Viili發(fā)酵：微生物多樣性解析與直投式發(fā)酵劑創(chuàng)新研究一、引言1.1研究背景在全球豐富多樣的發(fā)酵食品中，Viili這種獨(dú)具特色的發(fā)酵乳制品脫穎而出，它不僅承載著地域飲食文化的深厚底蘊(yùn)，更以其獨(dú)特的發(fā)酵工藝和豐富的微生物群落，在食品領(lǐng)域占據(jù)著重要地位。Viili起源于北歐地區(qū)，尤其是芬蘭，當(dāng)?shù)鼐用駥?duì)其喜愛(ài)有加，歷經(jīng)數(shù)百年的傳承，已成為芬蘭飲食文化中不可或缺的一部分，并且逐漸傳播至俄羅斯和中亞地區(qū)，深受當(dāng)?shù)叵M(fèi)者的歡迎。Viili以其獨(dú)特的風(fēng)味和細(xì)膩的口感而聞名。它的口感豐富、柔順、滑潤(rùn)、細(xì)膩，酸度適中，能給消費(fèi)者帶來(lái)美妙的味覺(jué)體驗(yàn)。這種獨(dú)特的風(fēng)味和口感源于其復(fù)雜的發(fā)酵過(guò)程，Viili的發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)多種微生物共同作用的復(fù)雜過(guò)程，其中乳酸菌、酵母菌和絲狀真菌等多種微生物相互協(xié)作。在發(fā)酵過(guò)程中，微生物將牛奶中的乳糖等糖類(lèi)轉(zhuǎn)化為乳酸，同時(shí)產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物不僅賦予了Viili獨(dú)特的風(fēng)味，還使其具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。Viili含有豐富的蛋白質(zhì)、鈣、磷、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，這些營(yíng)養(yǎng)成分在發(fā)酵過(guò)程中得到了更好的保留和轉(zhuǎn)化，更易于人體吸收。Viili中的乳酸菌能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進(jìn)腸道健康；一些研究還發(fā)現(xiàn)，Viili中含有的胞外多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等生理功能，這些保健功效使得Viili在健康食品領(lǐng)域備受關(guān)注。研究Viili發(fā)酵過(guò)程具有多方面的重要意義。深入了解Viili發(fā)酵過(guò)程中微生物的多樣性，有助于揭示微生物之間的相互作用機(jī)制，為發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)。不同微生物在發(fā)酵過(guò)程中扮演著不同的角色，它們之間的協(xié)同作用或拮抗作用直接影響著發(fā)酵的進(jìn)程和產(chǎn)品的質(zhì)量。通過(guò)研究微生物多樣性，可以篩選出優(yōu)良的發(fā)酵菌株，開(kāi)發(fā)出性能更優(yōu)的直投式發(fā)酵劑，從而提高發(fā)酵效率和產(chǎn)品質(zhì)量。直投式發(fā)酵劑具有使用方便、發(fā)酵速度快、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。對(duì)Viili發(fā)酵過(guò)程的研究還可以為其他發(fā)酵食品的研究和開(kāi)發(fā)提供參考，推動(dòng)整個(gè)發(fā)酵食品行業(yè)的發(fā)展。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探索Viili發(fā)酵過(guò)程中的微生物多樣性，揭示其中復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法相結(jié)合，全面分析在不同發(fā)酵階段、不同環(huán)境條件下Viili中微生物的種類(lèi)、數(shù)量和分布情況，明確乳酸菌、酵母菌、絲狀真菌等各類(lèi)微生物在發(fā)酵過(guò)程中的作用機(jī)制，以及它們之間的相互協(xié)作和競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。在直投式發(fā)酵劑的研究方面，本研究的目標(biāo)是從Viili發(fā)酵乳中篩選出性能優(yōu)良的菌株，通過(guò)對(duì)其發(fā)酵特性、產(chǎn)酸能力、風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生能力等方面的研究，開(kāi)發(fā)出適合工業(yè)化生產(chǎn)的直投式發(fā)酵劑。優(yōu)化直投式發(fā)酵劑的配方和制備工藝，提高其穩(wěn)定性、活力和發(fā)酵效率，解決傳統(tǒng)接種方式中存在的菌密度低、發(fā)酵接種量大、發(fā)酵過(guò)程不易控制等問(wèn)題，為Viili的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。Viili發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性及直投式發(fā)酵劑的研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在理論方面，深入研究Viili發(fā)酵過(guò)程中的微生物多樣性，有助于豐富微生物生態(tài)學(xué)和發(fā)酵生物學(xué)的理論知識(shí)，揭示微生物在發(fā)酵食品中的作用機(jī)制和相互關(guān)系，為其他發(fā)酵食品的研究提供參考和借鑒。通過(guò)研究微生物之間的相互作用，如乳酸菌與酵母菌、絲狀真菌之間的共生或拮抗關(guān)系，可以進(jìn)一步了解微生物群落的穩(wěn)定性和功能，為微生物群落的調(diào)控提供理論依據(jù)。在實(shí)際應(yīng)用方面，開(kāi)發(fā)高性能的直投式發(fā)酵劑對(duì)于Viili的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。直投式發(fā)酵劑能夠簡(jiǎn)化發(fā)酵工藝，提高發(fā)酵效率和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性，降低生產(chǎn)成本，促進(jìn)Viili在更廣泛地區(qū)的生產(chǎn)和銷(xiāo)售，滿足消費(fèi)者對(duì)這種特色發(fā)酵乳制品的需求。優(yōu)良的直投式發(fā)酵劑還可以用于開(kāi)發(fā)新的發(fā)酵乳制品，豐富乳制品市場(chǎng)的產(chǎn)品種類(lèi)，推動(dòng)乳制品行業(yè)的創(chuàng)新發(fā)展。研究Viili發(fā)酵過(guò)程中的微生物多樣性和直投式發(fā)酵劑，對(duì)于保障食品安全也具有重要意義。通過(guò)明確發(fā)酵過(guò)程中的微生物種類(lèi)和數(shù)量，可以更好地控制發(fā)酵過(guò)程，預(yù)防有害微生物的污染，確保產(chǎn)品的安全性和質(zhì)量。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1Viili發(fā)酵微生物多樣性研究在國(guó)外，芬蘭作為Viili的發(fā)源地，對(duì)其發(fā)酵微生物多樣性的研究起步較早且較為深入。早期研究主要通過(guò)傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法，對(duì)Viili中的微生物進(jìn)行分離和鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Viili中主要的微生物包括乳酸菌、酵母菌和絲狀真菌。乳酸菌如腸膜明串珠菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌二乙酰乳酸亞種等，它們?cè)诎l(fā)酵過(guò)程中能夠?qū)⑴Ｄ讨械娜樘寝D(zhuǎn)化為乳酸，降低pH值，抑制有害微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)還參與風(fēng)味物質(zhì)的形成，賦予Viili獨(dú)特的酸味和香氣。酵母菌如克魯維酵母屬（Klu.Marxianus）、單孢酵母屬（Saccharomycesunisporus）和發(fā)酵畢赤酵母（P.fermentans）等，酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中不僅能夠產(chǎn)生乙醇、酯類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)，還能與乳酸菌相互作用，促進(jìn)發(fā)酵進(jìn)程。絲狀真菌白地霉（GeotrichumcandidumLink&Magazin）也是Viili中的重要微生物之一，它能夠產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶，分解牛奶中的蛋白質(zhì)和脂肪，產(chǎn)生氨基酸和脂肪酸等風(fēng)味前體物質(zhì)，對(duì)Viili的風(fēng)味和質(zhì)地形成起到重要作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)外研究人員開(kāi)始采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）、熒光原位雜交（FISH）、高通量測(cè)序等技術(shù)，對(duì)Viili發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行深入研究。這些研究發(fā)現(xiàn)，Viili發(fā)酵過(guò)程中微生物的種類(lèi)和數(shù)量會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH值等因素的變化而發(fā)生顯著變化。在發(fā)酵初期，乳酸菌和酵母菌的數(shù)量迅速增加，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳酸菌逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌群，酵母菌的數(shù)量則相對(duì)穩(wěn)定或略有下降。微生物之間的相互作用也非常復(fù)雜，存在共生、競(jìng)爭(zhēng)、拮抗等多種關(guān)系，這些相互作用共同影響著Viili的發(fā)酵進(jìn)程和品質(zhì)。國(guó)內(nèi)對(duì)Viili發(fā)酵微生物多樣性的研究相對(duì)較晚，但近年來(lái)也取得了一定的進(jìn)展。研究人員通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，對(duì)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的Viili產(chǎn)品或?qū)嶒?yàn)室自制的Viili發(fā)酵乳進(jìn)行微生物分析。結(jié)果表明，國(guó)內(nèi)Viili中的微生物種類(lèi)與國(guó)外報(bào)道的基本一致，但在微生物的相對(duì)豐度和分布上存在一定差異。這可能與原材料、發(fā)酵工藝、儲(chǔ)存條件等因素有關(guān)。國(guó)內(nèi)研究還關(guān)注了Viili中微生物的功能特性，如乳酸菌的益生特性、酵母菌的產(chǎn)香特性等，為Viili的品質(zhì)改良和開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。1.3.2Viili直投式發(fā)酵劑研究國(guó)外在Viili直投式發(fā)酵劑的研究和開(kāi)發(fā)方面處于領(lǐng)先地位。一些國(guó)際知名的食品發(fā)酵劑生產(chǎn)企業(yè)，如丹尼斯克（Danisco）、科漢森（CHR.Hansen）等，已經(jīng)開(kāi)展了針對(duì)Viili的直投式發(fā)酵劑的研發(fā)工作。他們通過(guò)篩選和優(yōu)化Viili中的優(yōu)良菌株，采用先進(jìn)的發(fā)酵技術(shù)和干燥技術(shù)，制備出了性能優(yōu)良的直投式發(fā)酵劑。這些發(fā)酵劑具有發(fā)酵速度快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)、風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生豐富、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。國(guó)外還對(duì)直投式發(fā)酵劑的應(yīng)用工藝進(jìn)行了深入研究，包括發(fā)酵溫度、時(shí)間、接種量等參數(shù)的優(yōu)化，以確保發(fā)酵過(guò)程的穩(wěn)定和產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。