基因工程實(shí)驗(yàn)教案已知的原核基因的克隆和表達(dá)實(shí)驗(yàn)一基因工程試驗(yàn)基礎(chǔ)操作主要講解內(nèi)容：克隆流程、注意事項(xiàng)、實(shí)驗(yàn)安排1、培養(yǎng)基制作、各種溶液配制、實(shí)驗(yàn)二基因組DNA提取和電泳檢測(cè)主要講解內(nèi)容：基因組DNA提取方法和步驟準(zhǔn)備：提前培養(yǎng)大腸桿菌用于提取DNA提取緩沖液、DNA電泳緩沖液配制實(shí)驗(yàn)三目的基因分離和擴(kuò)增、目的片段回收和主要講解內(nèi)容：PCR引物，所用引物為什么這樣設(shè)計(jì)，T載體、表達(dá)載體、多克隆位點(diǎn)回收的方法，為什么要回收，最好是PCR完成后就回收主要實(shí)驗(yàn)：PCR、電泳檢測(cè)、目的片段回收準(zhǔn)備：PCR管等滅菌PCR程序（用大體系）回收的各種試劑實(shí)驗(yàn)四DH5α感受態(tài)制備和連接反應(yīng)（感受態(tài)做兩份要留給下一次）主要講解內(nèi)容：感受態(tài)制備、連接反應(yīng)（在下次試驗(yàn)的前天晚上做連接接）主要實(shí)驗(yàn)：感受態(tài)制備、感受態(tài)制備的細(xì)胞放入-80度冰箱保存準(zhǔn)備：提前準(zhǔn)備回收的各種試劑細(xì)胞提前活化（前一晚上）實(shí)驗(yàn)五轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆的篩選主要講解內(nèi)容：轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆的篩選的策略（藍(lán)白斑、抗性基因）主要實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)化、涂布平板（加抗生素、X-gal、）、(第二天挑選陽(yáng)性克隆、提取質(zhì)粒電泳、包括表達(dá)載體PET菌的活化和質(zhì)粒提取，課后學(xué)生自己做)準(zhǔn)備：1.提前準(zhǔn)備回收的各種試劑實(shí)驗(yàn)六重組質(zhì)粒鑒定（酶切和PCR）主要講解內(nèi)容：酶切鑒定的原理、PCR鑒定的原理主要實(shí)驗(yàn)：酶切反應(yīng)包括PET載體酶切留著下次用，PCR反應(yīng)，電泳檢測(cè)（學(xué)生課外做）準(zhǔn)備：1.提前準(zhǔn)備各種試劑實(shí)驗(yàn)七目的片段回收和BL21感受態(tài)制備實(shí)驗(yàn)八轉(zhuǎn)化和重組子篩選實(shí)驗(yàn)九重組子鑒定（酶切和PCR）實(shí)驗(yàn)十誘導(dǎo)表達(dá)和樣品的制備實(shí)驗(yàn)十一SDS開(kāi)放實(shí)驗(yàn)，克隆和表達(dá)一個(gè)已知的原核基因?qū)嶒?yàn)一基因工程試驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)內(nèi)容提綱：主要講解：整個(gè)基因工程試驗(yàn)?zāi)康暮土鞒?、?shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（培養(yǎng)基制作、菌種活化、藥品配制）實(shí)驗(yàn)室安全常識(shí)（禁食，安全防護(hù)，廢棄物處理），藥品性質(zhì)（危害，毒性，正確使用方法），存放條件及緊急突發(fā)事故的處理（燒傷，化學(xué)腐蝕，中毒，火災(zāi)）；禁食；廢棄物處理：（1）廢棄的培養(yǎng)基，需用消毒液浸泡30min以上；（2）致病菌培養(yǎng)基需高壓滅菌后廢棄。3、化學(xué)藥品火災(zāi)處理：就近用水稀釋藥劑，防火，若出現(xiàn)明火，脫離火場(chǎng)，報(bào)警并報(bào)告老師。實(shí)驗(yàn)儀器的安全操作及簡(jiǎn)單維護(hù)；（電路檢查，重點(diǎn)：電爐、烘箱、離心機(jī)的使用、觀看教學(xué)片。）基因工程實(shí)驗(yàn)整體安排目的是克隆和表達(dá)一個(gè)原核基因溶液配制方法、基因組提取溶液、質(zhì)粒提取溶液配制、瓊脂糖電泳液配制培養(yǎng)基的配制[每組固體培養(yǎng)基4瓶（150ml）、液體培養(yǎng)基30支5ml、5瓶50ml]菌種的活化、標(biāo)記、清潔工作各種需要的培養(yǎng)皿、槍頭、EP管滅菌等注意克隆載體、表達(dá)載體、不同基因型大腸桿菌原核基因克隆簡(jiǎn)要流程：1.染色體DNA提取1.染色體DNA提取2.PCR擴(kuò)增目的基因2.PCR擴(kuò)增目的基因3.回收目的基因、連接、轉(zhuǎn)化（克隆載體）3.回收目的基因、連接、轉(zhuǎn)化（克隆載體）4.重組子篩選和質(zhì)粒鑒定4.重組子篩選和質(zhì)粒鑒定5.酶切回收目的基因、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定（表達(dá)載體）5.酶切回收目的基因、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定（表達(dá)載體）6.誘導(dǎo)表達(dá)6.誘導(dǎo)表達(dá)7.SDS檢測(cè)7.SDS檢測(cè)8.目的基因表達(dá)產(chǎn)物回收8.目的基因表達(dá)產(chǎn)物回收原核基因克隆詳細(xì)流程：1.染色體DNA提取、電泳檢測(cè)1.染色體DNA提取、電泳檢測(cè)2.PCR擴(kuò)增目的基因、電泳檢測(cè)、大量擴(kuò)增、目的片段回收、電泳檢測(cè)2.PCR擴(kuò)增目的基因、電泳檢測(cè)、大量擴(kuò)增、目的片段回收、電泳檢測(cè)3.目的片段和T載體連接過(guò)夜、DH53.目的片段和T載體連接過(guò)夜、DH5α感受態(tài)制備（用于克隆T載體）表達(dá)載體制備（PET）4.轉(zhuǎn)化、過(guò)夜培養(yǎng)、重組子篩選（藍(lán)白斑、抗生素）表達(dá)載體制備（PET）4.轉(zhuǎn)化、過(guò)夜培養(yǎng)、重組子篩選（藍(lán)白斑、抗生素）質(zhì)粒提取、電泳檢測(cè)5.質(zhì)粒提取、電泳檢測(cè)、鑒定（酶切、PCR）、電泳檢測(cè)質(zhì)粒提取、電泳檢測(cè)5.質(zhì)粒提取、電泳檢測(cè)、鑒定（酶切、PCR）、電泳檢測(cè)大量酶切回收目的片段、電泳檢測(cè)6.大量酶切回收目的片段、電泳檢測(cè)大量酶切回收目的片段、電泳檢測(cè)6.大量酶切回收目的片段、電泳檢測(cè)11.SDS、染色10.培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)（IPTG）、菌體回收、點(diǎn)樣品制備9.質(zhì)粒提取、電泳檢測(cè)、鑒定（酶切、PCR）、電泳檢測(cè)8.