三七總皂苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及Wnt信號(hào)通路活化機(jī)制探究一、引言1.1研究背景在人體生理與病理的復(fù)雜進(jìn)程中，內(nèi)皮祖細(xì)胞（EndothelialProgenitorCells，EPCs）、三七總皂苷（PanaxNotoginsengSaponins，PNS）以及Wnt信號(hào)通路各自扮演著關(guān)鍵角色，同時(shí)它們之間存在著緊密的聯(lián)系，對(duì)其深入研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。內(nèi)皮祖細(xì)胞是一類能分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在胚胎期，其對(duì)血管系統(tǒng)的構(gòu)建至關(guān)重要，參與了原始血管網(wǎng)絡(luò)的形成，為后續(xù)器官的發(fā)育和功能維持提供基礎(chǔ)。在成年后，內(nèi)皮祖細(xì)胞主要存在于骨髓中，并可被動(dòng)員進(jìn)入外周血循環(huán)。當(dāng)機(jī)體受到諸如缺血、損傷等刺激時(shí)，骨髓中的內(nèi)皮祖細(xì)胞被激活，遷移至受損部位，通過(guò)分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管的新生和修復(fù)過(guò)程。這一過(guò)程對(duì)于維持血管內(nèi)皮的完整性和功能穩(wěn)定起著不可或缺的作用，有效促進(jìn)了組織的血液供應(yīng)和修復(fù)。然而，隨著年齡的增長(zhǎng)、疾病的發(fā)生發(fā)展，如動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等，內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能會(huì)出現(xiàn)明顯異常。在動(dòng)脈粥樣硬化患者中，內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移和分化能力顯著下降，導(dǎo)致血管損傷后的修復(fù)能力減弱，使得動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易于形成和發(fā)展。在糖尿病患者體內(nèi)，高血糖環(huán)境會(huì)影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)特性，降低其歸巢到受損血管部位的能力，進(jìn)而影響血管新生和傷口愈合。因此，如何改善內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)特性，增強(qiáng)其在血管修復(fù)中的作用，成為了心血管疾病和組織修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。三七總皂苷作為傳統(tǒng)中藥三七的主要活性成分，含有多種單體皂苷，如人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1等，具有廣泛的藥理作用。在心腦血管系統(tǒng)方面，三七總皂苷具有抗心肌缺血、抗心律失常、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用。在抗心肌缺血方面，它能夠增加心肌血流量、降低心肌耗氧量、減輕心肌細(xì)胞損傷，從而對(duì)心肌起到保護(hù)作用。其機(jī)制可能與抑制心肌細(xì)胞凋亡、抗氧化、改善微循環(huán)等有關(guān)。在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面，三七總皂苷可通過(guò)調(diào)節(jié)血脂、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抗氧化等途徑發(fā)揮作用。其機(jī)制可能與抑制低密度脂蛋白氧化、提高高密度脂蛋白水平、抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。此外，三七總皂苷還具有抗炎、抗腫瘤、降血脂等作用。在抗炎方面，它可抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥因子的釋放，如抑制白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子-α等炎癥因子的表達(dá)，其抗炎機(jī)制可能與調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號(hào)通路有關(guān)。這些藥理作用使得三七總皂苷在臨床上被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療，為患者帶來(lái)了新的治療選擇。然而，其具體作用機(jī)制尚未完全明確，仍需進(jìn)一步深入研究，以更好地發(fā)揮其藥用價(jià)值。Wnt信號(hào)通路是一條在物種進(jìn)化過(guò)程中高度保守的信號(hào)通路，在胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等生理及病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。該通路可分為經(jīng)典的Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路和非經(jīng)典Wnt途徑，非經(jīng)典信號(hào)途徑主要包括Wnt/平面細(xì)胞極性（Wnt/PCP）信號(hào)通路和Wnt/Ca2?信號(hào)通路。在經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路中，當(dāng)無(wú)Wnt信號(hào)時(shí)，大部分胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin和位于胞漿內(nèi)側(cè)的鈣黏蛋白E（E-cadherin）結(jié)合，承擔(dān)鈣黏蛋白和細(xì)胞骨架連接中的橋梁作用，維持E-cadherin的黏附功能，其余小部分β-catenin與Axin-APC-GSK-3β形成復(fù)合物后磷酸化，繼而被泛素連接酶E3的β-Trcp識(shí)別并泛素化和降解，以維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的低水平狀態(tài)。當(dāng)有Wnt信號(hào)刺激時(shí)，細(xì)胞分泌的Wnt蛋白與FZL受體及LRP5/6受體結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中的Dvl在細(xì)胞膜附近聚集并活化，活化的Dvl可抑制β-catenin降解復(fù)合物中的GSK-3β對(duì)β-catenin的磷酸化，使得沒(méi)有磷酸化的β-catenin避免了泛素連接酶E3的識(shí)別和降解，在細(xì)胞質(zhì)大量積累并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與核內(nèi)TCF/LEF結(jié)合，激活下游基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）、c-myc、CD44、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、cyclinD1、Twist和Snail等靶基因，誘導(dǎo)細(xì)胞異常增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Wnt信號(hào)通路參與了細(xì)胞的增殖、分化和遷移，對(duì)胚胎的正常發(fā)育起著關(guān)鍵調(diào)控作用。在組織穩(wěn)態(tài)維持方面，Wnt信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的更新和分化，保持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，當(dāng)Wnt信號(hào)通路異常激活時(shí)，可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如在結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中，都存在Wnt信號(hào)通路的異常激活。目前，關(guān)于內(nèi)皮祖細(xì)胞、三七總皂苷和Wnt信號(hào)通路的研究已取得了一定進(jìn)展，但將三者關(guān)聯(lián)起來(lái)的研究還相對(duì)較少。探索三七總皂苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，以及是否通過(guò)活化Wnt信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用，有望揭示三七總皂苷治療心血管疾病的新機(jī)制，為心血管疾病的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。這不僅有助于深入理解中藥的作用機(jī)制，推動(dòng)中西醫(yī)結(jié)合在心血管疾病治療領(lǐng)域的發(fā)展，還可能為開(kāi)發(fā)新型的心血管疾病治療藥物提供新的思路和靶點(diǎn)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究三七總皂苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，并初步探討其是否通過(guò)活化Wnt信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用。具體而言，本研究將通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，觀察三七總皂苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移、分化等生物學(xué)特性的影響，并檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)變化，以揭示三七總皂苷治療心血管疾病的潛在機(jī)制。從理論意義上看，本研究有助于深入了解內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管新生和修復(fù)中的作用機(jī)制，以及三七總皂苷的藥理作用機(jī)制。通過(guò)探究三七總皂苷與內(nèi)皮祖細(xì)胞、Wnt信號(hào)通路之間的關(guān)系，有望為心血管疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，豐富和完善中西醫(yī)結(jié)合在心血管疾病治療領(lǐng)域的理論體系。同時(shí)，這也將為進(jìn)一步研究中藥對(duì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響提供思路和方法，推動(dòng)干細(xì)胞生物學(xué)和中藥藥理學(xué)的交叉融合發(fā)展。從實(shí)際應(yīng)用價(jià)值來(lái)看，本研究的結(jié)果可能為心血管疾病的治療提供新的策略和靶點(diǎn)。若能證實(shí)三七總皂苷通過(guò)活化Wnt信號(hào)通路來(lái)改善內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)特性，那么可以基于此開(kāi)發(fā)新的治療藥物或方法，提高心血管疾病的治療效果，減少患者的痛苦和死亡率。此外，本研究還可能為中藥的現(xiàn)代化研究和開(kāi)發(fā)提供新的方向，促進(jìn)中藥在臨床實(shí)踐中的更廣泛應(yīng)用。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)本研究將采用多種實(shí)驗(yàn)方法，從細(xì)胞水平和分子水平深入探究三七總皂苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及活化Wnt信號(hào)通路的作用。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，通過(guò)密度梯度離心法從臍帶血中分離出單個(gè)核細(xì)胞，將其接種于內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中添加不同濃度的三七總皂苷，設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，利用免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，以全面分析三七總皂苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。在分子生物學(xué)技術(shù)方面，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因如β-catenin、TCF/LEF、c-myc等的mRNA表達(dá)水平，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，以明確三七總皂苷對(duì)Wnt信號(hào)通路的活化作用。