演講人：日期:生化檢驗(yàn)常用技術(shù)目錄CATALOGUE01光譜分析技術(shù)02電化學(xué)分析技術(shù)03分離與純化技術(shù)04分子診斷技術(shù)05免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)06自動(dòng)化與質(zhì)控技術(shù)PART01光譜分析技術(shù)紫外-可見(jiàn)分光光度法原理與應(yīng)用方法優(yōu)化儀器組成基于物質(zhì)對(duì)紫外-可見(jiàn)光區(qū)（200-800nm）的選擇性吸收，通過(guò)測(cè)量吸光度定量分析樣品濃度。廣泛應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)、藥物及環(huán)境污染物檢測(cè)，如DNA純度分析（A260/A280比值）和酶活性測(cè)定。包括光源（氘燈/鎢燈）、單色器、樣品池、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。關(guān)鍵參數(shù)包括波長(zhǎng)精度、帶寬和基線穩(wěn)定性，需定期校準(zhǔn)以保障數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。需控制pH、溫度及溶劑極性以減少干擾；多組分分析時(shí)可采用導(dǎo)數(shù)光譜或雙波長(zhǎng)法消除背景吸收，提高特異性。原子吸收光譜法元素定量分析通過(guò)基態(tài)原子對(duì)特征波長(zhǎng)光的吸收測(cè)定金屬元素（如鉛、汞、銅）含量，檢出限可達(dá)ppb級(jí)。適用于血液、水質(zhì)和食品中重金屬檢測(cè)，需配合石墨爐（痕量分析）或火焰原子化器（常規(guī)濃度）。操作要點(diǎn)優(yōu)化燃燒器高度、燃?xì)獗壤蔼M縫寬度；定期維護(hù)霧化器和空心陰極燈，確保靈敏度與穩(wěn)定性。干擾與校正常見(jiàn)干擾包括光譜重疊（如鐵對(duì)錳的干擾）和基體效應(yīng)，可通過(guò)背景校正（氘燈或塞曼效應(yīng)）、標(biāo)準(zhǔn)加入法或化學(xué)改性劑（如磷酸銨消除氯化物干擾）解決。熒光光譜分析法高級(jí)技術(shù)時(shí)間分辨熒光（區(qū)分短壽命背景干擾）和同步熒光掃描（提高選擇性）可用于復(fù)雜基質(zhì)（如血清）中目標(biāo)物分析，結(jié)合三維熒光圖譜可增強(qiáng)多組分分辨能力。影響因素溫度、溶劑極性和pH顯著影響熒光強(qiáng)度；內(nèi)濾效應(yīng)和猝滅現(xiàn)象（如氧分子猝滅）需通過(guò)脫氣或添加保護(hù)劑（如硫代硫酸鈉）抑制。高靈敏度檢測(cè)利用物質(zhì)受激發(fā)后發(fā)射熒光的特性，靈敏度較吸光法高1-3個(gè)數(shù)量級(jí)，適用于痕量物質(zhì)（如維生素、多環(huán)芳烴）分析?？山Y(jié)合熒光探針（如SYBRGreen）實(shí)現(xiàn)DNA定量或細(xì)胞成像。PART02電化學(xué)分析技術(shù)離子選擇性電極法原理與特點(diǎn)基于特定離子選擇性膜的電勢(shì)響應(yīng)，通過(guò)測(cè)量電極電位變化來(lái)定量分析目標(biāo)離子（如K?、Na?、Cl?等），具有高選擇性、快速響應(yīng)和低檢測(cè)限的優(yōu)勢(shì)。臨床應(yīng)用廣泛用于電解質(zhì)檢測(cè)（如血鉀、血鈉）、血?dú)夥治觯╬H值、CO?分壓）及尿液離子濃度測(cè)定，為急重癥患者提供實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。干擾因素與校準(zhǔn)需注意蛋白質(zhì)沉積、電極老化及共存離子干擾，定期使用標(biāo)準(zhǔn)液校準(zhǔn)以保證準(zhǔn)確性。電位滴定法通過(guò)測(cè)量滴定過(guò)程中溶液電位突躍確定終點(diǎn)，適用于弱酸弱堿、氧化還原反應(yīng)及絡(luò)合滴定，如血清鈣的EDTA滴定。滴定終點(diǎn)判定現(xiàn)代自動(dòng)電位滴定儀可精確控制滴定速度，減少人為誤差，提高重復(fù)性，常用于藥物含量分析和水質(zhì)硬度檢測(cè)。自動(dòng)化應(yīng)用對(duì)低濃度樣本靈敏度不足，且需選擇合適指示電極（如玻璃電極、鉑電極）以匹配待測(cè)物化學(xué)性質(zhì)。方法局限性010203電導(dǎo)分析法電導(dǎo)率測(cè)量原理通過(guò)檢測(cè)溶液導(dǎo)電能力（與離子濃度和遷移率相關(guān)）間接分析電解質(zhì)總量，常用于水質(zhì)純度和工業(yè)流程監(jiān)控。