生物工業(yè)下游加工技術(shù)

第十二章色譜分離第一節(jié)概論第二節(jié)色譜分離的分類第三節(jié)生物工業(yè)中的色譜分離第四節(jié)色譜分離的基本原理第五節(jié)柱色譜分離法第六節(jié)親和色譜知識要點（1）掌握各種色譜分離技術(shù)的特點及適應(yīng)范圍。（2）理解色譜分離方法的基本原理。（3）了解色譜分離方法的分類。第一節(jié)概述色譜分離（ChromatographicResolution，CR）：也稱色層分離或?qū)游龇蛛x（蛋白質(zhì)層析儀），在分析檢測中常稱為色譜分析。它是一種物理的分離方法，利用多組分混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)（吸附力、分子極性、分子形狀和大小、分子親和力、分配系數(shù)等）的差別，使各組分以不同程度分布在兩個相（固定相和流動相）中。當多組分混合物隨流動相流動時，由于各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別，而以不同的速率移動，使之分離。色譜分離法的發(fā)展歷史1903年俄國植物學(xué)家茨維特用菊根粉研究植物色素的提取物，以石油醚作為洗脫劑，得到分離的黃色、綠色區(qū)帶，故稱為色譜分離法。1931年有人用氧化鋁柱分離了胡蘿卜素的兩種同分異構(gòu)體，顯示了本方法具有極高的分辨率。50年代氣象色譜的出現(xiàn)，為色譜分離儀器化奠定了雄厚的物質(zhì)基礎(chǔ)。60年度高效液相色譜的發(fā)展，使高效固定相填料獲得了突破性的進展。在此后的20多年中，氣相色譜和液相色譜在分析化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)，尤其是對多組分復(fù)雜體系的分析占了絕對的統(tǒng)治地位。色譜分離法的發(fā)展歷史隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對生物產(chǎn)品的分離往往達不到所需的純度要求，色譜分離成為分離技術(shù)的研究重點，并在理論上從線性色譜發(fā)展到非線性色譜。近年來，陸續(xù)出現(xiàn)了全色譜分離和純化治療蛋白的工藝，使人們對加寬色譜分離應(yīng)用范圍的研究更趨活躍。色譜分離的基本特點（1）分離效率高：色譜分離的效率是所有分離純化技術(shù)中最高的。由于分離效率高，通常使用的色譜柱長只有幾厘米到幾十厘米。這種高效的分離尤其適合于極復(fù)雜混合物的分離。（2）應(yīng)用范圍廣：色譜分離的應(yīng)用范圍之廣也是其他分離技術(shù)無法相比的，從極性到非極性、離子型到非離子型、小分子到大分子等都可用色譜方法分離，尤其對生物大分子樣品的分離，是其他方法無法取代的。（3）選擇性強。色譜分離技術(shù)的可變參數(shù)之多也是其他分離技術(shù)無法相比的。因而具有很強的選擇性。在色譜分離中，可通過多種途徑選擇不同的操作參數(shù)，以適應(yīng)各種不同樣品的分離要求。色譜分離的基本特點（4）高靈敏度的在線檢測：與其他分離方法相比，色譜分離具有高靈敏度在線檢測的特性。在分離與純化過程中，可根據(jù)不同的物理與化學(xué)原理，采用不同的高靈敏度檢測器進行連續(xù)的在線檢測，以保證在要求的純度下得到最高的產(chǎn)率。（5）快速分離：高效細顆粒層析劑和高壓液相色譜分離技術(shù)的采用，保證了在高分離效率前提下的高分離速率，從而可以提高單位時間的產(chǎn)量。（6）過程自動化操作。計算機的應(yīng)用使色譜分離過程自動化，可按預(yù)先設(shè)置的程序進行完全自動化的操作，保證了產(chǎn)品的質(zhì)量，提高了產(chǎn)率，節(jié)省了勞動力，降低了生產(chǎn)成本。