致病大腸桿菌變異與仔豬白痢機(jī)制探究摘要/Abstract中文：本研究通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)系統(tǒng)分析了致病性大腸桿菌(PathogenicEscherichiacoli,PEC)的變異特性及其與仔豬白痢發(fā)病機(jī)制的關(guān)聯(lián)。從全國(guó)四個(gè)主要養(yǎng)豬區(qū)域采集300份患病仔豬糞便樣本，分離鑒定286株致病性大腸桿菌。結(jié)果顯示，變異菌株毒力顯著增強(qiáng)，其中F4+菌株黏附能力較野生型提高3.2倍(P<0.01)；多重耐藥菌株比例近5年上升27.6%；通過(guò)構(gòu)建仔豬感染模型發(fā)現(xiàn)，變異菌株可改變脂多糖結(jié)構(gòu)逃避宿主先天免疫識(shí)別，使腸道黏膜促炎因子(IL-6、TNF-α)分泌延遲4-6小時(shí)?；谘芯拷Y(jié)果，提出了建立基于多重PCR的變異菌株快速檢測(cè)方法、開(kāi)發(fā)包含變異毒力基因的多價(jià)疫苗等防控策略。English:ThisstudysystematicallyanalyzedthevariationcharacteristicsofpathogenicEscherichiacoli(PEC)anditsassociationwiththepathogenesisofwhitescourinpigletsusingmolecularbiologytechniques.Atotalof300fecalsamplesfromdiseasedpigletswerecollectedfromfourmajorpigfarmingregionsinChina,and286strainsofpathogenicE.coliwereisolatedandidentified.Theresultsshowedthatthevirulenceofvariantstrainswassignificantlyenhanced,withtheadhesioncapacityofF4+strainsbeing3.2timeshigherthanwild-type(P<0.01);theproportionofmultidrug-resistantstrainsincreasedby27.6%inrecentfiveyears;throughtheconstructionofapigletinfectionmodel,itwasfoundthatvariantstrainscouldalterlipopolysaccharidestructuretoevadehostinnateimmunerecognition,delayingthesecretionofintestinalmucosalproinflammatoryfactors(IL-6,TNF-α)by4-6hours.Basedonthefindings,preventionstrategiesincludingestablishingarapiddetectionmethodforvariantstrainsbasedonmultiplexPCRanddevelopingmultivalentvaccinescontainingvariantvirulencegeneswereproposed.致病性大腸桿菌/PathogenicEscherichiacoli基因變異/Geneticvariation仔豬白痢/Whitescourinpiglets毒力因子/Virulencefactors耐藥性/Drugresistance防控策略/Preventionstrategies一引言背景養(yǎng)豬業(yè)作為我國(guó)畜牧業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，2024年全國(guó)生豬出欄量達(dá)7.2億頭，產(chǎn)值超過(guò)2.8萬(wàn)億元，占畜牧業(yè)總產(chǎn)值的34.6%[1]。仔豬階段作為生豬養(yǎng)殖的關(guān)鍵時(shí)期，其健康狀況直接影響?zhàn)B殖效益。仔豬白痢是10-30日齡仔豬的常發(fā)性腸道傳染病，以排出灰白色漿狀稀糞為典型特征，發(fā)病率通常為30%-60%，死亡率為10%-30%，嚴(yán)重流行時(shí)可達(dá)50%以上[2]。據(jù)行業(yè)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年因仔豬白痢造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)60億元，間接損失（包括生長(zhǎng)遲緩、飼料轉(zhuǎn)化率下降等）更是高達(dá)120億元，成為制約養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要因素[3]。致病性大腸桿菌(PathogenicEscherichiacoli,PEC)是引起仔豬白痢的主要病原菌，該菌為革蘭陰性兼性厭氧菌，具有復(fù)雜的血清型和多樣的毒力特征。根據(jù)其致病機(jī)制不同，可分為產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)等，其中ETEC是引起仔豬白痢的主要類(lèi)型[4]。近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大、抗生素濫用及養(yǎng)殖環(huán)境變化，致病性大腸桿菌的變異現(xiàn)象日益突出，導(dǎo)致其血清型分布、毒力特征和耐藥譜發(fā)生顯著變化，給仔豬白痢的防控帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)[5]。致病性大腸桿菌的變異是其適應(yīng)環(huán)境壓力和宿主防御機(jī)制的重要進(jìn)化策略。分子流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)致病性大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型已從2015年的O8、O9轉(zhuǎn)變?yōu)?024年的O149、O138、O157，血清型轉(zhuǎn)換率達(dá)63.2%[6]。毒力基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，黏附素基因(faeG、fanC、fasA)和腸毒素基因(estA、eltB)的攜帶率分別提高了42.7%和38.9%，且出現(xiàn)了新型融合毒力基因[7]。耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，臨床分離株對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)藥物的耐藥率已分別達(dá)到89.3%、78.6%和92.1%，同時(shí)對(duì)氟喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)藥物的耐藥率也呈逐年上升趨勢(shì)，多重耐藥菌株比例已從2019年的34.5%升至2024年的62.1%[8]。1.1研究意義仔豬白痢的發(fā)生發(fā)展是病原體、宿主和環(huán)境共同作用的結(jié)果。新生仔豬腸道菌群尚未建立、胃酸分泌不足、免疫功能低下，為致病性大腸桿菌的定植和繁殖提供了有利條件[9]。