轉(zhuǎn)化、過(guò)夜培養(yǎng)、重組子篩選（抗生素）7.目的基因和表達(dá)載體連接過(guò)夜、BL21感受態(tài)制備（用于克隆表達(dá)載體）11.SDS、染色10.培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)（IPTG）、菌體回收、點(diǎn)樣品制備9.質(zhì)粒提取、電泳檢測(cè)、鑒定（酶切、PCR）、電泳檢測(cè)8.轉(zhuǎn)化、過(guò)夜培養(yǎng)、重組子篩選（抗生素）7.目的基因和表達(dá)載體連接過(guò)夜、BL21感受態(tài)制備（用于克隆表達(dá)載體）12.表達(dá)產(chǎn)物回收12.表達(dá)產(chǎn)物回收實(shí)驗(yàn)二基因組DNA提取和電泳檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆占?xì)菌染色體DNA的常規(guī)制備方法，要求學(xué)會(huì)根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求選擇不同實(shí)驗(yàn)方法。二、實(shí)驗(yàn)原理（見(jiàn)書(shū)p19，以此法為準(zhǔn)）基因組DNA抽提的基本原理基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫(kù)、Southern雜交（包括RFLP）及PCR分離基因等。利用基因組DNA較長(zhǎng)的特性，可以將其與細(xì)胞器或質(zhì)粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團(tuán)飄浮其中，可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部，從而達(dá)到提取的目的。在提取過(guò)程中，染色體會(huì)發(fā)生機(jī)械斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，因此分離基因組DNA時(shí)應(yīng)盡量在溫和的條件下操作，如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過(guò)程要輕緩，以保證得到較長(zhǎng)的DNA。一般來(lái)說(shuō)，構(gòu)建基因組文庫(kù)，初始DNA長(zhǎng)度必須在100kb以上，否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。而進(jìn)行RFLP和PCR分析，DNA長(zhǎng)度可短至50kb，在該長(zhǎng)度以上，可保證酶切后產(chǎn)生RFLP片段（20kb以下），并可保證包含PCR所擴(kuò)增的片段（一般2kb以下）。不同生物（植物、動(dòng)物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同，不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時(shí)必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)建立相應(yīng)的提取方法，以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質(zhì)對(duì)隨后的酶切、PCR反應(yīng)等有較強(qiáng)的抑制作用，因此用富含這類物質(zhì)的材料提取基因組DNA時(shí)，應(yīng)考慮除去多糖和酚類物質(zhì)。目前針對(duì)不同類型的細(xì)胞均開(kāi)發(fā)除了相應(yīng)的抽提試劑盒。常規(guī)實(shí)驗(yàn)中從細(xì)菌基因組上PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，一般所用的DNA量較少，可以采用較簡(jiǎn)單的沸水浴裂解法制備少量的DNA。在短時(shí)間的熱脈沖下，細(xì)胞膜表面會(huì)出現(xiàn)一些孔洞，此時(shí)就會(huì)有少量的染色體DNA從中滲透出來(lái)，然后離心去除菌體碎片，上清中所含的基因組DNA即可用于PCR模板。而對(duì)于大量的基因組DNA制備（如SouthernBlotting，需大量基因組），可采用試劑盒抽提。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與主要試劑1、儀器恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋、1.5mL離心管、槍2、試劑 （1）溶液I 堿溶法抽提質(zhì)粒DNA（2）溶液II 堿溶法抽提質(zhì)粒DNA（3）溶液III（pH5.53MKAc） （4）苯酚飽和溶液（5）氯仿（6）異丙醇（7）SDS（10％）（8）NaOH（2M）（9）NaCl（5M）（10）RNaseA（10mg/ml） 固體粉末溶于無(wú)菌水后煮沸10分鐘，后冷卻并分裝于小管中-20℃保存四、實(shí)驗(yàn)步驟1、沸水浴制備染色體DNA（1）在Eppendorf管中加入100l的ddH2O，挑入米粒大小的菌團(tuán)，充分懸浮并混勻。（2）上述菌體懸浮液沸水煮20秒。（3）迅速放置于常溫下15000rpm離心10分鐘。（4）用牙簽挑去菌體碎片（白色沉淀），上清待用。2、大腸桿菌中染色體DNA的抽提（1）大腸桿菌一級(jí)瓶培養(yǎng)過(guò)夜，以10%的接種量接二級(jí)瓶培養(yǎng)4～5小時(shí)后，培養(yǎng)物以50ml/管離心收獲（8000rpm，5min，4℃）。（2）菌體沉淀中加入10mlBufferA，旋渦振蕩混勻，37℃保溫30分鐘。（3）取出后加入10%SDS至最終濃度為1%，輕輕混勻，37℃保溫30分鐘澄清即可。（4）取出后加入20mg/ml的ProK至最終濃度為5g/ml，60℃保溫1小時(shí)。（染色體DNA結(jié)合蛋白的消化）（5）取出后加入預(yù)冷的5MNaCl至最終濃度為1M，混勻后冰浴30分鐘（溶液要混合成為均相，并且冰浴要充分，時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)）。（6）取出后4℃，15000rpm離心30分鐘。（離心前樣品管要進(jìn)行平衡，以免離心機(jī)受損）（7）在上清液中加入6ml苯酚和6ml氯仿混合液，混勻，室溫下12,000rpm離心30分鐘。（8）在上清液中加入10ml氯仿，混勻，室溫下12000rpm離心30分鐘。（9）取上清液，加一倍量異丙醇沉淀DNA，冰浴放置30分鐘，15000rpm離心30分鐘。（10）75%冰乙醇洗滌5分鐘。（11）晾干后，用300l無(wú)菌雙蒸水溶解染色體DNA，在37℃水浴中放置30分鐘。