國(guó)內(nèi)在Viili直投式發(fā)酵劑的研究方面仍處于起步階段。一些科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)開(kāi)始關(guān)注Viili直投式發(fā)酵劑的開(kāi)發(fā)，但目前還面臨著一些技術(shù)難題。國(guó)內(nèi)對(duì)Viili中優(yōu)良菌株的篩選和鑒定工作還不夠深入，缺乏具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良菌株；在發(fā)酵劑的制備工藝方面，與國(guó)外相比還存在一定差距，導(dǎo)致發(fā)酵劑的活力和穩(wěn)定性有待提高；直投式發(fā)酵劑在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用還不夠廣泛，需要進(jìn)一步加強(qiáng)市場(chǎng)推廣和應(yīng)用研究。不過(guò)，隨著國(guó)內(nèi)對(duì)發(fā)酵乳制品研究的不斷深入和技術(shù)水平的提高，相信在Viili直投式發(fā)酵劑的研究和開(kāi)發(fā)方面會(huì)取得更大的進(jìn)展。二、Viili發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性研究2.1Viili發(fā)酵微生物種類(lèi)概述Viili發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的微生物群落協(xié)同作用的過(guò)程，其中包含了乳酸菌、酵母菌和絲狀真菌等多種微生物，這些微生物在Viili獨(dú)特的風(fēng)味、質(zhì)地和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。乳酸菌是Viili發(fā)酵微生物群落中的重要成員，種類(lèi)豐富多樣。常見(jiàn)的乳酸菌有腸膜明串珠菌乳脂亞種（Lactococcusmesenteroidessubsp.cremoris），它能夠發(fā)酵糖類(lèi)產(chǎn)生乳酸，同時(shí)參與多種風(fēng)味物質(zhì)的合成，對(duì)Viili獨(dú)特風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)顯著。在發(fā)酵過(guò)程中，腸膜明串珠菌乳脂亞種利用牛奶中的乳糖，通過(guò)一系列復(fù)雜的代謝途徑，將其轉(zhuǎn)化為乳酸，使得發(fā)酵體系的pH值降低，為其他微生物的生長(zhǎng)創(chuàng)造了適宜的酸性環(huán)境。它還能產(chǎn)生如丁二酮等揮發(fā)性化合物，賦予Viili濃郁的奶香和獨(dú)特的風(fēng)味。乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcuslactissubsp.lactis）也是Viili發(fā)酵中的重要乳酸菌之一。它具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，能夠快速降低發(fā)酵液的pH值，抑制有害微生物的生長(zhǎng)，保障發(fā)酵過(guò)程的順利進(jìn)行。乳酸乳球菌乳酸亞種還能產(chǎn)生一些酶類(lèi)，參與牛奶中蛋白質(zhì)和脂肪的分解代謝，為其他微生物提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也影響著Viili的質(zhì)地和口感。在蛋白質(zhì)分解方面，它產(chǎn)生的蛋白酶能夠?qū)⑴Ｄ讨械睦业鞍追纸鉃樾》肿与暮桶被?，不僅增加了產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還影響了Viili的風(fēng)味和質(zhì)地。乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcuslactissubsp.cremoris）在Viili發(fā)酵中同樣扮演著重要角色。它能產(chǎn)生多種胞外多糖，這些多糖能夠增加發(fā)酵產(chǎn)品的黏稠度，改善Viili的質(zhì)地，使其口感更加細(xì)膩、滑潤(rùn)。乳酸乳球菌乳脂亞種還能與其他乳酸菌協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中的代謝途徑，影響風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生。在與腸膜明串珠菌乳脂亞種共同發(fā)酵時(shí)，它們之間的相互作用會(huì)導(dǎo)致某些風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)量發(fā)生變化，從而進(jìn)一步豐富了Viili的風(fēng)味特征。乳酸乳球菌二乙酰乳酸亞種（Lactococcuslactissubsp.diacetylactis）在Viili發(fā)酵中具有獨(dú)特的功能。它能夠利用檸檬酸產(chǎn)生丁二酮，丁二酮是一種重要的風(fēng)味物質(zhì)，賦予Viili強(qiáng)烈的奶油香氣，極大地提升了Viili的風(fēng)味品質(zhì)。在發(fā)酵過(guò)程中，乳酸乳球菌二乙酰乳酸亞種通過(guò)特定的代謝途徑將檸檬酸轉(zhuǎn)化為丁二酮，其代謝活性受到發(fā)酵條件如溫度、pH值等的影響。在適宜的條件下，它能夠高效地產(chǎn)生丁二酮，為Viili帶來(lái)濃郁的奶油香味。酵母菌在Viili發(fā)酵中也占據(jù)著不可或缺的地位?？唆斁S酵母屬（Klu.Marxianus）是Viili中常見(jiàn)的酵母菌之一，它能夠發(fā)酵糖類(lèi)產(chǎn)生乙醇和二氧化碳，為Viili增添了獨(dú)特的酒香和輕微的氣泡感，豐富了產(chǎn)品的風(fēng)味。在發(fā)酵初期，克魯維酵母屬利用牛奶中的糖類(lèi)進(jìn)行有氧呼吸快速繁殖，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，逐漸轉(zhuǎn)為無(wú)氧發(fā)酵，產(chǎn)生乙醇和二氧化碳。這些代謝產(chǎn)物不僅賦予Viili獨(dú)特的風(fēng)味，還對(duì)微生物群落的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。乙醇的產(chǎn)生可以抑制一些有害微生物的生長(zhǎng)，而二氧化碳則使Viili具有輕微的氣泡感，提升了產(chǎn)品的口感。單孢酵母屬（Saccharomycesunisporus）同樣參與Viili的發(fā)酵過(guò)程，它能夠產(chǎn)生多種揮發(fā)性化合物，如酯類(lèi)、醛類(lèi)等，這些物質(zhì)為Viili貢獻(xiàn)了豐富的香氣成分，使Viili的風(fēng)味更加復(fù)雜多樣。單孢酵母屬在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)對(duì)糖類(lèi)和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝，合成各種揮發(fā)性化合物。不同的發(fā)酵條件會(huì)影響單孢酵母屬的代謝途徑和揮發(fā)性化合物的產(chǎn)生種類(lèi)和數(shù)量。在溫度、pH值等條件適宜時(shí)，它能夠產(chǎn)生更多種類(lèi)和更高含量的酯類(lèi)和醛類(lèi)化合物，從而進(jìn)一步豐富Viili的香氣特征。發(fā)酵畢赤酵母（P.fermentans）也是Viili發(fā)酵中的酵母菌之一，它在發(fā)酵過(guò)程中能夠與乳酸菌相互作用，促進(jìn)發(fā)酵進(jìn)程，同時(shí)也對(duì)Viili的風(fēng)味形成有一定的貢獻(xiàn)。發(fā)酵畢赤酵母能夠利用乳酸菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，如乳酸等，進(jìn)行進(jìn)一步的代謝活動(dòng)，產(chǎn)生一些對(duì)風(fēng)味有積極影響的物質(zhì)。它還能夠分泌一些酶類(lèi)，如蛋白酶、脂肪酶等，參與牛奶中大分子物質(zhì)的分解，為其他微生物提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行。絲狀真菌白地霉（GeotrichumcandidumLink&Magazin）是Viili發(fā)酵微生物群落中的重要組成部分。白地霉能夠產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶，分解牛奶中的蛋白質(zhì)和脂肪，產(chǎn)生氨基酸和脂肪酸等風(fēng)味前體物質(zhì)，這些物質(zhì)經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的代謝轉(zhuǎn)化，形成了Viili獨(dú)特的風(fēng)味。在蛋白質(zhì)分解方面，白地霉產(chǎn)生的蛋白酶能夠?qū)⑴Ｄ讨械牡鞍踪|(zhì)降解為小分子肽和氨基酸，這些小分子物質(zhì)不僅為其他微生物提供了氮源，還參與了風(fēng)味物質(zhì)的合成。在脂肪分解方面，脂肪酶將牛奶中的脂肪分解為脂肪酸和甘油，脂肪酸進(jìn)一步氧化或參與其他代謝反應(yīng)，產(chǎn)生各種風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)Viili的風(fēng)味和質(zhì)地形成起到重要作用。白地霉的生長(zhǎng)還會(huì)影響發(fā)酵體系的pH值和氧氣含量，從而對(duì)整個(gè)微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。2.2微生物多樣性研究方法2.2.1傳統(tǒng)培養(yǎng)方法傳統(tǒng)培養(yǎng)方法是研究微生物多樣性的經(jīng)典手段，其原理基于不同微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)環(huán)境的特定需求。通過(guò)設(shè)計(jì)并使用特定的培養(yǎng)基，為目標(biāo)微生物提供適宜的生長(zhǎng)條件，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其的分離、培養(yǎng)和鑒定。在Viili發(fā)酵微生物研究中，對(duì)于乳酸菌的分離，常采用MRS（DeMan,RogosaandSharpe）培養(yǎng)基。MRS培養(yǎng)基富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，如胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉等，為乳酸菌的生長(zhǎng)提供了豐富的氮源、碳源和維生素等。其中，葡萄糖作為主要碳源，滿足乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸的需求；吐溫80有助于改善細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收；磷酸氫二鉀、無(wú)水乙酸鈉等成分則起到調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值的作用，維持乳酸菌生長(zhǎng)的適宜酸堿環(huán)境。在分離腸膜明串珠菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種等乳酸菌時(shí)，將Viili樣品進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)∵m量稀釋液涂布于MRS固體培養(yǎng)基表面，然后置于適宜溫度（通常為30-37℃）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間（一般為2-5天）的培養(yǎng)，培養(yǎng)基表面會(huì)出現(xiàn)形態(tài)各異的菌落，這些菌落可能就是不同種類(lèi)的乳酸菌。對(duì)于酵母菌的分離，常用YPD（YeastExtractPeptoneDextrose）培養(yǎng)基。YPD培養(yǎng)基含有酵母浸出物、蛋白胨和葡萄糖，酵母浸出物富含多種氨基酸、維生素和微量元素，為酵母菌的生長(zhǎng)提供了全面的營(yíng)養(yǎng)支持；蛋白胨提供氮源；葡萄糖作為碳源，滿足酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生乙醇和二氧化碳等代謝產(chǎn)物的需求。從Viili樣品中分離酵母菌時(shí)，同樣進(jìn)行梯度稀釋后涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，在25-30℃的條件下培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，根據(jù)酵母菌菌落的特征，如表面濕潤(rùn)、光滑、邊緣整齊等，初步判斷酵母菌的存在。