當(dāng)變異的致病性大腸桿菌突破宿主防御屏障后，通過(guò)表達(dá)黏附素定植于腸道上皮細(xì)胞，分泌腸毒素導(dǎo)致腸道黏膜細(xì)胞分泌功能亢進(jìn)，引起滲透性腹瀉[10]。同時(shí)，變異菌株可通過(guò)改變表面抗原、產(chǎn)生生物膜、分泌蛋白酶等方式逃避宿主免疫清除，延長(zhǎng)感染周期[11]。盡管?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)致病性大腸桿菌和仔豬白痢進(jìn)行了大量研究，但關(guān)于致病性大腸桿菌變異與其致病機(jī)制的系統(tǒng)性研究仍存在不足：一是對(duì)變異類(lèi)型的分子基礎(chǔ)認(rèn)識(shí)不全面，尤其缺乏不同變異類(lèi)型協(xié)同作用的研究；二是對(duì)變異菌株與宿主腸道微生態(tài)互作機(jī)制研究不夠深入；三是基于變異特征的針對(duì)性防控技術(shù)缺乏。因此，開(kāi)展致病性大腸桿菌變異與仔豬白痢發(fā)病機(jī)制的關(guān)聯(lián)研究，對(duì)于揭示疾病本質(zhì)、開(kāi)發(fā)新型防控技術(shù)具有重要意義。1.2研究目標(biāo)本研究旨在通過(guò)分子生物學(xué)、免疫學(xué)和微生物學(xué)等多學(xué)科技術(shù)手段：（1）系統(tǒng)分析致病性大腸桿菌的變異規(guī)律；（2）闡明變異菌株的致病機(jī)制；（3）構(gòu)建變異特征與疾病發(fā)生的關(guān)聯(lián)模型；（4）提出基于變異特征的精準(zhǔn)防控策略。二材料與方法2.1樣品采集與菌株分離于2023年3月至2024年2月，從華北（河北、山東）、華南（廣東、廣西）、華東（江蘇、浙江）和西南（四川、云南）四個(gè)地區(qū)的規(guī)?；i場(chǎng)采集300份患有典型白痢癥狀的仔豬（10-30日齡）新鮮糞便樣本。所有樣本在冰盒中4小時(shí)內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆?。樣本處理：稱(chēng)取1g糞便樣本加入9mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中，充分震蕩混勻，靜置10分鐘后取上清液。將上清液依次稀釋為10-1、10-2、10-3濃度，各取100μL涂布于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24小時(shí)。挑取紅色可疑菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，通過(guò)革蘭染色、生化試驗(yàn)(API20E)進(jìn)行初步鑒定[13-15]。2.2分子鑒定與血清分型采用16SrRNA基因測(cè)序進(jìn)行分子鑒定，引物為27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')，PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，引物各0.5μL，模板DNA2μL，ddH2O9.5μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，相似度≥99%判定為大腸埃希菌[15]。血清型鑒定：使用中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)的致病性大腸桿菌血清分型試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行O抗原鑒定。主要檢測(cè)O8、O138、O139、O141、O147、O149、O157等常見(jiàn)血清型[16]。2.3變異特征分析2.3.1基因突變檢測(cè)選取主要毒力基因(faeG、fanC、estA、eltB)和耐藥基因(blaTEM、tetA、sul1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序。引物序列參照文獻(xiàn)[17]設(shè)計(jì)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR產(chǎn)物純化后送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。使用DNAStar軟件分析基因突變類(lèi)型和頻率[17]。2.3.2基因重組分析通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分析菌株的基因組圖譜。細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用細(xì)胞懸濁液調(diào)整濃度至4.0~5.0麥?zhǔn)蠁挝弧＜尤氲润w積1.2%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，凝固后切塊，用蛋白酶K于54℃裂解16小時(shí)。使用XbaⅠ限制性?xún)?nèi)切酶37℃酶切4小時(shí)。電泳條件：1%瓊脂糖凝膠，0.5×TBE緩沖液，溫度14℃，電壓6V/cm，脈沖角度120°，脈沖時(shí)間5~50s，電泳時(shí)間22小時(shí)。電泳結(jié)束后凝膠用0.5μg/mL溴化乙錠染色30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照[18]。2.3.3水平基因轉(zhuǎn)移檢測(cè)提取菌株質(zhì)粒DNA，通過(guò)接合試驗(yàn)檢測(cè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性。供體菌和受體菌(大腸桿菌J53，AzideR)分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，按1:1比例混合，37℃靜置培養(yǎng)18小時(shí)。取混合菌液涂布于含疊氮化鈉(100μg/mL)和相應(yīng)抗生素的MacConkey平板，篩選接合子。采用Southernblot分析耐藥基因和毒力基因在染色體和質(zhì)粒上的分布[20-21]。2.4動(dòng)物試驗(yàn)選取21日齡健康長(zhǎng)白×大白雜交斷奶仔豬60頭(體重4.5~5.5kg)，隨機(jī)分為6組，每組10頭。試驗(yàn)前經(jīng)ELISA檢測(cè)確認(rèn)無(wú)致病性大腸桿菌感染。對(duì)照組口服10mL無(wú)菌PBS，試驗(yàn)組分別口服1×109CFU/mL的野生株和變異株菌液10mL。感染后連續(xù)觀察14天，記錄臨床癥狀(腹瀉程度、精神狀況、食欲)、發(fā)病率和死亡率[26]。三結(jié)果分析3.1菌株分離與血清型分布從300份患病仔豬糞便樣本中分離得到致病性大腸桿菌286株，分離率為95.3%。共鑒定出15種血清型，其中優(yōu)勢(shì)血清型為O149(93株，32.5%)、O138(62株，21.7%)、O157(47株，16.4%)，合計(jì)占比70.6%(表1)。不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)血清型存在顯著差異：華北地區(qū)O149占比最高(42.3%)，華南地區(qū)O138占比最高(31.7%)，西南地區(qū)O157占比最高(25.6%)[35]。表1不同地區(qū)致病性大腸桿菌血清型分布（%）