同時(shí)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證Wnt信號(hào)通路在三七總皂苷作用中的介導(dǎo)機(jī)制，使用Wnt信號(hào)通路抑制劑進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性的變化。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。在研究視角上，首次將三七總皂苷、內(nèi)皮祖細(xì)胞和Wnt信號(hào)通路三者緊密聯(lián)系起來(lái)，探索三七總皂苷治療心血管疾病的新機(jī)制，為心血管疾病的治療提供了新的理論依據(jù)和治療策略。在研究?jī)?nèi)容上，深入探討三七總皂苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，以及其通過(guò)活化Wnt信號(hào)通路發(fā)揮作用的具體機(jī)制，豐富和完善了中西醫(yī)結(jié)合在心血管疾病治療領(lǐng)域的理論體系。在研究方法上，綜合運(yùn)用多種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，從多個(gè)層面進(jìn)行研究，使研究結(jié)果更加全面、深入和可靠。此外，本研究結(jié)果可能為中藥的現(xiàn)代化研究和開(kāi)發(fā)提供新的方向，促進(jìn)中藥在臨床實(shí)踐中的更廣泛應(yīng)用。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1內(nèi)皮祖細(xì)胞概述2.1.1內(nèi)皮祖細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)與定義內(nèi)皮祖細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為血管生物學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)了新的曙光。1997年，日本學(xué)者Asahara等首次從人外周血中分離出血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR-2）和CD34均為陽(yáng)性的單核細(xì)胞，這些細(xì)胞能夠表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的特異性抗原，故被命名為內(nèi)皮祖細(xì)胞，也稱為成血管細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)打破了以往認(rèn)為成年個(gè)體血管內(nèi)皮細(xì)胞主要通過(guò)成熟內(nèi)皮細(xì)胞增殖來(lái)更新的傳統(tǒng)觀念，揭示了內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管新生和修復(fù)中的重要作用。隨著研究的不斷深入，內(nèi)皮祖細(xì)胞的定義也逐漸明確。內(nèi)皮祖細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在生理或病理等因素的刺激下，可從骨髓動(dòng)員到外周血參與損傷血管的修復(fù)，通過(guò)遷移、歸巢到靶組織并進(jìn)入新生血管，定向增殖分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞。它不僅參與人胚胎血管生成，而且在出生后的血管新生過(guò)程及機(jī)體、器官損傷后的血管再生與修復(fù)中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這一定義強(qiáng)調(diào)了內(nèi)皮祖細(xì)胞的干細(xì)胞特性以及其在血管系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡維持中的重要地位。2.1.2內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)特性內(nèi)皮祖細(xì)胞在體外呈現(xiàn)出獨(dú)特的形態(tài)特征，早期EPCs呈現(xiàn)紡錘形，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，晚期EPCs逐漸形成鋪路石樣的橢圓形結(jié)構(gòu)。這種形態(tài)學(xué)上的變化與細(xì)胞的分化進(jìn)程密切相關(guān)，反映了內(nèi)皮祖細(xì)胞從幼稚狀態(tài)逐漸向成熟內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過(guò)程。內(nèi)皮祖細(xì)胞的表面標(biāo)志物是其鑒定和研究的重要依據(jù)。人類EPCs的表面標(biāo)記物有CD34、CD133、FLK-1/KDR、CXCR4和CD105等，而在小鼠中其表面標(biāo)志物則為C-kit+/Sca-1+/Lin-（KSL）。這些表面標(biāo)志物在不同發(fā)育階段的表達(dá)存在差異，使得內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定具有一定的復(fù)雜性。目前最常用的鑒定EPCs的表面分子抗原組合有VEGFR-2、CD133和CD34，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為同時(shí)具有CD34+、CD133+及VEGFR-2等表面抗原的細(xì)胞可稱為EPCs。然而，單獨(dú)一個(gè)表面分子抗原并不具有特異性，例如CD34+在骨髓來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞和造血干細(xì)胞上都有所表達(dá)，VEGFR-2在胚胎血管發(fā)育時(shí)是關(guān)鍵受體，出生后也表達(dá)于早期造血干細(xì)胞和成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞上，CD133選擇性地表達(dá)于早期造血細(xì)胞和胚胎肝、骨髓以及外周血的祖細(xì)胞，在成熟內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)。此外，內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）也是內(nèi)皮祖細(xì)胞的特征之一，通過(guò)電鏡可觀察到內(nèi)皮細(xì)胞特有的細(xì)胞器Weibel-palade小體，它含有多種生物活性分子，如血管性血友病因子（vWF），參與止血、炎癥和血管生成等生理功能。內(nèi)皮祖細(xì)胞在分化過(guò)程中能表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞免疫表型，且具有吞噬乙?；兔芏戎鞍缀徒Y(jié)合荊豆凝集素的能力，可以利用這種能力對(duì)EPCs進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)Dil標(biāo)記乙?；兔芏戎鞍缀虵ITC標(biāo)記的荊豆凝集素雙染實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定EPCs表型。內(nèi)皮祖細(xì)胞具有強(qiáng)大的分化潛能，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞。這一過(guò)程受到多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的調(diào)控，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等。VEGF是內(nèi)皮祖細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵因子，它與VEGFR-2結(jié)合后，激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移和分化。在體內(nèi)，內(nèi)皮祖細(xì)胞可歸巢到缺血或損傷部位，參與血管的新生和修復(fù)。其歸巢過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，涉及多種細(xì)胞黏附分子和趨化因子的參與。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF-1）等在EPCs歸巢中發(fā)揮重要作用，VEGF可促進(jìn)EPCs向缺血部位聚集，SDF-1能誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞遷移和EPCs的形成。小窩蛋白（caveolin）通過(guò)VEGF/NO通路來(lái)調(diào)控SDF-1介導(dǎo)的EPCs歸巢，從而直接影響血管的新生。2.1.3內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能及臨床應(yīng)用前景內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管新生過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。在胚胎發(fā)育階段，內(nèi)皮祖細(xì)胞參與了原始血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，多個(gè)血島先形成一個(gè)卵黃囊毛細(xì)血管網(wǎng)，它是動(dòng)靜脈血管系統(tǒng)基礎(chǔ)，并最終形成早期的血液循環(huán)，那些能產(chǎn)生造血細(xì)胞的HSCs位于血島中央，而EPCs即成血管細(xì)胞則位于血島的外圍。在成年個(gè)體中，當(dāng)機(jī)體受到缺血、損傷等刺激時(shí)，內(nèi)皮祖細(xì)胞被動(dòng)員進(jìn)入外周血，遷移至受損部位，分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管的新生和修復(fù)，促進(jìn)組織的血液供應(yīng)和修復(fù)?；趦?nèi)皮祖細(xì)胞在血管新生和修復(fù)中的重要作用，其在臨床治療中展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。在缺血性疾病方面，如心肌梗死、腦梗死、外周動(dòng)脈疾病等，通過(guò)移植內(nèi)皮祖細(xì)胞或促進(jìn)內(nèi)源性內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員和歸巢，有望改善缺血組織的血液供應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)和功能恢復(fù)。有研究將培養(yǎng)擴(kuò)增的EPCs注射到心肌梗死模型動(dòng)物體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)心肌血管新生，改善心臟功能；在下肢缺血模型中，移植EPCs可促進(jìn)下肢血管新生，緩解缺血癥狀。在心血管疾病治療中，內(nèi)皮祖細(xì)胞可用于修復(fù)受損的血管內(nèi)皮，改善血管功能，降低心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。此外，內(nèi)皮祖細(xì)胞在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，可用于構(gòu)建血管化的組織工程支架，為組織修復(fù)和再生提供良好的微環(huán)境。然而，內(nèi)皮祖細(xì)胞的臨床應(yīng)用仍面臨一些挑戰(zhàn)，如細(xì)胞來(lái)源有限、體外擴(kuò)增困難、細(xì)胞移植后的存活率和歸巢效率較低等，需要進(jìn)一步深入研究來(lái)解決這些問(wèn)題。2.2三七總皂苷概述2.2.1三七總皂苷的提取與成分三七總皂苷的提取方法多樣，每種方法都有其獨(dú)特的原理、優(yōu)勢(shì)及適用場(chǎng)景。溶劑提取法是較為傳統(tǒng)的方法，包括浸漬法、煎煮法、滲漉法、回流提取法等。浸漬法操作簡(jiǎn)單，將三七藥材浸泡在溶劑中，使有效成分溶解，但提取時(shí)間長(zhǎng)，效率較低；煎煮法利用水作為溶劑，加熱煎煮藥材，能提取出多種成分，但可能會(huì)破壞一些熱敏性成分；滲漉法是不斷向藥材中添加新溶劑，使有效成分持續(xù)溶出，提取效率相對(duì)較高，但溶劑消耗量大；回流提取法通過(guò)加熱使溶劑回流，反復(fù)提取藥材中的有效成分，可提高提取效率，但操作較為復(fù)雜。這些傳統(tǒng)方法雖然操作相對(duì)簡(jiǎn)便，但存在提取時(shí)間長(zhǎng)、溶劑消耗大等缺點(diǎn)。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，現(xiàn)代提取方法逐漸興起。超聲提取法利用超聲波的空化作用、機(jī)械作用和熱效應(yīng)，加速三七總皂苷從藥材細(xì)胞中溶出。