色譜分離的缺點（1）儀器設(shè)備昂貴，一次性投入比較大。（2）要消耗溶劑用于分離，有時消耗的溶劑量比較大。（3）有些能與分離介質(zhì)反應(yīng)的物質(zhì)不能用色譜法分離。第二節(jié)色譜分離的分類一、按分離機理分類：（1）吸附色譜分離；（2）分配色譜分離；（3）離子交換色譜；（4）凝膠色譜；（5）親和色譜；吸附色譜吸附色譜（AdsorptionChromatography,AC）是指混合物隨流動相通過固定相（吸附劑）時，由于固定相對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物分離的方法。吸附色譜是各種色譜分離技術(shù)中應(yīng)用最早的一類，所用吸附劑一般為有機基質(zhì)并通過化學(xué)修飾后制成。它們都有比較明確的作用機理，即疏水作用，螯合作用和共價作用。分配色譜分配色譜（DistributionChromatography,DC）:因流動相和固定相都是液體，因此又稱為液液色譜。其原理是利用混合物中各物質(zhì)在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。根據(jù)分配原理進行色譜分離的操作方法有兩種：一種是柱（紙或板）色譜分離法，其固定相是將與流動相互不相溶的液體涂漬到載體上形成的；另一種是逆流分配法，其固定相和流動相都放在一組特別的分配管中，用來完成這種操作的儀器稱為逆流分配儀。根據(jù)固定相和流動相的極性與非極性的差別，分配色譜又可分為正向色譜和反相色譜。正向色譜的固定相與極性，流動相為非極性。而反相色譜則相反。離子交換色譜離子交換色譜（IonExchangeChromatography,IEC）:是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換，由于混合物中不同溶質(zhì)對交換劑具有不同的親和力而將它們分離。該法適合于離子和在溶劑中可發(fā)生電離的物質(zhì)的分離。特別是在蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物物質(zhì)的分離純化中，離子交換色譜分離占主導(dǎo)地位。凝膠色譜凝膠色譜（GelChromatography，GC）：以凝膠為固定相，是一種根據(jù)各物質(zhì)分子大小不同而進行分離的色譜技術(shù)，因而又稱為分子篩色譜（MolecularSieveChromatography，MSC）、空間排阻色譜或尺寸排阻色譜（SizeExclusionChromatography,SEC）。凝膠是一種不帶電荷的具有三維空間的多空網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，凝膠的每個顆粒的細微結(jié)構(gòu)就如一個篩子。當混合物隨流動相流經(jīng)凝膠時，較大的分子不能進入所有的凝膠網(wǎng)孔而受到排阻，它們將與流動相一起首先流出；較小的分子能進入部分凝膠網(wǎng)孔，流出的速率較慢；更小的分子能進入全部凝膠網(wǎng)孔，而最后從凝膠柱中流出。凝膠色譜按其流動相的不同分為兩大類：一類是水相系統(tǒng)，稱為凝膠過濾色譜，其所用凝膠是親水性的，用來分離水溶性大分子化合物；另一類是有機相系統(tǒng)，稱為凝膠滲透色譜，其所用凝膠是疏水性的，用來分離油溶性的高分子化合物。親和色譜親和力：生物體中許多大分子化合物具有與其結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性，如抗原與抗體。生物分子間的這種專一結(jié)合能力稱為親和力。親和色譜：利用與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相，則當含有目的產(chǎn)物的混合物（流動相）流經(jīng)此固定相時，即可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來。