（12）用2～2.5體積的無(wú)水乙醇沉淀(加入pH5.5的KAc0.1體積)。（13）沉淀洗滌，抽干后用ddH2O溶解，分裝并保存于-20℃。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳六、思考題大腸桿菌DNA提取和質(zhì)粒DNA提取有何區(qū)別實(shí)驗(yàn)三目的基因擴(kuò)增（PCR）和DNA片段回收一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕榻B凝膠電泳中DNA片段回收的各種方法及優(yōu)缺點(diǎn)，要求學(xué)會(huì)根據(jù)不同回收對(duì)象選擇不同的回收方法。1、目的基因PCR（大體系）、電泳檢測(cè)、如果有就回收2、DNA片段回收、用試劑盒二、實(shí)驗(yàn)原理DNA片段的分離與回收是基因工程操作中一項(xiàng)重要的技術(shù)，如可收集特定酶切片段用于基因克隆或是制備探針，回收PCR產(chǎn)物用于再次鑒定等。理想的DNA片段回收方法應(yīng)滿足以下幾個(gè)要求：（1）回收片段應(yīng)有非常高的純度如從普通凝膠中分離出來(lái)的片段不可帶有即使是微量的凝膠――凝膠會(huì)抑制大部分的酶活力，對(duì)于后續(xù)DNA片段用于再酶切分析或連接均是不利的。（2）回收過(guò)程必須是嚴(yán)格的無(wú)DNA酶污染的操作過(guò)程衡量的Dnase均可能使回收的目的DNA片段降解，當(dāng)降解作用僅發(fā)生在粘性末端時(shí)，在凝膠電泳中是無(wú)法看到回收的DNA片段有任何差異，但會(huì)導(dǎo)致DNA連接實(shí)驗(yàn)的失敗，最終影響后續(xù)的克隆實(shí)驗(yàn)。（3）能回收不同大小的DNA片段對(duì)于采用的回收方法必須能對(duì)不同大小的DNA片段均能回收，當(dāng)回收大片段時(shí)不發(fā)生機(jī)械性損傷與斷裂作用，造成大片段斷裂。（4）回收效率要高回收方法要能對(duì)微量DNA也能進(jìn)行操作，也即回收效率相對(duì)要較高，則對(duì)于實(shí)驗(yàn)中獲得的非常微量的DNA樣品也可進(jìn)行分析。（5）操作簡(jiǎn)單、快速在回收過(guò)程中一般不需特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，也不需要昂貴的試劑，并且操作時(shí)間較短，象現(xiàn)在常用的試劑盒回收在電泳完成后整個(gè)回收過(guò)程只需30min左右，并且樣品的回收率可達(dá)50％。各類常用回收方法由于分離方法眾多，且各種不同的方法可能同時(shí)依據(jù)多項(xiàng)原理，所以只能粗略地將各種方法分成五大類：電泳法、收集孔法、機(jī)械破碎法、溶（熔）膠法與酶處理法：1、電泳法根據(jù)凝膠割否分透析袋法與流動(dòng)電洗脫法（割膠），濾紙-透析膜法與DEAE膜法（不割膠）。（1）透析袋法該方法可回收大于5kb的片段，缺點(diǎn)是操作麻煩并易造成DNA酶的污染。（2）流動(dòng)電洗脫法該方法回收片段大小為4～50kb，且回收效率高達(dá)94～100％，極端條件下可回收大至550kb的片段。缺點(diǎn)是操作繁瑣，而且為了取得較高的回收率，需特定的流動(dòng)電洗脫槽。（3）濾紙-透析膜法回收率平均達(dá)70％左右，不需割膠，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但實(shí)驗(yàn)中需將濾紙上的DNA洗脫，也較繁瑣，也不易控制。（4）濾紙-透析膜法此方法用于回收小片段，一般小于5kb的片段回收效率較高，可達(dá)70％以上；對(duì)于大片段（>15kb）則難以從DEAE膜上洗脫下。2、收集孔法（1）蔗糖法回收小片段效率較高，564bp的PCR產(chǎn)物帶回收效率高達(dá)97.6%，并且回收中能將較寬的條帶濃縮于收集孔中，但回收中制作收集孔較麻煩，并且收集孔中要加入蔗糖，故獲得的DNA樣品不能直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（2）羥基磷灰石法該方法回收效率也較高，不利之處與上述方法相同，獲得的DNA需再純化，操作也較繁瑣。3、機(jī)械破碎法指用機(jī)械力將凝膠壓碎后再行回收DNA片段，有凍擠法，凍融法、壓碎浸泡法、（單層）濾膜過(guò)濾法及雙層（親和）膜過(guò)濾法。（1）凍擠法將膠條割下置于塞有玻璃棉的吸嘴或是管底刺有小孔的eppendorf管中，冰凍30min后全速離心5min，收集清液，再經(jīng)酚抽提、乙醇沉淀等純化濃縮處理（也可直接沉淀）。其基本原理理是利用離心力將凝膠中原有的液體擠出，同時(shí)也帶出膠中的DNA。從膠濃度為1%瓊脂糖中回收650bp、1.1kb、2.0kb、4.5kb的片段時(shí)，回收率分別為90％、74％、56％、30％。這是因?yàn)榇蠓肿覦NA更難于被膠中的緩沖液帶出，所以此法只適用于回收較小的DNA片段。（2）凍融法割下的膠條放在eppendorf管中，將之搗碎并放于-80℃冰凍5min，取出后迅速放置于37℃保溫10min，如此反復(fù)3次能使DNA從膠中游離出來(lái)，離心獲得上清中即含有目的DNA，可通過(guò)沉淀濃縮獲得高濃度。對(duì)一般的DNA片段回收效率在60～80%。操作簡(jiǎn)單，并不需特殊設(shè)備。（3）壓碎浸泡法又稱醋酸銨法，操作較費(fèi)時(shí)，回收效率較低，一般改良的方法是在凍擠法操作中，加入一定的水并浸泡10min，增加DNA的回收率。4、溶膠法根據(jù)物理或化學(xué)溶膠可分為低融點(diǎn)法（物理熔膠）與NaI、KI、NaClO4溶膠法（化學(xué)溶膠）。（1）低融點(diǎn)膠法采用特殊的低融點(diǎn)凝膠，該膠在65℃即溶化，實(shí)驗(yàn)中是先灌制正常的凝膠，然后用低融點(diǎn)膠取代其中的部分（即可節(jié)約低融點(diǎn)凝膠用量，也能保證電泳中整塊凝膠的完整性。）電泳完成后割下的凝膠可于65℃下保溫溶解，后直接用于酶切，連接，DNA標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)。操作方便簡(jiǎn)單，但需特殊的低融點(diǎn)凝膠，成本較高，且回收得到的樣品濃度較低。（2）化學(xué)融膠法瓊脂糖能溶解于一些鹽溶液中（NaI、KI、NaClO4），然后可用特殊的純化柱將DNA樣品溶液純化，現(xiàn)在廣泛使用的凝膠電泳中DNA片段回收試劑盒基本采用了此中回收原理，能在短時(shí)間內(nèi)獲得目的DNA片段，成本也較低。5、酶處理法對(duì)于大片段DNA的回收，象酵母人工染色體的克隆實(shí)驗(yàn)中，克隆片段可大到2000kb，一般采用此方法。利用瓊脂糖酶降解瓊脂糖，能較溫和的裂解瓊脂糖，最終成功回收DNA片段。