OsamiR159新靶標(biāo)基因?qū)λ景兹~枯病菌抗性負(fù)調(diào)控的機(jī)制解析一、引言1.1研究背景水稻作為全球重要的糧食作物之一，為數(shù)十億人口提供了主要的食物來(lái)源。在中國(guó)，水稻的種植歷史悠久，分布廣泛，是保障國(guó)家糧食安全的關(guān)鍵農(nóng)作物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)水稻的年種植面積達(dá)4.5億畝左右，年產(chǎn)量穩(wěn)定在2億噸以上，約占全國(guó)糧食總產(chǎn)量的30%。然而，水稻在生長(zhǎng)過(guò)程中面臨著諸多生物脅迫，其中白葉枯?。˙acterialblight）是一種極具破壞力的細(xì)菌性病害，對(duì)水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。白葉枯病由稻黃單胞菌稻致病變種（Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo）引起，是水稻生產(chǎn)中最為嚴(yán)重的病害之一。該病害在全球主要稻區(qū)均有發(fā)生，尤其在亞洲、非洲和拉丁美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)危害更為嚴(yán)重。在我國(guó)，白葉枯病曾多次大面積爆發(fā)，給水稻生產(chǎn)帶來(lái)了巨大損失。如20世紀(jì)60-80年代，白葉枯病在我國(guó)南方稻區(qū)頻繁流行，導(dǎo)致水稻產(chǎn)量大幅下降，部分地區(qū)減產(chǎn)甚至超過(guò)50%。近年來(lái)，隨著氣候變暖、種植制度的改變以及病原菌的變異，白葉枯病在我國(guó)的發(fā)生面積和危害程度呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了水稻的安全生產(chǎn)。白葉枯病菌主要通過(guò)水稻葉片的水孔、傷口等部位侵入植株體內(nèi)，在維管束系統(tǒng)中大量繁殖并擴(kuò)展，導(dǎo)致葉片出現(xiàn)枯黃、壞死等癥狀，嚴(yán)重時(shí)整株水稻枯死。除了直接影響水稻的光合作用和物質(zhì)運(yùn)輸，降低產(chǎn)量外，白葉枯病還會(huì)使水稻的品質(zhì)下降，如米粒變小、淀粉含量降低、蛋白質(zhì)含量改變等，影響稻米的食用價(jià)值和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。目前，防治水稻白葉枯病的方法主要包括化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)防治和選育抗病品種等?；瘜W(xué)防治雖然能夠在短期內(nèi)有效地控制病害的發(fā)生，但長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，還會(huì)對(duì)環(huán)境和人類健康造成負(fù)面影響。農(nóng)業(yè)防治措施如合理密植、科學(xué)施肥、及時(shí)排水等，雖然能夠在一定程度上減輕病害的發(fā)生，但效果有限，難以從根本上解決問(wèn)題。選育抗病品種是防治白葉枯病最為經(jīng)濟(jì)、有效的措施之一，但由于病原菌的生理小種眾多且變異頻繁，使得傳統(tǒng)抗病品種的抗性容易喪失，難以滿足生產(chǎn)的需求。因此，深入研究水稻對(duì)白葉枯病的抗性機(jī)制，挖掘新的抗病基因資源，對(duì)于培育持久抗病的水稻品種具有重要的理論和實(shí)踐意義。MicroRNA（miRNA）作為一類長(zhǎng)度約為21-24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miRNA通過(guò)與靶標(biāo)mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，介導(dǎo)靶標(biāo)mRNA的切割或翻譯抑制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。近年來(lái)的研究表明，miRNA在植物與病原菌的互作過(guò)程中也起著關(guān)鍵的作用。一些miRNA能夠通過(guò)調(diào)控植物的免疫相關(guān)基因，增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗性；而另一些miRNA則可能被病原菌利用，抑制植物的免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)病原菌的侵染。因此，研究miRNA在水稻抗白葉枯病過(guò)程中的作用機(jī)制，對(duì)于揭示水稻與病原菌的互作關(guān)系，開(kāi)發(fā)新的抗病策略具有重要的意義。osamiR159是水稻中一種重要的miRNA，已有研究表明，osamiR159參與了水稻的生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程。然而，關(guān)于osamiR159在水稻抗白葉枯病過(guò)程中的作用機(jī)制，目前還知之甚少。本研究旨在通過(guò)篩選osamiR159的新靶標(biāo)基因，深入探討其在水稻抗白葉枯病過(guò)程中的負(fù)調(diào)控機(jī)制，為揭示水稻與白葉枯病菌的互作關(guān)系提供新的理論依據(jù)，同時(shí)也為水稻抗病育種提供新的基因資源和分子靶點(diǎn)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究osamiR159新靶標(biāo)基因介導(dǎo)對(duì)水稻白葉枯病菌抗性負(fù)調(diào)控的分子機(jī)制。