這種技術(shù)稱為親和色譜。離子交換作用和親和作用也可看作特殊的吸附作用，因此也可把離子交換色譜和親和色譜歸類于吸附色譜。親和色譜作為色譜分離技術(shù)的一個分支，對于生物大分子化合物的分離純化具有特別重要的意義。二、按固定相形狀不同分類1、柱色譜分離：各種不同的色譜分離都可在柱子中進行。柱色譜就有進行量大和回收容易等優(yōu)點，但其分辨率不如紙上色譜和薄層色譜高。２、紙上色譜分離（紙層析）：是以濾紙為載體，以濾紙纖維及其結(jié)合水作為固定相，以有機溶劑作為流動相的分配色譜分離。紙上色譜分離具有設(shè)備簡單、操作方便、分離效率高、所需樣品量少等優(yōu)點，被廣泛用于定性與定量分析。二、按固定相形狀不同分類3、薄層色譜分離（薄層層析）：是將固定相在玻璃平板上鋪成薄層而進行分離的一種分離技術(shù)。根據(jù)玻璃平板上所涂固定相的不同，薄層色譜又分為薄層吸附色譜、薄層分配色譜、薄層離子交換色譜和薄層凝膠色譜等。薄層色譜是柱色譜和紙上色譜兩者的結(jié)合，兼有兩者的優(yōu)點，如操作簡便、分離效率高、分離速度快和適合不同分離機理的色譜分離等。三、其他分類方法（1）根據(jù)流動相的物態(tài)不同，可分為氣相色譜分離、液相色譜分離和超臨界色譜分離。在生物制備和工業(yè)分離中應(yīng)用最廣泛的是液相色譜（LiquidPhaseChromatography，LPC）。（2）根據(jù)操作壓力不同，可分為低壓色譜分離、中壓色譜分離和高壓色譜分離。高壓液相色譜分析就是大家經(jīng)常接觸到的HPLC。（3）根據(jù)洗脫操作時展開方式的不同，可分為洗脫展開法、前沿分析法和置換展開法三種。第三節(jié)生物工業(yè)中的色譜分離從理論分析得出，色譜和電泳是目前所知最好的兩種分離方法。但因為種種原因，電泳法目前尚不能用于生產(chǎn)規(guī)模的生物大分子的分離與純化。所以目前分離和純化蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖等生物大分子主要用色譜技術(shù)。特別是在基因工程產(chǎn)品中，色譜分離占有核心地位。一、色譜分離的規(guī)模與一般分離技術(shù)相比，色譜分離技術(shù)的規(guī)模是相當小的，可分為以下四類：1、色譜分析：<10mg2、半制備(中等規(guī)模制備)：10-50mg3、制備（樣品制備）：0.1-10g4、工業(yè)生產(chǎn)：>20g/d雖然看上去產(chǎn)量很小，但其實產(chǎn)值相當高。比如干擾素的售價為1萬元/mg,只要采用半制備規(guī)模，年產(chǎn)值可到1億元以上。二、色譜分離方法的選擇（1）目的產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)、及分子量的大??；（2）主要雜質(zhì)，特別是分子結(jié)構(gòu)、大小和理化特性與目的產(chǎn)物相近的雜質(zhì)的成分與含量；（3）目的產(chǎn)物在色譜分離過程中生理活性的穩(wěn)定性。二、色譜分離方法的選擇對于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子，由于它們分子量大，具有活性和生物專一親和性，經(jīng)常采用離子交換色譜、疏水作用色譜、凝膠色譜和親和色譜等。對于生物小分子的代謝物，由于它們分子量小，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)比較穩(wěn)定，操作條件不太苛刻，常采用吸附、分配和離子交換色譜。