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與主要試劑(一)儀器手術(shù)刀、Elutip-d柱、臺(tái)式離心機(jī)、乙醇、紫外透射儀、水平電泳儀(二)材料待分離的DNA(三)試劑回收試劑盒專用的限制性內(nèi)切核酸酶及酶切緩沖液低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(SeaPlaqu，F(xiàn)MCBioproducts)溴化乙錠溶液(1000貯存液0.5mg/mL，工作液0.5μg/mL，避光保存)TE緩沖液(10mmoL/LTris-HClpH8.0，lmmol/LEDTA)Tris-HCl飽和酚Elutip高鹽溶液(1mol/LNaCl，20mmol/LTris-HClpH7.5，1mmol/LEDTA，過(guò)濾除菌，室溫保存)Elutip低鹽溶液(0.2mol/LNaCl，20mmol/LTris-HClpH7.5，1mmol/LEDTA，過(guò)濾除菌，室溫保存)四、實(shí)驗(yàn)步驟試劑盒法：（Kit回收法，以上海申能博彩生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒為例）1、從電泳板上切割含目的DNA片段的凝膠塊（割膠盡可能的小，提供后續(xù)回收效率。）2、凝膠稱重后并將其放入1.5ml管中，將其適當(dāng)切小，加速溶解。每100mg凝膠加入400μlsolutionSN。（若稱重省略，一般加入400μlSN）3、凝膠溶解：55-60℃，保溫5-10分鐘，每2分鐘混勻一下，使凝膠溶解，膠完全融化后每400μlsolutionSN中加入solutionB100μl，混勻。4、將3S柱裝入2ml洗管，將上述混合液轉(zhuǎn)移至3S柱，室溫放置2min。室溫10000rpm離心1分鐘，穩(wěn)定45秒。5、取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一收集管中，加入600μlWashSolution，室溫10000rpm離心1分鐘。6、重復(fù)步驟5一次。7、取下3S柱，倒掉收集管中廢液，將3S柱放入同一收集管中，室溫10000rpm離心2分鐘。8、將3S柱放入新的離心管中，在3S柱子膜中央加30μlddH2O，不加蓋室溫放置2分鐘。9、蓋上離心管，室溫10000rpm離心1分鐘，離心管中的液體即為回收的DNA片段。低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠法：1．以相應(yīng)的限制性內(nèi)切核酸酶完全消化DNA樣品，純化后與加樣緩沖液混合，在1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中電泳(加入的DNA的量在低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中少于標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠)。2．經(jīng)溴化乙錠染色并切下靶條帶，于65℃熔解膠條，加入足夠量的TE緩沖液，使瓊脂糖含量降至0.4％以下。（如果DNA樣本將用于連接、轉(zhuǎn)化或限制性核酸內(nèi)切酶消化，可直接將β-瓊脂糖/DNA熔化液用于反應(yīng)。）3．加入等體積的Tris-HCl飽和酚，劇烈混合5～10min。室溫條件下離心10min。4．吸取水相入新管，用等體積的TE緩沖液與有機(jī)相一起再次抽提，離心條件同步驟3。5．吸取第二次抽提水相。如果仍出現(xiàn)較大的界面沉淀物，可進(jìn)行第三次抽提。6．合并水相，乙醇沉淀。經(jīng)由Elutip-d柱進(jìn)一步純化DNA或溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中直接使用。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、DNA回收中的注意事項(xiàng)除了選擇合適的方法外，實(shí)驗(yàn)中還要注意以下幾點(diǎn)：1、防止抽提過(guò)程中污染DNA酶與回收片段接觸的試劑與器皿等都應(yīng)進(jìn)行滅菌（酶）處理，即使是不能用干熱或濕熱法滅菌的器皿也要用乙醇浸泡以滅殺活菌與DNA酶，不然可能發(fā)生回收片段部分降解的現(xiàn)象，有時(shí)甚至一無(wú)所獲。即使是輕微的降解反應(yīng)——當(dāng)發(fā)生在粘性末端時(shí)也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的連接困難。2、紫外照射選擇長(zhǎng)波段回收過(guò)程往往需在紫外等監(jiān)測(cè)下進(jìn)行，與一般觀察電泳結(jié)果不同的是這時(shí)應(yīng)用長(zhǎng)波紫外燈。因?yàn)槎滩ㄗ贤饩€（254nm）會(huì)引起DNA的斷裂或是形成TT二聚體，前者會(huì)使以后的連接與轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)失敗，后者可能造成基因突變，給克隆工作帶來(lái)麻煩。即使是使用了長(zhǎng)波紫外照射，回收DNA時(shí)也要盡量短時(shí)照射，避免連續(xù)長(zhǎng)時(shí)間照射。3、實(shí)驗(yàn)操作要輕柔特別在處理較大片段時(shí)應(yīng)防止機(jī)械剪切作用DNA對(duì)的破壞，如吸取液體、轉(zhuǎn)動(dòng)離心管等操作均應(yīng)緩慢、輕柔。綜上所述，只有在合適的回收方法基礎(chǔ)上注意具體操作步驟是才能有效回收所需片段，為以后的酶切、連接、標(biāo)記等工作打下良好基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)四PCR擴(kuò)增DNA的基本反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、熟悉PCR反應(yīng)的基本原理2、掌握方法PCR反應(yīng)的操作方法二、實(shí)驗(yàn)原理1．以DNA為模板的反應(yīng)，根據(jù)多年來(lái)的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng)有了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件。