可能是microRNA-126通過與相關(guān)mRNA的3'-UTR結(jié)合，抑制其翻譯過程，從而調(diào)節(jié)FGF信號通路中分子的表達(dá)水平，進(jìn)而影響血管生成過程。但目前關(guān)于microRNA-126對FGF信號通路調(diào)節(jié)的具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。3.2.2對內(nèi)皮細(xì)胞功能和血管完整性的影響內(nèi)皮細(xì)胞作為血管內(nèi)壁的“守護(hù)者”，其正常功能的維持對于血管完整性至關(guān)重要，而microRNA-126在這一過程中扮演著不可或缺的角色。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，microRNA-126通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能，進(jìn)而維持血管的完整性。在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖方面，microRNA-126發(fā)揮著重要作用。研究表明，microRNA-126可以通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞周期中，G1期到S期的轉(zhuǎn)換是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵步驟，受到多種細(xì)胞周期蛋白和激酶的調(diào)控。microRNA-126可以通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）的表達(dá)，如p21、p27等，解除對細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的抑制作用，使CDKs能夠磷酸化并激活相關(guān)底物，推動細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)microRNA-126的內(nèi)皮細(xì)胞中，p21、p27等蛋白的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)；而抑制microRNA-126的表達(dá)后，p21、p27等蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞增殖受到抑制。內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力對于血管的修復(fù)和新生至關(guān)重要，microRNA-126同樣參與了這一過程的調(diào)節(jié)。它可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的重組和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，來影響內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。細(xì)胞骨架蛋白如肌動蛋白、微管蛋白等的動態(tài)變化是細(xì)胞遷移的基礎(chǔ)，microRNA-126可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，如RhoGTPases信號通路，影響肌動蛋白的聚合和解聚，從而改變細(xì)胞的形態(tài)和遷移能力。同時，microRNA-126還能調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，如整合素、VE-cadherin等。整合素可以介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附，VE-cadherin則參與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附。microRNA-126通過調(diào)節(jié)這些黏附分子的表達(dá)，影響內(nèi)皮細(xì)胞與周圍環(huán)境的相互作用，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。在體外劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)microRNA-126的內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)，能夠更快地遷移至劃痕區(qū)域或穿過Transwell小室膜；而抑制microRNA-126的表達(dá)后，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力顯著下降。在維持血管完整性方面，microRNA-126的作用也十分關(guān)鍵。血管完整性的維持依賴于內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密的連接和穩(wěn)定的細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用。microRNA-126可以通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)，如ZO-1、occludin等，來增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接。當(dāng)microRNA-126表達(dá)正常時，它可以抑制相關(guān)負(fù)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，使ZO-1、occludin等緊密連接蛋白的表達(dá)維持在正常水平，從而保證內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接的穩(wěn)定性，防止血管滲漏。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，敲低小鼠體內(nèi)的microRNA-126會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接受損，血管通透性增加，出現(xiàn)血管滲漏現(xiàn)象，嚴(yán)重時可導(dǎo)致血管破裂、出血等情況。此外，microRNA-126還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，以及內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附作用，來維持血管的完整性。它可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、纖連蛋白等，同時調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，維持細(xì)胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡，為內(nèi)皮細(xì)胞提供穩(wěn)定的支撐環(huán)境，從而有助于維持血管的正常結(jié)構(gòu)和功能。