生化檢測(cè)場(chǎng)景適用于無(wú)選擇性離子分析，如尿液電導(dǎo)率評(píng)估腎臟濃縮功能，或透析液電解質(zhì)平衡監(jiān)測(cè)。溫度補(bǔ)償要求電導(dǎo)率受溫度顯著影響，需內(nèi)置溫度傳感器或恒溫裝置進(jìn)行實(shí)時(shí)校正，確保數(shù)據(jù)可靠性。PART03分離與純化技術(shù)層析色譜法吸附色譜利用固定相對(duì)不同組分吸附能力的差異實(shí)現(xiàn)分離，常用于脂溶性物質(zhì)（如固醇類激素）的純化，硅膠和氧化鋁是常用吸附劑。離子交換色譜基于分子電荷差異進(jìn)行分離，適用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，通過(guò)調(diào)節(jié)pH或鹽濃度梯度洗脫目標(biāo)物。親和色譜通過(guò)生物特異性結(jié)合（如抗原-抗體、酶-底物）實(shí)現(xiàn)高選擇性純化，單克隆抗體純化中廣泛應(yīng)用。凝膠過(guò)濾色譜按分子大小分離，多用于脫鹽或蛋白質(zhì)分子量測(cè)定，常用介質(zhì)包括葡聚糖凝膠（Sephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）。電泳分離技術(shù)SDS十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過(guò)變性劑SDS使蛋白質(zhì)帶均勻負(fù)電荷，按分子量分離，廣泛用于蛋白質(zhì)純度分析和分子量測(cè)定。等電聚焦電泳根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pI）差異分離，用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究，可分辨pI相差0.01單位的蛋白質(zhì)。毛細(xì)管電泳高效微量化分離技術(shù)，適用于DNA測(cè)序、小分子藥物分析，具有高分辨率和快速分析優(yōu)勢(shì)。雙向電泳結(jié)合等電聚焦和SDS，用于復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品（如血清、組織提取物）的全譜分析。離心分離技術(shù)在蔗糖或氯化銫梯度介質(zhì)中按密度差異分離，超速離心可純化病毒顆?；騺喖?xì)胞器。密度梯度離心超速離心等密度離心通過(guò)逐步增加離心力分離不同密度組分，如細(xì)胞裂解液中細(xì)胞核（低速）、線粒體（中速）及核糖體（高速）的分級(jí)提取。轉(zhuǎn)速達(dá)10萬(wàn)轉(zhuǎn)/分鐘以上，用于脂蛋白分類（如HDL/LDL分離）或核酸密度測(cè)定。目標(biāo)物在梯度介質(zhì)中遷移至密度相等區(qū)域，常用于質(zhì)粒DNA與染色體DNA的分離純化。差速離心PART04分子診斷技術(shù)PCR擴(kuò)增技術(shù)基本原理與流程聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）通過(guò)變性、退火、延伸三個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)DNA片段指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，需依賴特異性引物、耐熱DNA聚合酶（如Taq酶）及dNTPs等核心組分，循環(huán)次數(shù)通常為25-40次。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上引入熒光標(biāo)記探針（如TaqMan探針）或SYBRGreen染料，可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程并實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)、基因表達(dá)分析及SNP分型。逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增，適用于RNA病毒檢測(cè)（如新冠病毒）及轉(zhuǎn)錄組研究，需注意RNA樣本的完整性和逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇。數(shù)字PCR（dPCR）通過(guò)微滴分割實(shí)現(xiàn)單分子擴(kuò)增，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，在低頻突變檢測(cè)和拷貝數(shù)變異分析中具有顯著優(yōu)勢(shì)。核酸雜交技術(shù)Southern/Northern雜交分別用于DNA和RNA的定性及定量分析，通過(guò)電泳分離、轉(zhuǎn)膜固定后與標(biāo)記探針雜交，可檢測(cè)特定序列的存在及大小，但操作繁瑣且靈敏度較低。