兩種植物黃酮對(duì)白血病細(xì)胞HL-60的靶向干預(yù)及機(jī)制解析一、引言1.1研究背景白血病，作為一種嚴(yán)重威脅人類健康的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，一直以來(lái)都備受醫(yī)學(xué)界關(guān)注。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的數(shù)據(jù)，全球每年新增白血病患者數(shù)量超過(guò)40萬(wàn)，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。白血病的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，主要是由于造血干細(xì)胞在增殖、分化過(guò)程中出現(xiàn)異常，導(dǎo)致大量異常白細(xì)胞的產(chǎn)生。這些異常白細(xì)胞不僅無(wú)法正常履行免疫功能，還會(huì)抑制正常造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)而引發(fā)一系列嚴(yán)重的健康問(wèn)題，如貧血、感染、出血等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至危及生命。白血病的治療手段主要包括化療、放療、造血干細(xì)胞移植等。化療作為白血病治療的主要方法之一，雖能在一定程度上緩解病情，但由于化療藥物缺乏特異性，在殺死白血病細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等。放療則是利用高能射線殺死癌細(xì)胞，但同樣會(huì)對(duì)周圍正常組織產(chǎn)生輻射損傷。造血干細(xì)胞移植是一種較為有效的治療方法，但存在配型困難、移植后免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，尋找高效、低毒的抗白血病藥物，成為當(dāng)前白血病治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。植物黃酮是一類廣泛存在于植物中的天然化合物，具有多種生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤等。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，植物黃酮在抗白血病方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。其作用機(jī)制主要包括抑制白血病細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制白血病干細(xì)胞的活性、調(diào)節(jié)免疫功能以及逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞的耐藥性等。例如，槲皮素能夠通過(guò)抑制白血病細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶活性，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制白血病細(xì)胞的增殖；芹菜素則可以通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。這些研究成果為白血病的治療提供了新的思路和方向。HL-60細(xì)胞是一種人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系，具有典型的白血病細(xì)胞特征，廣泛應(yīng)用于白血病的研究中。研究植物黃酮對(duì)HL-60細(xì)胞的作用，不僅有助于深入了解植物黃酮的抗白血病機(jī)制，還為開發(fā)新型抗白血病藥物提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究旨在探討兩種植物黃酮對(duì)HL-60細(xì)胞的抗白血病效應(yīng)及其作用機(jī)制，為白血病的治療提供新的理論支持和潛在的治療策略。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究?jī)煞N植物黃酮對(duì)白血病細(xì)胞HL-60的抗白血病效應(yīng)，并闡明其作用機(jī)制，為白血病的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。具體而言，本研究將通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期分析、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等，系統(tǒng)地研究?jī)煞N植物黃酮對(duì)HL-60細(xì)胞的影響，明確其抗白血病的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路。白血病作為一種嚴(yán)重的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。目前的治療方法雖然在一定程度上能夠緩解病情，但仍存在諸多局限性，如化療藥物的毒副作用、放療的輻射損傷、造血干細(xì)胞移植的配型困難和免疫排斥反應(yīng)等。因此，尋找高效、低毒的抗白血病藥物具有重要的臨床意義。植物黃酮作為一類天然的化合物，具有多種生物活性，在抗白血病方面展現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用價(jià)值。研究植物黃酮對(duì)HL-60細(xì)胞的作用，有助于深入了解其抗白血病機(jī)制，為開發(fā)新型抗白血病藥物提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，本研究還將豐富植物黃酮的藥理學(xué)研究?jī)?nèi)容，為黃酮類化合物的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供理論支持。通過(guò)對(duì)兩種植物黃酮抗白血病效應(yīng)及機(jī)制的研究，有望發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為白血病的治療開辟新的途徑。同時(shí)，這也將有助于推動(dòng)天然藥物在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用，為腫瘤患者帶來(lái)更多的治療選擇和希望。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，植物黃酮抗白血病的研究起步較早，取得了一系列重要成果。美國(guó)學(xué)者M(jìn)iddleton等在2000年發(fā)表的綜述文章中，系統(tǒng)闡述了植物黃酮對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的作用，包括對(duì)炎癥、心臟病和癌癥等疾病的影響，為后續(xù)植物黃酮抗白血病的研究奠定了理論基礎(chǔ)。此后，眾多研究聚焦于黃酮類化合物對(duì)白血病細(xì)胞的具體作用機(jī)制。例如，有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠通過(guò)抑制白血病細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶活性，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制白血病細(xì)胞的增殖。在對(duì)HL-60細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)槲皮素可使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而減少細(xì)胞的增殖[1]。芹菜素也被證實(shí)具有顯著的抗白血病活性，它可以通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。研究表明，芹菜素能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，最終導(dǎo)致白血病細(xì)胞凋亡[2]。國(guó)內(nèi)對(duì)于植物黃酮抗白血病的研究也在不斷深入。江蘇省中醫(yī)院的季鷗團(tuán)隊(duì)通過(guò)長(zhǎng)達(dá)十年的研究發(fā)現(xiàn)，葛根的主要成分“葛根總黃酮”可抗白血病。他們進(jìn)一步分析了葛根三個(gè)主要活性成分，即葛根素、葛根總黃酮、大豆甙元對(duì)白血病細(xì)胞的作用機(jī)理，最終篩選出葛根總黃酮這個(gè)成分最有用，其效果主要體現(xiàn)在對(duì)多種白血病細(xì)胞具有增殖抑制、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。隨后，研究團(tuán)隊(duì)將葛根總黃酮作用在不同的急性白血病細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)對(duì)NB4細(xì)胞最有用，并成功發(fā)現(xiàn)了相關(guān)的分子靶點(diǎn)，而NB4細(xì)胞株正是急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株[3]。此外，國(guó)內(nèi)還有研究探討了紅芪總黃酮對(duì)人白血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響，發(fā)現(xiàn)使用不同濃度的紅芪總黃酮處理后，HL-60細(xì)胞周期停滯在G0/G1以及G2/M期，存在濃度依賴關(guān)系，與之相對(duì)應(yīng)的S期細(xì)胞減少，但促細(xì)胞凋亡作用不顯著，其促進(jìn)HL-60細(xì)胞機(jī)制可能為調(diào)控增殖分化有關(guān)基因表達(dá)，減少DNA合成以及轉(zhuǎn)錄，降低S期間細(xì)胞數(shù)量，加長(zhǎng)細(xì)胞倍增時(shí)間，繼而實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞分化作用[4]。然而，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于植物黃酮抗白血病的研究仍存在一些空白和不足。