反應(yīng)體系一般選用50μL或100μL體積，其中含有：50mmol/LKCl10mmol/LTris-HCl(pH8.3，室溫)1.5mmol/LMgCl2100μg/mL明膠或牛血清白蛋白(BSA)2個(gè)引物，各0.25～1.0μmol/L4種底物(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，各200μmol/L模板DNA0.1μgTaqDNA聚合酶2.5U其中模板DNA的用量必須根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小加以調(diào)整，一般需要含102～106拷貝的DNA，封上礦物油防止高溫反應(yīng)時(shí)液體的揮發(fā)，即可進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件一般為94℃變性30s～60s，55℃退火30～60s，70～72℃延伸30～60s，共進(jìn)行30次左右的循環(huán)。末輪循環(huán)在72℃延伸7min。末輪循環(huán)后不再變性，將反應(yīng)物置-20℃保存。2．以mRNA為模板的反應(yīng)以mRNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)以擴(kuò)增DNA時(shí)，首先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以mRNA為模板合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中一般包括下列成分：mRNA、Oligo(dT)12—18(DNA合成引物)、Tris-HCl(pH7.6)、KCl、MgC12、4種dNTP混合液、DTT、RNA酶抑制劑。在加入上述試劑和材料后，加水將體積調(diào)整到48μL。然后加2μLMoloney鼠白血病病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶(pharmacia，200000U/mL；對(duì)于其他廠商產(chǎn)品，使用與此相當(dāng)?shù)膯挝粩?shù))。將混合物在37OC反應(yīng)1h。即可獲得cDNA，作為PCR擴(kuò)增的模板。隨后進(jìn)行以DNA為模板的PCR反應(yīng)。用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的上游寡核苷酸引物(亦稱3′引物或向前合成引物)10～50pmol可代替Oligo(dT)作引物。上游引物與初始mRNA互補(bǔ)，下游引物(亦稱5′引物或向后合成引物)與cDNA第一鏈互補(bǔ)。3．PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律在PCR的反應(yīng)過(guò)程中，DNA擴(kuò)增過(guò)程遵循酶的催化動(dòng)力學(xué)原理。在反應(yīng)初期，目的DNA片段增加呈指數(shù)形式。隨著目的DNA產(chǎn)物的逐漸積累，在引物-模板與DNA聚合酶達(dá)到一定比例時(shí)，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)擴(kuò)增DNA片段的增加減慢進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱“平臺(tái)期”。到達(dá)平臺(tái)期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶的種類和活性，以及非特異性產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)等因素。一般在到達(dá)“停滯”階段之前，用Klenow酶只能進(jìn)行20次左右的循環(huán)，而用TaqDNA聚合酶則可進(jìn)行25次以上PCR循環(huán)。這是因?yàn)門aqDNA聚合酶的高特異性，減少來(lái)自非特異性延伸產(chǎn)物對(duì)聚合酶的競(jìng)爭(zhēng)，從而使在“停滯”期到達(dá)之前有更多的目的基因片段積累。大多數(shù)情況下，平臺(tái)期在PCR反應(yīng)中是不可避免的。但一般在此之前，合成的目的基因片段的數(shù)量足可以滿足實(shí)驗(yàn)的需要。如果產(chǎn)物不夠，可繼續(xù)擴(kuò)增，將產(chǎn)物DNA樣品稀釋1000--10000倍后，作為模板進(jìn)行新的PCR。PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的事項(xiàng)：1．防止污染PCR技術(shù)的敏感性極高，如實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)交叉污染，很容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。采取如下措施有利于防止污染：(1)小量分裝所有試劑。(2)盡可能使用一次性吸頭及試管。(3)分開(kāi)操作區(qū)域。在專用超凈工作臺(tái)進(jìn)行樣品制備，專設(shè)工作臺(tái)進(jìn)行PCR操作，反應(yīng)后的產(chǎn)物在另一工作臺(tái)進(jìn)行結(jié)果分析。(4)樣品制備應(yīng)按無(wú)菌操作的原則進(jìn)行，避免樣品間的互相污染。(5)設(shè)置專用微量可調(diào)加樣器用于PCR，這套加樣器絕不能用于PCR的反應(yīng)產(chǎn)物分析。2．實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照每一次試驗(yàn)都需要設(shè)置嚴(yán)格的對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性模板。陰性對(duì)照：陰性模板。試劑對(duì)照：除模板外的所有組分。3．?dāng)U增反應(yīng)總是陰性結(jié)果(無(wú)產(chǎn)物)時(shí)應(yīng)采取的措施(1)取10/μL擴(kuò)增混合液作模板再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(2)增加TaqDNA聚合酶的濃度。(3)增加靶DNA量。(4)若模板為粗制品，提純樣品。(5)增加擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。(6)適當(dāng)降低退火溫度。4．出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物時(shí)應(yīng)采取的措施(1)提高退火溫度。(2)降低TaqDNA聚合酶的濃度。(3)縮短退火及延伸時(shí)間。(4)降低引物濃度。(5)減少擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。