其中，氨基酸、有機酸、核苷酸等一些離子型化合物的生產(chǎn)多用離子交換色譜分離；而抗生素、生物堿、萜類、色素等次級代謝產(chǎn)物多用吸附色譜或反相分配色譜分離。三、分析色譜與制備色譜及工業(yè)色譜的比較1、應(yīng)用色譜技術(shù)范圍的不同：分析色譜的流動相包括氣相和液相，固定相包括柱子、紙和薄板，而制備和工業(yè)色譜主要采用液相為流動相的柱上色譜。2、操作上的不同：在分析色譜中，進樣量越小越好，檢測靈敏度越高越佳。在制備和工業(yè)色譜中，則要求進樣量越多越好，色譜柱也應(yīng)適當大些，以便分離和純化較多的產(chǎn)品。三、分析色譜與制備色譜及工業(yè)色譜的比較3、色譜分離理論上的不同：分析色譜分離的好壞與理論塔板數(shù)有明顯的關(guān)系，而制備和工業(yè)色譜分離效果往往是多種分離機理的綜合效果，分離效果往往與理論塔板數(shù)沒有明顯關(guān)系。另外，在分析分配色譜中，樣品中溶質(zhì)濃度較低，分配系數(shù)為常數(shù)，溶質(zhì)在兩相中的關(guān)系成線性關(guān)系。而在制備和工業(yè)色譜中，樣品的濃度往往很高，分配系數(shù)不是常數(shù)，既是溫度的函數(shù)，同時也是流動相溶質(zhì)濃度的函數(shù)。最后，在分析色譜中，色譜峰高于組分濃度呈線性關(guān)系，因而峰高可作為定量分析的指標。但在制備色譜和工業(yè)色譜中，色譜的峰高不能作為制備色譜和工業(yè)色譜定量分析的指標。第四節(jié)色譜分離的基本原理第四節(jié)色譜分離的基本原理原理：各組分與固定相間存在一定的化學(xué)親和力，因而各組分的移動速率低于流動相的移動速率。若各組分對固定相的親和力大小不同，則各組分的移動速率就不同，從而使各組分在色譜柱內(nèi)分層而得以分離。從圖中可以看出，各組分對固定相親和力的次序為：白球分子>三角形分子。當繼續(xù)加入洗脫劑時，兩種組分將逐漸分開，其中親和力弱的三角形分子移動最快，首先從色譜中分離出來，而親和力強的白球分子最后從色譜柱中出來。在色譜操作中，加入洗脫劑而使各組分分層的操作稱為展開，洗脫時從柱中流出的溶液稱為洗脫液，而展開后各組分的分布情況稱為色譜。一、分配色譜分配色譜是利用混合物中各組分在兩種互不相溶的溶劑中的分配系數(shù)不同而得以分離，其過程相當于連續(xù)性的溶劑抽提。分配系數(shù)：一定量的溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中達到平衡時，溶質(zhì)在兩種溶劑中的濃度之比為一常數(shù)，此常數(shù)稱為分配系數(shù)。在分配色譜中，通常采用一種多孔的固體（如硅膠、硅藻土等）吸附著一種溶劑構(gòu)成固定相。其中的固體本身對分離不起作用，僅僅起到一個支持作用，稱為“支持劑”或“載體”。另一種溶劑與固定相溶劑互不相溶，色譜過程中流過固體相，因而稱為流動相。阻滯因數(shù)：溶質(zhì)在色譜柱（紙、板）中的移動速率與流動相移動速率之比稱為阻滯因數(shù)，以Rf表示。Rf值越大，溶質(zhì)隨著流動相移動的速率就越大，溶質(zhì)被洗脫的速率也就越快。塔板理論：色譜柱中的分離效率可用塔板理論來描述。設(shè)想把色譜柱分成若干段，每一段高度等于一塊理論塔板高度。所謂理論高度是指這樣一段柱高，自這段柱中流出的液體（流動相）和其中固定相的平均濃度相平衡。二、吸附色譜吸附現(xiàn)象是表面的一個重要性質(zhì)之一，在固體與氣體之間或固體與液體之間的表面上，都可以發(fā)生吸附現(xiàn)象。這是因為處于固體表面的分子所受的力是不對稱的，向內(nèi)的面受到固體內(nèi)部分子的作用力大，表面層所受的作用力小，因而溶質(zhì)分子在流動過程中碰到固體表面時受到這種剩余力的影響，就會被吸附而停留下來。根據(jù)所用吸附劑和吸附力的不同，吸附色譜可分為無機基質(zhì)吸附色譜、疏水作用吸附色譜、共價作用吸附色譜、金屬螯合作用吸附色譜、聚酰胺吸附色譜等。