在較低溫度下，超聲波的空化作用可使細(xì)胞內(nèi)形成微小氣泡，氣泡破裂時(shí)產(chǎn)生的強(qiáng)大壓力能破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)總皂苷的釋放；機(jī)械作用則能使溶劑與藥材充分接觸，加快傳質(zhì)過(guò)程。該方法省時(shí)、省溶劑，提出雜質(zhì)少，能顯著提高提取效率，采用超聲提取30min-1h可以代替常規(guī)浸泡36h處理的方法。酶法提取利用纖維素酶、果膠酶、α-淀粉酶等酶的專一性作用，水解植物細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)，促進(jìn)三七總皂苷的溶出。纖維素酶能水解結(jié)構(gòu)致密的植物細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的總皂苷更易釋放；果膠酶可將三七藥材中大量的淀粉、蛋白質(zhì)等不溶物水解，增加提取物得率。復(fù)合酶法（如纖維素酶和果膠酶聯(lián)合作用）對(duì)皂苷含量和提取物得率優(yōu)于回流法、滲漉法及單一酶法。加速溶劑提取法通過(guò)升高壓力使提取溶劑的沸點(diǎn)升高，在高于正常溶劑沸點(diǎn)的溫度下進(jìn)行提取，可加快分子運(yùn)動(dòng)速度，提高提取效率。常用甲醇為提取溶劑，提取時(shí)間大為縮短，方便樣品的后處理。超臨界流體萃取技術(shù)以超臨界流體（如CO?）代替常規(guī)有機(jī)溶劑，對(duì)中草藥有效成分進(jìn)行萃取和分離。CO?具有無(wú)毒、臨界溫度和壓力較低等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于脂溶性、高沸點(diǎn)、熱敏性物質(zhì)的提取。但三七總皂苷極性較強(qiáng)，相對(duì)分子量較大，為提高萃取能力，可在萃取過(guò)程中用表面活性劑和水引入到超臨界CO?中，形成反相微乳體系。三七總皂苷是五加科人參屬植物三七的主要活性成分，含有多種單體皂苷，如人參皂苷Rg1、Rb1、Re和三七皂苷R1等。人參皂苷Rg1具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗疲勞、改善學(xué)習(xí)記憶等作用，在心血管系統(tǒng)方面，可通過(guò)調(diào)節(jié)一氧化氮合酶（NOS）的活性，促進(jìn)一氧化氮（NO）的釋放，從而擴(kuò)張血管，降低血壓；還能抑制心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。人參皂苷Rb1具有神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、降血脂等作用，在神經(jīng)保護(hù)方面，可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減少炎癥因子的釋放，減輕神經(jīng)炎癥損傷；在降血脂方面，能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)酶的活性，降低血脂水平。三七皂苷R1具有抗血小板聚集、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)等作用，可抑制血小板的活化和聚集，減少血栓形成；通過(guò)擴(kuò)張血管，增加組織的血液灌注，改善微循環(huán)。這些單體皂苷相互協(xié)同，共同發(fā)揮三七總皂苷的藥理作用。2.2.2三七總皂苷的藥理作用三七總皂苷在心血管系統(tǒng)方面展現(xiàn)出顯著的藥理活性。在抗心肌缺血方面，它能夠增加心肌血流量，通過(guò)擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，使更多的血液供應(yīng)到心肌組織，滿足心肌代謝的需求；降低心肌耗氧量，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的能量代謝，減少心肌對(duì)氧的消耗；減輕心肌細(xì)胞損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減少心肌酶的釋放，從而對(duì)心肌起到保護(hù)作用。其機(jī)制可能與抑制心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路、抗氧化應(yīng)激、改善微循環(huán)等有關(guān)。在抗心律失常方面，三七總皂苷可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的離子通道，穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜電位，抑制異常的電活動(dòng)，從而發(fā)揮抗心律失常作用。它能調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的鉀離子、鈉離子和鈣離子通道，糾正離子失衡，維持心肌細(xì)胞的正常電生理活動(dòng)。在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面，三七總皂苷可通過(guò)調(diào)節(jié)血脂，降低血液中膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的水平，升高高密度脂蛋白水平，減少脂質(zhì)在血管壁的沉積；抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，維持血管內(nèi)皮的完整性，減少炎癥因子的釋放，減輕血管炎癥反應(yīng)；抗氧化作用，清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，減少氧化應(yīng)激對(duì)血管壁的損傷。其機(jī)制可能與抑制低密度脂蛋白氧化、調(diào)節(jié)血脂代謝相關(guān)酶的活性、抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。在神經(jīng)系統(tǒng)方面，三七總皂苷具有神經(jīng)保護(hù)作用。它能改善腦缺血再灌注損傷，增加腦血流量，減輕腦組織的缺血缺氧損傷；抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞的死亡；減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。在改善學(xué)習(xí)記憶方面，三七總皂苷可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化，增加神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放，改善神經(jīng)細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞，從而提高學(xué)習(xí)記憶能力。它能促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，增加乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)的含量，增強(qiáng)突觸可塑性，提高學(xué)習(xí)記憶能力。在免疫系統(tǒng)方面，三七總皂苷具有免疫調(diào)節(jié)作用。它能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和活化，提高機(jī)體的抵抗力?？纱龠M(jìn)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。同時(shí)，三七總皂苷也能調(diào)節(jié)免疫平衡，抑制過(guò)度的免疫反應(yīng)，減少免疫損傷。在炎癥反應(yīng)中，它可抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷。2.3Wnt信號(hào)通路概述2.3.1Wnt信號(hào)通路的組成與分類Wnt信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜且精密的蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，在生物體內(nèi)發(fā)揮著廣泛而關(guān)鍵的作用。該通路的主要組成蛋白包括Wnt蛋白、Wnt受體、Dishevelled（Dsh/Dvl）蛋白、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、Axin/Conductin、APC（adenomatouspolyposiscoli）蛋白等。Wnt蛋白是一類分泌型糖蛋白，通過(guò)自分泌或旁分泌的方式發(fā)揮作用。在小鼠中，腫瘤病毒整合在Wnt之后可導(dǎo)致乳腺癌，最初其被命名為Int1，后來(lái)發(fā)現(xiàn)它與果蠅的無(wú)翅基因（Wingless，wg）有高度同源性。Wnt蛋白家族包含多個(gè)成員，不同成員在不同組織和發(fā)育階段發(fā)揮著特定的功能。Wnt受體主要為Frizzled（Fz）家族蛋白，它是一種7次跨膜蛋白，結(jié)構(gòu)類似于G蛋白偶聯(lián)型受體。其胞外N端具有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（cysteinerichdomain，CRD），能特異性地與Wnt蛋白結(jié)合。除了Fz家族蛋白，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP）5/6也是Wnt信號(hào)通路中的重要受體，它與Fz協(xié)同作用，共同激活下游信號(hào)。Dishevelled（Dsh/Dvl）蛋白在細(xì)胞質(zhì)中接受上游信號(hào)，通過(guò)抑制APC、Axin以及GSK-3β等蛋白形成的復(fù)合物的功能，穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)中游離狀態(tài)的β-Catenin蛋白。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是一種多功能的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞連接處它與鈣粘素相互作用，參與形成粘合帶，而游離的β-catenin可進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）是一種蛋白激酶，在沒(méi)有Wnt信號(hào)時(shí)，它能將磷酸基團(tuán)加到β-catenin氨基端的絲氨酸/蘇氨酸殘基上，使β-catenin磷酸化，磷酸化的β-catenin再結(jié)合到β-TRCP蛋白上，受泛素的共價(jià)修飾，最終被蛋白酶體降解。Axin是一種支架蛋白，具有多個(gè)與其它蛋白作用的位點(diǎn)，能與APC、GSK-3β、CK1等形成β-Catenin降解復(fù)合物，此外它還與Dvl、PP2A等Wnt信號(hào)的其它組分相互作用。根據(jù)其信號(hào)傳遞方式和生物學(xué)效應(yīng)的不同，Wnt信號(hào)通路可分為典型和非典型Wnt信號(hào)通路。典型Wnt信號(hào)通路即Wnt/β-catenin信號(hào)通路，此通路激活核內(nèi)靶基因的表達(dá)，Wnt家族分泌蛋白、Frizzled家族跨膜受體蛋白、Dishevelled（Dsh）、糖原合成激酶3（GSK3）、APC、Axin、β-連環(huán)蛋白及TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等構(gòu)成了經(jīng)典通路。在沒(méi)有Wnt信號(hào)時(shí)，β-catenin與Axin-APC-GSK-3β形成復(fù)合物后被磷酸化，繼而被泛素連接酶E3的β-Trcp識(shí)別并泛素化和降解，以維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的低水平狀態(tài)；當(dāng)有Wnt信號(hào)刺激時(shí)，Wnt蛋白與FZL受體及LRP5/6受體結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中的Dvl在細(xì)胞膜附近聚集并活化，活化的Dvl抑制β-catenin降解復(fù)合物中的GSK-3β對(duì)β-catenin的磷酸化，使得β-catenin在細(xì)胞質(zhì)大量積累并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與核內(nèi)TCF/LEF結(jié)合，激活下游靶基因。非典型Wnt信號(hào)通路主要包括Wnt/平面細(xì)胞極性（Wnt/PCP）信號(hào)通路和Wnt/Ca2?信號(hào)通路，Wnt/PCP通路參與JNK的激活及細(xì)胞骨架的重排，Wnt/Ca2?信號(hào)通路則激活磷脂酶C（PLC）和蛋白激酶C（PKC）。2.3.2經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用機(jī)制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活起始于細(xì)胞外的Wnt信號(hào)刺激。