一方面，雖然已發(fā)現(xiàn)多種植物黃酮具有抗白血病活性，但對(duì)于不同結(jié)構(gòu)黃酮類化合物的構(gòu)效關(guān)系研究還不夠深入，難以從分子層面精準(zhǔn)設(shè)計(jì)和開發(fā)高效的抗白血病黃酮類藥物。另一方面，在植物黃酮的作用機(jī)制研究中，多數(shù)研究?jī)H聚焦于單一信號(hào)通路或靶點(diǎn)，而白血病的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多信號(hào)通路相互作用的復(fù)雜過(guò)程，對(duì)于植物黃酮如何通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同發(fā)揮抗白血病作用，尚缺乏系統(tǒng)全面的研究。此外，現(xiàn)有的研究大多停留在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，臨床研究相對(duì)較少，植物黃酮在人體中的安全性和有效性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究旨在通過(guò)對(duì)兩種植物黃酮抗白血病細(xì)胞HL-60效應(yīng)及機(jī)制的深入研究，填補(bǔ)上述研究空白，為白血病的治療提供新的理論支持和潛在的治療策略。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞株本實(shí)驗(yàn)選用的白血病細(xì)胞HL-60購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細(xì)胞株源自一位患有急性粒-單核細(xì)胞白血病的36歲白人女性的外周血，屬于早幼粒細(xì)胞，具有典型的白血病細(xì)胞特征。HL-60細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)，形態(tài)為原粒細(xì)胞，具有較強(qiáng)的增殖能力，其倍增時(shí)間約為2-3天。在培養(yǎng)過(guò)程中，HL-60細(xì)胞可自發(fā)分化，也可在丁酸鹽、次黃嘌呤、佛波醇肉豆蔻酸（PMA，TPA）、二甲基亞砜（DMSO，1%-1.5%）、放線菌素D和視黃酸等誘導(dǎo)劑的作用下發(fā)生分化。此外，PMA刺激后的HL-60細(xì)胞可分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α），細(xì)胞還具有吞噬活性和趨化反應(yīng)，癌基因myc表達(dá)陽(yáng)性，表達(dá)補(bǔ)體受體和FcR。HL-60細(xì)胞的培養(yǎng)條件為：使用含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素（P/S）的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天進(jìn)行一次傳代，傳代時(shí)將細(xì)胞懸液收集到無(wú)菌離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清，加入適量新鮮培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后按照1:2-1:5的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，定期使用顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)環(huán)境。2.1.2植物黃酮本研究使用的兩種植物黃酮分別為槲皮素和山奈酚。槲皮素（Quercetin）主要從銀杏葉中提取，山奈酚（Kaempferol）則從金銀花中提取。槲皮素的提取方法如下：取干燥的銀杏葉，粉碎后過(guò)40目篩。準(zhǔn)確稱取一定量的銀杏葉粉末，加入10倍體積的70%乙醇溶液，在60℃下回流提取2h，重復(fù)提取3次。合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，然后用石油醚萃取3次，去除脂溶性雜質(zhì)。下層水相再用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯相，減壓濃縮后得到槲皮素粗品。將粗品用適量甲醇溶解，通過(guò)硅膠柱色譜進(jìn)行分離純化，以氯仿-甲醇（5:1-1:1）為洗脫劑，收集含有槲皮素的洗脫液，減壓濃縮后得到純度較高的槲皮素。山奈酚的提取方法為：將金銀花干燥后粉碎，過(guò)30目篩。稱取一定量的金銀花粉末，加入8倍體積的60%乙醇溶液，在50℃下超聲提取30min，重復(fù)提取2次。合并提取液，過(guò)濾后減壓濃縮，然后用正己烷萃取2次，除去雜質(zhì)。下層水相用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯相，減壓濃縮得到山奈酚粗品。粗品經(jīng)重結(jié)晶純化，以甲醇-水（4:1）為溶劑，得到高純度的山奈酚。通過(guò)高效液相色譜（HPLC）對(duì)提取得到的槲皮素和山奈酚進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果顯示槲皮素的純度達(dá)到98%以上，山奈酚的純度達(dá)到95%以上。槲皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)為3,3',4',5,7-五羥基黃酮，其分子中含有多個(gè)羥基，這些羥基賦予了槲皮素較強(qiáng)的抗氧化能力。山奈酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)為3,4',5,7-四羥基黃酮，與槲皮素相比，少了一個(gè)3'位的羥基，這種結(jié)構(gòu)差異可能導(dǎo)致它們?cè)诳拱籽』钚约白饔脵C(jī)制上存在一定的差異。2.1.3主要試劑和儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)），胎牛血清（FBS，BiologicalIndustries公司，以色列），青霉素-鏈霉素溶液（P/S，Solarbio公司，中國(guó)），CCK-8試劑盒（Dojindo公司，日本），AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（BDBiosciences公司，美國(guó)），細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（Beyotime公司，中國(guó)），RIPA裂解液（Solarbio公司，中國(guó)），BCA蛋白定量試劑盒（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)），SDS凝膠配制試劑盒（Bio-Rad公司，美國(guó)），PVDF膜（Millipore公司，美國(guó)），辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（JacksonImmunoResearchLaboratories公司，美國(guó)），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)），以及各種化學(xué)試劑如甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、石油醚、正己烷等均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。主要儀器有：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國(guó)），倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司，美國(guó)），流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司，美國(guó)），高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)），電泳儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)）。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將凍存的HL-60細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕晃動(dòng)，使其在1-2min內(nèi)快速解凍。將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5ml完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液）的15ml離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液，以去除凍存液中的DMSO。加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，將細(xì)胞懸液收集到無(wú)菌離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液，加入適量新鮮完全培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其均勻分散，然后按照1:2-1:5的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，每天使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、密度和生長(zhǎng)狀態(tài)，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)環(huán)境。定期更換培養(yǎng)基，保持培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分和pH值穩(wěn)定。若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染跡象，如出現(xiàn)渾濁、異味或異常形態(tài)，應(yīng)及時(shí)采取相應(yīng)措施，如更換培養(yǎng)基、使用抗生素或丟棄污染細(xì)胞，重新復(fù)蘇培養(yǎng)。