DB42Determinationofenzymeactivityofzearalenone-degrad湖北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 2 2 2 2 2 3 4 5 6本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件起草單位：湖北大學、中國農業(yè)科學院油料作物玉米赤霉烯酮降解酶活力的測定尚沒有相關國家和行業(yè)標準，本文件的實施解決了玉米赤霉烯酮素脫毒技術的發(fā)展，對推動玉米赤霉烯酮降解酶本文件通過紫外檢測器和熒光檢測器兩種方法來檢測玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力，兩種方法的都具備，更具有普遍性，更容易被廣大企事業(yè)單位接11范圍本文件規(guī)定了玉米赤霉烯酮降解酶(zearalenone-degradingenzyme,英文縮寫：ZHD)的活力檢測方法。本文件適用于玉米赤霉烯酮降解酶產品，最低檢出量為0.2U/g(U/mL)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。玉米赤霉烯酮降解酶活力單位/ZHD活力單位(U)ZHDactivityunit在37℃、pH值為5.5的條件下，每分鐘從濃度為10μg/mL的玉米赤霉烯酮溶液中降解1μg玉米赤霉烯酮所需的酶量為一個玉米赤霉烯酮降解酶活力單位(U)。4原理ZHD能降解底物玉米赤霉烯酮(zearalenone,英文縮寫：ZEN),ZEN的降解量與ZHD的活性成正比。通過高效液相色譜檢測反應前和反應后殘留的ZEN含量，可以計算得出玉米赤霉烯酮降解酶ZHD活力單5試劑和材料5.1通用要求：除特殊說明外，所用的試劑均為分析純，水應符合GB/T6682中二級水的規(guī)定。5.2甲醇(CH?OH):色譜純。5.3乙腈(CH?CN):色譜純。5.4乙腈/水(60/40,v/v):取60mL乙腈加40mL水。5.5乙腈/水/甲醇(46/46/8,v/v/v):取46mL乙腈，加46mL水和8mL甲醇。5.6微孔濾器：孔徑0.22μm,有機相。5.7玉米赤霉烯酮ZEN標準品：純度≥99.0%。5.8玉米赤霉烯酮ZEN標準溶液：準確稱取1mg的ZEN標準品，用1mL色譜級甲醇配成濃度為1mg/mL的標準儲備液，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。25.9磷酸氫二鈉溶液(0.2mol/L):稱取磷酸氫二鈉14.20g,加水溶解，定容至500mL。5.10檸檬酸溶液(0.2mol/L):稱取檸檬酸19.21g,加水溶解，定容至500mL。5.11磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液(0.2mol/L,pH5.5):取50mL0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液，用大約18mL0.2mol/L檸檬酸溶液進行調節(jié)，用pH計測定使緩沖液pH為5.5。6.2離心機：離心轉速不低于12000r/min。6.4天平：感量0.1mg。6.5恒溫水浴鍋：37℃。6.7秒表：每小時誤差不超過5s。6.8分樣篩：孔徑為0.25mm。固態(tài)試樣應粉碎或充分碾碎，過0.25mm孔徑篩。稱取適量試樣兩份，精確至0.1mg,分別置于mL錐形瓶中，加入100mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液(見5.11)。搖床或磁力攪拌提取30min,離心機4000r/min離心5min,取上清液再用磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖溶液(見5.11)做二次稀釋，使稀釋后的移取適量樣品，用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液(見5.11)進行稀釋、定容，稀釋后的待測酶液中或檸檬酸溶液(見5.10)調整校正至pH5.5,再用磷酸氫二鈉-檸檬酸溶液(見5.11)適當稀釋并定容。流動相：乙腈/水(60/40,v/v);流速：1.0mL/min;柱溫：30℃;3在1.5mL的一次性小管中加入480μL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(見5.11),再加入10μL的底物ZEN(1mg/mL,用色譜純甲醇配制),體系中有10μgZEN,在37℃孵育10min。移取1mL待測酶液，置于具塞試管內，在37℃孵育5min。實驗組：取10μL經過37℃孵育的待測酶液，加入小管(見)中，混勻；對照組：取10μL經過37℃孵育的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(見5.11),加入小管(見)中，混勻。在37℃反應10min后，加入500μL色譜純甲醇終止反應，最后得到1mL的體系。體系中殘留的ZEN應按照7.3.1中規(guī)定的檢測條件進行檢測，上樣量20μL,高效液相色譜測得峰見附錄A,峰面積實驗組為S,對照組為So,做三次平行。通過線性回歸方程計算ZHD活力單位。流動相：乙腈/水/甲醇(46/46/8,v/v/v);檢測波長：激發(fā)波長274nm,發(fā)射波長440nm;柱溫：30℃;進樣量：20μL。4圖2ZEN標準品的高效液相色譜熒光檢測法色譜圖7.4.2標準曲線的繪制取6支1.5mL的塑料小管，用色譜純甲醇將ZEN標準溶液逐級稀釋得到濃度為0.2μg/mL、0.5μg/mL、繪制標準曲線，獲得線性回歸方程，R2達到0.99。在1.5mL的一次性小管中加入480μL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(見5.11),再加入10μL的底物ZEN(1mg/mL,用色譜純甲醇配制),體系中有10μgZEN,在37℃孵育10min。移取1mL待測酶液，置于具塞試管內，在37℃孵育5min。實驗組：取10μL經過37℃孵育的待測酶液，加入小管(見)中，混勻；對照組：取10μL經過37℃孵育的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(見5.11),加入小管(見)中，混勻。在37℃反應10min后，加入500μL色譜純甲醇終止反應，最后得到1mL的體系。體系中殘留的ZEN應按照7.4.1中規(guī)定的檢測條件進行檢測，上樣量20μL,高效液相色譜測得峰面積實驗組為S,對照組為So,做三次平行。通過線性回歸方程計算ZHD活力單位。8試驗數(shù)據(jù)處理試樣中ZHD活力單位以X,表示，單位為酶活力單位每毫升(U/mL),按式(1)計算：……XD——試樣稀釋液中ZHD活力單位，單位為酶活力單位每毫升(U/mL);k——標準曲線斜率；S——實驗組峰面積；1——最后反應體系體積1mL;0.01——反應體系中所用的酶體積(mL