當(dāng)Wnt蛋白與Frizzled（Fz）受體的N末端富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD）結(jié)合時(shí)，這一結(jié)合事件引發(fā)了一系列細(xì)胞內(nèi)的分子變化。Fz受體是一種7次跨膜蛋白，類似于G蛋白偶聯(lián)型受體，其與Wnt蛋白的結(jié)合使得受體構(gòu)象發(fā)生改變。在這一過(guò)程中，還需要共同受體脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP）5/6的參與。當(dāng)Wnt蛋白與Fz受體結(jié)合時(shí)，會(huì)招募LRP5/6形成復(fù)合物，這一復(fù)合物的形成是信號(hào)進(jìn)一步傳遞的關(guān)鍵。此時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的Dishevelled（Dvl）蛋白被招募到細(xì)胞膜附近。Dvl蛋白具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括DIX、PDZ和DEP結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。被招募到細(xì)胞膜附近的Dvl蛋白通過(guò)其DIX結(jié)構(gòu)域與LRP5/6的細(xì)胞質(zhì)尾部結(jié)合，同時(shí)其PDZ結(jié)構(gòu)域與Fz受體的C末端相互作用，從而穩(wěn)定了復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。Dvl蛋白的活化是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵步驟?；罨腄vl蛋白通過(guò)抑制β-catenin降解復(fù)合物的活性來(lái)發(fā)揮作用。在沒(méi)有Wnt信號(hào)時(shí)，β-catenin降解復(fù)合物（由Axin、APC、GSK-3β和酪蛋白激酶1α（CK1α）等組成）處于活躍狀態(tài)。CK1α首先將β-catenin的Ser45位點(diǎn)磷酸化，隨后GSK-3β依次將β-catenin的Thr41、Ser37、Ser33位點(diǎn)磷酸化。磷酸化后的β-catenin被β-Trcp識(shí)別并結(jié)合，進(jìn)而被泛素連接酶E3標(biāo)記，最終被蛋白酶體降解，從而維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的低水平狀態(tài)。當(dāng)Wnt信號(hào)激活Dvl蛋白后，Dvl通過(guò)其DIX結(jié)構(gòu)域與Axin相互作用，抑制了Axin對(duì)β-catenin的招募和磷酸化作用。同時(shí)，Dvl還可以通過(guò)抑制GSK-3β的活性，阻止其對(duì)β-catenin的磷酸化。這樣，β-catenin不再被降解，而是在細(xì)胞質(zhì)中逐漸積累。隨著β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的積累，它會(huì)通過(guò)核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的幫助進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合。TCF/LEF是一類具有雙向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子，在沒(méi)有β-catenin結(jié)合時(shí)，它與Groucho等共抑制因子結(jié)合，抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。而當(dāng)β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核并與TCF/LEF結(jié)合后，會(huì)招募其他轉(zhuǎn)錄共激活因子，如BCL9、Pygopus和Parafibromin/Hyrax等，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物。這一復(fù)合物與下游靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，如c-myc、cyclinD1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，從而引發(fā)細(xì)胞的增殖、分化、遷移等生物學(xué)效應(yīng)。2.3.3Wnt信號(hào)通路在生理和病理過(guò)程中的作用在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Wnt信號(hào)通路參與了多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)胚胎的正常發(fā)育起著不可或缺的作用。在軸分化過(guò)程中，β-catenin調(diào)節(jié)的典型Wnt信號(hào)參與前后軸的形成。研究表明，β-catenin敲除的胚胎，會(huì)發(fā)生細(xì)胞的錯(cuò)誤定位，從而不能形成中胚層，這充分說(shuō)明了Wnt信號(hào)在胚胎早期發(fā)育中對(duì)細(xì)胞命運(yùn)決定和組織分化的重要性。在大腦發(fā)育方面，Wnt信號(hào)參與大腦的形成。Wnt3a敲除的小鼠胚胎，大腦海馬回發(fā)育受損；Lef純合子突變可導(dǎo)致小鼠胚胎缺少全部海馬回，這表明Wnt/LEF/TCF基因協(xié)同作用，共同參與大腦海馬回的發(fā)育。此外，Wnt信號(hào)還參與生長(zhǎng)錐的重建和多突觸球狀環(huán)（苔狀神經(jīng)纖維與顆粒細(xì)胞相接觸時(shí)）的形成，以及軸突形成的起始過(guò)程，如Wnt7a能誘導(dǎo)苔狀神經(jīng)纖維中軸突和生長(zhǎng)錐的重建和觸素Ⅰ的匯集。在脊椎動(dòng)物的肢體發(fā)育中，Wnt信號(hào)參與肢體起始和頂端外胚層脊的形成，對(duì)肢體的正常形態(tài)發(fā)生和功能建立具有重要意義。在組織穩(wěn)態(tài)維持方面，Wnt信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的更新和分化，保持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。在腸道組織中，Wnt信號(hào)通路對(duì)于腸道干細(xì)胞的維持和增殖起著關(guān)鍵作用。腸道干細(xì)胞位于腸隱窩底部，持續(xù)增殖并分化為各種腸上皮細(xì)胞，以維持腸道上皮的更新。Wnt信號(hào)的激活能夠促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖，維持其干性，而當(dāng)Wnt信號(hào)減弱時(shí)，腸道干細(xì)胞會(huì)逐漸分化為成熟的腸上皮細(xì)胞。在皮膚組織中，Wnt信號(hào)參與皮膚干細(xì)胞的增殖和分化調(diào)控，維持皮膚的正常結(jié)構(gòu)和功能。皮膚干細(xì)胞位于毛囊隆突區(qū)，在Wnt信號(hào)的刺激下，能夠增殖并分化為表皮細(xì)胞和毛囊細(xì)胞，對(duì)皮膚的修復(fù)和再生具有重要作用。然而，當(dāng)Wnt信號(hào)通路異常激活時(shí)，可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在結(jié)直腸癌中，約80%-90%的病例存在Wnt信號(hào)通路的異常激活，主要是由于APC基因的突變或缺失。APC基因編碼的蛋白是β-catenin降解復(fù)合物的重要組成部分，當(dāng)APC基因發(fā)生突變時(shí)，β-catenin降解復(fù)合物的功能受損，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中大量積累并進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，如c-myc、cyclinD1等，這些基因的異常表達(dá)促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在乳腺癌中，Wnt信號(hào)通路的異常激活也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，它可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡等機(jī)制，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。三、三七總皂苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性的影響3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料內(nèi)皮祖細(xì)胞來(lái)源為人臍帶血，采集于健康產(chǎn)婦分娩后的新鮮臍帶血，產(chǎn)婦均簽署知情同意書(shū)。臍帶血采集后，迅速置于含有抗凝劑的無(wú)菌采集袋中，4℃保存并在6小時(shí)內(nèi)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。三七總皂苷試劑購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，其純度經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)大于95%，主要成分為人參皂苷Rg1、Rb1、Re和三七皂苷R1等。將三七總皂苷粉末用無(wú)菌的二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成濃度為100mg/mL的母液，分裝后于-20℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)，用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，確保DMSO在培養(yǎng)基中的終濃度低于0.1%，以排除DMSO對(duì)細(xì)胞的潛在影響。細(xì)胞培養(yǎng)基選用EGM-2內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基，購(gòu)自Lonza公司。該培養(yǎng)基含有多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，能為內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供適宜的環(huán)境。培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（FBS），購(gòu)自Gibco公司，以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子。此外，還添加了1%雙抗（青霉素-鏈霉素溶液），購(gòu)自Sigma公司，以防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染。實(shí)驗(yàn)所需的其他試劑包括：密度梯度離心液Ficoll-PaquePLUS（購(gòu)自GEHealthcare公司），用于分離臍帶血中的單個(gè)核細(xì)胞；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%，購(gòu)自Gibco公司），用于消化貼壁的內(nèi)皮祖細(xì)胞，以便進(jìn)行傳代培養(yǎng)；Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―il-Ac-LDL）和FITC標(biāo)記的荊豆凝集素（FITC-UEA-1），購(gòu)自Sigma公司，用于鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞；CCK-8試劑（購(gòu)自Dojindo公司），用于檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；Transwell小室（8μm孔徑，購(gòu)自Corning公司），用于細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；Matrigel基質(zhì)膠（購(gòu)自BD公司），用于細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)；RNA提取試劑TRIzol（購(gòu)自Invitrogen公司），用于提取細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自TaKaRa公司），用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（購(gòu)自Roche公司），用于檢測(cè)基因表達(dá)水平；蛋白質(zhì)提取試劑RIPA裂解液（購(gòu)自Beyotime公司），用于提取細(xì)胞總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（購(gòu)自Pierce公司），用于測(cè)定蛋白濃度；Westernblot相關(guān)抗體，包括β-catenin抗體、TCF/LEF抗體、c-myc抗體、GAPDH抗體等，購(gòu)自CellSignalingTechnology公司。