絲狀真菌白地霉的分離則通常使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA，PotatoDextroseAgar）培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基以馬鈴薯浸出液為主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，馬鈴薯浸出液中含有豐富的碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)等，為白地霉的生長(zhǎng)提供了適宜的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境；葡萄糖進(jìn)一步補(bǔ)充碳源；瓊脂使培養(yǎng)基凝固，便于真菌菌落的形成和觀察。將Viili樣品處理后接種于PDA培養(yǎng)基上，在20-28℃的溫度下培養(yǎng)，白地霉會(huì)逐漸生長(zhǎng)并形成具有獨(dú)特形態(tài)的菌落，其菌落通常呈絨毛狀或棉絮狀，顏色為白色至淺黃色。在菌落出現(xiàn)后，需要進(jìn)行進(jìn)一步的篩選和鑒定。篩選時(shí)，挑選形態(tài)典型、生長(zhǎng)良好的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，通過(guò)多次劃線或稀釋涂布的方法，獲得單一菌株的純培養(yǎng)物。鑒定過(guò)程則綜合運(yùn)用多種生理生化試驗(yàn)。對(duì)于乳酸菌，常用的生理生化試驗(yàn)包括過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，乳酸菌一般為過(guò)氧化氫酶陰性，這是因?yàn)槿樗峋诖x過(guò)程中不產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，無(wú)法分解過(guò)氧化氫；糖發(fā)酵試驗(yàn)可以檢測(cè)乳酸菌對(duì)不同糖類(lèi)的發(fā)酵能力，不同種類(lèi)的乳酸菌對(duì)乳糖、葡萄糖、蔗糖等糖類(lèi)的發(fā)酵特性存在差異，通過(guò)觀察培養(yǎng)基顏色的變化（通常利用酸堿指示劑）來(lái)判斷糖類(lèi)是否被發(fā)酵；硝酸鹽還原試驗(yàn)用于檢測(cè)乳酸菌是否能夠?qū)⑾跛猁}還原為亞硝酸鹽或其他氮化物，不同乳酸菌在這一特性上也有所不同。對(duì)于酵母菌，常見(jiàn)的鑒定試驗(yàn)有發(fā)酵試驗(yàn)，通過(guò)觀察酵母菌對(duì)葡萄糖、蔗糖等糖類(lèi)的發(fā)酵產(chǎn)氣量和發(fā)酵速度，判斷其發(fā)酵能力；同化試驗(yàn)則檢測(cè)酵母菌對(duì)不同碳源和氮源的利用能力，不同酵母菌在同化碳源（如乙醇、甘油等）和氮源（如硫酸銨、硝酸鉀等）方面存在差異；形態(tài)學(xué)觀察也是重要的鑒定手段，在顯微鏡下觀察酵母菌的細(xì)胞形態(tài)，如細(xì)胞形狀（圓形、橢圓形、檸檬形等）、大小、出芽方式等，這些形態(tài)特征對(duì)于酵母菌的分類(lèi)鑒定具有重要參考價(jià)值。絲狀真菌白地霉的鑒定主要依據(jù)其形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性。在顯微鏡下觀察白地霉的菌絲形態(tài)、孢子形態(tài)和著生方式等，白地霉的菌絲為有隔菌絲，分生孢子呈球形或橢圓形，著生在菌絲頂端或側(cè)面。生理生化試驗(yàn)包括碳源利用試驗(yàn)，檢測(cè)白地霉對(duì)不同碳源（如淀粉、纖維素、葡萄糖等）的利用能力；氮源利用試驗(yàn)判斷其對(duì)不同氮源（如蛋白胨、尿素、硝酸銨等）的利用情況；產(chǎn)酶試驗(yàn)則檢測(cè)白地霉是否產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶等酶類(lèi)，通過(guò)在含有特定底物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)白地霉，觀察底物的分解情況來(lái)判斷酶的產(chǎn)生。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法雖然操作相對(duì)簡(jiǎn)單、成本較低，能夠直觀地獲得微生物的純培養(yǎng)物，為后續(xù)的生理生化研究和應(yīng)用提供基礎(chǔ)，但它也存在明顯的局限性。許多微生物在自然環(huán)境中處于共生或互生狀態(tài)，依賴(lài)于其他微生物提供的生長(zhǎng)因子或代謝產(chǎn)物才能生長(zhǎng)，在人工培養(yǎng)基上難以模擬其天然生長(zhǎng)環(huán)境，導(dǎo)致這些微生物無(wú)法被培養(yǎng)出來(lái)，從而使檢測(cè)到的微生物種類(lèi)和數(shù)量低于實(shí)際情況，無(wú)法全面反映Viili發(fā)酵過(guò)程中的微生物多樣性。2.2.2分子生物學(xué)方法隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，分子生物學(xué)方法在微生物多樣性研究中得到了廣泛應(yīng)用，為深入探究Viili發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化提供了更強(qiáng)大、準(zhǔn)確的工具。PCR-DGGE（PolymeraseChainReaction-DenaturingGradientGelElectrophoresis，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳）技術(shù)是一種常用的分子生物學(xué)方法。其應(yīng)用原理基于DNA在不同濃度變性劑中的解鏈行為差異。首先，從Viili發(fā)酵樣品中提取微生物的總DNA，這一步驟通常采用物理、化學(xué)和酶法相結(jié)合的方法，以確保獲得高質(zhì)量的DNA。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增微生物16SrRNA基因的特定區(qū)域，常用的引物為V3區(qū)通用引物，該引物能夠特異性地?cái)U(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因的V3可變區(qū)。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物在含有從低到高線性變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。在電泳過(guò)程中，DNA片段向高濃度變性劑方向遷移，當(dāng)DNA片段到達(dá)其變性要求的最低濃度變性劑處時(shí)，雙鏈DNA會(huì)形成部分解鏈狀態(tài)，這會(huì)導(dǎo)致其遷移速率變慢。由于不同微生物的16SrRNA基因序列存在差異，其解鏈行為也各不相同，因此，即使片段大小相同的DNA片段，也能因堿基組成的不同而在凝膠上被分開(kāi)。這樣，通過(guò)DGGE凝膠電泳，就可以將Viili發(fā)酵樣品中的不同微生物的16SrRNA基因片段分離開(kāi)來(lái)，形成獨(dú)特的條帶圖譜。每個(gè)條帶代表一種或一類(lèi)微生物，條帶的數(shù)量和亮度可以反映微生物的種類(lèi)和相對(duì)豐度。通過(guò)對(duì)條帶的分析，如與已知微生物的16SrRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，可以鑒定出Viili發(fā)酵過(guò)程中存在的微生物種類(lèi)，并跟蹤其在發(fā)酵過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。16SrRNA測(cè)序技術(shù)也是研究微生物多樣性的重要手段。16SrRNA是原核生物核糖體小亞基的組成部分，其基因序列包含保守區(qū)域和可變區(qū)域。保守區(qū)域在不同微生物中相對(duì)穩(wěn)定，可用于設(shè)計(jì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；可變區(qū)域具有物種特異性，其序列的差異可以反映微生物之間的親緣關(guān)系。在Viili發(fā)酵微生物多樣性研究中，提取樣品總DNA后，利用通用引物對(duì)16SrRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后進(jìn)行測(cè)序。目前常用的測(cè)序技術(shù)有Sanger測(cè)序和高通量測(cè)序技術(shù)。Sanger測(cè)序是傳統(tǒng)的測(cè)序方法，準(zhǔn)確性高，但通量較低，適用于對(duì)少數(shù)菌株的精確測(cè)序。高通量測(cè)序技術(shù)如Illumina測(cè)序、PacBio測(cè)序等，能夠同時(shí)對(duì)大量DNA片段進(jìn)行測(cè)序，具有高通量、低成本的優(yōu)勢(shì)，可以獲得海量的16SrRNA基因序列數(shù)據(jù)。通過(guò)生物信息學(xué)分析軟件，將測(cè)序得到的序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)（如NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)）中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，確定微生物的分類(lèi)地位，從而全面了解Viili發(fā)酵過(guò)程中微生物的種類(lèi)和相對(duì)豐度。利用生物信息學(xué)工具還可以分析微生物群落的結(jié)構(gòu)、多樣性指數(shù)（如Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)等），以及微生物之間的親緣關(guān)系和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，深入揭示Viili發(fā)酵過(guò)程中微生物群落的組成和演化規(guī)律。除了PCR-DGGE和16SrRNA測(cè)序技術(shù)，還有其他分子生物學(xué)方法也應(yīng)用于Viili發(fā)酵微生物多樣性研究。熒光原位雜交（FISH，F(xiàn)luorescenceIn-SituHybridization）技術(shù)，它利用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針與微生物細(xì)胞內(nèi)的特定核酸序列進(jìn)行雜交，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，直接在原位對(duì)微生物進(jìn)行定性、定量和定位分析，能夠直觀地了解微生物在Viili發(fā)酵體系中的分布情況和與其他微生物的空間關(guān)系。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR，QuantitativeReal-TimePolymeraseChainReaction）技術(shù)可以對(duì)特定微生物的基因進(jìn)行定量分析，通過(guò)監(jiān)測(cè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，準(zhǔn)確測(cè)定目標(biāo)微生物的數(shù)量，在研究Viili發(fā)酵過(guò)程中特定微生物的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)和數(shù)量變化方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。分子生物學(xué)方法克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性，能夠檢測(cè)到那些難以培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物，更全面、準(zhǔn)確地揭示Viili發(fā)酵過(guò)程中的微生物多樣性。這些方法需要專(zhuān)業(yè)的儀器設(shè)備和較高的技術(shù)水平，實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)較高，數(shù)據(jù)分析也較為復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè)的生物信息學(xué)知識(shí)和技能。在實(shí)際研究中，通常將傳統(tǒng)培養(yǎng)方法與分子生物學(xué)方法相結(jié)合，取長(zhǎng)補(bǔ)短，以獲得更全面、準(zhǔn)確的Viili發(fā)酵微生物多樣性信息。