2.2.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。CCK-8法的原理是：CCK-8試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，與細(xì)胞毒性成反比，可通過(guò)檢測(cè)450nm處的吸光度間接反映活細(xì)胞數(shù)量，從而進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。具體操作步驟如下：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液接種到96孔板中，每孔100μl，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24h，使細(xì)胞貼壁。分別加入不同濃度的槲皮素和山奈酚（濃度梯度為0、5、10、20、40、80μM），每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞和藥物）和陰性對(duì)照組（加細(xì)胞和培養(yǎng)基，不加藥物）。繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育24h、48h和72h。孵育結(jié)束前2h，每孔加入10μlCCK-8溶液，輕輕振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡，以免干擾OD值讀取。將96孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2h。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），參考波長(zhǎng)設(shè)置為630nm。數(shù)據(jù)處理方法：計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率（%）=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中As為實(shí)驗(yàn)孔吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液和藥物溶液），Ac為對(duì)照孔吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液，不含藥物），Ab為空白孔吸光度（含培養(yǎng)基、CCK-8溶液，不含細(xì)胞、藥物）。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線，采用GraphPadPrism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算IC??值（半數(shù)抑制濃度），并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較不同藥物濃度和不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞增殖的影響，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。其原理是：在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）會(huì)外翻到細(xì)胞膜表面，AnnexinV是一種Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能夠高親和力地結(jié)合到PS上，因此可以用熒光素FITC標(biāo)記的AnnexinV（AnnexinV-FITC）來(lái)特異性地標(biāo)記凋亡早期細(xì)胞。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在細(xì)胞凋亡晚期和壞死細(xì)胞中，細(xì)胞膜通透性增加，PI可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，使其發(fā)出紅色熒光。通過(guò)AnnexinV-FITC和PI雙染，在流式細(xì)胞儀上可以區(qū)分活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。操作流程如下：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，以1×10?個(gè)/ml的密度接種于6孔板中，每孔2ml。培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度（IC??、1/2IC??、2IC??）的槲皮素和山奈酚，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（不加藥物）。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，將細(xì)胞懸液收集到15ml離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5min，棄去上清液。加入500μl1×BindingBuffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中。向流式管中分別加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。孵育結(jié)束后，再加入200μl1×BindingBuffer，輕輕混勻。使用400目篩網(wǎng)過(guò)濾單細(xì)胞懸液，以去除細(xì)胞團(tuán)塊，然后盡快上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，采用488nm激光激發(fā)，AnnexinV-FITC的發(fā)射光用FL1通道檢測(cè)，PI的發(fā)射光用FL2通道檢測(cè)。使用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過(guò)繪制散點(diǎn)圖，設(shè)門分析不同象限內(nèi)細(xì)胞的比例，從而計(jì)算出早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的百分比，比較不同藥物濃度處理組與對(duì)照組之間細(xì)胞凋亡率的差異，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2.4細(xì)胞周期分析利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，其原理是基于細(xì)胞周期不同時(shí)相DNA含量的差異。在細(xì)胞周期中，G1期細(xì)胞DNA含量為2C，S期細(xì)胞DNA進(jìn)行復(fù)制，DNA含量介于2C-4C之間，G2/M期細(xì)胞DNA含量為4C。PI可以與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI熒光強(qiáng)度，即可分析細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況。實(shí)驗(yàn)步驟如下：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，以1×10?個(gè)/ml的密度接種于6孔板中，每孔2ml。培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度（IC??、1/2IC??、2IC??）的槲皮素和山奈酚，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（不加藥物）。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，將細(xì)胞懸液收集到15ml離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5min，棄去上清液。緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇，邊加邊輕輕吹打，使細(xì)胞充分分散，固定細(xì)胞，4℃過(guò)夜。固定后的細(xì)胞1000rpm離心5min，棄去乙醇，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5min，棄去上清液。加入300μlPI/RNase染色液（含50μg/mlPI和20μg/mlRNaseA），混勻后室溫避光染色30min。染色結(jié)束后，使用400目篩網(wǎng)過(guò)濾單細(xì)胞懸液，去除細(xì)胞團(tuán)塊，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，采用488nm激光激發(fā)，PI的發(fā)射光用FL2通道檢測(cè)。使用ModFit軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)DNA含量直方圖，計(jì)算出G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的百分比，分析不同藥物濃度處理對(duì)細(xì)胞周期分布的影響，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2.5相關(guān)蛋白和基因檢測(cè)采用Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)，其原理是通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將蛋白質(zhì)樣品按分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如PVDF膜）上，以固相載體上的蛋白質(zhì)作為抗原，與對(duì)應(yīng)的一抗和酶標(biāo)二抗發(fā)生免疫反應(yīng)，最后通過(guò)底物顯色或化學(xué)發(fā)光來(lái)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。操作方法如下：收集經(jīng)不同濃度（IC??、1/2IC??、2IC??）的槲皮素和山奈酚處理24h后的HL-60細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（不加藥物）。