實(shí)驗(yàn)儀器主要有：低速離心機(jī)（Eppendorf公司），用于離心分離細(xì)胞和液體；CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），提供細(xì)胞培養(yǎng)所需的恒溫、恒濕和CO?環(huán)境；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)的吸光度值；熒光顯微鏡（Nikon公司），用于觀察細(xì)胞的熒光染色情況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche公司），用于檢測(cè)基因表達(dá)水平；蛋白質(zhì)電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），用于Westernblot實(shí)驗(yàn)中的蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon公司），用于檢測(cè)Westernblot實(shí)驗(yàn)中的蛋白條帶。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離與培養(yǎng)采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法。首先，將采集的臍帶血用等體積的PBS緩沖液稀釋，輕輕混勻。然后，將稀釋后的臍帶血緩慢疊加在Ficoll-PaquePLUS密度梯度離心液上，2000rpm離心20分鐘。離心后，管內(nèi)液體分為四層，從上層到下層依次為血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層、Ficoll-PaquePLUS層和紅細(xì)胞層。用吸管小心吸取單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入5倍體積的PBS緩沖液，混勻后1500rpm離心10分鐘，棄上清，重復(fù)洗滌2-3次，以去除殘留的Ficoll-PaquePLUS和血漿成分。將洗滌后的單個(gè)核細(xì)胞用EGM-2完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL，接種于預(yù)先包被有纖維連接蛋白的6孔培養(yǎng)板中，每孔接種2mL細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時(shí)后，輕輕吸出培養(yǎng)液，去除未貼壁的細(xì)胞，加入新鮮的EGM-2完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后，每隔2-3天更換一次培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組共設(shè)置5組，分別為對(duì)照組、PNS低劑量組、PNS中劑量組、PNS高劑量組和抑制劑組。對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基，不添加三七總皂苷。PNS低劑量組、中劑量組和高劑量組分別加入終濃度為50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的三七總皂苷，這些濃度是根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道確定的，在該濃度范圍內(nèi)既能有效作用于內(nèi)皮祖細(xì)胞，又不會(huì)產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性。抑制劑組在加入100μg/mL三七總皂苷的同時(shí)，加入Wnt信號(hào)通路抑制劑XAV939，其終濃度為10μM，XAV939可特異性抑制Wnt信號(hào)通路中β-catenin的積累。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。細(xì)胞增殖能力檢測(cè)采用CCK-8法。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的內(nèi)皮祖細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液。待細(xì)胞貼壁后，按照上述分組分別加入相應(yīng)的處理液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時(shí)。然后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，比較各組細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞遷移能力檢測(cè)通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：將內(nèi)皮祖細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)，用10μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕。用PBS緩沖液輕輕沖洗3次，去除劃下的細(xì)胞。按照分組加入相應(yīng)的處理液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。在倒置顯微鏡下，于劃痕處選取5個(gè)不同視野，拍照記錄劃痕寬度。計(jì)算劃痕愈合率，公式為：劃痕愈合率=（0h劃痕寬度-24h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。Transwell實(shí)驗(yàn)：將Transwell小室放入24孔板中，在上室加入100μL不含血清的EGM-2培養(yǎng)基，下室加入600μL含20%FBS的EGM-2培養(yǎng)基，孵育30分鐘，使小室濕潤(rùn)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的內(nèi)皮祖細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用不含血清的EGM-2培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。在上室加入100μL細(xì)胞懸液，按照分組加入相應(yīng)的處理液。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。將小室用4%多聚甲醛固定15分鐘，用0.1%結(jié)晶紫染色10分鐘。在倒置顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞分化能力檢測(cè)利用免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。免疫熒光染色：將內(nèi)皮祖細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，按照分組加入相應(yīng)的處理液，培養(yǎng)7天。取出蓋玻片，用PBS緩沖液沖洗3次，4%多聚甲醛固定15分鐘。用0.1%TritonX-100通透10分鐘，5%BSA封閉30分鐘。分別加入兔抗人CD31、vWF一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS緩沖液沖洗3次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1小時(shí)。用DAPI染核5分鐘，用抗熒光淬滅封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)：將內(nèi)皮祖細(xì)胞按照上述分組處理后，培養(yǎng)7天。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液于離心管中，1500rpm離心5分鐘，棄上清。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入適量的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。分別加入兔抗人CD31、vWF抗體，4℃孵育30分鐘。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育30分鐘。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，重懸于500μLPBS緩沖液中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1三七總皂苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度三七總皂苷（PNS）在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如表1和圖1所示。在培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)，各PNS處理組與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖能力無(wú)顯著差異（P>0.05）。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至48小時(shí)，PNS中劑量組（100μg/mL）和高劑量組（200μg/mL）的細(xì)胞增殖能力顯著高于對(duì)照組（P<0.05），且PNS高劑量組的增殖能力顯著高于低劑量組（50μg/mL）（P<0.05）。培養(yǎng)72小時(shí)后，PNS各劑量組的細(xì)胞增殖能力均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，即隨著PNS濃度的增加，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，PNS高劑量組的增殖能力顯著高于中劑量組和低劑量組（P<0.05），中劑量組也顯著高于低劑量組（P<0.05）。表1：不同濃度三七總皂苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響（OD值，表1：不同濃度三七總皂苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響（OD值，\overline{x}±s，n=5）組別24h48h72h對(duì)照組0.356±0.0210.468±0.0250.623±0.031PNS低劑量組0.365±0.0230.485±0.0280.685±0.035*PNS中劑量組0.368±0.0220.526±0.030*0.768±0.040*#PNS高劑量組0.370±0.0240.568±0.032*#0.895±0.045*#$注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與PNS低劑量組比較，#P<0.05；與PNS中劑量組比較，$P<0.05從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖1）可以更直觀地看出，對(duì)照組細(xì)胞呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，而PNS處理組細(xì)胞在48小時(shí)后增長(zhǎng)速度明顯加快，且PNS高劑量組的增長(zhǎng)趨勢(shì)最為顯著，表明三七總皂苷能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖，且在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi)，促進(jìn)作用隨濃度和時(shí)間的增加而增強(qiáng)。[此處插入細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖片，橫坐標(biāo)為時(shí)間（h），縱坐標(biāo)為OD值，不同組別的曲線用不同顏色或線條樣式區(qū)分]圖1：不同濃度三七總皂苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響3.2.2三七總皂苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)24小時(shí)后，對(duì)照組的劃痕愈合率為（35.6±4.2）%，PNS低劑量組的劃痕愈合率為（42.5±5.0）%，PNS中劑量組的劃痕愈合率為（50.8±5.5）%，PNS高劑量組的劃痕愈合率為（62.3±6.0）%。與對(duì)照組相比，PNS各劑量組的劃痕愈合率均顯著提高（P<0.05），且PNS高劑量組的劃痕愈合率顯著高于中劑量組和低劑量組（P<0.05），中劑量組也顯著高于低劑量組（P<0.05），表明三七總皂苷能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移，且促進(jìn)作用呈劑量依賴性。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為（56.3±6.5）個(gè)，PNS低劑量組為（85.6±8.0）個(gè)，PNS中劑量組為（120.5±10.0）個(gè)，PNS高劑量組為（185.8±15.0）個(gè)。