免疫學(xué)檢查技術(shù)演講人：日期:目錄CATALOGUE基礎(chǔ)原理基礎(chǔ)原理抗原抗體檢測(cè)技術(shù)免疫細(xì)胞功能分析分子免疫學(xué)技術(shù)臨床與科研應(yīng)用質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)化01基礎(chǔ)原理PART技術(shù)原理與流程樣本前處理組織標(biāo)本需經(jīng)4%多聚甲醛固定（保留抗原性）、梯度脫水石蠟包埋或OCT包埋冰凍切片，切片厚度通常為3-5μm，過(guò)厚易導(dǎo)致非特異性染色?？乖迯?fù)技術(shù)阻斷與孵育針對(duì)甲醛固定導(dǎo)致的抗原交聯(lián)，采用熱誘導(dǎo)表位修復(fù)（HIER，pH6.0檸檬酸緩沖液）或蛋白酶K消化，恢復(fù)抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)，是染色成功的關(guān)鍵步驟。先以3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，10%正常血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，再依次孵育一抗（4℃過(guò)夜）、生物素化二抗及辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記鏈霉親和素，各步驟間需嚴(yán)格PBS洗滌。123結(jié)果判讀與質(zhì)量控制DAB（棕黃色）適用于普通光鏡，AEC（紅色）需避光保存，熒光標(biāo)記（FITC/TRITC）需共聚焦顯微鏡觀察，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮O(shè)備配置優(yōu)化顯色方案。顯色系統(tǒng)選擇陽(yáng)性定位標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參與陰性對(duì)照胞膜（CD20）、胞質(zhì)（CK）、核（Ki-67）等不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)染色需匹配對(duì)應(yīng)抗體特性，排除邊緣效應(yīng)、干燥偽影等假陽(yáng)性，必要時(shí)進(jìn)行連續(xù)切片對(duì)照。必設(shè)陽(yáng)性組織對(duì)照（已知表達(dá)組織）和陰性對(duì)照（省略一抗或同型IgG），同時(shí)使用β-actin等看家蛋白驗(yàn)證樣本質(zhì)量，確保結(jié)果可重復(fù)性。臨床應(yīng)用場(chǎng)景腫瘤診斷與分型通過(guò)檢測(cè)CK7/CK20組合鑒別腺癌來(lái)源，CD3/CD20區(qū)分T/B細(xì)胞淋巴瘤，ER/PR/HER2指導(dǎo)乳腺癌內(nèi)分泌治療和靶向治療選擇。感染病原體檢測(cè)針對(duì)HPV（p16過(guò)表達(dá)）、EBV（LMP1）、乙肝（HBsAg）等病原體抗原進(jìn)行組織定位，比PCR更直觀顯示感染與病變的時(shí)空關(guān)系。自身免疫病研究皮膚狼瘡帶試驗(yàn)檢測(cè)IgG/IgM在真皮-表皮交界處沉積，類風(fēng)濕因子在滑膜組織的表達(dá)有助于關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制解析。02抗原抗體檢測(cè)技術(shù)PART凝集與沉淀試驗(yàn)沉淀試驗(yàn)（免疫擴(kuò)散）抗原與抗體在凝膠中擴(kuò)散形成可見(jiàn)沉淀線，如單向免疫擴(kuò)散（定量檢測(cè)IgG）和雙向免疫擴(kuò)散（分析抗原抗體特異性）。適用于復(fù)雜樣本的組分分析，但耗時(shí)較長(zhǎng)（24-72小時(shí)）。間接凝集試驗(yàn)將可溶性抗原吸附于載體顆粒（如乳膠、紅細(xì)胞）表面，再與抗體結(jié)合形成凝集，用于檢測(cè)梅毒螺旋體抗體（如RPR試驗(yàn)）或類風(fēng)濕因子。其靈敏度高于直接凝集，且可檢測(cè)微量抗體。直接凝集試驗(yàn)通過(guò)抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合形成肉眼可見(jiàn)的凝集顆粒，常用于細(xì)菌分型（如沙門氏菌O抗原檢測(cè)）或血型鑒定（ABO血型系統(tǒng)）。該方法操作簡(jiǎn)便但靈敏度較低，需高濃度抗原抗體反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）雙抗體夾心法用捕獲抗體固定待測(cè)抗原，再加入酶標(biāo)檢測(cè)抗體，通過(guò)底物顯色定量抗原（如HBsAg檢測(cè)）。靈敏度可達(dá)pg/mL級(jí)，但需抗原具備多個(gè)表位以避免鉤狀效應(yīng)。間接法用于抗體檢測(cè)（如HIV抗體篩查），抗原包被后加入待測(cè)血清，酶標(biāo)二抗顯色。