三、實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑(一)材料試劑不同來(lái)源的模板、引物、Taq酶、緩沖液、MgCL2、dNTP、ddH2O、Mark四、實(shí)驗(yàn)步驟1、取一個(gè)0.5mL的離心管，加入以下成分（總體積100μL）：ddH2O66μL模板DNA5μL上游引物（10μmol/L）5μL下游引物（10μmol/L）5μL10x緩沖液10μLMgCL26μLdNTP3μLTaq酶0.5μL2、稍做離心，將反應(yīng)管放入PCR儀，按下列條件設(shè)計(jì)好程序，進(jìn)行反應(yīng)3、反應(yīng)程序：94℃條件下使模板DNA變性5min變性94℃1min退火55℃1min30個(gè)循環(huán)延伸72℃2.5min最后在72℃條件進(jìn)行延伸7~10min。4、PCR反應(yīng)結(jié)束后，取出5μL反應(yīng)液用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，進(jìn)行鑒定。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、思考題PCR擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)30次為宜，為什么？實(shí)驗(yàn)五DNA體外重組一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)會(huì)根據(jù)克隆要求對(duì)已酶切的載體與目的DNA的分子濃度比例進(jìn)行調(diào)節(jié)并連接。2.學(xué)習(xí)克隆中常用的單、雙酶切，了解DNA連接酶的性質(zhì)及反應(yīng)條件二、實(shí)驗(yàn)原理外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組。連接的方式不外乎兩種，一種是黏端連接，另一種是平端連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。T4DNA連接酶以ATP為能源，大腸桿菌DNA連接酶則以NAD為能源。影響連接反應(yīng)的因素：反應(yīng)溫度、連接酶的用量、DNA濃度及兩種DNA分子數(shù)的比例、外源DNA末端的性質(zhì)等。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與主要試劑(一)儀器恒溫?fù)u床，臺(tái)式高速離心機(jī)，恒溫水浴鍋，瓊脂糖凝膠電泳裝置，電熱恒溫培養(yǎng)箱，微量移液槍，eppendorf管。(二)材料和試劑載體DNA、外源DNA、T4DNA連接酶四、操作步驟1．連接反應(yīng)：將試劑按以下比例混合載體DNA2μl外源DNA5μl10*Buffer2μlT4DNA連接酶1μlddH2O10μl反應(yīng)總體積20μl2．12-15℃反應(yīng)過(guò)夜。若不馬上轉(zhuǎn)化，-20℃保存。3．制備感受態(tài)細(xì)胞。4．轉(zhuǎn)化。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、思考題1、影響連接的因素有哪些實(shí)驗(yàn)六感受態(tài)制備、轉(zhuǎn)化和重組子篩選一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊髮W(xué)生掌握分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中兩種細(xì)菌轉(zhuǎn)化的原理，以及CaCl2法轉(zhuǎn)化和電穿孔法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備，外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞以及轉(zhuǎn)化子篩選的方法。了解細(xì)菌轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義。二、實(shí)驗(yàn)原理CaCl2轉(zhuǎn)化法原理：許多細(xì)菌(如大腸桿菌)不能攝取有功能活性的DNA，但可以通過(guò)人工的方法導(dǎo)入DNA，用CaCl2處理受體菌（本實(shí)驗(yàn)用E.coliDH5α作為受體菌），可誘導(dǎo)短暫的“感受態(tài)”，使之具有攝取外源DNA的能力，從而能攝取不同來(lái)源的DNA。DNA與Ca2＋結(jié)合亦可形成對(duì)DNase有抗性的復(fù)合物結(jié)合在細(xì)菌表面，經(jīng)過(guò)短暫的42℃熱激可促進(jìn)細(xì)菌攝取DNA-Ca2＋復(fù)合物，提高轉(zhuǎn)化效率。然而即使在最佳條件下，也只能將部分質(zhì)粒DNA導(dǎo)入受體菌。為鑒定這些轉(zhuǎn)化子，需利用質(zhì)粒的篩選標(biāo)記。這些標(biāo)記賦予細(xì)菌以新的表型，使轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌很容易被篩選出來(lái)。如pUCl9質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(ampicillinresistancegene)，以其轉(zhuǎn)化的E.coliDH5α就能夠在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，未轉(zhuǎn)化的受體菌則不能在這種選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。電穿孔高效轉(zhuǎn)化法原理：利用高電勢(shì)差的作用，使感受態(tài)細(xì)胞表面受損，產(chǎn)生微小的“孔”，然后外源質(zhì)粒DNA分子通過(guò)此“孔”進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，使宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的表型。與CaCl2相比，電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率較高。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與主要試劑(一)儀器恒溫?fù)u床，生化培養(yǎng)箱，水浴鍋，超凈工作臺(tái)，分光光度計(jì)，全自動(dòng)滅菌鍋，臺(tái)式離心機(jī)，電轉(zhuǎn)化儀，微量移液器，離心管，Epperdorf管。(二)材料大腸桿菌單菌落，pUC18質(zhì)粒。(三)試劑SOC培養(yǎng)基，LB和LA培養(yǎng)基，CaCl2溶液(0.1mol/LCaCl2，10％甘油，ampicillin溶液(100mg/ml)（使用終濃度1000μg/ml）。四、實(shí)驗(yàn)步驟CaCl2轉(zhuǎn)化法：1．