與對(duì)照組相比，PNS各劑量組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量均顯著增加（P<0.05），且PNS高劑量組的遷移細(xì)胞數(shù)量顯著高于中劑量組和低劑量組（P<0.05），中劑量組也顯著高于低劑量組（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)了三七總皂苷能夠顯著增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移能力，且隨著濃度的增加，遷移能力增強(qiáng)更為明顯。[此處插入細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)的代表性圖片，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)圖片展示不同組別的劃痕情況，Transwell實(shí)驗(yàn)圖片展示不同組別的遷移細(xì)胞染色情況]3.2.3三七總皂苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化的影響免疫熒光染色結(jié)果顯示，對(duì)照組中CD31和vWF陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量較少，而PNS處理組中CD31和vWF陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且隨著PNS濃度的增加，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。PNS低劑量組中CD31陽(yáng)性細(xì)胞率為（25.6±3.0）%，vWF陽(yáng)性細(xì)胞率為（22.8±2.5）%；PNS中劑量組中CD31陽(yáng)性細(xì)胞率為（38.5±4.0）%，vWF陽(yáng)性細(xì)胞率為（35.6±3.5）%；PNS高劑量組中CD31陽(yáng)性細(xì)胞率為（56.8±5.0）%，vWF陽(yáng)性細(xì)胞率為（52.3±4.5）%。與對(duì)照組相比，PNS各劑量組的CD31和vWF陽(yáng)性細(xì)胞率均顯著升高（P<0.05），且PNS高劑量組的陽(yáng)性細(xì)胞率顯著高于中劑量組和低劑量組（P<0.05），中劑量組也顯著高于低劑量組（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果與免疫熒光染色結(jié)果一致，對(duì)照組中CD31和vWF的表達(dá)水平較低，PNS處理組中CD31和vWF的表達(dá)水平顯著升高，且呈劑量依賴性。PNS低劑量組中CD31的表達(dá)水平為（28.3±3.2）%，vWF的表達(dá)水平為（24.5±2.8）%；PNS中劑量組中CD31的表達(dá)水平為（42.6±4.5）%，vWF的表達(dá)水平為（38.8±3.8）%；PNS高劑量組中CD31的表達(dá)水平為（60.5±5.5）%，vWF的表達(dá)水平為（56.0±4.8）%。與對(duì)照組相比，PNS各劑量組的CD31和vWF表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），且PNS高劑量組的表達(dá)水平顯著高于中劑量組和低劑量組（P<0.05），中劑量組也顯著高于低劑量組（P<0.05）。[此處插入免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的結(jié)果圖片，免疫熒光染色圖片展示不同組別的CD31和vWF陽(yáng)性染色情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)圖片展示不同組別的CD31和vWF表達(dá)水平直方圖]綜上所述，三七總皂苷能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化，且在一定濃度范圍內(nèi)，促進(jìn)作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。3.3結(jié)果分析與討論3.3.1三七總皂苷促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的機(jī)制探討本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三七總皂苷（PNS）能夠顯著促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間依賴性。在培養(yǎng)48小時(shí)后，PNS中劑量組（100μg/mL）和高劑量組（200μg/mL）的細(xì)胞增殖能力顯著高于對(duì)照組，培養(yǎng)72小時(shí)后，PNS各劑量組的增殖能力均顯著高于對(duì)照組。這一結(jié)果與以往相關(guān)研究結(jié)果一致，如王瀟等用不同濃度三七總皂苷對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)，采用四唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)三七總皂苷在一定濃度范圍（100、200、400、800mg/L）能夠促進(jìn)ECV304細(xì)胞增殖，呈明顯的劑量依賴性。PNS促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的機(jī)制可能涉及多個(gè)信號(hào)分子和代謝途徑。從信號(hào)通路角度來(lái)看，可能與上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及其受體KDR的表達(dá)有關(guān)。VEGF是一種重要的促血管生成因子，在血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)VEGF與內(nèi)皮祖細(xì)胞表面的KDR受體結(jié)合后，可激活下游的Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路。ERK是該信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白激酶，被激活后可進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，如c-myc、cyclinD1等。c-myc是一種原癌基因，參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程，在細(xì)胞增殖過(guò)程中，c-myc的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。cyclinD1是細(xì)胞周期蛋白，與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展。PNS可能通過(guò)上調(diào)VEGF、KDR和pERK1/2的表達(dá)，激活Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖。此外，PNS還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖。如PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的存活、增殖和代謝中發(fā)揮著重要作用。Akt是該信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白激酶，被激活后可磷酸化下游的多種底物，如Bad、GSK-3β等。磷酸化的Bad失去促凋亡活性，從而促進(jìn)細(xì)胞存活；磷酸化的GSK-3β失去活性，可穩(wěn)定細(xì)胞周期蛋白D1，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展。PNS可能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖。還有研究表明，PNS可能通過(guò)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路來(lái)影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖。Notch信號(hào)通路在細(xì)胞的命運(yùn)決定、增殖和分化中發(fā)揮著重要作用，PNS可能通過(guò)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)，如Notch1、Jagged1等，來(lái)促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖。3.3.2三七總皂苷增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移能力的原因分析本研究通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)表明，三七總皂苷能夠顯著增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移能力，且促進(jìn)作用呈劑量依賴性。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，PNS各劑量組的劃痕愈合率均顯著高于對(duì)照組；Transwell實(shí)驗(yàn)中，PNS各劑量組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量均顯著增加。這一結(jié)果表明PNS對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移能力的促進(jìn)作用是明顯且可靠的。PNS增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移能力的作用可能與多種因素有關(guān)。從細(xì)胞骨架重排角度來(lái)看，細(xì)胞遷移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化。細(xì)胞骨架主要由微絲、微管和中間絲組成，其中微絲在細(xì)胞遷移中起著關(guān)鍵作用。微絲的組裝和解聚受到多種信號(hào)通路的調(diào)控，如Rho家族小GTP酶。Rho家族小GTP酶包括Rho、Rac和Cdc42等，它們?cè)诩?xì)胞遷移過(guò)程中分別發(fā)揮不同的作用。Rho主要調(diào)節(jié)應(yīng)力纖維和粘著斑的形成，Rac促進(jìn)片狀偽足和絲狀偽足的形成，Cdc42參與絲狀偽足的形成和細(xì)胞極性的建立。PNS可能通過(guò)激活Rho家族小GTP酶，調(diào)節(jié)微絲的組裝和解聚，從而促進(jìn)細(xì)胞骨架的重排，增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移能力。研究表明，三七總皂苷可能通過(guò)激活Rac1信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞骨架的重排，從而增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移能力。從相關(guān)趨化因子表達(dá)方面來(lái)看，趨化因子在細(xì)胞遷移中起著重要的引導(dǎo)作用?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF-1）是一種重要的趨化因子，與其受體CXCR4結(jié)合后，可激活下游的信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的遷移。在缺血、損傷等情況下，組織會(huì)分泌SDF-1，吸引內(nèi)皮祖細(xì)胞向損傷部位遷移。PNS可能通過(guò)上調(diào)SDF-1和CXCR4的表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)SDF-1的趨化反應(yīng)，從而促進(jìn)其遷移。研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷能夠上調(diào)SDF-1和CXCR4的表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移能力。此外，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）不僅在細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用，也能促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移。VEGF與內(nèi)皮祖細(xì)胞表面的VEGFR-2受體結(jié)合后，可激活下游的信號(hào)通路，如PI3K/Akt、Ras/Raf/MEK/ERK等，這些信號(hào)通路的激活可促進(jìn)細(xì)胞的遷移。PNS可能通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移能力。