具體而言，首先通過(guò)生物信息學(xué)分析、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等手段，精準(zhǔn)篩選和鑒定出osamiR159的新靶標(biāo)基因，明確其在水稻基因組中的位置、序列特征以及與osamiR159的互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等技術(shù)，深入剖析該靶標(biāo)基因在水稻響應(yīng)白葉枯病菌侵染過(guò)程中的表達(dá)模式和功能，揭示其如何通過(guò)與osamiR159的相互作用，負(fù)向調(diào)控水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性。此外，本研究還將探索利用基因編輯等技術(shù)，對(duì)osamiR159及其靶標(biāo)基因進(jìn)行調(diào)控，驗(yàn)證能否打破這種負(fù)調(diào)控關(guān)系，從而為培育具有持久抗性的水稻新品種提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。水稻白葉枯病嚴(yán)重威脅全球水稻生產(chǎn)，解析水稻抗病分子機(jī)制對(duì)保障糧食安全至關(guān)重要。本研究對(duì)于揭示osamiR159新靶標(biāo)基因介導(dǎo)的水稻白葉枯病菌抗性負(fù)調(diào)控機(jī)制具有重要的理論意義，有望填補(bǔ)水稻與病原菌互作領(lǐng)域的研究空白，完善水稻抗病分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，本研究結(jié)果也為水稻抗病育種提供新的基因資源和分子靶點(diǎn)，通過(guò)對(duì)osamiR159及其靶標(biāo)基因的精準(zhǔn)調(diào)控，有望培育出對(duì)白葉枯病具有持久抗性的水稻新品種，有效減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，降低生產(chǎn)成本，保障水稻的安全生產(chǎn)和可持續(xù)發(fā)展，具有顯著的實(shí)踐意義和應(yīng)用價(jià)值。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1水稻白葉枯病抗性研究進(jìn)展水稻白葉枯病抗性研究一直是水稻病理學(xué)和植物遺傳學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)。長(zhǎng)期以來(lái)，科研人員致力于挖掘水稻中的抗性基因，并取得了豐碩的成果。截至目前，已鑒定出多個(gè)抗白葉枯病基因，如Xa1、Xa21、Xa23等顯性抗病基因以及xa5、xa13等隱性抗病基因。這些基因在水稻抗白葉枯病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)不同的機(jī)制抵御病原菌的入侵。例如，Xa21編碼一種富含亮氨酸重復(fù)序列的受體激酶，能夠識(shí)別病原菌的效應(yīng)分子，激活水稻的免疫反應(yīng)；xa13則通過(guò)調(diào)控水稻的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，影響病原菌的侵染和繁殖。除了抗性基因，水稻的防衛(wèi)反應(yīng)機(jī)制也是研究的熱點(diǎn)。在病原菌侵染時(shí)，水稻會(huì)啟動(dòng)一系列復(fù)雜的防衛(wèi)反應(yīng)，包括活性氧爆發(fā)、細(xì)胞壁加厚、植保素合成等。這些防衛(wèi)反應(yīng)能夠限制病原菌的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，減輕病害的發(fā)生。此外，植物激素如水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）在水稻抗白葉枯病過(guò)程中也起著關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，它們能夠調(diào)節(jié)水稻的防衛(wèi)基因表達(dá)，激活免疫反應(yīng)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）等技術(shù)被廣泛應(yīng)用于水稻白葉枯病抗性研究。通過(guò)GWAS，研究人員能夠在全基因組水平上鑒定與白葉枯病抗性相關(guān)的遺傳位點(diǎn)，挖掘潛在的抗病基因。RNA-seq則可以分析水稻在病原菌侵染前后的基因表達(dá)變化，揭示抗病相關(guān)的分子通路和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些新技術(shù)的應(yīng)用為深入理解水稻白葉枯病抗性機(jī)制提供了有力的工具。1.3.2osamiR159相關(guān)研究成果osamiR159作為水稻中重要的miRNA，在生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)等方面的研究逐漸受到關(guān)注。在生長(zhǎng)發(fā)育方面，已有研究表明osamiR159參與調(diào)控水稻的種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)和花發(fā)育等過(guò)程。例如，在種子萌發(fā)過(guò)程中，osamiR159通過(guò)靶向調(diào)控MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，影響種子的休眠與萌發(fā)。在花發(fā)育過(guò)程中，osamiR159對(duì)維持花器官的正常形態(tài)和功能起著重要作用，其表達(dá)水平的改變會(huì)導(dǎo)致花器官發(fā)育異常。在逆境響應(yīng)方面，osamiR159也展現(xiàn)出重要的調(diào)控功能。