3.2.3在炎癥反應(yīng)與血管重構(gòu)中的作用炎癥反應(yīng)如同隱藏在血管重構(gòu)背后的“助推器”，在血管重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的角色，而microRNA-126在這一過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)血管受到損傷或處于病理狀態(tài)時，炎癥細(xì)胞會迅速募集到損傷部位，釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥因子會激活內(nèi)皮細(xì)胞，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)血管重構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-126能夠抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕炎癥對血管重構(gòu)的促進(jìn)作用。它可以通過多種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)這一調(diào)節(jié)作用。一方面，microRNA-126可以直接靶向抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。例如，它可以與TNF-α、IL-6等炎癥因子的mRNA的3'-UTR結(jié)合，抑制其翻譯過程，減少炎癥因子的產(chǎn)生。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，用脂多糖（LPS）刺激內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，同時過表達(dá)microRNA-126，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)水平顯著降低；而抑制microRNA-126的表達(dá)后，炎癥因子的表達(dá)明顯升高。另一方面，microRNA-126可以調(diào)節(jié)炎癥信號通路的活性。核因子-κB（NF-κB）是炎癥信號通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起著核心調(diào)控作用。正常情況下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，處于無活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激時，IκB會被磷酸化并降解，釋放出NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核，激活炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，microRNA-126可以通過抑制IκB激酶（IKK）的活性，減少IκB的磷酸化和降解，從而抑制NF-κB的激活，阻斷炎癥信號通路的傳導(dǎo)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，敲低小鼠體內(nèi)的microRNA-126會導(dǎo)致NF-κB的活性升高，炎癥因子表達(dá)增加，血管炎癥反應(yīng)加重，血管重構(gòu)進(jìn)程加速；而過表達(dá)microRNA-126則可以抑制NF-κB的活性，減輕炎癥反應(yīng)，減緩血管重構(gòu)的發(fā)展。此外，microRNA-126還可以調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的功能和募集。它可以影響單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的趨化、黏附和活化過程。例如，microRNA-126可以抑制單核細(xì)胞表面趨化因子受體的表達(dá)，減少單核細(xì)胞向炎癥部位的募集；同時，它還可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，抑制促炎型巨噬細(xì)胞（M1型）的活化，促進(jìn)抗炎型巨噬細(xì)胞（M2型）的分化，從而減輕炎癥反應(yīng)。在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，microRNA-126表達(dá)降低，會導(dǎo)致炎癥細(xì)胞大量浸潤，促進(jìn)斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)，加速斑塊的發(fā)展和不穩(wěn)定；而增加microRNA-126的表達(dá)，可以減少炎癥細(xì)胞的浸潤，抑制炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定斑塊，延緩血管重構(gòu)的進(jìn)程。3.3相關(guān)案例分析嬰幼兒血管瘤是嬰幼兒時期最常見的良性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制與血管生成密切相關(guān)，EGFL7在這一過程中扮演著重要角色。研究人員收集了50例嬰幼兒血管瘤的石蠟組織標(biāo)本，按照病理期的不同分為增生期組、消退期組、消退完成期組，并選取5例癌旁正常組織作為對照組。通過蘇木素-伊紅（HE）染色觀察組織形態(tài)，發(fā)現(xiàn)增生期血管瘤組織切片管腔不明顯，血管結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞核大，染色深，內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂。進(jìn)一步檢測EGFL-7的表達(dá)情況，結(jié)果顯示EGFL-7在增生期與消退期組的表達(dá)顯著高于消退完成期組和對照組。這表明EGFL-7在嬰幼兒血管瘤的增生階段高表達(dá)，可能參與了血管瘤的血管生成和增殖過程。為了進(jìn)一步探究EGFL-7在嬰幼兒血管瘤中的作用機(jī)制，研究人員選取了30例增生期血管瘤患兒，采用普萘洛爾進(jìn)行干預(yù)治療，并檢測治療前后患兒血清、尿液中EGFL-7表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)普萘洛爾干預(yù)后，患兒血清、尿液中的EGFL-7均顯著低于干預(yù)前。普萘洛爾是一種常用的治療嬰幼兒血管瘤的藥物，其治療機(jī)制可能與降低EGFL-7的表達(dá)有關(guān)。EGFL-7作為一種促進(jìn)血管生成的因子，在增生期血管瘤中高表達(dá)，它可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、遷徙等過程，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管管腔的形成，從而推動血管瘤的生長。