生物分離純化技術(shù)日期:目錄CATALOGUE02.物理分離方法04.電泳技術(shù)應(yīng)用05.膜分離技術(shù)01.基本原理03.色譜技術(shù)詳解06.優(yōu)化與評估基本原理01定義與核心概念基于目標分子與雜質(zhì)在物理、化學(xué)或生物學(xué)性質(zhì)上的差異（如分子大小、電荷、溶解度、親和性等），通過特定技術(shù)手段實現(xiàn)分離。核心分離原理

0104

03

02

實際應(yīng)用中常采用多級分離技術(shù)（如粗提、精制、拋光）逐步提高純度，避免單一技術(shù)的局限性。多步驟協(xié)同策略生物分離純化是指從復(fù)雜的生物體系中提取、分離和純化目標生物分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等）的技術(shù)過程，旨在獲得高純度、高活性的目標產(chǎn)物。生物分離純化的定義純化過程需兼顧產(chǎn)物的純度、收率、活性及規(guī)模化可行性，通常通過電泳、色譜、離心等技術(shù)評估純化效果。純化目標與標準技術(shù)應(yīng)用范圍純化特定蛋白質(zhì)或核酸用于結(jié)構(gòu)解析（如X射線晶體學(xué)）、功能研究（如酶活性測定）或診斷試劑開發(fā)。生物醫(yī)學(xué)研究食品與農(nóng)業(yè)環(huán)境生物技術(shù)用于重組蛋白（如抗體、疫苗）、基因治療載體（如AAV病毒）的規(guī)?；a(chǎn)，滿足GMP標準下的純度要求。提取功能性成分（如乳清蛋白、植物多糖）或去除有害物質(zhì)（如過敏原、毒素），提升產(chǎn)品安全性。從微生物群落中分離特定菌株或酶制劑，用于污染物降解或生物能源生產(chǎn)。制藥工業(yè)關(guān)鍵分離機制分子篩效應(yīng)疏水作用與反相色譜電荷相互作用生物特異性親和利用凝膠過濾色譜或超濾膜按分子大小分離，適用于脫鹽或不同量級生物分子的分級。通過離子交換色譜根據(jù)分子表面電荷差異分離，可精細區(qū)分等電點相近的蛋白質(zhì)?；诜肿邮杷圆町悾绕溥m用于肽段或小分子代謝產(chǎn)物的分離純化。采用抗體、配體或標簽（如His-tag）的特異性結(jié)合，實現(xiàn)高選擇性純化，單步純度提升顯著。物理分離方法02沉淀技術(shù)鹽析沉淀法通過加入高濃度中性鹽（如硫酸銨）降低蛋白質(zhì)溶解度，利用蛋白質(zhì)在不同鹽濃度下的沉淀特性實現(xiàn)分離，適用于大規(guī)模粗提和濃縮。有機溶劑沉淀法利用乙醇、丙酮等有機溶劑改變?nèi)芤簶O性，使蛋白質(zhì)或核酸因溶解度降低而析出，需嚴格控制溫度和pH以避免變性。等電點沉淀法調(diào)節(jié)溶液pH至目標物質(zhì)的等電點（pI），使其表面電荷為零而聚集沉淀，常用于分離兩性電解質(zhì)如氨基酸和多肽。熱變性沉淀法通過加熱使雜蛋白變性沉淀，保留目標蛋白活性，適用于熱穩(wěn)定性差異顯著的蛋白質(zhì)純化。離心分離差速離心法基于顆粒大小和密度差異，通過階梯式轉(zhuǎn)速分離細胞器（如線粒體、溶酶體），需優(yōu)化離心力和時間以提高分辨率。在蔗糖或氯化銫梯度介質(zhì)中，利用沉降系數(shù)差異分離DNA、RNA或病毒顆粒，超速離心可達百萬g級離心力。目標物質(zhì)在梯度介質(zhì)中遷移至與自身密度相等的區(qū)域，適用于分離脂蛋白或亞細胞結(jié)構(gòu)，需精確控制離心時間。處理大體積樣品時，通過連續(xù)進樣和出樣實現(xiàn)高通量分離，廣泛應(yīng)用于工業(yè)級生物制劑生產(chǎn)。差速離心法差速離心法差速離心法過濾技術(shù)微濾（MF）采用0.1-10μm孔徑膜去除細菌、細胞碎片，操作壓力低（<2bar），常用于培養(yǎng)基澄清和預(yù)過濾步驟。超濾（UF）截留分子量1-1000kDa的溶質(zhì)，通過切向流設(shè)計減少膜污染，適用于蛋白質(zhì)濃縮和緩沖液置換。納濾（NF）選擇性分離二價離子和小分子有機物（200-1000Da），在生物制藥中用于脫鹽和低分子量雜質(zhì)去除。