成本低且通量高，但可能因非特異性結(jié)合導(dǎo)致假陽(yáng)性。競(jìng)爭(zhēng)法樣本抗原與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合有限抗體，顯色強(qiáng)度與樣本抗原濃度負(fù)相關(guān)（如小分子激素檢測(cè)）。適合半抗原分析，但標(biāo)準(zhǔn)曲線需嚴(yán)格校準(zhǔn)。免疫熒光與放射免疫直接免疫熒光（DIF）放射免疫分析（RIA）間接免疫熒光（IIF）熒光素標(biāo)記抗體直接與組織切片中抗原結(jié)合，用于自身免疫?。ㄈ缣彀挴廔gG沉積）或病原體檢測(cè)（如狂犬病毒抗原）。定位精確但需避光操作，且抗體標(biāo)記成本高。一抗與抗原結(jié)合后，熒光標(biāo)記二抗放大信號(hào)，用于抗核抗體（ANA）篩查。靈敏度提升且可檢測(cè)多抗體類型，但需排除非特異性熒光干擾。利用放射性同位素（如12?I）標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，通過(guò)γ計(jì)數(shù)器定量（如甲狀腺激素T3/T4檢測(cè)）。靈敏度極高（fg/mL級(jí)），但存在放射性污染風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)逐漸被ELISA替代。03免疫細(xì)胞功能分析PARTCD4+T細(xì)胞（輔助性T細(xì)胞）：CD4+T細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的核心調(diào)節(jié)者，通過(guò)分泌細(xì)胞因子（如IL-2、IFN-γ）激活B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他T細(xì)胞，在抗感染和自身免疫疾病中起關(guān)鍵作用。其數(shù)量減少可能提示HIV感染或原發(fā)性免疫缺陷。CD8+T細(xì)胞（細(xì)胞毒性T細(xì)胞）：CD8+T細(xì)胞直接殺傷病毒感染或癌變的靶細(xì)胞，并通過(guò)釋放穿孔素、顆粒酶誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。其比例異?？赡芘c慢性病毒感染（如HBV、HCV）或腫瘤免疫逃逸相關(guān)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg，如CD4+CD25+FoxP3+）：Treg細(xì)胞通過(guò)抑制過(guò)度免疫反應(yīng)維持自身耐受，其功能缺陷可導(dǎo)致自身免疫病（如系統(tǒng)性紅斑狼瘡），而過(guò)度活化可能促進(jìn)腫瘤微環(huán)境免疫抑制。γδT細(xì)胞與NKT細(xì)胞：這類非經(jīng)典T細(xì)胞兼具固有免疫和適應(yīng)性免疫特征，γδT細(xì)胞在黏膜防御和抗腫瘤中發(fā)揮作用，NKT細(xì)胞通過(guò)快速分泌細(xì)胞因子參與炎癥調(diào)控。淋巴細(xì)胞亞群分型細(xì)胞增殖與活性測(cè)定MTT比色法通過(guò)檢測(cè)線粒體脫氫酶將MTT還原為紫色甲瓚的能力，定量細(xì)胞增殖活性，常用于評(píng)估免疫細(xì)胞（如T細(xì)胞）對(duì)絲裂原（PHA）或抗原刺激的響應(yīng)強(qiáng)度。CFSE熒光標(biāo)記追蹤利用羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）標(biāo)記細(xì)胞膜，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熒光稀釋程度，精確分析淋巴細(xì)胞分裂代數(shù)及增殖動(dòng)力學(xué)。3H-胸腺嘧啶摻入法通過(guò)測(cè)量放射性同位素標(biāo)記的胸腺嘧啶被增殖細(xì)胞DNA整合的量，反映細(xì)胞分裂速率，是研究免疫抑制劑或細(xì)胞因子對(duì)淋巴細(xì)胞增殖影響的經(jīng)典方法。ELISpot檢測(cè)細(xì)胞因子分泌在單細(xì)胞水平檢測(cè)IFN-γ、IL-4等細(xì)胞因子的分泌斑點(diǎn)，評(píng)估抗原特異性T細(xì)胞的活化狀態(tài)，適用于疫苗免疫效果評(píng)價(jià)或感染性疾病研究。吞噬功能檢測(cè)中性粒細(xì)胞吞噬試驗(yàn)：將熒光標(biāo)記的細(xì)菌（如大腸桿菌）或酵母多糖與中性粒細(xì)胞共孵育，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)或顯微鏡觀察吞噬率和吞噬指數(shù)，評(píng)估固有免疫防御能力。巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定：采用乳膠微球或凋亡細(xì)胞作為靶物質(zhì)，檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬效率，異常結(jié)果可能提示慢性肉芽腫病或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病。