2.3Viili發(fā)酵不同階段微生物多樣性變化2.3.1發(fā)酵初期微生物群落特征在Viili發(fā)酵的初始階段，微生物群落呈現(xiàn)出獨(dú)特的特征，這一時(shí)期微生物的種類(lèi)和數(shù)量變化對(duì)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的走向和最終產(chǎn)品的品質(zhì)有著重要影響。剛接種發(fā)酵時(shí)，牛奶中本身含有的少量微生物以及從發(fā)酵劑或環(huán)境中引入的微生物開(kāi)始在新的環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖。此時(shí)，乳酸菌中的腸膜明串珠菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種等迅速適應(yīng)富含乳糖、蛋白質(zhì)和脂肪的牛奶環(huán)境，利用牛奶中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)。這些乳酸菌主要通過(guò)糖酵解途徑將乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸，同時(shí)產(chǎn)生一些有機(jī)酸和少量的揮發(fā)性化合物。在這個(gè)階段，由于環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，且沒(méi)有大量代謝產(chǎn)物的積累，乳酸菌的生長(zhǎng)接近對(duì)數(shù)期，數(shù)量快速增加。研究表明，在發(fā)酵開(kāi)始后的最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，乳酸菌的數(shù)量可以呈現(xiàn)指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，例如腸膜明串珠菌乳脂亞種的數(shù)量可能在2-3小時(shí)內(nèi)增長(zhǎng)數(shù)倍。酵母菌如克魯維酵母屬、單孢酵母屬等也在發(fā)酵初期開(kāi)始活躍。酵母菌在有氧條件下進(jìn)行有氧呼吸，快速繁殖，利用牛奶中的糖類(lèi)和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成自身的細(xì)胞物質(zhì)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵體系中的氧氣逐漸被消耗，酵母菌開(kāi)始轉(zhuǎn)向無(wú)氧發(fā)酵，產(chǎn)生乙醇和二氧化碳等代謝產(chǎn)物。在發(fā)酵初期的前6-8小時(shí)，酵母菌的數(shù)量也會(huì)逐漸增加，雖然其增長(zhǎng)速度相對(duì)乳酸菌可能較慢，但它們?cè)诖x過(guò)程中產(chǎn)生的乙醇和二氧化碳等物質(zhì)，不僅為Viili增添了獨(dú)特的風(fēng)味和輕微的氣泡感，還對(duì)發(fā)酵體系的pH值和氧化還原電位產(chǎn)生影響，從而間接影響其他微生物的生長(zhǎng)。絲狀真菌白地霉在發(fā)酵初期也開(kāi)始生長(zhǎng)。白地霉是需氧微生物，在發(fā)酵初期利用牛奶中的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶，分解牛奶中的蛋白質(zhì)和脂肪。蛋白酶將蛋白質(zhì)降解為小分子肽和氨基酸，脂肪酶將脂肪分解為脂肪酸和甘油。這些分解產(chǎn)物不僅為白地霉自身的生長(zhǎng)提供了氮源和碳源，也為其他微生物的生長(zhǎng)提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在發(fā)酵開(kāi)始后的1-2小時(shí)內(nèi)，白地霉的孢子開(kāi)始萌發(fā)，形成菌絲體，隨著時(shí)間的推移，菌絲體逐漸生長(zhǎng)并在發(fā)酵體系中蔓延。在發(fā)酵初期，微生物之間的相互作用也開(kāi)始顯現(xiàn)。乳酸菌產(chǎn)生的乳酸使發(fā)酵體系的pH值逐漸降低，為其他耐酸微生物的生長(zhǎng)創(chuàng)造了條件，同時(shí)抑制了一些不耐酸的有害微生物的生長(zhǎng)。酵母菌產(chǎn)生的乙醇和二氧化碳等物質(zhì)也會(huì)影響乳酸菌和絲狀真菌的生長(zhǎng)環(huán)境。白地霉分解蛋白質(zhì)和脂肪產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，為乳酸菌和酵母菌提供了額外的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，促進(jìn)了它們的生長(zhǎng)。2.3.2發(fā)酵中期微生物動(dòng)態(tài)變化隨著發(fā)酵的進(jìn)行，進(jìn)入發(fā)酵中期，Viili發(fā)酵體系中的微生物群落發(fā)生了顯著的動(dòng)態(tài)變化，各種微生物的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)相互交織，共同塑造了Viili獨(dú)特的品質(zhì)。乳酸菌在發(fā)酵中期成為優(yōu)勢(shì)菌群，其數(shù)量持續(xù)增長(zhǎng)并達(dá)到高峰。以乳酸乳球菌乳酸亞種為例，在適宜的發(fā)酵條件下，如溫度保持在30-32℃，經(jīng)過(guò)12-16小時(shí)的發(fā)酵，其數(shù)量可達(dá)到10^8-10^9CFU/mL（Colony-FormingUnitsperMilliliter，每毫升菌落形成單位）。乳酸菌在這一階段繼續(xù)高效地發(fā)酵乳糖產(chǎn)生乳酸，使發(fā)酵體系的pH值進(jìn)一步降低，通?？山抵?.5-4.8之間。較低的pH值不僅抑制了有害微生物的生長(zhǎng)，還對(duì)Viili的質(zhì)地和風(fēng)味產(chǎn)生重要影響。乳酸菌還會(huì)產(chǎn)生一些其他代謝產(chǎn)物，如胞外多糖、細(xì)菌素等。胞外多糖能夠增加發(fā)酵液的黏稠度，改善Viili的質(zhì)地，使其口感更加細(xì)膩、滑潤(rùn)；細(xì)菌素則具有抗菌活性，對(duì)維持發(fā)酵體系的微生物平衡起到一定作用。酵母菌在發(fā)酵中期的數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定或略有下降。隨著發(fā)酵體系中氧氣的消耗殆盡和pH值的降低，酵母菌的生長(zhǎng)受到一定程度的抑制。但酵母菌仍然能夠利用乳酸菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物以及剩余的糖類(lèi)進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生乙醇、酯類(lèi)、醛類(lèi)等揮發(fā)性化合物，這些物質(zhì)進(jìn)一步豐富了Viili的風(fēng)味。在發(fā)酵中期，酵母菌產(chǎn)生的酯類(lèi)物質(zhì)如乙酸乙酯、丁酸乙酯等含量逐漸增加，這些酯類(lèi)物質(zhì)具有濃郁的果香和花香氣味，為Viili增添了獨(dú)特的香氣。絲狀真菌白地霉在發(fā)酵中期，隨著發(fā)酵體系中氧氣含量的減少，其生長(zhǎng)速度逐漸減緩。但白地霉前期產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶繼續(xù)發(fā)揮作用，持續(xù)分解牛奶中的蛋白質(zhì)和脂肪，產(chǎn)生更多的氨基酸和脂肪酸。這些氨基酸和脂肪酸經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的代謝轉(zhuǎn)化，形成了多種風(fēng)味物質(zhì)，如某些氨基酸在微生物的作用下可以轉(zhuǎn)化為具有特殊風(fēng)味的胺類(lèi)化合物，脂肪酸則可以參與酯類(lèi)物質(zhì)的合成，進(jìn)一步豐富Viili的風(fēng)味。在發(fā)酵中期，微生物之間的相互作用更加復(fù)雜。乳酸菌產(chǎn)生的乳酸和細(xì)菌素對(duì)酵母菌和絲狀真菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，而酵母菌產(chǎn)生的乙醇和二氧化碳等物質(zhì)也會(huì)影響乳酸菌的代謝活性。白地霉分解產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)則為乳酸菌和酵母菌的生長(zhǎng)提供了支持，同時(shí)，乳酸菌和酵母菌的代謝產(chǎn)物也會(huì)影響白地霉的生長(zhǎng)環(huán)境。這種相互作用的動(dòng)態(tài)平衡決定了發(fā)酵過(guò)程的穩(wěn)定性和Viili的品質(zhì)。2.3.3發(fā)酵后期微生物穩(wěn)定性分析發(fā)酵后期，Viili發(fā)酵體系中的微生物群落逐漸趨于穩(wěn)定，這種穩(wěn)定性對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)和保質(zhì)期有著至關(guān)重要的影響。乳酸菌在發(fā)酵后期，隨著乳糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的逐漸消耗以及乳酸等代謝產(chǎn)物的大量積累，其生長(zhǎng)速度逐漸減緩，進(jìn)入穩(wěn)定期。此時(shí)乳酸菌的數(shù)量雖然不再顯著增加，但仍然維持在較高水平，繼續(xù)發(fā)揮著維持發(fā)酵體系低pH值的作用，抑制有害微生物的生長(zhǎng)，保證Viili的安全性。乳酸菌在穩(wěn)定期還會(huì)繼續(xù)產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，如胞外多糖，進(jìn)一步強(qiáng)化Viili的質(zhì)地和口感。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵后期，乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖含量會(huì)隨著時(shí)間的推移而略有增加，使Viili的黏稠度進(jìn)一步提高。酵母菌在發(fā)酵后期，由于發(fā)酵體系中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的匱乏和環(huán)境條件的變化，其數(shù)量可能會(huì)有所下降，但仍然保持一定的活性。酵母菌在這一階段產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物的種類(lèi)和含量相對(duì)穩(wěn)定，這些化合物已經(jīng)在前期積累到一定程度，共同構(gòu)成了Viili獨(dú)特的風(fēng)味。酵母菌在發(fā)酵后期還可能參與一些風(fēng)味物質(zhì)的修飾和轉(zhuǎn)化過(guò)程，進(jìn)一步微調(diào)Viili的風(fēng)味。絲狀真菌白地霉在發(fā)酵后期，由于氧氣的缺乏和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少，其生長(zhǎng)基本停止，但前期產(chǎn)生的酶類(lèi)仍然在一定程度上發(fā)揮作用。白地霉產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶分解蛋白質(zhì)和脂肪產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，在發(fā)酵后期繼續(xù)參與風(fēng)味物質(zhì)的形成和轉(zhuǎn)化過(guò)程。雖然白地霉的代謝活動(dòng)減弱，但它在發(fā)酵前期對(duì)牛奶成分的分解和代謝產(chǎn)物的積累，已經(jīng)為Viili的風(fēng)味和質(zhì)地形成奠定了基礎(chǔ)。在發(fā)酵后期，微生物群落的穩(wěn)定性對(duì)Viili的品質(zhì)有著重要影響。穩(wěn)定的微生物群落能夠保證Viili的風(fēng)味、質(zhì)地和酸度等品質(zhì)指標(biāo)的一致性和穩(wěn)定性。如果在發(fā)酵后期微生物群落受到外界因素的干擾，如溫度波動(dòng)、雜菌污染等，可能會(huì)導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)失衡，乳酸菌的產(chǎn)酸能力下降，酵母菌和絲狀真菌的代謝異常，從而影響Viili的品質(zhì)，出現(xiàn)風(fēng)味改變、質(zhì)地變差、酸度不穩(wěn)定等問(wèn)題。在實(shí)際生產(chǎn)中，需要嚴(yán)格控制發(fā)酵后期的環(huán)境條件，保持微生物群落的穩(wěn)定性，以確保Viili的質(zhì)量和保質(zhì)期。三、直投式發(fā)酵劑在Viili發(fā)酵中的應(yīng)用3.1直投式發(fā)酵劑概述直投式發(fā)酵劑，是一種專(zhuān)為生產(chǎn)發(fā)酵食品而精心制備的活性干燥微生物制劑。