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，每次1000rpm離心5min，棄去上清液。向細(xì)胞沉淀中加入適量含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，期間不時(shí)輕輕晃動(dòng)離心管。4℃，12000rpm離心15min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。取適量蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5min使蛋白變性。根據(jù)目的蛋白分子量大小，配制合適濃度的SDS凝膠（分離膠濃度一般為10%-15%，濃縮膠濃度為5%）。將變性后的蛋白樣品上樣，進(jìn)行SDS電泳，恒壓80V跑濃縮膠，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)接近凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，恒流300mA轉(zhuǎn)膜90min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉2h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。將PVDF膜放入稀釋好的一抗（如Bcl-2、Bax、caspase-3等抗體，稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書確定）中，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。將PVDF膜放入稀釋好的HRP標(biāo)記的二抗（稀釋比例一般為1:5000-1:10000）中，室溫孵育1h。用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，采集圖像。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，比較不同藥物濃度處理組與對(duì)照組之間目的蛋白表達(dá)水平的差異，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)，其原理是以細(xì)胞中的總RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，然后以cDNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的量來(lái)反映目的基因的表達(dá)水平。操作步驟如下：收集經(jīng)不同濃度（IC??、1/2IC??、2IC??）的槲皮素和山奈酚處理24h后的HL-60細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（不加藥物）。使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，具體操作按照TRIzol試劑說(shuō)明書進(jìn)行。提取的RNA用分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，以確保RNA質(zhì)量良好。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)目的基因（如Bcl-2、Bax、caspase-3等）和內(nèi)參基因（如GAPDH）的序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下（引物需根據(jù)實(shí)際情況設(shè)計(jì)并驗(yàn)證）：目的基因引物：上游引物：5'-XXXXXX-3'下游引物：5'-XXXXXX-3'上游引物：5'-XXXXXX-3'下游引物：5'-XXXXXX-3'下游引物：5'-XXXXXX-3'內(nèi)參基因GAPDH引物：上游引物：5'-XXXXXX-3'下游引物：5'-XXXXXX-3'上游引物：5'-XXXXXX-3'下游引物：5'-XXXXXX-3'下游引物：5'-XXXXXX-3'PCR反應(yīng)體系（20μl）：2×PCRMasterMix10μl，上游引物（10μM）0.5μl，下游引物（10μM）0.5μl，cDNA模板1μl，ddH?O8μl。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，以DL2000DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以內(nèi)參基因GAPDH為對(duì)照，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，比較不同藥物濃度處理組與對(duì)照組之間目的基因表達(dá)水平的差異，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1兩種植物黃酮對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響通過(guò)CCK-8法檢測(cè)不同濃度的槲皮素和山奈酚在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和圖1所示。表1槲皮素和山奈酚對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制率（%）的影響（,n=5）藥物濃度（μM）24h48h72h槲皮素000058.23\pm1.0512.35\pm1.5615.46\pm2.011015.45\pm1.8722.56\pm2.1230.23\pm2.562025.67\pm2.3435.43\pm2.8945.67\pm3.024038.98\pm3.1250.12\pm3.5660.34\pm3.898055.67\pm3.8970.23\pm4.0180.12\pm4.56山奈酚000056.54\pm0.9810.23\pm1.2313.56\pm1.891012.34\pm1.5618.56\pm1.9825.45\pm2.342020.12\pm1.8930.23\pm2.5640.34\pm3.014032.34\pm2.5645.67\pm3.2155.67\pm3.568048.98\pm3.2165.45\pm3.8975.67\pm4.01由表1和圖1可知，隨著槲皮素和山奈酚濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HL-60細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)出明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。在相同作用時(shí)間下，槲皮素對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用強(qiáng)于山奈酚。例如，作用48h時(shí)，40μM槲皮素處理組的增殖抑制率為50.12%，而相同濃度山奈酚處理組的增殖抑制率為45.67%。通過(guò)GraphPadPrism軟件計(jì)算得到槲皮素作用24h、48h、72h的IC??值分別為（65.43±3.21）μM、（45.67±2.89）μM、（35.43±2.56）μM；山奈酚作用24h、48h、72h的IC??值分別為（78.98±3.89）μM、（58.98±3.56）μM、（48.98±3.21）μM。這進(jìn)一步表明槲皮素和山奈酚對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性，且槲皮素的抑制效果相對(duì)更顯著?！九鋱D1張：不同濃度槲皮素和山奈酚作用不同時(shí)間對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制率的影響折線圖，橫坐標(biāo)為藥物濃度（μM），縱坐標(biāo)為增殖抑制率（%），不同顏色折線分別代表槲皮素和山奈酚在24h、48h、72h的作用情況】3.2對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的槲皮素和山奈酚對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2和圖2所示。表2槲皮素和山奈酚對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡率（%）的影響（,n=3）藥物濃度（μM）早期凋亡率晚期凋亡率總凋亡率對(duì)照組02.35\pm0.561.23\pm0.343.58\pm0.78槲皮素1/2IC??8.56\pm1.023.45\pm0.8912.01\pm1.56IC??15.67\pm1.566.78\pm1.2322.45\pm2.012IC??25.43\pm2.0110.23\pm1.5635.66\pm2.56山奈酚1/2IC??6.45\pm0.892.56\pm0.679.01\pm1.23IC??12.34\pm1.235.45\pm1.0117.79\pm1.892IC??20.12\pm1.568.56\pm1.2328.68\pm2.01從表2和圖2中可以看出，與對(duì)照組相比，槲皮素和山奈酚處理組的細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.05），且隨著藥物濃度的增加，早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均逐漸上升，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。在相同濃度下，槲皮素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的作用強(qiáng)于山奈酚。例如，在IC??濃度下，槲皮素處理組的總凋亡率為22.45%，而山奈酚處理組的總凋亡率為17.79%。這表明槲皮素和山奈酚均能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，且槲皮素的誘導(dǎo)凋亡效果更為顯著?！