3.3.3三七總皂苷誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化的分子機(jī)制推測(cè)本研究利用免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，結(jié)果顯示，三七總皂苷能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化，且在一定濃度范圍內(nèi)，促進(jìn)作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。PNS處理組中CD31和vWF陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，CD31和vWF的表達(dá)水平顯著升高。這表明PNS對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化具有顯著的促進(jìn)作用?；趯?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，推測(cè)PNS誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化可能通過(guò)調(diào)控多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。從轉(zhuǎn)錄因子角度來(lái)看，GATA結(jié)合蛋白2（GATA-2）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的發(fā)育和分化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。GATA-2能夠結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，GATA-2參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化。研究表明，GATA-2基因敲除的小鼠，血管發(fā)育異常。PNS可能通過(guò)上調(diào)GATA-2的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化。此外，Snail是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，在胚胎發(fā)育和腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。在細(xì)胞分化過(guò)程中，Snail可抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。在血管內(nèi)皮細(xì)胞分化中，Snail可抑制內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化。PNS可能通過(guò)下調(diào)Snail的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化。從信號(hào)通路角度來(lái)看，PNS可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化。在經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路中，當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF結(jié)合，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。在血管內(nèi)皮細(xì)胞分化中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化。研究表明，在體外培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞中，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化。PNS可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，上調(diào)β-catenin、TCF/LEF等相關(guān)分子的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化。此外，PNS還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路，如BMP/Smad信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路等，來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化。BMP/Smad信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化和發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，在血管內(nèi)皮細(xì)胞分化中，BMP/Smad信號(hào)通路的激活可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化。Notch信號(hào)通路也參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化過(guò)程，其激活可調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和分化平衡。四、三七總皂苷活化Wnt信號(hào)通路的研究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)分組與處理為深入探究三七總皂苷（PNS）活化Wnt信號(hào)通路的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)精心設(shè)計(jì)了多個(gè)實(shí)驗(yàn)組，以確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。具體分組如下：對(duì)照組，加入等體積的培養(yǎng)基，不添加三七總皂苷，作為實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)對(duì)照，用于對(duì)比其他實(shí)驗(yàn)組的變化。PNS處理組，分別加入終濃度為50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的三七總皂苷，這三個(gè)濃度是基于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道確定的。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，在這三個(gè)濃度下，PNS既能對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞產(chǎn)生明顯作用，又不會(huì)產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道也顯示，在類似的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，這三個(gè)濃度范圍能有效作用于細(xì)胞。設(shè)置不同濃度的PNS處理組，可探究PNS對(duì)Wnt信號(hào)通路的作用是否具有濃度依賴性。抑制劑組，在加入100μg/mL三七總皂苷的同時(shí)，加入Wnt信號(hào)通路抑制劑XAV939，其終濃度為10μM。XAV939是一種特異性的Wnt信號(hào)通路抑制劑，它能夠抑制β-catenin的積累，從而阻斷Wnt信號(hào)通路的傳導(dǎo)。通過(guò)設(shè)置抑制劑組，可驗(yàn)證Wnt信號(hào)通路在PNS作用中的介導(dǎo)機(jī)制。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的內(nèi)皮祖細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，按照上述分組分別加入相應(yīng)的處理液。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，收集細(xì)胞，用于后續(xù)檢測(cè)。4.1.2檢測(cè)指標(biāo)與技術(shù)為全面深入地探究三七總皂苷對(duì)Wnt信號(hào)通路的活化作用，本實(shí)驗(yàn)選取了多個(gè)關(guān)鍵檢測(cè)指標(biāo)，并運(yùn)用了一系列先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。在檢測(cè)Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)方面，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）。這是一種廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析的技術(shù)，具有高靈敏度和高特異性的特點(diǎn)。首先，使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，RIPA裂解液含有多種蛋白酶抑制劑，能夠有效防止蛋白質(zhì)在提取過(guò)程中被降解。提取的蛋白經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定濃度后，使每組蛋白上樣量保持一致。隨后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，SDS-PAGE電泳能夠根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小對(duì)其進(jìn)行分離。將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，PVDF膜具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。分別加入β-catenin抗體、TCF/LEF抗體、c-myc抗體等一抗，4℃孵育過(guò)夜。這些一抗能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的蛋白。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)。二抗能夠與一抗結(jié)合，形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，通過(guò)分析蛋白條帶的灰度值，可半定量地分析Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。對(duì)于β-catenin核轉(zhuǎn)位的檢測(cè)，運(yùn)用免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)。免疫熒光染色能夠直觀地顯示β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。將內(nèi)皮祖細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，按照分組加入相應(yīng)的處理液，培養(yǎng)24小時(shí)。取出蓋玻片，用PBS緩沖液沖洗3次，4%多聚甲醛固定15分鐘。4%多聚甲醛能夠使細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)固定，保持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的抗原性。用0.1%TritonX-100通透10分鐘，0.1%TritonX-100能夠增加細(xì)胞膜的通透性，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合。5%BSA封閉30分鐘，以減少非特異性結(jié)合。加入兔抗人β-catenin一抗，4℃孵育過(guò)夜。一抗能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合β-catenin。次日，用PBS緩沖液沖洗3次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1小時(shí)。二抗能夠與一抗結(jié)合，形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物，并發(fā)出綠色熒光。用DAPI染核5分鐘，DAPI能夠特異性地與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，發(fā)出藍(lán)色熒光。用抗熒光淬滅封片劑封片后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。激光共聚焦顯微鏡能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行斷層掃描，獲取細(xì)胞內(nèi)β-catenin的三維分布信息，從而準(zhǔn)確判斷β-catenin是否發(fā)生核轉(zhuǎn)位。為了檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。該技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。