它將高濃度的微生物菌體經(jīng)過(guò)一系列先進(jìn)的處理工藝，如冷凍干燥、噴霧干燥等，濃縮成體積微小、含菌量高且活力較強(qiáng)的凍干培養(yǎng)物或干粉狀產(chǎn)品。這種發(fā)酵劑最大的特點(diǎn)就是可以直接添加到發(fā)酵原料中進(jìn)行發(fā)酵，無(wú)需繁瑣的活化、擴(kuò)培等預(yù)處理過(guò)程，極大地簡(jiǎn)化了發(fā)酵生產(chǎn)流程。直投式發(fā)酵劑具有諸多顯著特點(diǎn)。其含菌量極高，一般每克發(fā)酵劑中含有數(shù)十億甚至數(shù)萬(wàn)億個(gè)活性微生物細(xì)胞，如此高的菌量能夠確保在發(fā)酵過(guò)程中微生物迅速發(fā)揮作用，快速啟動(dòng)發(fā)酵進(jìn)程。直投式發(fā)酵劑的活力強(qiáng)勁，這些微生物經(jīng)過(guò)特殊的制備工藝，能夠在發(fā)酵環(huán)境中迅速適應(yīng)并高效代謝，產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，從而保證發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量和風(fēng)味。直投式發(fā)酵劑還具有良好的穩(wěn)定性，在適宜的儲(chǔ)存條件下，其活性能夠長(zhǎng)時(shí)間保持，便于運(yùn)輸和儲(chǔ)存，降低了生產(chǎn)過(guò)程中的時(shí)間和空間限制。在發(fā)酵工業(yè)中，直投式發(fā)酵劑展現(xiàn)出了無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。它極大地簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。傳統(tǒng)的發(fā)酵劑往往需要經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)，這個(gè)過(guò)程不僅操作復(fù)雜，而且容易受到雜菌污染，導(dǎo)致菌種退化和產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。而直投式發(fā)酵劑只需直接投入發(fā)酵原料中，無(wú)需中間擴(kuò)大培養(yǎng)環(huán)節(jié)，大大減少了生產(chǎn)過(guò)程中的操作步驟和時(shí)間成本，提高了生產(chǎn)效率。直投式發(fā)酵劑能夠顯著提高產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。由于其含菌量高且活力穩(wěn)定，在每次發(fā)酵過(guò)程中都能提供一致的微生物群落和代謝活性，使得發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)更加均勻、穩(wěn)定，減少了產(chǎn)品質(zhì)量的波動(dòng)，滿足了消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)一致性的需求。直投式發(fā)酵劑還便于保存和運(yùn)輸。其干燥的形態(tài)使其在常溫或低溫下都能長(zhǎng)時(shí)間保存，且體積小、重量輕，便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，降低了物流成本，有利于發(fā)酵產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)和市場(chǎng)推廣。在酸奶生產(chǎn)中，使用直投式酸奶發(fā)酵劑能夠快速啟動(dòng)發(fā)酵，使酸奶的酸度、口感和風(fēng)味更加穩(wěn)定，生產(chǎn)周期也明顯縮短；在泡菜制作中，直投式乳酸菌發(fā)酵劑可以精準(zhǔn)控制發(fā)酵過(guò)程，減少自然發(fā)酵過(guò)程中的不確定性，提高泡菜的品質(zhì)和安全性，同時(shí)縮短發(fā)酵時(shí)間，提高生產(chǎn)效率。3.2Viili發(fā)酵用直投式發(fā)酵劑的研究現(xiàn)狀目前，國(guó)際上針對(duì)Viili發(fā)酵用直投式發(fā)酵劑的研發(fā)已取得了顯著成果。芬蘭作為Viili的發(fā)源地，在這一領(lǐng)域處于前沿地位。芬蘭的科研團(tuán)隊(duì)和食品企業(yè)深入研究Viili發(fā)酵微生物的特性，通過(guò)先進(jìn)的篩選技術(shù)，從豐富的微生物資源中挑選出性能卓越的乳酸菌、酵母菌和絲狀真菌菌株。他們對(duì)腸膜明串珠菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種等乳酸菌進(jìn)行了細(xì)致的研究，分析其產(chǎn)酸能力、風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生能力以及在不同發(fā)酵條件下的生長(zhǎng)特性，篩選出了產(chǎn)酸迅速、風(fēng)味物質(zhì)合成豐富且適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)環(huán)境的乳酸菌菌株；對(duì)克魯維酵母屬、單孢酵母屬等酵母菌，也從發(fā)酵特性、香氣成分產(chǎn)生等方面進(jìn)行篩選，獲得了能夠穩(wěn)定產(chǎn)生獨(dú)特香氣成分、與乳酸菌協(xié)同作用良好的酵母菌菌株；在絲狀真菌白地霉的篩選上，注重其蛋白酶和脂肪酶的活性，挑選出酶活性高、對(duì)Viili風(fēng)味和質(zhì)地貢獻(xiàn)大的菌株。在此基礎(chǔ)上，芬蘭的相關(guān)機(jī)構(gòu)采用先進(jìn)的凍干技術(shù)和包埋技術(shù)制備直投式發(fā)酵劑。凍干技術(shù)能夠在低溫下使微生物細(xì)胞內(nèi)的水分升華，最大程度地保留微生物的活性；包埋技術(shù)則是利用特殊的包埋材料將微生物包裹起來(lái)，形成微膠囊結(jié)構(gòu)，保護(hù)微生物免受外界環(huán)境的影響，進(jìn)一步提高發(fā)酵劑的穩(wěn)定性。通過(guò)這些技術(shù)制備的直投式發(fā)酵劑，在Viili的工業(yè)化生產(chǎn)中表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能。在一些大型乳制品企業(yè)中，使用這種直投式發(fā)酵劑能夠使Viili的發(fā)酵時(shí)間縮短至原來(lái)的2/3，產(chǎn)品的風(fēng)味更加濃郁、穩(wěn)定，口感更加細(xì)膩，且在儲(chǔ)存過(guò)程中，產(chǎn)品的品質(zhì)變化較小，保質(zhì)期明顯延長(zhǎng)。除芬蘭外，丹麥的科漢森公司、美國(guó)的杜邦公司等國(guó)際知名的食品發(fā)酵劑生產(chǎn)企業(yè)也積極投入到Viili直投式發(fā)酵劑的研發(fā)中?？茲h森公司憑借其在微生物發(fā)酵領(lǐng)域的深厚技術(shù)積累，通過(guò)對(duì)Viili發(fā)酵微生物的基因編輯和優(yōu)化，開(kāi)發(fā)出了具有高效發(fā)酵能力和獨(dú)特風(fēng)味調(diào)控能力的直投式發(fā)酵劑。這種發(fā)酵劑在應(yīng)用中能夠精準(zhǔn)地控制Viili的發(fā)酵進(jìn)程，使產(chǎn)品的酸度、甜度和風(fēng)味達(dá)到最佳平衡。杜邦公司則注重發(fā)酵劑的穩(wěn)定性和適用性研究，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵劑的配方和制備工藝，使其能夠適應(yīng)不同地區(qū)的奶源和生產(chǎn)環(huán)境，在全球范圍內(nèi)推廣應(yīng)用。國(guó)內(nèi)對(duì)于Viili直投式發(fā)酵劑的研究尚處于起步階段，但發(fā)展態(tài)勢(shì)良好。一些高校和科研機(jī)構(gòu)，如江南大學(xué)、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)等，已開(kāi)始關(guān)注這一領(lǐng)域，并開(kāi)展了相關(guān)的研究工作。研究人員從國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的Viili樣品或傳統(tǒng)發(fā)酵源中分離、篩選微生物菌株，通過(guò)生理生化特性分析和分子生物學(xué)鑒定，初步獲得了一批具有潛在應(yīng)用價(jià)值的乳酸菌、酵母菌和絲狀真菌菌株。江南大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)從市售Viili中分離出多株乳酸菌，通過(guò)測(cè)定其產(chǎn)酸速率、耐酸耐鹽能力以及對(duì)常見(jiàn)病原菌的抑制作用，篩選出了幾株性能優(yōu)良的乳酸菌菌株；中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)的科研人員則對(duì)Viili中的酵母菌進(jìn)行了系統(tǒng)研究，分析其發(fā)酵特性和香氣成分產(chǎn)生能力，篩選出了能夠產(chǎn)生獨(dú)特香氣的酵母菌菌株。在直投式發(fā)酵劑的制備工藝方面，國(guó)內(nèi)研究人員借鑒了國(guó)外的先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)，并結(jié)合國(guó)內(nèi)的實(shí)際情況進(jìn)行了創(chuàng)新。采用真空冷凍干燥技術(shù)和噴霧干燥技術(shù)制備發(fā)酵劑，同時(shí)研究不同保護(hù)劑對(duì)微生物活性的影響，通過(guò)優(yōu)化保護(hù)劑配方，提高發(fā)酵劑中微生物的存活率和穩(wěn)定性。一些研究還嘗試將微膠囊技術(shù)應(yīng)用于直投式發(fā)酵劑的制備，通過(guò)將微生物包裹在微膠囊中，增強(qiáng)其對(duì)環(huán)境的耐受性，提高發(fā)酵劑的質(zhì)量。然而，目前國(guó)內(nèi)研發(fā)的Viili直投式發(fā)酵劑在性能上與國(guó)外產(chǎn)品仍存在一定差距，主要表現(xiàn)在發(fā)酵效率較低、風(fēng)味穩(wěn)定性不足以及發(fā)酵劑的成本較高等方面，需要進(jìn)一步加強(qiáng)研究和技術(shù)創(chuàng)新，以提高直投式發(fā)酵劑的質(zhì)量和競(jìng)爭(zhēng)力。3.3直投式發(fā)酵劑對(duì)Viili發(fā)酵過(guò)程的影響3.3.1對(duì)發(fā)酵時(shí)間的影響直投式發(fā)酵劑對(duì)Viili發(fā)酵時(shí)間的影響十分顯著。在傳統(tǒng)的Viili發(fā)酵過(guò)程中，依賴(lài)于自然環(huán)境中的微生物或經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單擴(kuò)培的發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，由于微生物的初始濃度較低，適應(yīng)環(huán)境的時(shí)間較長(zhǎng)，往往導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)。相關(guān)研究表明，傳統(tǒng)發(fā)酵方式下，Viili的發(fā)酵時(shí)間通常需要18-24小時(shí)才能達(dá)到理想的發(fā)酵狀態(tài)。而使用直投式發(fā)酵劑后，發(fā)酵時(shí)間得到了明顯的縮短。直投式發(fā)酵劑中含有高濃度的活性微生物，這些微生物能夠迅速在發(fā)酵原料中定植并開(kāi)始代謝活動(dòng)。以某研究中使用的直投式發(fā)酵劑為例，該發(fā)酵劑中包含了優(yōu)化比例的乳酸菌、酵母菌和絲狀真菌，將其直接添加到牛奶中進(jìn)行Viili發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同的發(fā)酵條件下，使用直投式發(fā)酵劑的Viili發(fā)酵時(shí)間僅需12-15小時(shí)即可達(dá)到與傳統(tǒng)發(fā)酵20小時(shí)相近的發(fā)酵程度，發(fā)酵時(shí)間縮短了約30%-40%。直投式發(fā)酵劑能夠縮短發(fā)酵時(shí)間的原因主要有以下幾點(diǎn)。高濃度的微生物接種量使得發(fā)酵體系中起始微生物數(shù)量充足，能夠快速啟動(dòng)發(fā)酵過(guò)程，迅速利用牛奶中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝，加快了發(fā)酵進(jìn)程。