接種一個(gè)大腸桿菌的單菌落于5mLLB培養(yǎng)液中，于220r/min搖床中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。2．取100μL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于5ml的LB培養(yǎng)液中，再加入5mL培養(yǎng)液，于37℃搖床(220r/min)培養(yǎng)至OD600＝0.4－0.5左右。3．將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至1.5mL預(yù)冷無(wú)菌的聚丙烯管中，于冰上放置20min，然后于4℃下，3000r/min離心5min，棄上清。4．細(xì)胞沉淀用750μL冰冷的CaCl2溶液重懸，于冰上放置30min，4℃，3000r/min離心5min，棄上清。5．用100μL冰冷的CaCl2，溶液重懸各管細(xì)胞，立即凍存于-70℃。6．按照以下各步驟用感受態(tài)細(xì)菌。A：取體積相當(dāng)10ngpUC18與100μL感受態(tài)DH5α混勻，已知質(zhì)粒用無(wú)菌水和同時(shí)作正對(duì)照和負(fù)對(duì)照方法如上。B：冰浴30min，42℃熱激60~90sec，再加入400μLLB置于37℃振蕩培養(yǎng)45min，然后再按照梯度涂ampicillin抗性LA平板。電穿孔高效轉(zhuǎn)化法：1．DH5α在LA平板上劃線，37℃培養(yǎng)12小時(shí)2．從平板上挑取單菌落，接入裝有5mlSOC培養(yǎng)基的universal瓶中，37℃搖床培養(yǎng)12小時(shí)（220r/m）3．按1：100的比例將菌液轉(zhuǎn)接入4個(gè)250mlSOC培養(yǎng)基中。37℃搖床培養(yǎng)（220r/m）。4．當(dāng)OD值達(dá)到0.7~0.8時(shí)，將菌液取出，用250ml的離心管4℃7000r/m離心5min。5．用去離子水清洗菌體。在vortex上用殘余的液體把沉淀打散，加入50ml～100ml的去離子水，在vortex上劇烈震蕩，直至菌液均勻。離心，條件同上。6．重復(fù)步驟5。棄上清，用10％Glycerol清洗菌體，在vortex上用殘余的液體把沉淀打散，加入50ml～100ml的10％Glycerol，在vortex上劇烈震蕩，直至菌液均勻。離心，條件同上。7．重復(fù)步驟6，2次8．測(cè)試。取20μl菌液進(jìn)行電轉(zhuǎn)，要求無(wú)電火花。9．將菌液裝入預(yù)冷的0.5mlEp管中，每管40μl10．－70℃保存。11．將一定量的pUC18與40μl的感受態(tài)混勻，移入電轉(zhuǎn)化杯中，于電轉(zhuǎn)化儀中轉(zhuǎn)化，然后立即加入冰冷的LB，置于37℃預(yù)培養(yǎng)30－60min。12．按照步驟11，同時(shí)作一正對(duì)照和負(fù)對(duì)照。13．按照梯度，涂含ampicillin的LA平板，待菌液吸干后，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算轉(zhuǎn)化子的數(shù)量，從而算出轉(zhuǎn)化頻率，與CaCl2轉(zhuǎn)化法作對(duì)比。轉(zhuǎn)化率＝轉(zhuǎn)化子的個(gè)數(shù)/質(zhì)粒DNA的量（ng）注意事項(xiàng)：感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化頻率的高低與菌體的生長(zhǎng)狀況聯(lián)系緊密，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體制備的感受態(tài)細(xì)胞，相對(duì)而言，轉(zhuǎn)化頻率較高。CaCl2轉(zhuǎn)化法時(shí)熱激的時(shí)間與溫度很重要，一般溫度為42℃，時(shí)間不能超過(guò)120sec。轉(zhuǎn)化對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一個(gè)破損過(guò)程，所以預(yù)培養(yǎng)有利于轉(zhuǎn)化頻率的提高。電轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)胞一定充分洗滌，感受態(tài)制備完后，應(yīng)作空轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，已便補(bǔ)救。六、思考題：1．CaCl2轉(zhuǎn)化與電穿孔法轉(zhuǎn)化的原理，導(dǎo)致二者轉(zhuǎn)化頻率差異的原因是什么？2．轉(zhuǎn)化子篩選的原理是什么？實(shí)驗(yàn)七DNA的限制性內(nèi)切核酸酶酶切分析一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解限制性內(nèi)切核酸酶的特性2、掌握DNA限制性內(nèi)切核酸酶酶解方法3、掌握DNA限制性內(nèi)切核酸酶酶解效果的檢測(cè)方法二、實(shí)驗(yàn)原理1、限制性內(nèi)切核酸酶的特性(1)各種限制性內(nèi)切核酸酶具有專一地識(shí)別與切割序列。(2)識(shí)別堿基對(duì)數(shù)目一般為4bp、5bp、6bp長(zhǎng)度范圍。但亦有識(shí)別序列為8bp或8bp以上者，如NstⅠ和SfiⅠ的識(shí)別序列為8bp，可將基因組DNA切割成較大的DNA片段，對(duì)制作真核基因組物理圖譜極為有用。(3)識(shí)別序列大多為二重對(duì)稱(即回文結(jié)構(gòu))。(4)多數(shù)限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)就在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)，但少數(shù)限制酶的切割位點(diǎn)不在識(shí)別位點(diǎn)之內(nèi)，而是在識(shí)別位點(diǎn)的旁側(cè)：例如：Hga1的識(shí)別位點(diǎn)是GACGC(5/10)，切割位點(diǎn)在兩條DNA鏈上分別在距識(shí)別位點(diǎn)5個(gè)和10個(gè)核苷酸處5ˊ-GACGCNNNNN↓NNNNNN-3ˊ3ˊ-CTGCGNNNNNNNNNN↑N-5ˊ(5)限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)底物的切割有兩種方式?！┟冈诙貙?duì)稱軸處同時(shí)切割DNA的兩條鏈，產(chǎn)生帶平端的DNA片段，如：PuvII酶切后的DNA為平瑞；而大多數(shù)的酶則在對(duì)稱軸處的兩側(cè)類似的位置切割產(chǎn)生單鏈的突出DNA黏性末端。