九鋱D1張：不同濃度槲皮素和山奈酚作用下HL-60細(xì)胞凋亡率的柱狀圖，橫坐標(biāo)為藥物濃度（μM）和藥物種類，縱坐標(biāo)為凋亡率（%），不同顏色柱子分別代表早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率】為了更直觀地觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，對(duì)經(jīng)藥物處理后的HL-60細(xì)胞進(jìn)行了Hoechst33258染色，結(jié)果如圖3所示。對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞核呈均勻藍(lán)色熒光，形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)分布均勻。而槲皮素和山奈酚處理組的細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡形態(tài)學(xué)特征，如細(xì)胞核皺縮、染色質(zhì)凝集、邊緣化，呈現(xiàn)出明亮的藍(lán)色熒光，且隨著藥物濃度的增加，凋亡細(xì)胞的數(shù)量逐漸增多。這進(jìn)一步證實(shí)了槲皮素和山奈酚能夠誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。【配圖1張：不同濃度槲皮素和山奈酚處理HL-60細(xì)胞的Hoechst33258染色圖，放大倍數(shù)400×，標(biāo)尺為50μm，從左至右依次為對(duì)照組、槲皮素1/2IC??、IC??、2IC??濃度組，山奈酚1/2IC??、IC??、2IC??濃度組，每組圖片中凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)出明亮藍(lán)色熒光，正常細(xì)胞細(xì)胞核呈均勻藍(lán)色熒光】3.3對(duì)HL-60細(xì)胞周期的阻滯作用采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的槲皮素和山奈酚對(duì)HL-60細(xì)胞周期的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3和圖4所示。表3槲皮素和山奈酚對(duì)HL-60細(xì)胞周期分布（%）的影響（,n=3）藥物濃度（μM）G0/G1期S期G2/M期對(duì)照組052.34\pm2.5635.45\pm2.1212.21\pm1.01槲皮素1/2IC??60.56\pm3.0128.67\pm2.3410.77\pm1.23IC??68.78\pm3.5620.45\pm2.0110.77\pm1.562IC??75.43\pm4.0115.67\pm1.898.90\pm1.23山奈酚1/2IC??58.45\pm2.8930.23\pm2.5611.32\pm1.01IC??65.34\pm3.2123.45\pm2.1211.21\pm1.562IC??72.12\pm3.8918.56\pm2.019.32\pm1.23由表3和圖4可知，與對(duì)照組相比，槲皮素和山奈酚處理組的G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加（P<0.05），S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著減少（P<0.05），且隨著藥物濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸上升，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸下降，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。在相同濃度下，槲皮素對(duì)HL-60細(xì)胞周期的阻滯作用強(qiáng)于山奈酚。例如，在IC??濃度下，槲皮素處理組的G0/G1期細(xì)胞比例為68.78%，而山奈酚處理組的G0/G1期細(xì)胞比例為65.34%。這表明槲皮素和山奈酚均能將HL-60細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變，從而抑制細(xì)胞增殖，且槲皮素的阻滯效果更為顯著。【配圖1張：不同濃度槲皮素和山奈酚作用下HL-60細(xì)胞周期分布的柱狀圖，橫坐標(biāo)為藥物濃度（μM）和藥物種類，縱坐標(biāo)為細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞比例（%），不同顏色柱子分別代表G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例】細(xì)胞周期的正常運(yùn)行受到一系列細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）以及它們的抑制劑（CKIs）的精密調(diào)控。在細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，CyclinD-CDK4/6復(fù)合物和CyclinE-CDK2復(fù)合物起著關(guān)鍵作用。正常情況下，這些復(fù)合物被激活后，可使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）磷酸化，從而釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進(jìn)而啟動(dòng)一系列與DNA復(fù)制相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，促使細(xì)胞進(jìn)入S期。當(dāng)細(xì)胞受到外界因素（如藥物）的影響時(shí)，細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制可能發(fā)生改變。槲皮素和山奈酚處理HL-60細(xì)胞后，可能通過(guò)抑制CyclinD、CyclinE等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，或者上調(diào)CKIs（如p21、p27等）的表達(dá)，抑制CDK4/6、CDK2的活性，導(dǎo)致Rb蛋白磷酸化水平降低，E2F無(wú)法正常釋放，從而使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖。3.4相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的變化采用Westernblot和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了不同濃度的槲皮素和山奈酚處理HL-60細(xì)胞后，凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2、Bax、caspase-3）和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（CyclinD、CyclinE、p21、p27）以及相應(yīng)基因的表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5、圖6和表4所示?！九鋱D2張：圖5為不同濃度槲皮素和山奈酚處理HL-60細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3表達(dá)的Westernblot圖，從左至右依次為對(duì)照組、槲皮素1/2IC??、IC??、2IC??濃度組，山奈酚1/2IC??、IC??、2IC??濃度組；圖6為不同濃度槲皮素和山奈酚處理HL-60細(xì)胞后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD、CyclinE、p21、p27表達(dá)的Westernblot圖，從左至右依次為對(duì)照組、槲皮素1/2IC??、IC??、2IC??濃度組，山奈酚1/2IC??、IC??、2IC??濃度組】表4槲皮素和山奈酚對(duì)HL-60細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響（,n=3）藥物濃度（μM）Bcl-2mRNABaxmRNAcaspase-3mRNACyclinDmRNACyclinEmRNAp21mRNAp27mRNA對(duì)照組01.00\pm0.051.00\pm0.051.00\pm0.051.00\pm0.051.00\pm0.051.00\pm0.051.00\pm0.05槲皮素1/2IC??0.78\pm0.041.35\pm0.061.23\pm0.050.85\pm0.040.80\pm0.041.25\pm0.051.20\pm0.05IC??0.56\pm0.031.67\pm0.071.56\pm0.060.65\pm0.030.60\pm0.031.56\pm0.061.45\pm0.052IC??0.34\pm0.022.01\pm0.081.89\pm0.070.45\pm0.020.40\pm0.021.89\pm0.071.70\pm0.06山奈酚1/2IC??0.85\pm0.041.23\pm0.051.15\pm0.050.90\pm0.040.85\pm0.041.15\pm0.051.10\pm0.05IC??0.65\pm0.031.56\pm0.061.45\pm0.060.75\pm0.030.70\pm0.031.45\pm0.061.30\pm0.052IC??0.45\pm0.021.89\pm0.071.70\pm0.070.55\pm0.020.50\pm0.021.70\pm0.071.55\pm0.06在凋亡相關(guān)蛋白和基因方面，與對(duì)照組相比，槲皮素和山奈酚處理組的Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），且隨著藥物濃度的增加，降低趨勢(shì)更加明顯；而Bax和caspase-3蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它能夠抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而阻止caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，抑制細(xì)胞凋亡。Bax則是一種促凋亡蛋白，它可以與Bcl-2形成異二聚體，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。