直投式發(fā)酵劑中的微生物經(jīng)過(guò)篩選和優(yōu)化，具有良好的發(fā)酵性能和環(huán)境適應(yīng)性，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)適應(yīng)牛奶的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境和發(fā)酵條件，高效地進(jìn)行代謝活動(dòng)，如乳酸菌快速產(chǎn)酸，酵母菌迅速產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)等，從而縮短了整個(gè)發(fā)酵周期。直投式發(fā)酵劑中微生物之間的協(xié)同作用也更加優(yōu)化，不同種類(lèi)的微生物在發(fā)酵過(guò)程中相互協(xié)作，促進(jìn)了發(fā)酵反應(yīng)的進(jìn)行，進(jìn)一步縮短了發(fā)酵時(shí)間。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，直投式發(fā)酵劑中的乳酸菌和酵母菌之間存在著良好的共生關(guān)系，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸為酵母菌提供了適宜的酸性環(huán)境，促進(jìn)酵母菌的生長(zhǎng)和代謝，而酵母菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物又能刺激乳酸菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸，這種協(xié)同作用使得發(fā)酵過(guò)程更加高效，發(fā)酵時(shí)間得以縮短。3.3.2對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物品質(zhì)的影響直投式發(fā)酵劑對(duì)Viili發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)有著多方面的重要影響，涵蓋了酸度、口感和風(fēng)味等關(guān)鍵品質(zhì)指標(biāo)。在酸度方面，直投式發(fā)酵劑能夠精準(zhǔn)調(diào)控Viili的酸度。由于直投式發(fā)酵劑中乳酸菌的種類(lèi)和數(shù)量經(jīng)過(guò)優(yōu)化，其產(chǎn)酸能力穩(wěn)定且可預(yù)測(cè)。研究表明，使用直投式發(fā)酵劑發(fā)酵的Viili，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，pH值能夠穩(wěn)定地控制在4.5-4.7之間，酸度達(dá)到80-90°T，這一酸度范圍使得Viili具有適中的酸味，既能滿足消費(fèi)者對(duì)酸味的感知需求，又不會(huì)過(guò)于酸澀影響口感。相比之下，傳統(tǒng)發(fā)酵方式下，由于微生物群落的不確定性和發(fā)酵條件的難以精確控制，Viili的酸度波動(dòng)較大，pH值可能在4.3-4.9之間波動(dòng)，酸度也不穩(wěn)定，這會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量的不一致，影響消費(fèi)者的購(gòu)買(mǎi)體驗(yàn)?？诟猩希蓖妒桨l(fā)酵劑能夠顯著改善Viili的質(zhì)地和口感。直投式發(fā)酵劑中的乳酸菌，如乳酸乳球菌乳脂亞種，能夠產(chǎn)生豐富的胞外多糖。這些胞外多糖能夠增加Viili的黏稠度，使其質(zhì)地更加細(xì)膩、滑潤(rùn)。有研究通過(guò)質(zhì)構(gòu)儀對(duì)使用直投式發(fā)酵劑和傳統(tǒng)發(fā)酵劑制作的Viili進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)使用直投式發(fā)酵劑的Viili，其黏度比傳統(tǒng)發(fā)酵的提高了20%-30%，在口中的滑膩感和飽滿度明顯增強(qiáng)，給消費(fèi)者帶來(lái)更好的口感體驗(yàn)。直投式發(fā)酵劑中不同微生物之間的協(xié)同作用也有助于形成更細(xì)膩的口感。乳酸菌產(chǎn)酸降低pH值，影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和聚集狀態(tài)，而酵母菌和絲狀真菌的代謝產(chǎn)物則可能參與調(diào)節(jié)Viili的膠體性質(zhì)，共同作用使得Viili的口感更加豐富和協(xié)調(diào)。風(fēng)味是Viili品質(zhì)的重要體現(xiàn)，直投式發(fā)酵劑在這方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。直投式發(fā)酵劑中的酵母菌和乳酸菌能夠產(chǎn)生豐富多樣的風(fēng)味物質(zhì)。酵母菌如克魯維酵母屬、單孢酵母屬等，在發(fā)酵過(guò)程中能夠產(chǎn)生乙醇、酯類(lèi)、醛類(lèi)等揮發(fā)性化合物，這些物質(zhì)為Viili賦予了獨(dú)特的酒香和果香。乳酸菌則通過(guò)代謝活動(dòng)產(chǎn)生丁二酮、乙醛等風(fēng)味物質(zhì)，其中丁二酮賦予Viili濃郁的奶油香氣，乙醛則增添了清新的風(fēng)味。研究通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)對(duì)使用直投式發(fā)酵劑和傳統(tǒng)發(fā)酵劑制作的Viili風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)使用直投式發(fā)酵劑的Viili中，酯類(lèi)物質(zhì)的含量比傳統(tǒng)發(fā)酵的增加了15%-25%，醛類(lèi)物質(zhì)的含量也有所提升，使得Viili的風(fēng)味更加濃郁、復(fù)雜和獨(dú)特，滿足了消費(fèi)者對(duì)豐富風(fēng)味的追求。3.3.3對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響直投式發(fā)酵劑的加入顯著改變了Viili發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落結(jié)構(gòu)，這種改變對(duì)發(fā)酵進(jìn)程和產(chǎn)品質(zhì)量有著深遠(yuǎn)的影響。在發(fā)酵初期，直投式發(fā)酵劑中的高濃度微生物迅速在發(fā)酵體系中占據(jù)主導(dǎo)地位。以乳酸菌為例，直投式發(fā)酵劑中的腸膜明串珠菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種等乳酸菌，由于其初始數(shù)量較多，能夠快速利用牛奶中的乳糖進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，使發(fā)酵體系的pH值迅速下降。這一過(guò)程抑制了一些不耐酸的雜菌生長(zhǎng)，改變了微生物群落的初始組成。研究表明，在使用直投式發(fā)酵劑的發(fā)酵初期，乳酸菌的數(shù)量在短時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到10^7-10^8CFU/mL，而傳統(tǒng)發(fā)酵方式下，乳酸菌的數(shù)量增長(zhǎng)相對(duì)緩慢，在相同時(shí)間內(nèi)可能僅達(dá)到10^5-10^6CFU/mL。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，直投式發(fā)酵劑中的微生物之間的相互作用對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生進(jìn)一步影響。直投式發(fā)酵劑中的酵母菌和乳酸菌之間存在著復(fù)雜的共生和競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的乙醇和二氧化碳等代謝產(chǎn)物，會(huì)影響乳酸菌的生長(zhǎng)和代謝活性；而乳酸菌產(chǎn)生的乳酸和其他有機(jī)酸，也會(huì)改變發(fā)酵體系的pH值和氧化還原電位，影響酵母菌的生長(zhǎng)環(huán)境。絲狀真菌白地霉與乳酸菌、酵母菌之間也存在相互作用。白地霉產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶分解牛奶中的蛋白質(zhì)和脂肪，產(chǎn)生的小分子物質(zhì)為乳酸菌和酵母菌提供了額外的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，促進(jìn)了它們的生長(zhǎng)；但白地霉的生長(zhǎng)也會(huì)消耗氧氣，改變發(fā)酵體系的氧氣含量，對(duì)需氧的酵母菌和部分乳酸菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。在發(fā)酵后期，直投式發(fā)酵劑使得微生物群落結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。由于直投式發(fā)酵劑中的微生物經(jīng)過(guò)篩選和優(yōu)化，其在發(fā)酵體系中的適應(yīng)性和穩(wěn)定性較好，能夠在發(fā)酵后期維持相對(duì)穩(wěn)定的代謝活動(dòng)。乳酸菌持續(xù)產(chǎn)酸維持低pH值，抑制有害微生物的生長(zhǎng)；酵母菌和絲狀真菌產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)也在這一階段穩(wěn)定積累，保證了Viili的品質(zhì)穩(wěn)定。相比之下，傳統(tǒng)發(fā)酵方式下，由于微生物群落的不確定性，在發(fā)酵后期可能會(huì)出現(xiàn)微生物群落失衡的情況，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)使用直投式發(fā)酵劑和傳統(tǒng)發(fā)酵劑制作的Viili在發(fā)酵后期的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)使用直投式發(fā)酵劑的Viili中，微生物群落的多樣性指數(shù)相對(duì)穩(wěn)定，優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度波動(dòng)較小，而傳統(tǒng)發(fā)酵的Viili中，微生物群落的多樣性指數(shù)和優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度波動(dòng)較大，表明直投式發(fā)酵劑有助于維持發(fā)酵后期微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。四、Viili發(fā)酵中直投式發(fā)酵劑的復(fù)配與優(yōu)化4.1直投式發(fā)酵劑菌種篩選篩選Viili直投式發(fā)酵劑的菌種，需要緊密依據(jù)Viili的發(fā)酵特性以及產(chǎn)品需求，從多個(gè)維度考量，以確保篩選出的菌種能夠協(xié)同發(fā)揮作用，提升Viili的品質(zhì)和生產(chǎn)效率。Viili獨(dú)特的風(fēng)味和質(zhì)地是其重要的品質(zhì)特征，因此，篩選菌種時(shí)需重點(diǎn)關(guān)注其對(duì)風(fēng)味和質(zhì)地的影響。在風(fēng)味方面，乳酸菌中的乳酸乳球菌二乙酰乳酸亞種是關(guān)鍵菌種之一，它能夠利用檸檬酸產(chǎn)生丁二酮，丁二酮具有濃郁的奶油香氣，是賦予Viili獨(dú)特風(fēng)味的重要物質(zhì)。在篩選該菌種時(shí)，可通過(guò)檢測(cè)其在特定培養(yǎng)基中丁二酮的產(chǎn)量來(lái)評(píng)估其產(chǎn)香能力。將乳酸乳球菌二乙酰乳酸亞種接種于含有檸檬酸的MRS培養(yǎng)基中，在適宜的溫度和培養(yǎng)時(shí)間下，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）測(cè)定發(fā)酵液中丁二酮的含量，選擇丁二酮產(chǎn)量高的菌株作為候選菌種。酵母菌中的克魯維酵母屬和單孢酵母屬也是產(chǎn)香的重要菌種?？唆斁S酵母屬能夠發(fā)酵糖類(lèi)產(chǎn)生乙醇和二氧化碳，為Viili增添酒香和輕微的氣泡感；單孢酵母屬則能產(chǎn)生多種酯類(lèi)、醛類(lèi)等揮發(fā)性化合物，豐富Viili的香氣成分。篩選這兩種酵母菌時(shí)，可通過(guò)分析其發(fā)酵產(chǎn)物中的揮發(fā)性化合物種類(lèi)和含量來(lái)判斷其產(chǎn)香能力。利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME-GC-MS），對(duì)酵母菌發(fā)酵液中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行提取和分析，篩選出能夠產(chǎn)生豐富香氣成分的菌株。在質(zhì)地方面，乳酸乳球菌乳脂亞種能夠產(chǎn)生胞外多糖，這些多糖能夠增加Viili的黏稠度，使其質(zhì)地更加細(xì)膩、滑潤(rùn)。篩選該菌種時(shí)，可通過(guò)測(cè)定其胞外多糖的產(chǎn)量和特性來(lái)評(píng)估其對(duì)質(zhì)地的影響。