分離因數(shù)：某一瞬間被吸附的溶質(zhì)量占總量的分數(shù)。較高的有效結(jié)合位點濃度、較低的溶質(zhì)濃度和解離常數(shù)，具有較大的分離因數(shù)。三、凝膠色譜分離特點：（1）凝膠不與溶質(zhì)分子發(fā)生作用，分離條件溫和，蛋白質(zhì)收率高，重現(xiàn)性好；（2）應(yīng)用范圍廣，分離分子量的覆蓋面大，可分離從幾百到數(shù)百萬分子量的分子；（3）設(shè)備簡單，易于操作，周期短，層析劑不需再生即可反復(fù)使用，有的可連續(xù)使用幾百次至上千次。凝膠色譜分離原理示意圖凝膠色譜分離原理示意圖含有大小不同分子的混合液加入色譜柱頂端，小分子溶質(zhì)進入凝膠顆粒的微孔中，在凝膠內(nèi)部擴散；而大分子溶質(zhì)不能進入凝膠內(nèi)部，只能隨著流動相順著凝膠間隙流下來，其下移通道較短，下移速率較快，將首先被洗脫出來；小分子下移通道較長，下移速率較慢，在色譜柱中逐漸與大分子物質(zhì)拉開距離。隨著洗脫過程的進行，小分子物質(zhì)慢慢從凝膠柱中流出。第五節(jié)柱色譜分離法一、層析劑：用于色譜分離技術(shù)中的固定相或分離介質(zhì)，總稱為層析劑。它由基質(zhì)和表面活性官能團組成。其中，層析劑的基質(zhì)材料應(yīng)為化學(xué)惰性物質(zhì)，與目的產(chǎn)物和雜質(zhì)都無結(jié)合作用；活性官能團則根據(jù)所用色譜分離方法選用或者制取。生物產(chǎn)品所需固定相或?qū)游鰟┚哂械奶匦裕?）不溶于流動相，且具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性和機械強度；（2）具有較大的表面積和孔隙度，且粒度、孔徑分布均勻。（3）有較高的回收率和負載量，能達到所需的分離效率，且重現(xiàn)性好。（4）層析劑應(yīng)具有較好的熱穩(wěn)定性。（5）無毒性，分離過程不引起目的產(chǎn)物的變性或失活。（6）成本較低，價格合理。（一）無機基質(zhì)層析劑1、硅膠：化學(xué)成分是二氧化硅，用作分離介質(zhì)的硅膠是人工合成的多孔二氧化硅，其特點是表面含有很多硅羥基團，這是硅膠可以進行表面化學(xué)修飾或改性的基礎(chǔ)。2、氧化鋁：有堿性、中性和酸性之分。氧化鋁通常用作吸附層析劑，且主要用于小分子有機化合物的分離。限制它更廣泛應(yīng)用的主要因素是，它難以像硅膠那樣通過與硅羥基的鍵合作用而得到不同分離機理的層析劑。（一）無機基質(zhì)層析劑（3）活性炭：活性炭分為粉末狀活性炭和顆粒狀活性炭兩種。活性炭柱色譜特點：樣品上柱量大，分離效果好，來源較易，價格便宜，適用于大量制備性的分離。但其吸附力不像氧化鋁、硅膠那樣容易控制，故應(yīng)用不廣。（4）多孔玻璃：主要成分也是二氧化硅，多孔玻璃的孔徑可自數(shù)納米至數(shù)微米間調(diào)整，且其孔徑分布窄，機械強度也很高。同硅膠一樣，多孔玻璃表面也含有豐富的硅羥基，因此它同樣可以進行適當?shù)幕瘜W(xué)修飾或表面處理，制得不同分離機理的層析劑。（一）無機基質(zhì)層析劑（5）羥基磷灰石：是一種晶體形磷酸鈣，與生物體有很好的相容性。羥基磷灰石層析劑可用于生物大分子的分離與純化，近年來已成為水相體系中蛋白質(zhì)、核酸和病毒等色譜分離應(yīng)用最廣的技術(shù)之一。羥基磷灰石表面有很多帶電荷離子Ca2+和PO43-，它們能與蛋白質(zhì)分子以帶極性的偶極-偶極鍵合形式相結(jié)合。(二)有機基質(zhì)層析劑與無機基質(zhì)相比，有機基質(zhì)材料具有如下特征：（1）基質(zhì)微?？