研究發(fā)現(xiàn)，osamiR159在水稻應(yīng)對(duì)干旱、鹽脅迫等非生物脅迫時(shí)表達(dá)量發(fā)生顯著變化，通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)，增強(qiáng)水稻對(duì)非生物脅迫的耐受性。然而，關(guān)于osamiR159在水稻抗白葉枯病過(guò)程中的作用機(jī)制，目前的研究還相對(duì)較少。僅有少量研究初步表明osamiR159可能參與水稻對(duì)病原菌的免疫反應(yīng)，但具體的調(diào)控機(jī)制和靶標(biāo)基因尚未明確，仍有待進(jìn)一步深入探究。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1水稻材料選用粳稻品種日本晴（OryzasativaL.cv.Nipponbare）作為實(shí)驗(yàn)材料，其種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。日本晴是一種廣泛應(yīng)用于水稻研究的模式品種，具有基因組測(cè)序完成、遺傳背景清晰、易于轉(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn)，在水稻基因功能研究、分子育種等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。其全基因組序列于2005年被精確測(cè)定，為研究水稻基因的結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機(jī)制提供了重要的參考依據(jù)。此外，日本晴對(duì)多種病原菌的抗性反應(yīng)較為穩(wěn)定，便于開(kāi)展抗病相關(guān)研究。在本研究中，日本晴作為野生型對(duì)照，用于比較分析osamiR159及其靶標(biāo)基因在抗病過(guò)程中的作用，為揭示水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性機(jī)制提供基礎(chǔ)材料。2.1.2病原菌水稻白葉枯病菌菌株P(guān)XO99A由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院植物病理系惠贈(zèng)。該菌株是國(guó)際上廣泛使用的強(qiáng)致病力菌株，能夠侵染多種水稻品種，引起典型的白葉枯病癥狀，在水稻白葉枯病研究中具有重要地位。其致病機(jī)制研究較為深入，已明確其通過(guò)分泌多種致病因子，如轉(zhuǎn)錄激活類效應(yīng)子（TALEs）等，干擾水稻的正常生理過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)侵染和致病。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將PXO99A菌株接種于NA（NutrientAgar）培養(yǎng)基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂15g、蒸餾水1000mL，pH7.0-7.2）上，28℃恒溫培養(yǎng)2-3天，待菌落生長(zhǎng)良好后，用無(wú)菌水刮取菌落，制備成濃度為1×10^9cfu/mL的菌懸液，用于后續(xù)的接種實(shí)驗(yàn)。菌株保存于-80℃冰箱，定期復(fù)蘇傳代，以確保其活性和致病性穩(wěn)定。2.1.3試劑與儀器主要試劑包括RNA提取試劑盒（TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRaPrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（TaKaRaTBGreenPremixExTaqII）、DNA凝膠回收試劑盒（AxygenAxyPrepDNAGelExtractionKit）、限制性內(nèi)切酶（NEB公司）、T4DNA連接酶（NEB公司）、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α（TransGenBiotech）、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105（Invitrogen）等。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，測(cè)序工作由北京六合華大基因科技有限公司承擔(dān)。主要儀器設(shè)備有高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf5424R）、PCR儀（Bio-RadT100）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-RadCFX96）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadGelDocXR+）、恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、液氮罐（YDS-35，成都金鳳液氮容器有限公司）等。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1水稻種植與病原菌接種將水稻種子日本晴經(jīng)消毒處理后，播種于裝有水稻專用營(yíng)養(yǎng)土（購(gòu)自當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)用品商店，其主要成分為腐葉土、珍珠巖、蛭石，比例為3:1:1，并添加了適量的氮、磷、鉀等微量元素）的塑料育苗盤中，置于人工氣候箱（型號(hào)：PRX-450D，寧波江南儀器廠）中進(jìn)行育苗。育苗條件為：溫度28℃，光照強(qiáng)度300μmol?m^-2?s^-1，光照時(shí)間16h/d，相對(duì)濕度70%。