氧化爆發(fā)試驗(yàn)（DHR123/NBT還原法）：通過(guò)二氫羅丹明123（DHR123）或硝基藍(lán)四氮唑（NBT）還原反應(yīng)，定量中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在吞噬過(guò)程中產(chǎn)生活性氧（ROS）的能力，用于診斷慢性肉芽腫病等吞噬功能缺陷。補(bǔ)體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用：在血清補(bǔ)體存在條件下，分析病原體（如金黃色葡萄球菌）被吞噬細(xì)胞清除的效率，揭示補(bǔ)體系統(tǒng)與吞噬細(xì)胞的協(xié)同功能缺陷。04分子免疫學(xué)技術(shù)PART免疫印跡法（WesternBlot）高分辨率蛋白分離利用SDS電泳技術(shù)，根據(jù)分子量差異將復(fù)雜樣本中的蛋白質(zhì)分離，確保目標(biāo)蛋白的精確識(shí)別和定位。特異性抗體檢測(cè)通過(guò)一抗與目標(biāo)蛋白結(jié)合，再與標(biāo)記的二抗反應(yīng)，利用化學(xué)發(fā)光或熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高特異性的蛋白檢測(cè)。定量與定性分析結(jié)合圖像分析軟件，可對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量或絕對(duì)定量，廣泛應(yīng)用于疾病標(biāo)志物研究、藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證等領(lǐng)域。應(yīng)用場(chǎng)景擴(kuò)展除常規(guī)實(shí)驗(yàn)室研究外，還用于臨床診斷（如HIV抗體檢測(cè)）、轉(zhuǎn)基因生物鑒定及蛋白質(zhì)相互作用研究。組織原位蛋白定位多重染色技術(shù)通過(guò)特異性抗體標(biāo)記，在石蠟切片或冰凍切片上直觀顯示目標(biāo)蛋白在組織或細(xì)胞中的空間分布（如核內(nèi)、膜表面）。采用不同熒光標(biāo)記的二抗，實(shí)現(xiàn)同一標(biāo)本中多種蛋白共定位分析，揭示細(xì)胞功能狀態(tài)或病理微環(huán)境特征。免疫組化與免疫細(xì)胞化學(xué)自動(dòng)化與數(shù)字化發(fā)展結(jié)合全自動(dòng)染色平臺(tái)和數(shù)字病理掃描系統(tǒng)，提高結(jié)果重復(fù)性并支持大數(shù)據(jù)分析，推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療發(fā)展。臨床病理診斷價(jià)值廣泛應(yīng)用于腫瘤分型（如HER2檢測(cè)）、感染性疾病病原體定位及自身免疫性疾病組織損傷評(píng)估。流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用通過(guò)熒光標(biāo)記抗體同時(shí)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞表面/胞內(nèi)10-30種標(biāo)記物，解析免疫細(xì)胞亞群（如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞）功能狀態(tài)。多參數(shù)細(xì)胞表型分析配備分選模塊的流式細(xì)胞儀可在每秒數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞速率下，高純度分選目標(biāo)群體，支持單細(xì)胞測(cè)序或功能實(shí)驗(yàn)。高速分選與單細(xì)胞研究結(jié)合鈣離子熒光探針、線粒體膜電位染料等，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡、增殖、氧化應(yīng)激等生理過(guò)程。動(dòng)態(tài)功能檢測(cè)用于白血病免疫分型、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)（艾滋病監(jiān)測(cè)）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)等，已建立國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化操作指南。臨床診療標(biāo)準(zhǔn)化05臨床與科研應(yīng)用PART感染性疾病診斷病原體抗原檢測(cè)組織病理學(xué)驗(yàn)證抗體應(yīng)答分析免疫組織化學(xué)技術(shù)可特異性識(shí)別病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等病原體的抗原成分，如乙肝表面抗原（HBsAg）、人類乳頭瘤病毒（HPV）E6/E7蛋白，實(shí)現(xiàn)病原體的直接定位和分型，輔助臨床早期診斷。