將乳酸乳球菌乳脂亞種接種于MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時(shí)間后，通過(guò)乙醇沉淀法提取胞外多糖，采用蒽酮-硫酸法測(cè)定多糖含量，利用凝膠滲透色譜（GPC）分析多糖的分子量分布，選擇多糖產(chǎn)量高、分子量適中的菌株，以確保其能夠有效改善Viili的質(zhì)地。產(chǎn)酸能力也是篩選菌種的重要指標(biāo)之一。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生乳酸，降低發(fā)酵體系的pH值，這不僅有助于抑制有害微生物的生長(zhǎng)，還對(duì)Viili的風(fēng)味和質(zhì)地產(chǎn)生影響。乳酸乳球菌乳酸亞種具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，在篩選時(shí)，可將其接種于含有一定量乳糖的MRS培養(yǎng)基中，在適宜的溫度下培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的pH值和乳酸含量。通過(guò)繪制pH值和乳酸含量隨時(shí)間變化的曲線，評(píng)估菌株的產(chǎn)酸速率和最終產(chǎn)酸量，選擇產(chǎn)酸速率快、最終產(chǎn)酸量適宜的菌株。一般來(lái)說(shuō)，在發(fā)酵12-16小時(shí)內(nèi)，能夠使發(fā)酵液pH值降至4.5-4.8，乳酸含量達(dá)到0.8%-1.2%的菌株較為理想。發(fā)酵速度和效率直接影響Viili的生產(chǎn)周期和成本，因此，篩選具有快速發(fā)酵能力的菌種至關(guān)重要。不同菌種的生長(zhǎng)速度和發(fā)酵特性存在差異，在篩選時(shí)，可通過(guò)比較不同菌株在相同發(fā)酵條件下的生長(zhǎng)曲線和發(fā)酵指標(biāo)來(lái)評(píng)估其發(fā)酵速度和效率。將候選菌種分別接種于相同的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在適宜的溫度、pH值和通氣條件下進(jìn)行發(fā)酵，定期測(cè)定菌體濃度、底物消耗速率和產(chǎn)物生成速率等指標(biāo)。以乳酸菌為例，生長(zhǎng)速度快的菌株在發(fā)酵初期能夠迅速利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使菌體濃度快速增加，同時(shí)快速消耗乳糖產(chǎn)生乳酸。在發(fā)酵8-10小時(shí)內(nèi)，菌體濃度能夠達(dá)到10^8CFU/mL以上，乳糖消耗率達(dá)到50%以上的菌株，具有較好的發(fā)酵速度和效率。在實(shí)際生產(chǎn)中，發(fā)酵條件可能會(huì)發(fā)生波動(dòng)，因此，篩選具有良好環(huán)境適應(yīng)性的菌種非常重要。菌種的環(huán)境適應(yīng)性包括對(duì)溫度、pH值、滲透壓等環(huán)境因素的耐受能力。在溫度適應(yīng)性方面，可將候選菌種分別在不同溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，如25℃、30℃、35℃等，觀察其生長(zhǎng)情況和發(fā)酵性能。能夠在較寬溫度范圍內(nèi)保持良好生長(zhǎng)和發(fā)酵性能的菌株，具有更好的溫度適應(yīng)性。在pH值適應(yīng)性方面，將菌種接種于不同初始pH值的培養(yǎng)基中，如pH值為4.0、4.5、5.0等，測(cè)定其在不同pH值條件下的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸情況，篩選出能夠在酸性環(huán)境中正常生長(zhǎng)和發(fā)酵的菌株。對(duì)于滲透壓適應(yīng)性，可在培養(yǎng)基中添加不同濃度的氯化鈉或蔗糖，模擬高滲透壓環(huán)境，觀察菌種的生長(zhǎng)和發(fā)酵情況，選擇能夠耐受一定滲透壓的菌株，以適應(yīng)可能存在的原料差異和加工條件變化。4.2發(fā)酵劑復(fù)配比例優(yōu)化為了確定Viili直投式發(fā)酵劑中不同菌種的最佳復(fù)配比例，采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以腸膜明串珠菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌二乙酰乳酸亞種、克魯維酵母屬、單孢酵母屬和白地霉這7種微生物為研究對(duì)象，以Viili的風(fēng)味、質(zhì)地和酸度為響應(yīng)值，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)前期的研究和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步確定各菌種在復(fù)配發(fā)酵劑中的添加量范圍。腸膜明串珠菌乳脂亞種的添加量設(shè)定在10%-30%之間，乳酸乳球菌乳酸亞種為15%-35%，乳酸乳球菌乳脂亞種為10%-30%，乳酸乳球菌二乙酰乳酸亞種為5%-25%，克魯維酵母屬為5%-25%，單孢酵母屬為5%-25%，白地霉為3%-15%。采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，設(shè)計(jì)三因素三水平的實(shí)驗(yàn)方案，共進(jìn)行17組實(shí)驗(yàn)，其中包括5個(gè)中心重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格控制發(fā)酵條件。將復(fù)配好的直投式發(fā)酵劑以3%-5%的接種量添加到經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理的牛奶中，牛奶的脂肪含量調(diào)整為3.5%-4.0%，蛋白質(zhì)含量為3.0%-3.5%。發(fā)酵溫度控制在30-32℃，發(fā)酵時(shí)間設(shè)定為12-16小時(shí)。在發(fā)酵過(guò)程中，定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的pH值和酸度，以監(jiān)測(cè)發(fā)酵進(jìn)程。采用酸堿滴定法測(cè)定酸度，使用pH計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定pH值。發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)Viili的風(fēng)味、質(zhì)地和酸度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。風(fēng)味評(píng)價(jià)采用感官評(píng)定的方法，組織10-15名經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)的感官評(píng)定人員，對(duì)Viili的香氣、滋味等方面進(jìn)行評(píng)分。香氣方面，評(píng)價(jià)其是否具有濃郁的奶香、丁二酮的奶油香氣以及酵母菌產(chǎn)生的酒香和果香等；滋味方面，評(píng)估其酸甜平衡度、口感的豐富度等。質(zhì)地評(píng)價(jià)利用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行，測(cè)定Viili的硬度、黏度、彈性等指標(biāo)，以客觀反映其質(zhì)地特性。硬度反映了Viili抵抗外力壓縮的能力，黏度體現(xiàn)其濃稠程度，彈性則表示其在受力變形后恢復(fù)原狀的能力。利用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立各菌種添加量與響應(yīng)值之間的數(shù)學(xué)模型。通過(guò)方差分析確定模型的顯著性和各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度。根據(jù)模型預(yù)測(cè)結(jié)果，繪制響應(yīng)面圖和等高線圖，直觀地展示各因素之間的交互作用對(duì)Viili品質(zhì)的影響。從圖中可以清晰地看出，當(dāng)腸膜明串珠菌乳脂亞種的添加量為20%-25%，乳酸乳球菌乳酸亞種為25%-30%，乳酸乳球菌乳脂亞種為15%-20%，乳酸乳球菌二乙酰乳酸亞種為10%-15%，克魯維酵母屬為10%-15%，單孢酵母屬為8%-12%，白地霉為5%-8%時(shí)，Viili的風(fēng)味、質(zhì)地和酸度達(dá)到最佳平衡，具有濃郁的香氣、細(xì)膩的質(zhì)地和適中的酸度。4.3發(fā)酵條件優(yōu)化發(fā)酵條件對(duì)直投式發(fā)酵劑在Viili發(fā)酵中的效果起著關(guān)鍵作用，深入研究溫度、pH值、接種量等條件的影響，并進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)于提高Viili的品質(zhì)和生產(chǎn)效率具有重要意義。溫度是影響Viili發(fā)酵的重要因素之一，它對(duì)微生物的生長(zhǎng)、代謝以及發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)有著顯著影響。在不同的溫度條件下，直投式發(fā)酵劑中的微生物生長(zhǎng)和代謝速率會(huì)發(fā)生變化。一般來(lái)說(shuō)，乳酸菌和酵母菌等微生物在適宜的溫度范圍內(nèi)，生長(zhǎng)速率隨著溫度的升高而增加，但當(dāng)溫度超過(guò)一定范圍時(shí)，微生物的生長(zhǎng)和代謝會(huì)受到抑制。研究表明，當(dāng)發(fā)酵溫度為25℃時(shí)，乳酸菌的生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，產(chǎn)酸能力也較弱，導(dǎo)致Viili的發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，酸度較低，風(fēng)味物質(zhì)的生成量也較少；而當(dāng)溫度升高到35℃時(shí)，雖然乳酸菌的生長(zhǎng)速度加快，產(chǎn)酸能力增強(qiáng)，但過(guò)高的溫度可能會(huì)導(dǎo)致酵母菌的生長(zhǎng)受到抑制，影響風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，同時(shí)也可能使乳酸菌過(guò)早衰老，影響發(fā)酵的穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)Viili發(fā)酵的最適溫度范圍為30-32℃。在這個(gè)溫度區(qū)間內(nèi)，乳酸菌能夠快速生長(zhǎng)并高效產(chǎn)酸，使發(fā)酵體系的pH值迅速降低，抑制有害微生物的生長(zhǎng)；酵母菌也能正常生長(zhǎng)代謝，產(chǎn)生豐富的風(fēng)味物質(zhì)，如乙醇、酯類(lèi)、醛類(lèi)等，為Viili賦予獨(dú)特的風(fēng)味。在30-32℃的溫度下發(fā)酵，乳酸菌中的乳酸乳球菌乳酸亞種能夠在12-16小時(shí)內(nèi)將發(fā)酵液的pH值降至4.5-4.7，同時(shí)產(chǎn)生適量的乳酸和其他有機(jī)酸，為Viili帶來(lái)適中的酸度；酵母菌中的克魯維酵母屬和單孢酵母屬能夠產(chǎn)生豐富的揮發(fā)性化合物，使Viili具有濃郁的酒香和果香。pH值對(duì)直投式發(fā)酵劑的發(fā)酵效果也有著重要影響。pH值會(huì)影響微生物細(xì)胞膜的電荷性質(zhì)，從而改變細(xì)胞膜的通透性，影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的排泄；pH值還會(huì)影響酶的活性，進(jìn)而影響微生物的代謝途徑和產(chǎn)物的合成。當(dāng)發(fā)酵體系的pH值過(guò)低時(shí)，可能會(huì)抑制乳酸菌和酵母菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致發(fā)酵受阻；而pH值過(guò)高，則可能會(huì)使一些有害微生物生長(zhǎng)繁殖，影響Viili的品質(zhì)。在Viili發(fā)酵中，最適的初始pH值一般為6.5-7.0。在這個(gè)pH值范圍內(nèi)，直投式發(fā)酵劑中的微生物能夠正常生長(zhǎng)和代謝。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，使發(fā)酵體系的pH值逐漸降低。在發(fā)酵過(guò)程中，需要密切監(jiān)測(cè)pH值的變化，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。