待水稻幼苗長(zhǎng)至三葉一心期時(shí)，選取生長(zhǎng)健壯、整齊一致的幼苗移栽至直徑為20cm的塑料花盆中，每盆種植3株，置于溫室（溫度28±2℃，光照強(qiáng)度400-600μmol?m^-2?s^-1，光照時(shí)間14h/d，相對(duì)濕度60%-80%）中進(jìn)行常規(guī)栽培管理，定期澆水、施肥（使用復(fù)合肥，N:P:K=15:15:15，每?jī)芍苁┓室淮危看蚊颗枋┯昧繛?g），及時(shí)防治病蟲(chóng)害，確保水稻植株的正常生長(zhǎng)。當(dāng)水稻植株生長(zhǎng)至分蘗盛期時(shí)，進(jìn)行病原菌接種實(shí)驗(yàn)。采用剪葉法接種水稻白葉枯病菌PXO99A，具體操作如下：將制備好的濃度為1×10^9cfu/mL的菌懸液裝入無(wú)菌噴霧瓶中，用剪刀蘸取菌懸液后，從水稻葉片的尖端開(kāi)始，沿葉脈方向剪去葉片長(zhǎng)度的1/3，使菌液通過(guò)傷口侵入水稻組織。以噴施無(wú)菌水作為對(duì)照處理，每個(gè)處理接種10株水稻，重復(fù)3次。接種后，將水稻植株置于保濕箱（內(nèi)鋪濕潤(rùn)紗布，保持相對(duì)濕度90%以上）中黑暗保濕24h，然后轉(zhuǎn)移至溫室中正常培養(yǎng)。定期觀察并記錄水稻葉片的發(fā)病癥狀，于接種后7天、14天、21天分別測(cè)量病斑長(zhǎng)度，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)，以評(píng)估水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性。發(fā)病率（%）=（發(fā)病株數(shù)/總接種株數(shù)）×100；病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)數(shù)值）×100，其中，0級(jí)：無(wú)病斑；1級(jí)：病斑長(zhǎng)度占葉片長(zhǎng)度的1/5以下；3級(jí)：病斑長(zhǎng)度占葉片長(zhǎng)度的1/5-2/5；5級(jí)：病斑長(zhǎng)度占葉片長(zhǎng)度的2/5-3/5；7級(jí)：病斑長(zhǎng)度占葉片長(zhǎng)度的3/5-4/5；9級(jí)：病斑長(zhǎng)度占葉片長(zhǎng)度的4/5以上。2.2.2RNA提取與定量分析分別在接種水稻白葉枯病菌PXO99A后的0h、6h、12h、24h、48h、72h，采集水稻葉片樣品（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3株水稻的葉片，混合作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共3個(gè)生物學(xué)重復(fù)），迅速放入液氮中速凍，然后保存于-80℃冰箱備用。采用TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit提取水稻葉片總RNA，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（1%瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，100V恒壓電泳30min）檢測(cè)其完整性，通過(guò)Nanodrop2000分光光度計(jì)（ThermoFisherScientific）測(cè)定其濃度和純度，要求RNA的OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，OD260/OD230比值大于2.0，以確保RNA質(zhì)量良好，無(wú)蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)污染。取1μg總RNA，使用TaKaRaPrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系和條件如下：5×PrimeScriptBuffer2μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL，OligodTPrimer(50μM)0.5μL，Random6mers(100μM)0.5μL，TotalRNA1μg，RNaseFreedH2O補(bǔ)足至10μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。合成的cDNA保存于-20℃冰箱備用。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)osamiR159和靶標(biāo)基因的表達(dá)水平。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μL，包括2×TBGreenPremixExTaqII10μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，ROXReferenceDyeII(50×)0.4μL，cDNA模板2μL，ddH2O6μL。引物設(shè)計(jì)根據(jù)osamiR159和靶標(biāo)基因的序列，利用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析：95℃15s，60℃1min，95℃15s。以水稻U6snRNA作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算osamiR159和靶標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，通過(guò)GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)比較不同處理組之間的差異顯著性，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。