蓮V泛選擇單體和交聯(lián)劑聚合進行化學(xué)改性處理，所合成的層析劑產(chǎn)品普遍具有良好的選擇性；（2）層析劑負載能力強，有較高的色譜容量；（3）具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，可在廣泛的pH范圍內(nèi)使用；（4）不易產(chǎn)生不可逆的吸附作用，特別是對于生化物質(zhì)的分離能較好地保存其生物活性。常見的有機基質(zhì)層析劑1、瓊脂糖：瓊脂糖是D-半乳糖和3,6-脫水-L半乳糖交替結(jié)合而成的鏈狀多糖，是生物大分子物質(zhì)色譜分離操作最常用的基質(zhì)之一。由于瓊脂糖顆粒中帶有大量的-OH基團，不但親水性好，而且可以方便地進行化學(xué)修飾，接上一些官能團，以便與某些接枝“手臂”或配基共價結(jié)合，適應(yīng)于各種色譜分離技術(shù)。能用于色譜分離法的瓊脂糖基質(zhì)有許多商品，如Sepharose（Pharmacia）、BiogelA（Bio-rad）、UltrogelA（LKB等）。2.葡聚糖：葡聚糖（Dextran）是

-1,6健相連的葡萄糖聚合物。由環(huán)氧氯丙交聯(lián)葡聚糖得到的珠粒，商品名稱為Sephadex。由于多糖骨架上有大量羥基使得它的親水性比Sepharose還強。凝膠的化學(xué)性質(zhì)和熱穩(wěn)定性也很好?？讖捷^小的Sephadex主要用于脫鹽、肽與其他小分子的分離；孔徑較大的Sephadex用于蛋白質(zhì)與其他大分子的分離。常見的有機基質(zhì)層析劑3.纖維素：纖維素是

-1,4健相連的D-葡萄糖（偶爾有1,6鍵合）的線性聚合物。纖維素及其眾多的衍生物已被廣泛用于蛋白質(zhì)類物質(zhì)的純化。尤其是內(nèi)部具有不均勻球狀結(jié)構(gòu)的球狀纖維素，具有很高的孔度和親水性，機械強度比葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠都好。同樣也可以進行化學(xué)修飾，以滿足不同的需要。4.聚丙烯酰胺凝膠：是由丙烯酰胺與交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺共聚得到。它具有烷烴的骨架和許多羧酰胺側(cè)鏈。根據(jù)交聯(lián)劑比例的不同，可得到不同孔度的網(wǎng)格。聚丙烯酰胺親水性好，pH1-10范圍內(nèi)穩(wěn)定，且不為生物降解，因此在色譜分離中有廣泛用途。它主要用于凝膠過濾法和凝膠電泳法的生物大分子的分離中。普通的聚丙烯酰胺凝膠目前使用一種新型的聚合物，它的商品名為Trisacryl。該商品親水性好，化學(xué)穩(wěn)定性和機械強度也好，pH適應(yīng)范圍寬，通?？捎米麟x子交換層析劑和親和層析劑的基質(zhì)。常見的有機基質(zhì)層析劑5、聚丙烯醇：是以交聯(lián)聚乙烯醇為骨架的凝膠過濾介質(zhì)，80年代初問世。Toyopearl為多孔的三向網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大分子鏈上含有豐富的羥基，骨架為親水性。除廣泛用于凝膠過濾外，還可進行化學(xué)改性而得到含有多種官能團的離子交換劑及親和吸附層析劑。二、柱色譜裝置

柱色譜裝置一般由進樣、流動相供給、色譜柱、檢測及流分收集器等部分構(gòu)成，其中色譜柱是色譜分離裝置的關(guān)鍵部件。二、柱色譜裝置

1、進樣及流動相供給裝置：流動相供給部分一般包括儲液罐、高壓泵、液體混合室及梯度洗脫洗脫。此外，進樣體積大時，進樣器需附加一個輸液泵。2、色譜柱：色譜柱通常用玻璃柱，這樣可直接觀察色帶的移動情況。工業(yè)上的大型色譜柱可以用金屬制造，有時在柱壁嵌一條玻璃或有機玻璃狹帶，便于觀察。一般情況下，柱子的分離效率與柱子長度成正比，與柱子的直徑成反比，所以食譜柱一般都是細長的。色譜柱填裝的好壞，對色譜分離的效果有很大的影響。裝柱子時，最好將層析劑先與不超過層析劑用量的一份緩沖液調(diào)成漿料，然后慢慢地邊加邊攪拌，一次加完。二、柱色譜裝置