深層過濾技術(shù)結(jié)合纖維素/硅藻土等多孔介質(zhì)，通過吸附和機械截留去除微小顆粒，成本低但需定期更換濾芯。色譜技術(shù)詳解03離子交換色譜分離原理基于分子表面電荷差異，通過固定相（離子交換樹脂）與流動相中帶電分子的靜電相互作用實現(xiàn)分離，適用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的純化。01樹脂類型選擇陽離子交換樹脂（如磺酸基團）用于帶正電分子分離，陰離子交換樹脂（如季銨基團）用于帶負電分子分離，需根據(jù)目標分子等電點優(yōu)化pH條件。洗脫策略采用梯度鹽濃度（如NaCl梯度）或pH梯度洗脫，逐步削弱目標分子與樹脂的結(jié)合力，提高分離分辨率。應(yīng)用場景廣泛用于單克隆抗體純化、酶制劑制備及質(zhì)粒DNA提取等生物制藥領(lǐng)域。020304親和色譜特異性結(jié)合機制利用生物分子間高親和力相互作用（如抗原-抗體、酶-底物、受體-配體），通過固定化配體（如ProteinA/G）選擇性捕獲目標物質(zhì)。工業(yè)應(yīng)用單抗藥物生產(chǎn)中ProteinA親和層析為核心步驟，純度可達95%以上，但需注意配體脫落導(dǎo)致的產(chǎn)物污染風(fēng)險。配體設(shè)計需考慮配體穩(wěn)定性（如耐酸堿、抗蛋白酶降解）和結(jié)合容量，常用配體包括鎳柱（His標簽純化）、凝集素（糖蛋白純化）等。洗脫條件優(yōu)化采用競爭性洗脫（如咪唑競爭His標簽）、pH驟變或溫和還原劑（如DTT）破壞相互作用，避免目標蛋白變性。凝膠過濾色譜1234分子篩效應(yīng)依據(jù)分子大小差異進行分離，大分子因無法進入凝膠孔徑（如Sephadex、Superdex）而先流出，小分子滯留時間更長。需匹配目標分子量范圍，如SephacrylS-200HR適用于10-1500kDa蛋白，Superose6Increase適合超大分子復(fù)合物分析。介質(zhì)選擇緩沖液要求需保持恒定離子強度和pH以避免非特異性吸附，常用Tris-HCl或PBS緩沖體系，流速控制在0.5-1mL/min以平衡分辨率與耗時。應(yīng)用優(yōu)勢無需結(jié)合洗脫步驟即可脫鹽、緩沖液置換或寡聚體分析，常用于單抗聚合體去除或病毒顆粒純化。電泳技術(shù)應(yīng)用04SDS分析蛋白質(zhì)分子量測定SDS（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）通過SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合形成均勻負電荷，消除蛋白質(zhì)形狀差異，使遷移率僅與分子量相關(guān)，廣泛用于精確測定蛋白質(zhì)亞基分子量。純度檢測與分離該技術(shù)可分離復(fù)雜混合物中的蛋白質(zhì)組分，通過染色或熒光標記評估樣品純度，常用于重組蛋白表達純化后的質(zhì)量控制。WesternBlot前處理作為WesternBlot的關(guān)鍵預(yù)處理步驟，SDS將蛋白質(zhì)按分子量分離后轉(zhuǎn)移至膜上，便于后續(xù)抗體特異性檢測目標蛋白。動態(tài)范圍優(yōu)化通過調(diào)整凝膠濃度（如8%-16%梯度膠），可針對不同分子量范圍（10-250kDa）的蛋白質(zhì)實現(xiàn)最佳分辨率。等電聚焦利用pH梯度凝膠和電場作用，蛋白質(zhì)遷移至與其等電點（pI）相同的pH區(qū)域并聚焦成窄帶，分辨率可達0.01pH單位，適用于蛋白質(zhì)變體或翻譯后修飾分析。等電點精確測定與SDS聯(lián)用構(gòu)成2D，先按等電點分離，再按分子量分離，大幅提高復(fù)雜樣本（如細胞裂解液）的分辨能力。二維電泳第一維分離可檢測蛋白質(zhì)脫酰胺、磷酸化等修飾導(dǎo)致的電荷變異，廣泛應(yīng)用于生物制藥中單克隆抗體的電荷異構(gòu)體分析。電荷異質(zhì)性研究現(xiàn)代等電聚焦采用預(yù)鑄的固相pH梯度膠（IPG膠條），克服了傳統(tǒng)載體兩性電解質(zhì)的穩(wěn)定性問題，提升重復(fù)性和上樣量。