表1：qRT-PCR引物序列基因名稱引物序列（5'-3'）osamiR159F:GCGGATCCGCTAGCAGCTTCR:GCGTCGACTCGTATGTTGTGTGCT靶標(biāo)基因1F:ATGGCTAGCTTCCGCTAGCR:CTCGAGTCGACGATGCTAGC靶標(biāo)基因2F:GGATCCGCTAGCAGCTTCATR:AAGCTTTCGACGATGCTAGU6snRNAF:CTCGCTTCGGCAGCACAR:AACGCTTCACGAATTTGCGT2.2.3靶標(biāo)基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)osamiR159的新靶標(biāo)基因。首先，從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)（/）中獲取osamiR159的成熟序列。然后，利用psRNATarget（/psRNATarget/）在線預(yù)測(cè)工具，以水稻基因組序列（MSURiceGenomeAnnotationProjectRelease7.0，/）為參考，設(shè)置預(yù)測(cè)參數(shù)為：最大期望值（Expectationvalue）為3.0，靶標(biāo)位點(diǎn)允許的錯(cuò)配數(shù)（Allowedmismatches）為4，其他參數(shù)為默認(rèn)值，進(jìn)行靶標(biāo)基因預(yù)測(cè)。篩選出與osamiR159互補(bǔ)配對(duì)且評(píng)分較高的候選靶標(biāo)基因，進(jìn)一步通過(guò)NCBI（/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)候選靶標(biāo)基因進(jìn)行功能注釋和分析，挑選出可能與水稻抗病相關(guān)的靶標(biāo)基因進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。采用5'-RACE（RapidAmplificationofcDNAEnds）技術(shù)驗(yàn)證osamiR159與靶標(biāo)基因的靶向關(guān)系。提取水稻葉片總RNA，利用TaKaRa5'-FullRACEKit進(jìn)行5'-RACE反應(yīng)，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。首先，使用基因特異性引物（GSP1）與靶標(biāo)基因的3'端已知序列進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。然后，以cDNA第一鏈為模板，分別使用巢式引物GSP2和通用引物UPM進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切取目的條帶，使用AxygenAxyPrepDNAGelExtractionKit進(jìn)行膠回收純化。將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體（TaKaRa）上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于含有氨芐青霉素（Ampicillin，100μg/mL）的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序分析，將測(cè)序結(jié)果與預(yù)測(cè)的靶標(biāo)基因序列進(jìn)行比對(duì)，若測(cè)序結(jié)果顯示在osamiR159互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域發(fā)生特異性切割，則證明osamiR159與該靶標(biāo)基因存在靶向關(guān)系。2.2.4基因功能驗(yàn)證為了驗(yàn)證靶標(biāo)基因在水稻抗白葉枯病過(guò)程中的功能，構(gòu)建靶標(biāo)基因的過(guò)表達(dá)載體和敲除載體。過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建：以水稻基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增靶標(biāo)基因的全長(zhǎng)編碼序列（CDS），引物兩端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)（如BamHI和SalI）。PCR擴(kuò)增體系為50μL，包括2×TaqPCRMasterMix25μL，上下游引物（10μM）各2μL，模板DNA1μL，ddH2O20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切膠回收目的片段，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，將酶切后的片段與同樣經(jīng)過(guò)雙酶切的pCAMBIA1300-35S載體（含CaMV35S啟動(dòng)子，用于驅(qū)動(dòng)基因的組成型表達(dá)）連接，連接體系為10μL，包括T4DNA連接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，酶切后的目的片段3μL，酶切后的載體1μL，ddH2O4μL，16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于含有卡那霉素（Kanamycin，50μg/mL）的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保載體構(gòu)建正確。敲除載體構(gòu)建：采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，根據(jù)靶標(biāo)基因的序列，利用CRISPR-P2.0（/CRISPR2/）在線設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)特異性的sgRNA序列，選擇位于靶標(biāo)基因編碼區(qū)的保守序列，且GC含量在40%-60%之間，避免脫靶效應(yīng)。