3、檢測器與流分收集器：通過檢測器連續(xù)監(jiān)測柱底出口處液體中各組分的濃度變化，可以了解樣品中組分的分辨情況。根據(jù)組分的理化性質(zhì)，選育適當?shù)膬x器，進行在線檢測。常用的一個指標是光吸收度，在生物大分子的色譜分離時，常用紫外分光光度計作為檢測器，直接了解蛋白質(zhì)的分離情況。流分收集器是將底部流出的液體，每次按一定量分別收集的儀器。其中以容量式和質(zhì)量式較為方便實用。三、操作技術(shù)1、樣品溶解與進樣方法：樣品中應(yīng)不夾帶固體顆粒，通常需要加其他試劑，以增加蛋白質(zhì)樣品的溶解度。2、展開操作：樣品上柱后，加入洗脫劑，使樣品分離并收集目的產(chǎn)物。第六節(jié)親和色譜親和色譜（AffinityChromatography,AFC）是專門用于純化生物大分子的色譜分離技術(shù)，它是基于固定相的配基與生物分子間的特殊生物親和能力的不同來進行相互分離的。親和色譜的顯著特點：具有其他分離技術(shù)不能比擬的高選擇性，色譜過程操作條件溫和，能有效保持生物大分子高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，活性樣品的回收率也比較高。特別對分離含量極少而又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)最有效，經(jīng)一步親和色譜即可提純幾百至幾千倍。親和色譜的局限性：不是任何生物高分子都有特定的配基。針對某一分離對象需要制備專一的配基和選擇特定的色譜條件，因此其商品化受到限制。一、親和色譜的基本原理和過程親和色譜也是一種吸附色譜，但它的吸附作用主要靠生物分子對它的互補結(jié)合體（配基）的生物識別能力（鎖匙結(jié)合）?；具^程：把具有特異親和力的一對分子的任何一方作為配基，在不傷害其生物功能情況下，與不溶性載體結(jié)合，使之固定化，裝入色譜柱，然后把含有目的物質(zhì)的混合液作為流動相，在有利于固定相配基和目的物質(zhì)形成絡(luò)合物的條件下進入色譜柱。這時，混合液中只有能與配基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)形成絡(luò)合物的目的物質(zhì)被吸附，不能發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的雜質(zhì)分子則直接流出。變換通過色譜柱的溶液組成，促使配基與其親和物（目的物質(zhì)）解離，即可獲得純化的目的產(chǎn)物。親和色譜中常用的生物親和關(guān)系（1）酶：底物、底物類似物、抑制劑、輔酶、金屬離子；（2）抗體：抗原、病毒、細胞；（3）激素、維生素：受體蛋白、載體蛋白；（4）外源凝集素：多糖、糖蛋白、細胞表面受體蛋白、細胞；（5）核酸：互補堿基鏈段、組蛋白、核酸聚合酶、核酸結(jié)合蛋白；（6）細胞：細胞表面特異蛋白、外源凝集素。親和色譜基本過程示意圖親和色譜分類根據(jù)親和色譜選擇性的高低，可將親和色譜分為專一性和基團性兩大類。前者的配基對某種生物物質(zhì)有特別強的親和性，后者則指固定相配基對一類基團有極強的親和關(guān)系。常用基團性親和色譜的配基有（1）三嗪染料F3GA；（2）蛋白質(zhì)A；（3）伴刀豆球蛋白A；（4）5‘-AMP；（5）2’，5’-ADP；（6）聚尿苷酸；（7）聚腺苷酸。二、親和層析劑親和層析劑的制備過程一般包括3步：載體的選擇、載體的活化和配基的連接。親和色譜的理想載體特性：（1）不溶性；（2）滲透性；（3）高硬度及適當?shù)念w粒形式；（4）最低的吸附力；（5）較好的化學(xué)穩(wěn)定性；（6）抗微生物和酶的侵蝕；（