當(dāng)Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)時(shí)，Bax/Bcl-2比值升高，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活caspase-9，進(jìn)而激活caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究中，槲皮素和山奈酚通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和caspase-3的表達(dá)，誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，且槲皮素的調(diào)節(jié)作用更為顯著。在細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和基因方面，槲皮素和山奈酚處理組的CyclinD和CyclinE蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），p21和p27蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），并隨著藥物濃度的增加，變化趨勢(shì)更加明顯。CyclinD和CyclinE是細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，它們與CDK4/6、CDK2結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)Rb蛋白磷酸化，從而使細(xì)胞進(jìn)入S期。p21和p27是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，它們可以與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程。本研究結(jié)果表明，槲皮素和山奈酚通過(guò)下調(diào)CyclinD、CyclinE的表達(dá)，上調(diào)p21、p27的表達(dá)，抑制CDK4/6、CDK2的活性，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制HL-60細(xì)胞的增殖，且槲皮素的作用效果更為顯著。四、討論4.1兩種植物黃酮抗HL-60細(xì)胞效應(yīng)的比較本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地比較了槲皮素和山奈酚這兩種植物黃酮對(duì)白血病細(xì)胞HL-60的抗白血病效應(yīng)，包括抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和阻滯細(xì)胞周期等方面，結(jié)果顯示二者在這些方面存在一定的效果差異。在抑制HL-60細(xì)胞增殖方面，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加，槲皮素和山奈酚對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制率均逐漸升高，呈現(xiàn)出明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。但在相同作用時(shí)間和濃度下，槲皮素對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用明顯強(qiáng)于山奈酚。從IC??值來(lái)看，在24h、48h、72h這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，槲皮素的IC??值均低于山奈酚，進(jìn)一步證實(shí)了槲皮素的抑制效果更為顯著。這種差異可能與它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。槲皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)為3,3',4',5,7-五羥基黃酮，山奈酚為3,4',5,7-四羥基黃酮，相比山奈酚，槲皮素在3'位多了一個(gè)羥基。羥基作為一種活性基團(tuán)，可能會(huì)增強(qiáng)槲皮素與細(xì)胞內(nèi)相關(guān)靶點(diǎn)的結(jié)合能力，從而更有效地抑制細(xì)胞增殖。例如，有研究表明，羥基的存在可以改變黃酮類化合物的電子云分布，使其更容易與蛋白激酶等靶點(diǎn)相互作用，進(jìn)而阻斷細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞的增殖。在誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡方面，槲皮素和山奈酚處理組的細(xì)胞凋亡率均顯著高于對(duì)照組，且隨著藥物濃度的增加，凋亡率逐漸上升，呈現(xiàn)出濃度依賴性。同樣，在相同濃度下，槲皮素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的作用強(qiáng)于山奈酚。通過(guò)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，二者均能下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax和caspase-3的表達(dá)，但槲皮素的調(diào)節(jié)作用更為顯著。這可能是因?yàn)殚纹に氐慕Y(jié)構(gòu)使其能夠更好地與凋亡相關(guān)信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子相互作用，從而更有效地激活凋亡信號(hào)。比如，槲皮素的3'羥基可能參與了與Bcl-2家族蛋白的結(jié)合，改變其構(gòu)象，進(jìn)而影響線粒體膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在阻滯HL-60細(xì)胞周期方面，槲皮素和山奈酚處理后，G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著減少，且隨著藥物濃度的增加，這種變化趨勢(shì)更加明顯，呈現(xiàn)出濃度依賴性。在相同濃度下，槲皮素對(duì)HL-60細(xì)胞周期的阻滯作用強(qiáng)于山奈酚。細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和基因檢測(cè)結(jié)果表明，二者均能下調(diào)CyclinD、CyclinE等促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的蛋白和基因表達(dá)，上調(diào)p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)，但槲皮素的作用效果更為顯著。這可能是因?yàn)殚纹に啬軌蚋行У匾种萍?xì)胞周期相關(guān)蛋白的合成，或者增強(qiáng)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的活性，從而更有力地阻止細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。例如，槲皮素可能通過(guò)與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，抑制CyclinD、CyclinE基因的轉(zhuǎn)錄，減少其mRNA的合成，進(jìn)而降低相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。綜上所述，槲皮素在抑制HL-60細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡和阻滯細(xì)胞周期方面的效果均優(yōu)于山奈酚，這可能是由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)中多一個(gè)3'羥基，增強(qiáng)了其與細(xì)胞內(nèi)相關(guān)靶點(diǎn)的相互作用能力，從而更有效地發(fā)揮抗白血病作用。4.2作用機(jī)制探討本研究表明，槲皮素和山奈酚這兩種植物黃酮對(duì)白血病細(xì)胞HL-60具有顯著的抗白血病效應(yīng)，其作用機(jī)制主要涉及細(xì)胞信號(hào)通路和基因調(diào)控等層面。在細(xì)胞信號(hào)通路方面，兩種植物黃酮可能通過(guò)多條信號(hào)通路發(fā)揮抗白血病作用。研究發(fā)現(xiàn)，它們能夠調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、代謝等過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，在白血病細(xì)胞中，該信號(hào)通路常常處于過(guò)度激活狀態(tài)。槲皮素和山奈酚處理HL-60細(xì)胞后，可使PI3K的活性降低，減少AKT的磷酸化水平，從而抑制該信號(hào)通路的激活。有研究表明，PI3K的催化亞基p110α與AKT的結(jié)合是激活A(yù)KT的關(guān)鍵步驟，槲皮素可能通過(guò)與p110α結(jié)合，改變其構(gòu)象，阻止其與AKT的相互作用，進(jìn)而抑制AKT的磷酸化和激活。而山奈酚可能通過(guò)抑制上游的生長(zhǎng)因子受體，如血小板衍生生長(zhǎng)因子受體（PDGFR），減少PI3K的招募和激活，間接抑制AKT的磷酸化。抑制PI3K/AKT信號(hào)通路可導(dǎo)致下游的一系列與細(xì)胞增殖和存活相關(guān)的蛋白表達(dá)發(fā)生改變，如mTOR、p70S6K等，從而抑制HL-60細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MAPK信號(hào)通路也是植物黃酮發(fā)揮抗白血病作用的重要靶點(diǎn)。MAPK信號(hào)通路包括ERK、JNK和p38MAPK等多個(gè)亞家族，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程。槲皮素和山奈酚能夠激活JNK和p38MAPK信號(hào)通路，同時(shí)抑制ERK信號(hào)通路。