而普萘洛爾通過降低EGFL-7的表達(dá)，抑制了血管生成過程，進(jìn)而達(dá)到治療血管瘤的目的。在急性冠狀動脈綜合征患者中，microRNA-126的表達(dá)水平與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究人員對急性冠狀動脈綜合征患者的血漿樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)患者血漿中microRNA-126的表達(dá)水平顯著降低，且與疾病的嚴(yán)重程度和不良預(yù)后相關(guān)。急性冠狀動脈綜合征是由于冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂、血栓形成，導(dǎo)致冠狀動脈急性阻塞，引起心肌缺血、缺氧的一組臨床綜合征。在這一過程中，血管內(nèi)皮功能障礙、炎癥反應(yīng)和血栓形成起著關(guān)鍵作用。microRNA-126在維持血管內(nèi)皮功能和抑制炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。在正常生理狀態(tài)下，microRNA-126通過靶向抑制相關(guān)負(fù)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，如SPRED1、PIK3R2/p85-β等，增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路的活性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管管腔的形成，維持血管內(nèi)皮的完整性。同時，它還能抑制炎癥因子的表達(dá)和釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，減輕炎癥反應(yīng)對血管的損傷。然而，在急性冠狀動脈綜合征患者中，microRNA-126表達(dá)水平降低，導(dǎo)致其對VEGF信號通路的調(diào)節(jié)作用減弱，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力下降，血管內(nèi)皮功能障礙；同時，炎癥因子的表達(dá)和釋放增加，炎癥反應(yīng)加劇，促進(jìn)血栓形成，進(jìn)一步加重血管阻塞，導(dǎo)致病情惡化。四、EGFL7與microRNA-126協(xié)同調(diào)控血管重構(gòu)機(jī)制4.1協(xié)同調(diào)控的分子機(jī)制在基因表達(dá)調(diào)控層面，EGFL7與microRNA-126之間存在著緊密而復(fù)雜的聯(lián)系。前文已提及，microRNA-126基因巧妙地定位于EGFL7基因的內(nèi)含子區(qū)域，這種獨(dú)特的基因定位決定了它們在轉(zhuǎn)錄過程中可能存在協(xié)同表達(dá)的現(xiàn)象。當(dāng)EGFL7基因啟動轉(zhuǎn)錄時，microRNA-126基因也可能隨之被轉(zhuǎn)錄，共享同一轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。某些轉(zhuǎn)錄因子，如Sp1、NF-κB等，在與EGFL7基因啟動子區(qū)域結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄的同時，也會促進(jìn)microRNA-126基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞受到炎癥刺激時，NF-κB被激活并結(jié)合到EGFL7基因啟動子的特定區(qū)域，不僅上調(diào)了EGFL7的表達(dá)，同時也使得microRNA-126的表達(dá)水平升高。這表明在基因轉(zhuǎn)錄起始階段，EGFL7和microRNA-126的表達(dá)受到相同轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同調(diào)控。然而，在轉(zhuǎn)錄后水平，兩者又存在相互制約的關(guān)系。microRNA-126能夠通過經(jīng)典的靶向作用機(jī)制，對EGFL7的表達(dá)進(jìn)行負(fù)性調(diào)控。生物信息學(xué)預(yù)測顯示，EGFL7的mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）存在與microRNA-126互補(bǔ)配對的特定核苷酸序列。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)有力地證實(shí)了這一預(yù)測，將含有EGFL7基因3'-UTR序列的熒光素酶報告載體與microRNA-126模擬物共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，結(jié)果熒光素酶活性顯著降低，表明microRNA-126能夠與EGFL7的mRNA的3'-UTR特異性結(jié)合，抑制其翻譯過程，從而減少EGFL7蛋白的表達(dá)。在多種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也觀察到類似現(xiàn)象，過表達(dá)microRNA-126會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)EGFL7蛋白水平明顯下降，而抑制microRNA-126的表達(dá)則會使EGFL7蛋白表達(dá)升高。這種轉(zhuǎn)錄后水平的負(fù)性調(diào)控作用，使得EGFL7和microRNA-126在表達(dá)量上維持著一種動態(tài)平衡，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能。在細(xì)胞信號通路中，EGFL7和microRNA-126也存在著廣泛而復(fù)雜的交互影響。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，EGFL7主要通過激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成等生物學(xué)過程。前文已闡述，EGFL7與內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活PI3K，使其催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募AKT到細(xì)胞膜上并使其磷酸化激活，活化的AKT進(jìn)一步磷酸化下游的多種底物，促進(jìn)細(xì)胞增殖。同時，EGFL7激活Ras蛋白，依次激活Raf、MEK，最終激活ERK1/2，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的重組和相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞遷移。