液相雜交捕獲技術(shù)如雜交捕獲測(cè)序（HybridCaptureSequencing），通過(guò)溶液相雜交富集目標(biāo)區(qū)域，顯著提高NGS測(cè)序深度，在腫瘤panel檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。熒光原位雜交（FISH）使用熒光標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織中的靶核酸原位結(jié)合，可在顯微鏡下直接觀察基因定位或染色體異常，常用于腫瘤診斷（如HER2基因檢測(cè)）。基因芯片技術(shù)將數(shù)千種探針固定于固相載體，通過(guò)一次雜交實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，適用于多病原體篩查、基因分型和表達(dá)譜分析，但數(shù)據(jù)分析復(fù)雜度高?；驕y(cè)序技術(shù)Sanger測(cè)序基于雙脫氧核苷酸（ddNTPs）鏈終止原理，采用毛細(xì)管電泳分離，仍是突變驗(yàn)證的金標(biāo)準(zhǔn)，但通量低且成本較高，適合小片段靶向測(cè)序。01二代測(cè)序（NGS）包括Illumina邊合成邊測(cè)序、IonTorrent半導(dǎo)體測(cè)序等技術(shù)，具有高通量（單次運(yùn)行可達(dá)Tb級(jí)數(shù)據(jù)）、低成本特點(diǎn)，全基因組測(cè)序已降至千美元級(jí)別。三代單分子測(cè)序如PacBioSMRT和OxfordNanopore技術(shù)，無(wú)需PCR擴(kuò)增即可直接測(cè)序長(zhǎng)讀長(zhǎng)（>10kb），在結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)和表觀遺傳研究中不可替代。靶向測(cè)序panel針對(duì)特定疾病相關(guān)基因設(shè)計(jì)（如腫瘤驅(qū)動(dòng)基因、遺傳病基因集），通過(guò)多重PCR或雜交捕獲實(shí)現(xiàn)高深度測(cè)序，臨床診斷敏感性可達(dá)99%以上。020304PART05免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理與應(yīng)用基于抗原-抗體特異性結(jié)合原理，通過(guò)酶標(biāo)記技術(shù)放大信號(hào)，廣泛應(yīng)用于傳染病標(biāo)志物（如乙肝表面抗原）、腫瘤標(biāo)志物（如AFP）及激素水平檢測(cè)（如HCG）。具有高靈敏度（檢測(cè)限可達(dá)pg/mL級(jí)）和批量檢測(cè)優(yōu)勢(shì)。操作流程包括包被（固相載體吸附抗原/抗體）、封閉（減少非特異性結(jié)合）、加樣（待測(cè)物與酶標(biāo)抗體反應(yīng)）、洗滌（去除未結(jié)合物）、顯色（酶催化底物產(chǎn)生顏色變化）及終止反應(yīng)六大步驟，全程需嚴(yán)格質(zhì)量控制。方法學(xué)分類根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)可分為直接法（檢測(cè)抗原）、間接法（檢測(cè)抗體）、競(jìng)爭(zhēng)法（小分子物質(zhì)檢測(cè)）和夾心法（大分子抗原檢測(cè)），不同方法適用于不同分子特性的待測(cè)物。干擾因素控制需注意鉤狀效應(yīng)（高濃度樣本假陰性）、交叉反應(yīng)（相似抗原干擾）及溶血/脂血樣本的影響，需通過(guò)稀釋試驗(yàn)和阻斷劑消除干擾。放射免疫分析法采用碘-125或氚等放射性同位素標(biāo)記抗原/抗體，通過(guò)測(cè)量γ或β射線強(qiáng)度定量分析，靈敏度可達(dá)fg/mL級(jí)，是內(nèi)分泌激素（如T3/T4）和藥物濃度監(jiān)測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。同位素標(biāo)記技術(shù)需制備6-8個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，擬合四參數(shù)或Logit-Log數(shù)學(xué)模型，要求相關(guān)系數(shù)R2>0.99，批內(nèi)變異系數(shù)需控制在5%以內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)曲線建立實(shí)驗(yàn)區(qū)域需設(shè)置鉛屏蔽裝置，操作人員需佩戴劑量計(jì)并定期體檢，廢棄物需按半衰期分類存放至10個(gè)半衰期以上方可處理。