15DetectionofShigellainanimalbe2021-01-25發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定I動物墊料中志賀氏菌檢測GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格GB/T33682基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜鑒別微生物方法通則SN/T1538.1培養(yǎng)基制備指南第1部分：實驗室培養(yǎng)基制SN/T1538.2培養(yǎng)基制備指南第2部分：培養(yǎng)基性能用于吸收動物排泄物，使動物保持舒適生活環(huán)境4設(shè)備和材料4.1冰箱：2℃~5℃。4.4均質(zhì)器。4.5漩渦振蕩器。4.7光學(xué)顯微鏡。4.9飛行時間質(zhì)譜儀。4.10二級生物安全柜。14.12無菌濾膜均質(zhì)袋。4.14無菌培養(yǎng)皿：15mm×904.15無菌試管：18mm×180mm。4.17無菌剪刀。4.18無菌勺。5.5志賀氏菌顯色培養(yǎng)基。5.17志賀氏菌生化鑒定試劑盒。5.18革蘭氏陰性菌生化鑒定卡。5.19飛行質(zhì)譜儀靶板。5.20志賀氏菌屬診斷血清。2應(yīng)遵循隨機性、代表性的原則。取樣過程遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來污染。對送檢樣品包裝內(nèi)不同部位樣品進行隨機多點取樣至少250g，充分混勻后稱取25g顆粒狀或粉末狀墊料樣品，加入225mL志賀氏菌增菌肉湯，充分振搖或均質(zhì)1min～2min，于41.5℃±1℃,厭氧無菌操作將滅菌規(guī)格板（5cmi5cm）放在平面墊料表面，用浸有無菌稀釋液（磷酸緩沖液或生理鹽水）的棉拭子，在規(guī)格板內(nèi)來回均勻涂抹整個方格3次，并隨之轉(zhuǎn)動棉拭子，然后用滅菌剪刀剪去復(fù)取樣1～4個規(guī)格板面積，相應(yīng)地將棉拭子頭置入25mL～100mL的無菌稀釋液中，充分振搖制成樣品3），肉湯，充分振搖或均質(zhì)1min～2min。于41.5℃±1℃,厭氧培養(yǎng)16h～20h。1234取增菌后的志賀氏菌增菌肉湯分別劃線接種于XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板上，于36℃±1℃培養(yǎng)20h～24h，觀察各個平板上生長的菌落形態(tài)。若出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察，則繼續(xù)培養(yǎng)至48h再觀察。志賀氏菌在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征見MAC瓊脂7.3.1自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個挑7.3.1培養(yǎng)的菌落進行志賀氏菌生化鑒定，具體操作依據(jù)志賀氏菌生化鑒定試劑說明書或4志賀氏菌無鞭毛抗原，有菌體（O）抗原。菌體（O）抗原分為型和群的特一般采用1.2%～1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試注1：一些志賀氏菌如果因為K抗原存在而不出現(xiàn)凝集反應(yīng)時，可挑取菌苔于1mL生注2：D群志賀氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，與其他志賀分別將兩個區(qū)域的菌落研成乳狀液。將載玻片傾斜搖動混勻1min，并對著黑色背景進行觀察，如果抗綜合生化鑒定結(jié)果、輔助鑒定結(jié)果和血清學(xué)試驗結(jié)果，報告25g（cm2）動9生物安全措施檢測過程中的廢棄物需經(jīng)121℃高壓滅菌處理至少305A.1培養(yǎng)基制備及質(zhì)量保證A.2志賀氏增菌肉湯-新生霉素A.2.1志賀氏菌增菌肉A.2.1.1成分A.2.1.2制法至50℃~55℃,計入除菌過濾的新生霉素溶液（0.5μg/mL分裝備用。A.2.2新生霉素溶液A.2.2.1成分A.2.2.2制法A.3.1成分6A.3.2制法A.4.1成分硫代硫酸鈉6.8g檸檬酸鐵銨A.4.2制法將上述兩溶液混合均勻后，再加入指示劑，冷卻至冷卻至50℃~55℃,傾注平板。注：本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，避免降低其A.5.1成分A.5.2制法7A.6營養(yǎng)瓊脂斜面A.6.1成分將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水中，加入15%氫氧化鈉溶液約2mL，冷卻至25A.7半固體瓊脂A.7.1成分gggA.7.2制法A.8葡萄糖胺培養(yǎng)基A.8.1成分A.8.2制法8A.8.3試驗方法良好。如在葡萄糖胺斜面上生長極微小的菌落可視為結(jié)果陰A.9尿素瓊脂A.9.1成分A.9.2制法A.9.3試驗方法A.10.1.1成分鄰苯硝基β-D-半乳糖苷600.01mol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.5±0.2）A.10.1.2制法將ONPG溶于緩沖液內(nèi)，加入蛋白胨水，過濾除菌，分裝于10mm×79A.10.1.3試驗方法自瓊脂斜面挑取培養(yǎng)物一滿環(huán)接種，于36℃A.10.2.1成分5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)A.10.2.2制法將各成分（A.10.2.1）加入1000mL蒸餾水中，加熱煮沸溶解，冷卻至25℃,調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2，A.10.2.3試驗方法挑取瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于平板，劃線和點種均可，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h觀察結(jié)果。若平板上的培養(yǎng)物變?yōu)樗{色，判為有β-D-半乳糖苷酶產(chǎn)生；若培養(yǎng)物為無色或不透明色，或培養(yǎng)48h~A.11氨基酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基A.11.1成分A.11.2制法管0.5mL，上面再滴加一層石蠟油，115℃高壓滅菌10A.11.3試驗方法從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種，于36℃±1℃培養(yǎng)1氨基酸脫羧酶陽性；若培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，則判為陰性。陰性A.12糖發(fā)酵管A.12.1成分A.12.2制法A.12.2.1葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后，A.12.3試驗方法從瓊脂斜面上挑取少量培養(yǎng)物接種于糖發(fā)酵管A.13西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基A.13.1成分A.13.2制法A.13.3試驗方法A.14粘液酸鹽培養(yǎng)基A.14.1測試肉湯A.14.1.1成分A.14.1.2制法A.14.2質(zhì)控肉湯A.14.2.1成分溴麝香草酚藍溶液0.024A.14.2.2制法所有成分加熱溶解，冷卻至25℃左右，調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2，分裝試管，每管約5mL，于121℃高A.14.3試驗方法將待測新鮮培養(yǎng)物接種測試肉湯（A.14.1）和質(zhì)控肉湯（A.14.2于A.15蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑A.15.1成分蛋白胨（或胰蛋白胨）20.A.15.2制法所有成分加熱溶解，冷卻至25℃左右，調(diào)節(jié)pH至7.4，分裝小試管，121℃高壓滅菌A.15.3靛基質(zhì)試劑A.15.3.1柯凡克試劑：將5g對二氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后緩慢加入濃鹽酸25mL。A.15.3.2歐-波試劑：將1g對二氨基苯甲醛溶解于95%乙醇內(nèi)，然后緩慢加入濃鹽酸20mL。A.15.4試驗方法mL，輕搖試管，若試劑層呈深紅色，判為陽性；或加入歐-波試劑0.5mL，沿管壁流下，覆蓋于培養(yǎng)液鳥氨酸脫羧酶以及水楊苷和七葉苷分解試驗。志賀氏菌屬生---+-----------+----------++-+-+-d由于某些不活潑的大腸埃希氏菌（anaerogenicE.coli）、A-D（Alkalescens-Disparbiotypes,堿性-異型）菌的部分生化特征與志賀氏菌相似，并能與部分志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集；因此前面生化試驗符合志