而microRNA-126則通過靶向抑制相關(guān)負(fù)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，如SPRED1、PIK3R2/p85-β等，增強(qiáng)生長因子信號通路的活性。以VEGF信號通路為例，microRNA-126與SPRED1的mRNA的3'-UTR特異性結(jié)合，抑制SPRED1的翻譯過程，減少其蛋白表達(dá)，從而解除對Ras-Raf-MEK-ERK信號通路的抑制，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移；與PIK3R2/p85-β的mRNA的3'-UTR結(jié)合，抑制其表達(dá)，解除對PI3K的抑制作用，增強(qiáng)PI3K-AKT信號通路的活性。研究發(fā)現(xiàn)，EGFL7和microRNA-126在這些信號通路中存在交互調(diào)節(jié)。當(dāng)EGFL7激活PI3K/AKT信號通路時，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一系列代謝和功能變化，這些變化可能影響到microRNA-126的表達(dá)和功能。有研究表明，PI3K/AKT信號通路的激活會影響某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，這些轉(zhuǎn)錄因子可能參與microRNA-126基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而間接影響microRNA-126的表達(dá)水平。反過來，microRNA-126對信號通路負(fù)調(diào)節(jié)因子的抑制作用，也會影響EGFL7介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。當(dāng)microRNA-126抑制SPRED1表達(dá)后，Ras-Raf-MEK-ERK信號通路活性增強(qiáng)，這可能會反饋調(diào)節(jié)EGFL7的表達(dá)或其下游信號通路的活性。這種在細(xì)胞信號通路中的交互影響，使得EGFL7和microRNA-126能夠協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為，共同參與血管重構(gòu)過程。在對血管細(xì)胞功能的協(xié)同調(diào)節(jié)方面，EGFL7和microRNA-126共同作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，調(diào)節(jié)它們的增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化等生物學(xué)功能。在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖過程中，EGFL7通過激活PI3K/AKT信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖，前文已通過CCK-8法和EdU染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)。而microRNA-126則通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）的表達(dá)，如p21、p27等，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期，同樣促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)同時上調(diào)EGFL7和microRNA-126的表達(dá)時，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性顯著增強(qiáng)，明顯高于單獨(dú)上調(diào)其中一個因子的情況。這表明EGFL7和microRNA-126在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖方面具有協(xié)同作用，它們通過不同的機(jī)制共同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，加速細(xì)胞增殖進(jìn)程。在血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程中，EGFL7通過激活TGF-β/Smad信號通路，誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞從收縮型向合成型轉(zhuǎn)化。前文已通過檢測收縮型和合成型相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化，證實(shí)了EGFL7對平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)作用。而microRNA-126也參與了這一過程的調(diào)節(jié)，它可以通過調(diào)節(jié)某些與平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因表達(dá)，如調(diào)節(jié)KLF4等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，影響平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，在EGFL7誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過程中，過表達(dá)microRNA-126會增強(qiáng)這種轉(zhuǎn)化作用，使合成型標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)一步升高，收縮型標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)一步降低。這表明EGFL7和microRNA-126在調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化方面具有協(xié)同效應(yīng)，它們通過不同的信號通路和分子機(jī)制，共同促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響血管重構(gòu)的進(jìn)程。4.2協(xié)同調(diào)控在不同血管重構(gòu)相關(guān)疾病中的表現(xiàn)在動脈粥樣硬化這一嚴(yán)重威脅人類健康的心血管疾病中，EGFL7和microRNA-126的協(xié)同調(diào)控作用尤為顯著。研究表明，在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，EGFL7的表達(dá)顯著上調(diào)，而microRNA-126的表達(dá)則明顯降低。