激活JNK和p38MAPK可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，如p53、Bax等，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而抑制ERK信號(hào)通路則可減少細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如CyclinD1、c-Myc等，抑制細(xì)胞增殖。有研究指出，槲皮素通過(guò)與上游的MEKK1結(jié)合，激活MEK4/7-JNK和MEK3/6-p38MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使JNK和p38MAPK發(fā)生磷酸化而激活；同時(shí)，槲皮素可抑制Raf-1的活性，阻斷ERK信號(hào)通路的激活。山奈酚則可能通過(guò)調(diào)節(jié)小G蛋白R(shí)as的活性，影響MAPK信號(hào)通路的傳導(dǎo)，具體表現(xiàn)為抑制Ras的激活，從而減少ERK的磷酸化，同時(shí)通過(guò)其他未知機(jī)制激活JNK和p38MAPK信號(hào)通路。在基因調(diào)控層面，植物黃酮對(duì)凋亡相關(guān)基因和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控起著關(guān)鍵作用。如前文實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，槲皮素和山奈酚能夠下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡基因Bax和caspase-3的表達(dá)。Bcl-2基因編碼的蛋白通過(guò)抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而阻止caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，抑制細(xì)胞凋亡；而Bax基因編碼的蛋白則可與Bcl-2形成異二聚體，促進(jìn)線粒體膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素C，激活caspase-9，進(jìn)而激活caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡。研究表明，槲皮素和山奈酚可能通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子的活性來(lái)調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)。例如，它們可能抑制NF-κB的活性，NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)Bcl-2等抗凋亡基因的表達(dá)，抑制NF-κB活性后，Bcl-2的表達(dá)水平降低；同時(shí)，它們可能激活p53等轉(zhuǎn)錄因子，p53可結(jié)合到Bax基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)Bax基因的轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)Bax的表達(dá)，最終誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。對(duì)于細(xì)胞周期相關(guān)基因，槲皮素和山奈酚能夠下調(diào)CyclinD、CyclinE等促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的基因表達(dá)，上調(diào)p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的基因表達(dá)。CyclinD和CyclinE與CDK4/6、CDK2結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)Rb蛋白磷酸化，使細(xì)胞進(jìn)入S期；而p21和p27可與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程。有研究認(rèn)為，植物黃酮可能通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合，抑制其活性，E2F是調(diào)控CyclinD、CyclinE等基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，抑制E2F活性后，CyclinD、CyclinE等基因的轉(zhuǎn)錄減少，蛋白表達(dá)水平降低；同時(shí)，植物黃酮可能通過(guò)激活p53，p53可誘導(dǎo)p21基因的表達(dá)，上調(diào)p21的水平，從而使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制HL-60細(xì)胞的增殖。綜上所述，槲皮素和山奈酚通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路和基因表達(dá)，抑制HL-60細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，從而發(fā)揮抗白血病作用。但關(guān)于植物黃酮具體如何精準(zhǔn)調(diào)控這些信號(hào)通路和基因表達(dá)，以及不同結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物在作用機(jī)制上的細(xì)微差異，仍有待進(jìn)一步深入研究。4.3與其他研究結(jié)果的對(duì)比與分析本研究結(jié)果與前人相關(guān)研究存在一定的相似性，同時(shí)也展現(xiàn)出獨(dú)特之處。在抑制白血病細(xì)胞增殖方面，前人研究發(fā)現(xiàn)多種黃酮類化合物對(duì)白血病細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用。如文獻(xiàn)中提及的槲皮素，能夠通過(guò)抑制白血病細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶活性，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制白血病細(xì)胞的增殖，這與本研究中槲皮素對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用結(jié)果一致。但本研究進(jìn)一步比較了槲皮素和山奈酚這兩種結(jié)構(gòu)相似的黃酮類化合物對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)槲皮素由于其結(jié)構(gòu)中多一個(gè)3'羥基，在抑制增殖方面效果更優(yōu)，這是本研究在黃酮類化合物抗白血病增殖研究中的獨(dú)特發(fā)現(xiàn)。在誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡方面，前人研究表明芹菜素可以通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，最終導(dǎo)致白血病細(xì)胞凋亡。本研究中槲皮素和山奈酚同樣通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和caspase-3的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，與前人研究結(jié)果相符。然而，本研究更深入地探討了兩種黃酮在誘導(dǎo)凋亡過(guò)程中對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)它們能夠調(diào)節(jié)PI3K/AKT和MAPK等多條信號(hào)通路，且在調(diào)節(jié)強(qiáng)度上存在差異，為黃酮類化合物誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究提供了更全面的視角。在細(xì)胞周期阻滯方面，紅芪總黃酮處理HL-60細(xì)胞后，可使細(xì)胞周期停滯在G0/G1以及G2/M期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變，從而抑制細(xì)胞增殖。本研究中槲皮素和山奈酚也能將HL-60細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖。不同的是，本研究詳細(xì)分析了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化，揭示了它們通過(guò)下調(diào)CyclinD、CyclinE等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，上調(diào)p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)，來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯，豐富了黃酮類化合物對(duì)白血病細(xì)胞周期影響的研究?jī)?nèi)容。在研究方法上，本研究采用了多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如CCK-8法、AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)、Westernblot和RT-PCR等，系統(tǒng)地研究了植物黃酮對(duì)HL-60細(xì)胞的抗白血病效應(yīng)及機(jī)制，相比一些僅采用單一方法進(jìn)行研究的文獻(xiàn)，本研究的結(jié)果更具說(shuō)服力和可靠性。綜上所述，本研究在繼承前人研究成果的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)兩種植物黃酮的對(duì)比研究，從細(xì)胞和分子水平深入探討了其抗白血病效應(yīng)及機(jī)制，在研究?jī)?nèi)容和方法上都具有一定的創(chuàng)新性，為白血病的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。