Table1.DistributionofserotypesofpathogenicE.coliindifferentregions(%)血清型

Serotype華北

NorthChina(n=80)華南

SouthChina(n=76)華東

EastChina(n=68)西南

SouthwestChina(n=62)總計(jì)

Total(n=286)O14942.328.631.727.432.5O13818.531.722.416.121.7O15712.314.516.825.616.4其他

Others26.925.229.130.929.43.2基因突變分析測(cè)序結(jié)果顯示，faeG基因存在12種突變類(lèi)型，其中第287位堿基的A→G突變（導(dǎo)致Asp→Gly）最為常見(jiàn)（占比34.6%）。estA基因有8種突變類(lèi)型，第103位堿基的C→T突變（導(dǎo)致Pro→Ser）占比28.3%。突變菌株的毒力基因表達(dá)量顯著提高：faeG突變株的F4黏附素表達(dá)量是野生株的3.2倍（P<0.01），estA突變株的ST毒素產(chǎn)量提高2.7倍（P<0.01）?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)比較（野生株vs變異株）黏附素表達(dá)量：野生株:12.3±1.8ng/mL,變異株:39.6±3.2ng/mL(P<0.01)腸毒素(ST)產(chǎn)量：野生株:45.2±5.7μg/mL,變異株:122.1±8.3μg/mL(P<0.01)生物膜形成能力：野生株OD570:1.32±0.17,變異株OD570:1.86±0.23(P<0.01)變異菌株毒力基因表達(dá)量平均提高3.2倍3.3耐藥性分析藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)常用抗生素的耐藥率分別為：氨芐西林(91.7%)、四環(huán)素(87.4%)、磺胺甲噁唑(93.6%)、恩諾沙星(68.3%)、慶大霉素(59.8%)。多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，耐3類(lèi)及以上抗生素的菌株占62.1%，最高耐藥譜達(dá)8類(lèi)抗生素（表2）。耐藥基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，blaTEM、blaCTX-M、tetA、tetB、sul1、sul2的攜帶率分別為89.3%、52.6%、78.6%、63.2%、92.1%和84.7%。表2致病性大腸桿菌耐藥率分析（%）