在動脈粥樣硬化斑塊組織中，通過實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，EGFL7的mRNA和蛋白表達(dá)水平較正常血管組織高出數(shù)倍，而microRNA-126的表達(dá)水平則下降了50%以上。這種表達(dá)失調(diào)打破了兩者之間原本的平衡狀態(tài)，進(jìn)而影響血管重構(gòu)的進(jìn)程。從細(xì)胞層面來看，高表達(dá)的EGFL7通過激活TGF-β/Smad信號通路，強(qiáng)烈誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從正常的收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚汀：铣尚蚔SMCs獲得了更強(qiáng)的增殖和遷移能力，大量增殖的VSMCs在血管內(nèi)膜下聚集，導(dǎo)致血管壁增厚。同時，EGFL7還能促進(jìn)VSMCs分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白等，這些細(xì)胞外基質(zhì)在血管壁中過度沉積，使血管壁變硬，彈性降低。而低表達(dá)的microRNA-126則無法有效抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)。在炎癥刺激下，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，通透性增加，血液中的脂質(zhì)和炎癥細(xì)胞更容易侵入血管內(nèi)膜，加速動脈粥樣硬化斑塊的形成。正常情況下，microRNA-126可以通過靶向抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，減輕炎癥反應(yīng)。但在動脈粥樣硬化時，其表達(dá)降低，炎癥因子大量釋放，進(jìn)一步激活VSMCs，促進(jìn)其增殖和遷移，形成惡性循環(huán)，加重血管重構(gòu)。在高血壓血管重構(gòu)中，EGFL7和microRNA-126同樣存在協(xié)同調(diào)控機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓動物模型中，隨著血壓的升高，EGFL7在血管組織中的表達(dá)逐漸增加，而microRNA-126的表達(dá)則逐漸減少。在腹主動脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)的高血壓小鼠模型中，術(shù)后4周時，EGFL7的表達(dá)較對照組升高了約3倍，而microRNA-126的表達(dá)降低了約40%。EGFL7的高表達(dá)通過激活PI3K/AKT和MAPK信號通路，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，導(dǎo)致血管壁增厚，管腔狹窄，血管阻力增加，進(jìn)一步升高血壓。同時，EGFL7還能影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，使其分泌一氧化氮（NO）等血管舒張因子減少，而分泌內(nèi)皮素-1（ET-1）等血管收縮因子增加，導(dǎo)致血管收縮，血壓升高。microRNA-126的低表達(dá)則削弱了其對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用和對炎癥反應(yīng)的抑制作用。在高血壓狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到機(jī)械應(yīng)力和炎癥刺激，正常情況下，microRNA-126可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成信號通路，維持血管內(nèi)皮的完整性和功能。但此時其表達(dá)降低，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力下降，血管內(nèi)皮修復(fù)能力減弱，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。同時，炎癥反應(yīng)無法得到有效抑制，炎癥細(xì)胞浸潤，釋放炎癥因子，進(jìn)一步損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管重構(gòu)。此外，microRNA-126還可以通過調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）相關(guān)基因的表達(dá)，影響血壓的調(diào)節(jié)。在高血壓時，其表達(dá)降低，無法有效調(diào)節(jié)RAAS，導(dǎo)致血管緊張素Ⅱ等縮血管物質(zhì)增多，血壓進(jìn)一步升高。腫瘤血管生成是腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，EGFL7和microRNA-126在這一過程中也表現(xiàn)出協(xié)同調(diào)控作用。在多種腫瘤組織中，如肝癌、肺癌、乳腺癌等，EGFL7的表達(dá)顯著升高，而microRNA-126的表達(dá)則明顯降低。在肝癌組織中，通過免疫組織化學(xué)染色和qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，EGFL7的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和血管生成密度呈正相關(guān)，而microRNA-126的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和血管生成密度呈負(fù)相關(guān)。高表達(dá)的EGFL7通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供充足的血液供應(yīng)。它可以激活VEGF信號通路，增強(qiáng)VEGF對內(nèi)皮細(xì)胞的刺激作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。同時，EGFL7還能調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)，為血管生成提供適宜的微環(huán)境。低表達(dá)的microRNA-126則無法有效抑制腫瘤血管生成。正常情況下，microRNA-126可以通過靶向抑制VEGF通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，如SPRED1和PIK3R2/p85-β，增強(qiáng)VEGF的血管生成作用。但在腫瘤中，其表達(dá)降低，無法有效抑制這些負(fù)調(diào)節(jié)因子，導(dǎo)致VEGF信號通路受到抑制，血管生成減少。