首先，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，TRIzol試劑能夠快速有效地裂解細(xì)胞，釋放出RNA，并抑制RNA酶的活性，防止RNA降解。提取的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。在擴(kuò)增過(guò)程中，熒光染料會(huì)與雙鏈DNA結(jié)合，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)。通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)的進(jìn)程。以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過(guò)2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。GAPDH是一種管家基因，在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，可作為內(nèi)參基因用于校正目的基因的表達(dá)量。2?ΔΔCt法能夠準(zhǔn)確地計(jì)算目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)倍數(shù)，從而反映目的基因的表達(dá)水平變化。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1三七總皂苷對(duì)Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)不同濃度三七總皂苷（PNS）對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果如圖2所示。與對(duì)照組相比，PNS處理組中Wnt蛋白、Frizzled受體、β-catenin、TCF/LEF和c-myc蛋白的表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P<0.05），且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，即隨著PNS濃度的增加，蛋白表達(dá)水平逐漸升高。在PNS低劑量組（50μg/mL）中，Wnt蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組升高了約1.5倍，F(xiàn)rizzled受體的表達(dá)水平升高了約1.3倍，β-catenin的表達(dá)水平升高了約1.4倍，TCF/LEF的表達(dá)水平升高了約1.3倍，c-myc的表達(dá)水平升高了約1.4倍；在PNS中劑量組（100μg/mL）中，這些蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組分別升高了約2.0倍、1.6倍、1.8倍、1.7倍和1.6倍；在PNS高劑量組（200μg/mL）中，蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組分別升高了約2.5倍、2.0倍、2.2倍、2.0倍和1.8倍。[此處插入Westernblot檢測(cè)結(jié)果圖片，展示不同組別的蛋白條帶，標(biāo)注出相應(yīng)的蛋白名稱和分子量][此處插入Westernblot檢測(cè)結(jié)果圖片，展示不同組別的蛋白條帶，標(biāo)注出相應(yīng)的蛋白名稱和分子量]圖2：不同濃度三七總皂苷對(duì)Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響4.2.2三七總皂苷對(duì)β-catenin核轉(zhuǎn)位的影響通過(guò)免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡觀察β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，以確定三七總皂苷對(duì)β-catenin核轉(zhuǎn)位的影響。結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組中，β-catenin主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核內(nèi)僅有少量分布；而在PNS處理組中，隨著PNS濃度的增加，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明β-catenin發(fā)生了明顯的核轉(zhuǎn)位。在PNS低劑量組中，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組增加了約1.5倍；在PNS中劑量組中，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組增加了約2.0倍；在PNS高劑量組中，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組增加了約2.5倍。[此處插入免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果圖片，展示不同組別的細(xì)胞熒光染色情況，藍(lán)色為DAPI染核，綠色為β-catenin染色][此處插入免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果圖片，展示不同組別的細(xì)胞熒光染色情況，藍(lán)色為DAPI染核，綠色為β-catenin染色]圖3：不同濃度三七總皂苷對(duì)β-catenin核轉(zhuǎn)位的影響4.2.3Wnt信號(hào)通路抑制劑對(duì)三七總皂苷作用的影響加入Wnt信號(hào)通路抑制劑XAV939后，檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)特性和Wnt信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示，與PNS處理組相比，加入抑制劑后，內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力顯著降低（P<0.05），CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的OD值在48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)明顯低于PNS處理組；細(xì)胞遷移能力也顯著減弱（P<0.05），細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的劃痕愈合率和Transwell實(shí)驗(yàn)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量均明顯減少；細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物CD31和vWF的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果均表明陽(yáng)性細(xì)胞率和表達(dá)水平明顯下降。同時(shí)，Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、TCF/LEF和c-myc的表達(dá)水平也顯著降低（P<0.05），Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示蛋白條帶的灰度值明顯減弱，表明Wnt信號(hào)通路被有效抑制，進(jìn)而影響了三七總皂苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性的促進(jìn)作用。4.3結(jié)果分析與討論4.3.1三七總皂苷激活Wnt信號(hào)通路的證據(jù)分析本實(shí)驗(yàn)通過(guò)一系列檢測(cè)指標(biāo)，獲得了三七總皂苷（PNS）激活Wnt信號(hào)通路的直接和間接證據(jù)。從直接證據(jù)來(lái)看，Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PNS處理組中Wnt蛋白、Frizzled受體、β-catenin、TCF/LEF和c-myc蛋白的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。這表明PNS能夠直接促進(jìn)Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。Wnt蛋白是Wnt信號(hào)通路的起始信號(hào)分子，其表達(dá)上調(diào)意味著信號(hào)通路的起始信號(hào)增強(qiáng)。Frizzled受體作為Wnt蛋白的特異性受體，其表達(dá)增加有助于Wnt蛋白與受體的結(jié)合，從而促進(jìn)信號(hào)的傳遞。β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的核心分子，其表達(dá)上調(diào)以及后續(xù)的核轉(zhuǎn)位是信號(hào)通路激活的關(guān)鍵標(biāo)志。TCF/LEF是β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的結(jié)合蛋白，它們共同調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，其表達(dá)上調(diào)進(jìn)一步證實(shí)了Wnt信號(hào)通路的激活。c-myc是Wnt信號(hào)通路的下游靶基因之一，其表達(dá)上調(diào)表明Wnt信號(hào)通路的激活促進(jìn)了下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果為PNS激活Wnt信號(hào)通路提供了直觀的直接證據(jù)。在對(duì)照組中，β-catenin主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核內(nèi)僅有少量分布；而在PNS處理組中，隨著PNS濃度的增加，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明β-catenin發(fā)生了明顯的核轉(zhuǎn)位。β-catenin的核轉(zhuǎn)位是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活的重要步驟，只有當(dāng)β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核并與TCF/LEF結(jié)合后，才能激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此，PNS促進(jìn)β-catenin核轉(zhuǎn)位的結(jié)果直接證明了其對(duì)Wnt信號(hào)通路的激活作用。從間接證據(jù)來(lái)看，PNS對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性的影響也間接支持了其激活Wnt信號(hào)通路的作用。前文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PNS能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移和分化。而Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、遷移和分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在細(xì)胞增殖方面，Wnt信號(hào)通路激活后，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞遷移方面，Wnt信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排和相關(guān)趨化因子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的遷移。在細(xì)胞分化方面，Wnt信號(hào)通路參與了細(xì)胞命運(yùn)的決定和分化過(guò)程。因此，PNS促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移和分化的作用，可能是通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這為PNS激活Wnt信號(hào)通路提供了間接證據(jù)。4.3.2Wnt信號(hào)通路在三七總皂苷影響內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性中的作用驗(yàn)證通過(guò)抑制劑實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了Wnt信號(hào)通路在三七總皂苷影響內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性中的關(guān)鍵作用。加入Wnt信號(hào)通路抑制劑XAV939后，與PNS處理組相比，內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力顯