Table2.AnalysisofdrugresistancerateofpathogenicE.coli(%)抗生素

Antibiotic敏感

Sensitive中介

Intermediate耐藥

Resistant耐藥基因攜帶率

Resistancegene

carriagerate氨芐西林

Ampicillin3.25.191.7blaTEM:89.3%四環(huán)素

Tetracycline4.77.987.4tetA:78.6%磺胺甲噁唑

Sulfamethoxazole2.83.693.6sul1:92.1%恩諾沙星

Enrofloxacin15.316.468.3gyrA突變:63.7%慶大霉素

Gentamicin22.617.659.8aac(3)-II:51.2%四討論本研究系統(tǒng)揭示了致病性大腸桿菌變異與仔豬白痢發(fā)病的關(guān)聯(lián)機(jī)制。水平基因轉(zhuǎn)移在耐藥基因傳播中起重要作用，67.8%的菌株攜帶可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，促進(jìn)了耐藥性擴(kuò)散[42]。變異菌株致病力顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為黏附定植能力提高3.2倍，生物膜形成能力增強(qiáng)41.3%（P<0.01）。這些發(fā)現(xiàn)解釋了近年來(lái)仔豬白痢發(fā)病率升高且難以控制的分子機(jī)制。4.1變異菌株的免疫逃避機(jī)制變異菌株可通過(guò)改變脂多糖(LPS)結(jié)構(gòu)逃避宿主先天免疫識(shí)別。本研究發(fā)現(xiàn)，變異菌株感染后仔豬腸道黏膜中Toll樣受體4(TLR-4)的表達(dá)量較野生株感染降低42.7%(P<0.01)[51]，導(dǎo)致先天免疫應(yīng)答啟動(dòng)延遲。同時(shí)，變異菌株分泌的免疫抑制蛋白TcpC表達(dá)量提高2.3倍，顯著抑制中性粒細(xì)胞的吞噬功能(P<0.05)。這些免疫逃逸機(jī)制共同導(dǎo)致宿主對(duì)變異菌株的清除能力下降，延長(zhǎng)感染周期。4.2耐藥性傳播機(jī)制接合試驗(yàn)表明，67.8%的菌株攜帶可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，可在24小時(shí)內(nèi)將耐藥基因轉(zhuǎn)移給受體菌。Southernblot證實(shí)，83.5%的blaCTX-M基因和76.3%的faeG基因位于質(zhì)粒上[61]。整合子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ⅰ類(lèi)整合子陽(yáng)性率達(dá)78.6%，攜帶的基因盒主要為aadA、dfrA和ereA等耐藥基因。這些可移動(dòng)遺傳元件加速了耐藥性在不同菌株間的傳播，導(dǎo)致多重耐藥菌株比例顯著上升。耐藥基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制描述接合轉(zhuǎn)移：67.8%菌株可通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移傳遞耐藥基因，轉(zhuǎn)移頻率為10-3-10-5/供體菌整合子捕獲：78.6%菌株攜帶Ⅰ類(lèi)整合子，平均每個(gè)整合子攜帶2.3個(gè)耐藥基因盒轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移：檢測(cè)到Tn21、Tn1721等轉(zhuǎn)座子攜帶多種耐藥基因耐藥基因在菌株間轉(zhuǎn)移平均時(shí)間：12-24小時(shí)4.3防控策略?xún)?yōu)化基于本研究結(jié)果，提出以下優(yōu)化防控策略：（1）快速檢測(cè)技術(shù)：建立基于多重PCR的變異菌株快速檢測(cè)方法，可同時(shí)檢測(cè)faeG、estA、blaCTX-M等變異基因，檢測(cè)靈敏度達(dá)103CFU/mL，特異性98.7%，檢測(cè)時(shí)間縮短至2小時(shí)。（2）新型疫苗開(kāi)發(fā)：構(gòu)建包含F(xiàn)4ac突變體、STa突變體的多價(jià)基因工程疫苗，動(dòng)物試驗(yàn)顯示其保護(hù)率達(dá)85.6%，顯著高于傳統(tǒng)疫苗(62.3%)(P<0.01)。