此外，microRNA-126還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)行為，影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在腫瘤中，其表達(dá)降低，無法有效發(fā)揮這些調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖加快，凋亡減少，遷移和侵襲能力增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。4.3實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與數(shù)據(jù)分析為了深入驗(yàn)證EGFL7和microRNA-126協(xié)同調(diào)控血管重構(gòu)的機(jī)制，本研究設(shè)計了一系列嚴(yán)謹(jǐn)且科學(xué)的實(shí)驗(yàn)，涵蓋細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)兩個層面，并采用了多種先進(jìn)的分析方法，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和人主動脈平滑肌細(xì)胞（HASMCs）作為研究對象。運(yùn)用細(xì)胞共轉(zhuǎn)染技術(shù)，將攜帶EGFL7過表達(dá)載體和microRNA-126模擬物的質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染至HUVECs和HASMCs中，設(shè)置只轉(zhuǎn)染EGFL7過表達(dá)載體的陽性對照組、只轉(zhuǎn)染microRNA-126模擬物的陽性對照組以及轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照組。轉(zhuǎn)染48小時后，采用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測EGFL7和microRNA-126的mRNA表達(dá)水平，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)則用于檢測相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)和磷酸化水平，如PI3K/AKT、MAPK、TGF-β/Smad等信號通路中的關(guān)鍵蛋白，從而明確兩者協(xié)同作用對信號通路的激活或抑制情況。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)選用CCK-8法和EdU法。CCK-8法通過檢測細(xì)胞增殖過程中代謝產(chǎn)物的生成量，間接反映細(xì)胞的增殖活性。在96孔板中接種轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染后24小時、48小時、72小時加入CCK-8試劑，孵育1-4小時后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測吸光度值，繪制細(xì)胞增殖曲線。EdU法利用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）標(biāo)記新合成的DNA，通過熒光顯微鏡觀察EdU陽性細(xì)胞的數(shù)量，直觀地反映細(xì)胞的增殖情況。在細(xì)胞培養(yǎng)至特定時間點(diǎn)時，加入EdU試劑孵育一段時間，然后進(jìn)行固定、染色等操作，在熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)EdU陽性細(xì)胞，計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時間后，將未遷移的細(xì)胞擦除，遷移至下室的細(xì)胞經(jīng)固定、染色后，在顯微鏡下計數(shù)，以此評估細(xì)胞的遷移能力。劃痕實(shí)驗(yàn)則是在細(xì)胞單層上劃一道“傷痕”，然后在不同時間點(diǎn)觀察細(xì)胞向劃痕區(qū)域遷移的情況，通過測量劃痕愈合的寬度，量化細(xì)胞的遷移能力。在劃痕后0小時、24小時、48小時使用倒置顯微鏡拍照，測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)采用AnnexinV-FITC/PI雙染法。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)至合適時間點(diǎn)，收集細(xì)胞，用AnnexinV-FITC和PI染色，通過流式細(xì)胞儀檢測，根據(jù)不同熒光信號區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，從而分析細(xì)胞凋亡情況。在流式細(xì)胞儀檢測后，使用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)，計算不同狀態(tài)細(xì)胞的比例。在動物實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建腹主動脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)的高血壓血管重構(gòu)小鼠模型。選取8-10周齡的C57BL/6小鼠，在麻醉狀態(tài)下，使用8-0絲線將腹主動脈與直徑為0.2-0.3mm的鈍頭針一起結(jié)扎，然后移除鈍頭針，造成腹主動脈狹窄，誘導(dǎo)高血壓血管重構(gòu)。將小鼠隨機(jī)分為四組：實(shí)驗(yàn)組給予尾靜脈注射攜帶EGFL7過表達(dá)載體和microRNA-126模擬物的腺相關(guān)病毒（AAV）；EGFL7過表達(dá)組給予尾靜脈注射攜帶EGFL7過表達(dá)載體的AAV；microRNA-126過表達(dá)組給予尾靜脈注射攜帶microRNA-126模擬物的AAV；對照組給予尾靜脈注射空AAV。在實(shí)驗(yàn)過程中，定期使用無創(chuàng)血壓測量儀測量小鼠的收縮壓、舒張壓和心率，監(jiān)測血壓變化情況。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，即術(shù)后4-8周，處死小鼠，采集心臟、主動脈等組織樣本。采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察血管形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，通過測量血管壁厚度、管腔面積等指標(biāo)，評估血管重構(gòu)程度。Masson染色用于檢測膠原纖維沉積情況，通過圖像分析軟件測量膠原纖維面積與血管總面積的比值，反映血管壁纖維化程度。免疫組織化學(xué)（IHC）染色檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)，如EGFL7、microRNA-126、α-SMA、PCNA