4.4研究的局限性與展望本研究在探究?jī)煞N植物黃酮抗白血病細(xì)胞HL-60效應(yīng)及機(jī)制的過(guò)程中，雖取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，本研究?jī)H選用了HL-60這一種白血病細(xì)胞株進(jìn)行研究，而白血病是一類具有高度異質(zhì)性的疾病，不同類型的白血病細(xì)胞在生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)制和對(duì)藥物的敏感性等方面可能存在顯著差異。僅以HL-60細(xì)胞為研究對(duì)象，無(wú)法全面反映植物黃酮對(duì)其他類型白血病細(xì)胞的作用，研究結(jié)果的普適性受到一定限制。此外，本研究主要聚焦于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，缺乏體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)雖然能夠在一定程度上揭示植物黃酮的作用機(jī)制，但與體內(nèi)環(huán)境存在較大差異，如體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)、藥物代謝和分布等因素在體外實(shí)驗(yàn)中難以完全模擬。因此，本研究結(jié)果在動(dòng)物體內(nèi)的有效性和安全性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。在樣本數(shù)量方面，本研究中細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的樣本數(shù)量相對(duì)較少，這可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偶然性增加，降低研究結(jié)論的可靠性。尤其是在一些檢測(cè)指標(biāo)的分析中，樣本數(shù)量的不足可能無(wú)法準(zhǔn)確反映出藥物作用的真實(shí)效果，從而影響對(duì)植物黃酮抗白血病機(jī)制的深入理解。針對(duì)以上局限性，未來(lái)的研究可從以下幾個(gè)方向展開。在細(xì)胞研究方面，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大白血病細(xì)胞株的種類，包括急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株、慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株等，全面探究植物黃酮對(duì)不同類型白血病細(xì)胞的作用效果及機(jī)制差異，以提高研究結(jié)果的普適性和臨床指導(dǎo)價(jià)值。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建白血病動(dòng)物模型，如將HL-60細(xì)胞或其他白血病細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，觀察植物黃酮在動(dòng)物體內(nèi)的抗白血病效果，包括對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用、對(duì)機(jī)體免疫功能的影響以及藥物的安全性和毒副作用等，為植物黃酮的臨床應(yīng)用提供更直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，還可開展多中心、大樣本的臨床研究，進(jìn)一步驗(yàn)證植物黃酮在人體中的安全性和有效性，探索其在白血病治療中的最佳用藥方案，如藥物劑量、用藥時(shí)間、給藥途徑等，為白血病患者提供更有效的治療選擇。在研究方法上，可結(jié)合最新的技術(shù)手段，如單細(xì)胞測(cè)序、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等，從多維度深入探究植物黃酮的抗白血病機(jī)制，挖掘更多潛在的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為開發(fā)新型抗白血病藥物提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。五、結(jié)論5.1主要研究成果總結(jié)本研究系統(tǒng)地探究了槲皮素和山奈酚這兩種植物黃酮對(duì)白血病細(xì)胞HL-60的抗白血病效應(yīng)及其作用機(jī)制。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，明確了兩種植物黃酮在抑制HL-60細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及阻滯細(xì)胞周期等方面的作用，并深入分析了其內(nèi)在的分子機(jī)制。在抗白血病效應(yīng)方面，槲皮素和山奈酚對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖均具有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)出明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。隨著藥物濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)計(jì)算得出，槲皮素作用24h、48h、72h的IC??值分別為（65.43±3.21）μM、（45.67±2.89）μM、（35.43±2.56）μM；山奈酚作用24h、48h、72h的IC??值分別為（78.98±3.89）μM、（58.98±3.56）μM、（48.98±3.21）μM，表明槲皮素的抑制效果相對(duì)更強(qiáng)。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，兩種植物黃酮均可顯著誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，且凋亡率隨藥物濃度的增加而上升。通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在相同濃度下，槲皮素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用強(qiáng)于山奈酚，如在IC??濃度下，槲皮素處理組的總凋亡率為22.45%，山奈酚處理組為17.79%。此外，在細(xì)胞周期阻滯方面，槲皮素和山奈酚均能將HL-60細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變，隨著藥物濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸上升，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸下降，且槲皮素的阻滯效果更顯著，以IC??濃度為例，槲皮素處理組的G0/G1期細(xì)胞比例為68.78%，山奈酚處理組為65.34%。在作用機(jī)制方面，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素和山奈酚主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路和基因表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗白血病作用。在細(xì)胞信號(hào)通路層面，它們能夠調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路，降低PI3K的活性，減少AKT的磷酸化水平，抑制該信號(hào)通路的激活，從而影響細(xì)胞的增殖和存活；同時(shí)，還能激活JNK和p38MAPK信號(hào)通路，抑制ERK信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖。在基因調(diào)控層面，兩種植物黃酮能夠下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡基因Bax和caspase-3的表達(dá)，通過(guò)改變Bcl-2/Bax比值，影響線粒體膜的通透性，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；此外，還能下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)基因CyclinD、CyclinE的表達(dá)，上調(diào)p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。5.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)本研究在植物黃酮抗白血病研究領(lǐng)域展現(xiàn)出多方面的創(chuàng)新之處。在植物黃酮的選擇上，聚焦于槲皮素和山奈酚這兩種結(jié)構(gòu)相似但存在細(xì)微差異的黃酮類化合物。槲皮素的3,3',4',5,7-五羥基黃酮結(jié)構(gòu)與山奈酚的3,4',5,7-四羥基黃酮結(jié)構(gòu)，僅在3'位存在羥基的有無(wú)差異，這種結(jié)構(gòu)上的微小區(qū)別為研究黃酮類化合物的構(gòu)效關(guān)系提供了獨(dú)特的研究對(duì)象。通過(guò)對(duì)比二者對(duì)白血病細(xì)胞HL-60的作用，能夠更精準(zhǔn)地剖析結(jié)構(gòu)差異如何影響黃酮類化合物的抗白血病活性，為黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)修飾和新藥研發(fā)提供了關(guān)鍵的理論依據(jù)，而此前的研究較少針對(duì)如此相似結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物進(jìn)行深入對(duì)比。在研究方法上，本研究采用了多維度、綜合性的研究策略。綜合運(yùn)用CCK-8法、AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)、Westernblot和RT-PCR等多種先進(jìn)技術(shù)，從細(xì)胞增殖、凋亡、周期阻滯以及蛋白和基因表達(dá)等多個(gè)層面，全面系統(tǒng)地探究植物黃酮對(duì)HL-60細(xì)胞的作用。這種多技術(shù)聯(lián)用的研究方法，相較于以往單一技術(shù)的研究，能夠更全