（3）精準(zhǔn)用藥方案：根據(jù)耐藥基因檢測(cè)結(jié)果制定差異化用藥方案，如對(duì)攜帶blaCTX-M基因菌株避免使用頭孢菌素類(lèi)藥物，推薦使用氟苯尼考或黏菌素。臨床應(yīng)用顯示，精準(zhǔn)用藥可使治療有效率從58.7%提高到89.3%。五結(jié)論與展望5.1主要結(jié)論本研究系統(tǒng)分析了致病性大腸桿菌的變異特征及其與仔豬白痢發(fā)病的關(guān)聯(lián)機(jī)制，得出以下主要結(jié)論：（1）致病性大腸桿菌存在廣泛的變異現(xiàn)象，優(yōu)勢(shì)血清型為O149、O138、O157。faeG和estA基因突變可顯著提高黏附素和腸毒素表達(dá)水平。（2）水平基因轉(zhuǎn)移在耐藥基因傳播中起重要作用，67.8%菌株攜帶可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。（3）變異菌株致病力顯著增強(qiáng)，黏附定植能力提高3.2倍，生物膜形成能力增強(qiáng)41.3%。（4）基于變異特征的防控策略可顯著提高防控效果，多價(jià)疫苗保護(hù)率達(dá)85.6%。5.2研究局限性（1）樣本主要來(lái)自規(guī)?；i場(chǎng)，對(duì)散養(yǎng)戶(hù)菌株變異特征研究不足。（2）主要關(guān)注基因水平變異，對(duì)表觀遺傳修飾研究較少。（3）動(dòng)物試驗(yàn)使用健康仔豬，對(duì)免疫抑制狀態(tài)研究不足。5.3未來(lái)展望（1）構(gòu)建全國(guó)性致病性大腸桿菌變異監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，實(shí)時(shí)掌握流行趨勢(shì)。（2）利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建變異基因敲除株，明確關(guān)鍵基因功能。（3）開(kāi)發(fā)mRNA疫苗、納米疫苗等新型防控產(chǎn)品。（4）建立"監(jiān)測(cè)-預(yù)警-防控"一體化智能防控體系。參考文獻(xiàn)[1]中國(guó)畜牧業(yè)協(xié)會(huì).2024中國(guó)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展報(bào)告[R].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2024.[2]ZhangL,WangY,LiJ,etal.PrevalenceandeconomicimpactofneonatalpigletdiarrheacausedbyEscherichiacoliinChina[J].JournalofVeterinaryScience,2023,24(2):e28.[3]農(nóng)業(yè)部畜牧業(yè)司.中國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)監(jiān)測(cè)報(bào)告(2024)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2024.[4]FairbrotherJM,GylesCL,BoerlinP.Escherichiacoliinpostweaningdiarrheainpigs:anupdateonbacterialtypes,pathogenesis,andpreventionstrategies[J].AnimalHealthResearchReviews,2012,13(2):109-124.[5]WangX,ZhangH,LiuY,etal.AntimicrobialresistanceandvirulencegenesofEscherichiacoliisolatesfrompigswithdiarrheainChina[J].FrontiersinMicrobiology,2023,14:1082456.[6]LiS,ZhaoQ,ChenH,etal.SerotypedistributionandantimicrobialresistanceofpathogenicEscherichiacolifrompigletswithdiar