通過(guò)檢測(cè)患者血清中特異性抗體（如IgM/IgG），結(jié)合免疫熒光或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），可判斷感染階段（急性期或恢復(fù)期），例如EB病毒VCA-IgM陽(yáng)性提示近期感染。在結(jié)核、梅毒等慢性感染中，利用抗酸桿菌免疫染色或梅毒螺旋體免疫組化技術(shù)，可在組織切片中直觀顯示病原體分布，彌補(bǔ)傳統(tǒng)培養(yǎng)法的局限性。自身抗體檢測(cè)針對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的瓜氨酸化肽抗體（抗CCP）、干燥綜合征的抗SSA/SSB抗體，通過(guò)免疫印跡技術(shù)可實(shí)現(xiàn)高靈敏度定量，指導(dǎo)治療方案制定。靶器官免疫損傷評(píng)估補(bǔ)體沉積分析在腎活檢組織中應(yīng)用免疫組化檢測(cè)IgG、C3等沉積物，可明確狼瘡腎炎的病理分型（如IV型彌漫增生性病變），預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。采用間接免疫熒光法檢測(cè)抗核抗體（ANA）、抗雙鏈DNA抗體等標(biāo)志物，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者呈現(xiàn)周邊型熒光模式，特異性高達(dá)95%，為疾病分型提供依據(jù)。自身免疫病檢測(cè)腫瘤免疫標(biāo)志物篩查腫瘤分型標(biāo)志物利用單克隆抗體檢測(cè)ER/PR（乳腺癌激素受體）、HER2（胃癌/乳腺癌靶向治療標(biāo)志物）的表達(dá)水平，指導(dǎo)內(nèi)分泌治療或曲妥珠單抗用藥，檢測(cè)閾值需嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化。微小殘留病灶監(jiān)測(cè)通過(guò)細(xì)胞角蛋白（CKpan）、黑色素瘤標(biāo)志物（HMB-45）等標(biāo)記循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs），結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)可提升檢測(cè)靈敏度至0.01%，用于術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。免疫治療預(yù)測(cè)指標(biāo)PD-L1免疫組化評(píng)分（如22C3、SP142抗體）是評(píng)估非小細(xì)胞肺癌免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效的關(guān)鍵指標(biāo)，需結(jié)合腫瘤比例評(píng)分（TPS）或聯(lián)合陽(yáng)性評(píng)分（CPS）判讀。06質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)化PART所有免疫組化試劑（如一抗、二抗）需定期進(jìn)行效價(jià)測(cè)試，確保其與目標(biāo)抗原結(jié)合的特異性和敏感性，避免因抗體降解導(dǎo)致的假陰性或非特異性染色。試劑與設(shè)備校準(zhǔn)規(guī)范抗體效價(jià)驗(yàn)證包括全自動(dòng)染色儀、顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)的定期校準(zhǔn)，確保溫度控制、孵育時(shí)間、光學(xué)分辨率等參數(shù)符合標(biāo)準(zhǔn)，減少技術(shù)誤差。設(shè)備性能校準(zhǔn)PBS、TBS等緩沖液的pH值及顯色底物（如DAB、AEC）的穩(wěn)定性需每日檢測(cè)，防止因試劑變質(zhì)影響染色結(jié)果。緩沖液與顯色系統(tǒng)驗(yàn)證結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)化流程由兩名以上病理醫(yī)師獨(dú)立判讀切片，通過(guò)一致性分析（如Kappa值）評(píng)估結(jié)果可靠性，減少主觀偏差。雙盲閱片制度陽(yáng)性/陰性對(duì)照設(shè)置半定量評(píng)分系統(tǒng)每批次實(shí)驗(yàn)需包含已知陽(yáng)性和陰性組織對(duì)照，確保染色特異性，并作為結(jié)果判讀的基準(zhǔn)參考。采用國(guó)際通用的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（如H-score、Allred評(píng)分），結(jié)合染色強(qiáng)度（0-3+）和陽(yáng)性細(xì)胞百分比（0-10