輻射防護(hù)要求存在放射性污染風(fēng)險(xiǎn)，試劑有效期短（碘-125標(biāo)記物通常僅4-6周），且需配備昂貴的γ計(jì)數(shù)器或液體閃爍儀，正逐步被化學(xué)發(fā)光法替代。技術(shù)局限性采用魯米諾、吖啶酯等發(fā)光底物，在過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶催化下產(chǎn)生光子信號(hào)，較ELISA靈敏度提高10-100倍，適用于超微量物質(zhì)檢測(cè)（如心肌肌鈣蛋白I）。信號(hào)放大系統(tǒng)除常規(guī)蛋白標(biāo)志物外，新一代磁微?；瘜W(xué)發(fā)光平臺(tái)可實(shí)現(xiàn)核酸雜交檢測(cè)（如HPV分型）、細(xì)胞因子譜分析（IL-6/TNF-α等）及自身抗體檢測(cè)（ANA譜）。檢測(cè)菜單擴(kuò)展集成樣本處理、溫育、檢測(cè)于一體，檢測(cè)速度可達(dá)200測(cè)試/小時(shí)，支持隨機(jī)急診插入，配套質(zhì)控軟件可自動(dòng)生成Westgard規(guī)則質(zhì)控圖。全自動(dòng)化優(yōu)勢(shì)010302化學(xué)發(fā)光免疫分析需進(jìn)行精密度（總CV<10%）、線性范圍（覆蓋臨床決定水平）、功能靈敏度（20%CV對(duì)應(yīng)濃度）及方法學(xué)比對(duì)（與參考方法相關(guān)系數(shù)>0.975）等驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。性能驗(yàn)證要點(diǎn)04PART06自動(dòng)化與質(zhì)控技術(shù)高通量檢測(cè)能力智能化校準(zhǔn)與維護(hù)采用先進(jìn)的加樣系統(tǒng)和光學(xué)檢測(cè)模塊，可同時(shí)處理數(shù)百個(gè)樣本，實(shí)現(xiàn)葡萄糖、肝功能、腎功能等項(xiàng)目的快速批量檢測(cè)，顯著提升實(shí)驗(yàn)室工作效率。內(nèi)置自動(dòng)校準(zhǔn)程序和故障診斷系統(tǒng)，通過(guò)定期光電校正、試劑空白監(jiān)測(cè)和反應(yīng)杯清潔功能，確保儀器長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行，減少人為操作誤差。全自動(dòng)生化分析儀多波長(zhǎng)分光技術(shù)配備12-16個(gè)獨(dú)立濾光片或全息光柵分光系統(tǒng)，支持340-800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度檢測(cè)，可精確區(qū)分血紅蛋白、膽紅素等物質(zhì)的干擾吸收峰。模塊化擴(kuò)展設(shè)計(jì)支持生化、免疫分析模塊的自由組合，通過(guò)軌道式樣本傳輸系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)不同檢測(cè)平臺(tái)的整合，滿足實(shí)驗(yàn)室集約化發(fā)展需求。室內(nèi)質(zhì)量控制流程Westgard多規(guī)則質(zhì)控策略采用1-2s/1-3s/2-2s/R-4s等規(guī)則組合判讀質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，通過(guò)Levey-Jennings質(zhì)控圖可視化分析批間變異，能有效識(shí)別隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差。01質(zhì)控品分級(jí)管理設(shè)置日間質(zhì)控（3水平）、日內(nèi)質(zhì)控（2水平）和急診質(zhì)控（1水平）三級(jí)體系，涵蓋醫(yī)學(xué)決定水平濃度，確保從低值到高值全程監(jiān)控。02失控處理標(biāo)準(zhǔn)化建立包含重復(fù)檢測(cè)、更換試劑/校準(zhǔn)品、儀器維護(hù)、人員復(fù)核等7步糾正流程，要求所有失控記錄存檔并追溯根本原因，形成閉環(huán)管理。03質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)信息化通過(guò)LIS系統(tǒng)自動(dòng)采集質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，計(jì)算累積CV值和Sigma水平，生成月度質(zhì)控報(bào)告，為方法學(xué)改進(jìn)提供量化依據(jù)。04室間質(zhì)量評(píng)價(jià)體系每年參加國(guó)家臨檢中心組織的6次PT調(diào)查，覆蓋常規(guī)生化項(xiàng)目（如ALT、CREA等）和特殊項(xiàng)目（如同型半胱氨酸），要求≥80%