固相pH梯度技術(shù)高效微量分析多種分離模式毛細管電泳（CE）在數(shù)十微米內(nèi)徑的毛細管中進行，僅需納升級樣品，適用于珍貴或微量樣本（如單細胞分析）的高效分離。包括自由溶液區(qū)帶電泳（CZE）、膠束電動色譜（MEKC）和篩分電泳（CGE），可針對核酸、蛋白質(zhì)、小分子等不同物質(zhì)優(yōu)化分離條件。毛細管電泳高靈敏度檢測結(jié)合紫外、激光誘導(dǎo)熒光（LIF）或質(zhì)譜檢測器，CE的檢測限可達飛摩爾級別，常用于藥物代謝產(chǎn)物或生物標志物超痕量分析。自動化與高通量現(xiàn)代多通道毛細管陣列電泳系統(tǒng)（如遺傳分析儀）支持96孔板同步上樣，廣泛應(yīng)用于基因組測序和片段分析，單次運行時間可短至10分鐘。膜分離技術(shù)05超濾方法4膜材料選擇3應(yīng)用領(lǐng)域2操作參數(shù)優(yōu)化1分子量截留機制常用聚醚砜（PES）、聚偏氟乙烯（PVDF）等材料，需根據(jù)目標產(chǎn)物的化學(xué)穩(wěn)定性和親水性進行篩選。需控制跨膜壓力（0.1-1MPa）、流速和溫度，避免濃差極化和膜污染，同時采用錯流過濾模式以延長膜壽命。廣泛應(yīng)用于生物制藥（單克隆抗體純化）、食品工業(yè)（乳清蛋白濃縮）及廢水處理（去除膠體顆粒）。超濾通過特定孔徑的膜實現(xiàn)分子量分級，截留大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多糖）而允許小分子（如水、無機鹽）透過，截留范圍通常為1-1000kDa。透析技術(shù)半透膜擴散原理利用濃度梯度驅(qū)動小分子溶質(zhì)（如鹽類、代謝廢物）通過半透膜（截留分子量1-10kDa），而大分子（如蛋白質(zhì)）被保留。透析效率受膜面積、緩沖液體積和更換頻率影響，通常需4-24小時完成平衡，低溫操作可防止樣品變性。需匹配目標分子的pH和離子強度，常用Tris-HCl或磷酸鹽緩沖液，避免滲透壓劇烈變化導(dǎo)致樣品失活。用于血液透析（清除尿素）、蛋白脫鹽及細胞培養(yǎng)液更換，成本低但處理量較小。半透膜擴散原理半透膜擴散原理半透膜擴散原理微濾操作在生物反應(yīng)器收獲（菌體分離）、飲料澄清（果汁過濾）及空氣質(zhì)量監(jiān)測（顆粒物采集）中發(fā)揮關(guān)鍵作用。工業(yè)規(guī)?；瘧?yīng)用使用前需進行高壓滅菌或乙醇浸泡，并通過泡點法檢測膜完整性，確保分離效率。滅菌與完整性測試死端過濾適合低固含量樣品，切向流可減少膜堵塞，需優(yōu)化剪切力以平衡通量與膜污染。死端與切向流模式微濾膜孔徑為0.1-10μm，可截留細菌、細胞碎片和懸浮顆粒，適用于澄清和除菌步驟。粒徑篩分特性優(yōu)化與評估06純化策略設(shè)計多步驟組合純化根據(jù)目標分子的理化性質(zhì)，設(shè)計層析、超濾、沉淀等技術(shù)的組合流程，逐步提高產(chǎn)物純度并減少雜質(zhì)干擾。例如，先采用離子交換層析去除帶電雜質(zhì)，再通過疏水層析分離疏水性差異組分。連續(xù)純化技術(shù)應(yīng)用整合模擬移動床色譜（SMB）或連續(xù)逆流層析，實現(xiàn)不間斷進料與分離，顯著提升處理通量并降低緩沖液消耗，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。親和層析優(yōu)化利用生物特異性相互作用（如抗原-抗體、酶-底物）實現(xiàn)高選擇性純化。需優(yōu)化配基固定化密度、洗脫緩沖液pH和離子強度，平衡結(jié)合效率與產(chǎn)物回收率。效能評價指標動態(tài)結(jié)合容量評估測定層析介質(zhì)在特定流速下的動態(tài)載量（DBC），優(yōu)化填料類型與操作參數(shù)，避免柱超載導(dǎo)致的穿透或分辨率下降。宿主蛋白殘留檢測運用ELISA或質(zhì)譜法量化工藝中宿主細胞蛋白（HCP）殘留，確保其低于監(jiān)管閾值（通常<100ppm），避免引發(fā)免疫原性風(fēng)險。純度與收率平衡采用HPLC或CE分析目標產(chǎn)物純度，同時計算各步驟收率，通過質(zhì)量平衡模型評估工藝整體效率。純度需滿足下游應(yīng)用標準（