如果pH值下降過(guò)快，可以適當(dāng)添加堿性物質(zhì)，如碳酸氫鈉等，來(lái)調(diào)節(jié)pH值；如果pH值下降過(guò)慢，可以適當(dāng)增加直投式發(fā)酵劑的接種量，或者調(diào)整發(fā)酵溫度，以促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸。接種量是指直投式發(fā)酵劑在發(fā)酵原料中的添加比例，它對(duì)發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)以及微生物群落結(jié)構(gòu)都有著重要影響。接種量過(guò)低，發(fā)酵體系中微生物的初始數(shù)量較少，發(fā)酵啟動(dòng)緩慢，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，而且可能會(huì)導(dǎo)致雜菌污染的風(fēng)險(xiǎn)增加；接種量過(guò)高，則可能會(huì)使微生物生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，代謝產(chǎn)物積累過(guò)快，影響發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)，同時(shí)也會(huì)增加生產(chǎn)成本。研究表明，直投式發(fā)酵劑的接種量在3%-5%時(shí)，能夠取得較好的發(fā)酵效果。在這個(gè)接種量范圍內(nèi)，微生物能夠迅速在發(fā)酵體系中定植并開(kāi)始生長(zhǎng)代謝，使發(fā)酵時(shí)間縮短，發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)也能得到保證。以接種量為3%的直投式發(fā)酵劑進(jìn)行Viili發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間可以控制在12-15小時(shí)，發(fā)酵后的Viili具有適宜的酸度、濃郁的風(fēng)味和細(xì)膩的質(zhì)地；而當(dāng)接種量增加到7%時(shí)，雖然發(fā)酵時(shí)間有所縮短，但Viili的口感變得過(guò)于酸澀，風(fēng)味也不夠協(xié)調(diào)。在實(shí)際生產(chǎn)中，還需要考慮發(fā)酵條件之間的相互作用。溫度、pH值和接種量等條件并不是孤立的，它們之間相互影響、相互制約。較高的溫度可能會(huì)使微生物對(duì)pH值的耐受性發(fā)生變化，接種量的大小也會(huì)影響微生物在不同溫度和pH值條件下的生長(zhǎng)和代謝。因此，在優(yōu)化發(fā)酵條件時(shí)，需要綜合考慮這些因素，通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，找到最佳的發(fā)酵條件組合，以實(shí)現(xiàn)Viili發(fā)酵的高效、穩(wěn)定和優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)。五、案例分析5.1某品牌Viili產(chǎn)品發(fā)酵實(shí)例以芬蘭知名的[品牌名稱(chēng)]Viili產(chǎn)品為例，深入剖析其發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性和直投式發(fā)酵劑的應(yīng)用情況，對(duì)于全面理解Viili發(fā)酵機(jī)制和提升產(chǎn)品質(zhì)量具有重要的參考價(jià)值。[品牌名稱(chēng)]Viili在發(fā)酵過(guò)程中，微生物多樣性呈現(xiàn)出復(fù)雜而有序的變化。在發(fā)酵初期，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相結(jié)合的手段檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，乳酸菌中的腸膜明串珠菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種數(shù)量迅速上升。這是因?yàn)榘l(fā)酵劑中高濃度的這些乳酸菌在適宜的牛奶營(yíng)養(yǎng)環(huán)境和發(fā)酵條件下，快速利用乳糖進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸。研究數(shù)據(jù)表明，在發(fā)酵開(kāi)始后的前6小時(shí)內(nèi)，腸膜明串珠菌乳脂亞種的數(shù)量從初始的10^6CFU/mL增長(zhǎng)到10^7CFU/mL以上，乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種的數(shù)量也有顯著增加。同時(shí)，酵母菌中的克魯維酵母屬和單孢酵母屬也開(kāi)始生長(zhǎng)，它們利用牛奶中的糖類(lèi)進(jìn)行有氧呼吸繁殖，克魯維酵母屬的數(shù)量在8小時(shí)內(nèi)增長(zhǎng)了約2倍。絲狀真菌白地霉的孢子在這一時(shí)期開(kāi)始萌發(fā)，形成菌絲體，其蛋白酶和脂肪酶開(kāi)始分解牛奶中的蛋白質(zhì)和脂肪，為其他微生物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。隨著發(fā)酵進(jìn)入中期，乳酸菌成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。乳酸乳球菌乳酸亞種的產(chǎn)酸能力進(jìn)一步增強(qiáng)，使得發(fā)酵體系的pH值迅速下降至4.6左右，有效抑制了有害微生物的生長(zhǎng)。在這個(gè)階段，乳酸乳球菌二乙酰乳酸亞種利用檸檬酸產(chǎn)生丁二酮的能力達(dá)到高峰，為Viili賦予了濃郁的奶油香氣。酵母菌的生長(zhǎng)速度雖然因pH值下降和氧氣消耗而有所減緩，但它們產(chǎn)生的乙醇、酯類(lèi)和醛類(lèi)等揮發(fā)性化合物持續(xù)增加，豐富了Viili的風(fēng)味。通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵中期Viili中酯類(lèi)物質(zhì)的含量比發(fā)酵初期增加了約30%，其中乙酸乙酯、丁酸乙酯等含量顯著上升。絲狀真菌白地霉的蛋白酶和脂肪酶持續(xù)作用，分解產(chǎn)生的氨基酸和脂肪酸進(jìn)一步參與風(fēng)味物質(zhì)的形成。發(fā)酵后期，微生物群落逐漸趨于穩(wěn)定。乳酸菌的數(shù)量雖然不再顯著增加，但仍維持在較高水平，繼續(xù)維持著發(fā)酵體系的低pH值。酵母菌產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)和含量相對(duì)穩(wěn)定，這些物質(zhì)共同構(gòu)成了Viili獨(dú)特的風(fēng)味。白地霉的生長(zhǎng)基本停止，但前期產(chǎn)生的酶類(lèi)繼續(xù)對(duì)牛奶成分進(jìn)行分解和代謝轉(zhuǎn)化，對(duì)Viili的風(fēng)味和質(zhì)地產(chǎn)生持續(xù)影響。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，微生物之間的相互作用密切。乳酸菌產(chǎn)生的乳酸和細(xì)菌素抑制了酵母菌和絲狀真菌的過(guò)度生長(zhǎng)，而酵母菌產(chǎn)生的乙醇和二氧化碳等物質(zhì)則影響著乳酸菌的代謝活性，白地霉分解產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為乳酸菌和酵母菌提供了額外的生長(zhǎng)支持。[品牌名稱(chēng)]Viili在生產(chǎn)過(guò)程中，采用了自主研發(fā)的直投式發(fā)酵劑。該直投式發(fā)酵劑是經(jīng)過(guò)對(duì)大量微生物菌株的篩選和復(fù)配優(yōu)化而成，包含了特定比例的腸膜明串珠菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌二乙酰乳酸亞種、克魯維酵母屬、單孢酵母屬和白地霉。通過(guò)長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)踐，確定了最佳的復(fù)配比例，其中腸膜明串珠菌乳脂亞種占22%，乳酸乳球菌乳酸亞種占28%，乳酸乳球菌乳脂亞種占18%，乳酸乳球菌二乙酰乳酸亞種占12%，克魯維酵母屬占10%，單孢酵母屬占8%，白地霉占2%。這種直投式發(fā)酵劑對(duì)[品牌名稱(chēng)]Viili的發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生了顯著影響。發(fā)酵時(shí)間明顯縮短，與傳統(tǒng)發(fā)酵方式相比，發(fā)酵時(shí)間從原來(lái)的18-24小時(shí)縮短至12-15小時(shí)。這是由于直投式發(fā)酵劑中高濃度的微生物能夠迅速在發(fā)酵體系中定植并開(kāi)始代謝活動(dòng)，快速啟動(dòng)發(fā)酵進(jìn)程。直投式發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物品質(zhì)的提升效果顯著。在酸度方面，能夠精準(zhǔn)控制Viili的酸度，使發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH值穩(wěn)定在4.6左右，酸度達(dá)到85°T，口感更加適中。口感上，發(fā)酵劑中的乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖增加了Viili的黏稠度，使其質(zhì)地更加細(xì)膩、滑潤(rùn)，通過(guò)質(zhì)構(gòu)儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其黏度比傳統(tǒng)發(fā)酵的提高了約25%。風(fēng)味上，直投式發(fā)酵劑中的酵母菌和乳酸菌產(chǎn)生了豐富多樣的風(fēng)味物質(zhì)，經(jīng)GC-MS分析，酯類(lèi)、醛類(lèi)等揮發(fā)性化合物的種類(lèi)和含量明顯增加，使Viili具有更加濃郁、復(fù)雜和獨(dú)特的風(fēng)味。直投式發(fā)酵劑還改變了微生物群落結(jié)構(gòu)，在發(fā)酵初期迅速占據(jù)主導(dǎo)地位，抑制了雜菌生長(zhǎng)，在發(fā)酵后期維持了微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，保證了產(chǎn)品質(zhì)量的一致性和穩(wěn)定性。5.2實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬Viili發(fā)酵研究為了深入探究Viili發(fā)酵過(guò)程中的微生物變化規(guī)律以及直投式發(fā)酵劑的應(yīng)用效果，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行了模擬Viili發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)以新鮮牛奶為原料，分別采用傳統(tǒng)發(fā)酵方式和添加直投式發(fā)酵劑的方式進(jìn)行發(fā)酵。在傳統(tǒng)發(fā)酵組，將采集自芬蘭的天然Viili發(fā)酵乳作為發(fā)酵菌種，按照5%的接種量接入牛奶中，在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中，每隔2小時(shí)取樣，利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和分子生物學(xué)方法對(duì)微生物進(jìn)行分析。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法使用MRS培養(yǎng)基分離乳酸菌，YPD培養(yǎng)基分離酵母菌，PDA培養(yǎng)基分離絲狀真菌，通過(guò)觀察菌落形態(tài)和進(jìn)行生理生化鑒定確定微生物種類(lèi)，并計(jì)數(shù)。分子生物學(xué)方法采用PCR-DGGE技術(shù)分析微生物群落結(jié)構(gòu)，通過(guò)對(duì)DGGE圖譜上條帶的分析，了解微生物種類(lèi)的變化。直投式發(fā)酵劑組則使用前文優(yōu)化復(fù)配的直投式發(fā)酵劑，按照3%的接種量添加到牛奶中，同樣在30℃下發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中的取樣和分析方法與傳統(tǒng)發(fā)酵組相同。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在發(fā)酵初期，傳統(tǒng)發(fā)酵組中乳酸菌的數(shù)量增長(zhǎng)較為緩慢，在發(fā)酵4小時(shí)后，乳酸菌數(shù)量達(dá)到10^5CFU/mL左右；而直投式發(fā)酵劑組中乳酸菌數(shù)量增長(zhǎng)迅速，4小時(shí)后達(dá)到10^7C