如EcoRⅠ酶切DNA后產(chǎn)生5’-P端的突出黏性末端，而PstⅠ則產(chǎn)生3’-OH端的突出黏性末端。(6)有些限制性內(nèi)切核酸酶雖然來(lái)源及識(shí)別位點(diǎn)不同，但切割DNA后產(chǎn)生相同匹配的黏性末端，這些酶稱同裂酶。如BamHⅠ識(shí)別位點(diǎn)為5ˊ-G↓GATCC-3ˊ與其相匹配的黏性末端的酶就有BclⅠ、BglⅡ、MobⅠ、XboⅠ。（7）限制性內(nèi)切核酸酶一般都以Mg2+為惟一的輔助因子，并且要求—定的鹽離子濃度。(8)限制性內(nèi)切核酸酶極易失活，要特別注意酶活力的保存，保存酶的緩沖液為：10mmol/LTris-HCl(pH7.4，緩沖pH)、50-100mmol/LNaCl或KCl(鹽離子)、1mmol/LDTT(還原性保持酶活性)、100～200μg/mLBSA(保持蛋白濃度，使酶穩(wěn)定)、50％甘油(存于-20℃不結(jié)冰，結(jié)冰反復(fù)解凍使酶失活)。三、實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑(一)材料DNA樣品，溶于TE緩沖液(二)試劑10х酶切緩沖液、限制性內(nèi)切核酸酶、加樣緩沖液0.5mol/LEDTA，pH8.0(選用)10X酶切緩沖液：100mmol/LTris-HClpH7.5，100mmol/LMgCl2，10mmol/LDTT，1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)，0、0.5、1.0或1.5mol/LNaCl。各限制酶所需NaCl濃度查書(shū)。Sma工需KCl緩沖液。10X乙酸鉀（基礎(chǔ)的）緩沖液：660mmol/L乙酸鉀，330mmol/LTris-乙酸pH7.9，100mmol/L乙酸鎂，5mmol／LDTT，lmg/mLBSA2X谷氨酸鉀（基礎(chǔ)的）緩沖液：200mmol/L谷氨酸鉀，50mmol/LTris-乙酸pH7.5，100μg/mLBSA，1mmol/L2-ME10XSmaⅠ緩沖液：60mmol/LTris-HClpH8.0，60mmol/LMgCl2，200mmol/LKCl，60mmol/L2-ME，lmg/mLBSA四、實(shí)驗(yàn)步驟單酶單DNA樣品的消化此法只需要簡(jiǎn)單地將酶和DNA樣品放在合適的反應(yīng)緩沖液中溫育，其中DNA和酶的量、緩沖液的離子強(qiáng)度、溫育溫度和時(shí)間都依具體的反應(yīng)而改變。1．取一只無(wú)菌微量離心管，加入以下溶液：хμLDNA(0.1～4μg溶于H20或TE緩沖液)2μL10X酶切緩沖液18～хH20用于聚丙烯酰胺凝膠電泳或瓊脂糖凝膠電泳分析時(shí)，20μL的反應(yīng)體積就足夠了。只要反應(yīng)體系中各成分的比例保持一定，可增減DNA量。2．加入限制性內(nèi)切核酸酶(1～5μgDNA)，推薦的溫度(一般為37℃)溫育lh。在推薦的反應(yīng)條件下，lU限制性內(nèi)切核酸酶理論上可在60min內(nèi)完全消化1μg純化的DNA樣品。然而，實(shí)際操作中粗制的DNA樣品，常需要使用較多的酶，或較長(zhǎng)的時(shí)間才能完全消化。酶的體積應(yīng)低于反應(yīng)總體積的1/10，因?yàn)槊敢褐械母视涂梢愿蓴_酶切反應(yīng)。3．加入5μL電泳加樣緩沖液(20％反應(yīng)體積)終止反應(yīng)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳。加入0.5μL0.5mol/LEDTA(終濃度為12mmol/L)也可終止反應(yīng)，因?yàn)槠淇沈厦盖兴枰逆V離子。在65℃溫育10min很多酶可被不可逆滅活，也可用來(lái)終止反應(yīng)。如果酶具熱抗性，則可通過(guò)酚抽提和乙醇沉淀或通過(guò)硅基質(zhì)懸浮法去除酶蛋白，以此來(lái)終止酶切，純化DNA。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、思考題1、如何判斷質(zhì)粒是否被切開(kāi)2、如何判斷重組質(zhì)粒是正確的實(shí)驗(yàn)八蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS電泳檢測(cè)一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解限制性內(nèi)切核酸酶的特性2、掌握DNA限制性內(nèi)切核酸酶酶解方法3、掌握DNA限制性內(nèi)切核酸酶酶解效果的檢測(cè)方法二、實(shí)驗(yàn)原理將外源基因克隆在含有l(wèi)ac啟動(dòng)子的表達(dá)載體中，讓其在大腸桿菌中表達(dá)。先讓宿主菌生長(zhǎng)，lacⅠ產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱的基因結(jié)合，從而不能進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，此時(shí)宿主菌正常生長(zhǎng)。然后向培養(yǎng)基中加入lac操縱子的誘導(dǎo)物IPTG，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，則外源基因大量轉(zhuǎn)錄并高效表達(dá)。故表達(dá)蛋白可經(jīng)SDS檢測(cè)。細(xì)菌體中含有大量蛋白質(zhì)，具有不同的電荷和分子量。強(qiáng)陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，通過(guò)加熱使蛋白質(zhì)解離，大量的SDS結(jié)合蛋白質(zhì)，使其帶相同密度的負(fù)電荷，在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）上，不同蛋白質(zhì)的遷移率僅取決于分子量。采用考馬斯亮蘭快速染色，可及時(shí)觀察電泳分離效果。因而根據(jù)預(yù)計(jì)表達(dá)蛋白的分子量，可篩選陽(yáng)性表達(dá)的重組體。三、實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑（一）材料1、含外源基因表達(dá)質(zhì)粒的BL21菌體、LB液體培養(yǎng)基、Amp、IPTG、SDS、丙烯酰胺、N,N-亞甲雙丙烯酰胺（Bis）、四甲基乙二胺（TEMED）、過(guò)硫酸銨（Aps）、Tris、0.1％溴酚藍(lán)、雙蒸水、考馬斯亮籃R250、巰基乙醇、瓊脂、冰醋酸（二）實(shí)驗(yàn)儀器1、超凈工作臺(tái)、恒溫?fù)u床、生化培養(yǎng)箱、離心機(jī)、分光光度計(jì)2、蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)、平板電泳槽及