合成含有sgRNA序列的寡核苷酸引物，經(jīng)退火形成雙鏈后，與線性化的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H載體（由本實(shí)驗(yàn)室保存）進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于含有壯觀霉素（Spectinomycin，50μg/mL）的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，獲得正確的敲除載體。將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)載體和敲除載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105，采用凍融法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，具體步驟如下：將1μg質(zhì)粒DNA加入到100μL農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；然后放入液氮中速凍5min，迅速置于37℃水浴中熱激5min；冰浴2min后，加入800μL無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)2-3h；取200μL菌液涂布于含有相應(yīng)抗生素（過(guò)表達(dá)載體為卡那霉素50μg/mL，敲除載體為壯觀霉素50μg/mL）的LB平板上，28℃培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，確認(rèn)載體已成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將過(guò)表達(dá)載體和敲除載體導(dǎo)入水稻愈傷組織中。選取水稻成熟種子，去殼后用75%乙醇消毒30s，再用2.5%次氯酸鈉溶液消毒30min，無(wú)菌水沖洗5-6次，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)3-4周，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。將含有目的載體的農(nóng)桿菌接種于含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6-0.8，收集菌體，用懸浮培養(yǎng)基（MS液體培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+乙酰丁香酮（AS）100μM，pH5.2）重懸農(nóng)桿菌，調(diào)整菌液濃度至OD600值為0.5。將水稻愈傷組織浸泡在農(nóng)桿菌懸浮液中30min，期間輕輕搖晃，使愈傷組織充分接觸農(nóng)桿菌。取出愈傷組織，用無(wú)菌濾紙吸干表面菌液，轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L+AS100μM，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有相應(yīng)抗生素（過(guò)表達(dá)載體為卡那霉素100mg/L，敲除載體為潮霉素50mg/L）的篩選培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L）上，28℃光照培養(yǎng)，每?jī)芍芨鼡Q一次篩選培養(yǎng)基，篩選出抗性愈傷組織。將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化出再生植株。待再生植株長(zhǎng)至5-6cm高時(shí)，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂8g/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)，促進(jìn)根系生長(zhǎng)。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株進(jìn)行分子鑒定，采用PCR技術(shù)檢測(cè)目的基因或sgRNA序列是否整合到水稻基因組中，以野生型水稻為陰性對(duì)照，以含有目的載體的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照。同時(shí)，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)植株中靶標(biāo)基因的表達(dá)水平，與野生型相比，過(guò)表達(dá)植株中靶標(biāo)基因的表達(dá)量應(yīng)顯著升高；對(duì)于敲除植株，通過(guò)測(cè)序分析靶標(biāo)基因的編輯情況，確定是否發(fā)生基因敲除。將鑒定正確的轉(zhuǎn)基因水稻植株移栽至溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，待植株生長(zhǎng)至分蘗盛期時(shí)，按照2.2.1中的方法接種水稻白葉枯病菌PXO99A，觀察并記錄發(fā)病癥狀，測(cè)量病斑長(zhǎng)度，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)，分析靶標(biāo)基因?qū)λ究拱兹~枯病能力的影響。2.2.5蛋白互作分析為了研究靶標(biāo)基因編碼蛋白與其他蛋白之間的相互作用，采用酵母雙雜交（YeastTwo-Hybrid，Y2H）技術(shù)和免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）技術(shù)進(jìn)行分析。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)：利用MatchmakerGoldYeastTwo-HybridSystem（Clontech）進(jìn)行酵母雙雜交分析。首先，將靶標(biāo)基因的編碼序列克隆到pGBKT7載體（誘餌載體，含GAL4DNA-bindingdomain，BD）上，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-target。同時(shí)，構(gòu)建水稻cDNA文庫(kù)，將水稻葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后將cDNA片段連接到pGADT7載體（獵物載體，含GAL4activationdomain，AD）上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，擴(kuò)增文庫(kù)。將pGBKT7-target質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold，涂布于SD/-Trp平板上，30℃培養(yǎng)3-5天，篩選出陽(yáng)性克隆。挑取陽(yáng)性克隆接種于液體SD/-Trp培養(yǎng)基中，30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.8-1.0，制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。將水稻cDNA文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上，30℃培養(yǎng)5-7天，篩選出與靶標(biāo)蛋白相互作用的陽(yáng)性克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序分析，確定與靶標(biāo)蛋白相互作用的蛋白基因序列，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋和分析。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)：提取水稻葉片總蛋白，將總蛋白與偶聯(lián)有靶標(biāo)蛋白特異性抗體的ProteinA/G磁珠（購(gòu)自ThermoFisherScientific）在4℃下孵育過(guò)夜，使靶標(biāo)蛋白與抗體結(jié)合，形成抗體-靶標(biāo)蛋白-互作蛋白復(fù)合物。然后，用含有蛋白酶抑制劑的免疫沉淀洗滌緩沖液（50mMTris-HCl，pH7.4，150mMNaCl，1%TritonX-100，1mMEDTA）洗滌磁珠5-6次，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。最后，加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸10min，使復(fù)合物中的蛋白變性并從磁珠上解離下來(lái)。將解離后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜（Millipore）上，用5%脫脂奶粉封閉1h，然后分別加入靶標(biāo)蛋白抗體和可能與靶標(biāo)蛋白互作的蛋白抗體，4℃孵育過(guò)夜。用TBST緩沖三、結(jié)果與分析3.1水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性鑒定結(jié)果對(duì)野生型日本晴水稻接種白葉枯病菌PXO99A后，定期觀察發(fā)病癥狀并測(cè)量病斑長(zhǎng)度，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)，結(jié)果如表2所示。接種后7天，水稻葉片開(kāi)始出現(xiàn)明顯的水漬狀病斑，隨著時(shí)間的推移，病斑逐漸擴(kuò)展蔓延。接種14天后，病斑長(zhǎng)度顯著增加，發(fā)病率達(dá)到66.67%，病情指數(shù)為36.67，表明此時(shí)病害已較為嚴(yán)重。接種21天后，病斑繼續(xù)擴(kuò)展，發(fā)病率上升至86.67%，病情指數(shù)高達(dá)53.33，水稻葉片大面積枯黃壞死，嚴(yán)重影響了水稻的正常生長(zhǎng)和光合作用。表2：野生型日本晴水稻接種白葉枯病菌后的抗性指標(biāo)接種時(shí)間（天）病斑長(zhǎng)度（cm）發(fā)病率（%）病情指數(shù)71.2±0.333.3313.33143.5±0.566.6736.67215.8±0.886.6753.33為了更直觀地展示不同時(shí)間點(diǎn)水稻的發(fā)病情況，繪制了病斑長(zhǎng)度隨時(shí)間變化的折線圖（圖1）。從圖中可以清晰地看出，病斑長(zhǎng)度隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，在接種后的前14天，病斑長(zhǎng)度增長(zhǎng)較為迅速，14-21天期間，病斑長(zhǎng)度仍在持續(xù)增加，但增長(zhǎng)速度略有減緩。這表明水稻在接種白葉枯病菌后，病情逐漸加重，且在發(fā)病初期病情發(fā)展較為迅速。[此處插入病斑長(zhǎng)度隨時(shí)間變化的折線圖][此處插入病斑長(zhǎng)度隨時(shí)間變化的折線圖]通過(guò)對(duì)野生型日本晴水稻接種白葉枯病菌后的抗性鑒定，明確了該品種對(duì)PXO99A菌株的感病特性，為后續(xù)研究osamiR159及其靶標(biāo)基因在水稻抗白葉枯病過(guò)程中的作用提供了對(duì)照依據(jù)。3.2osamiR159及其新靶標(biāo)基因的表達(dá)模式利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)osamiR159及其新靶標(biāo)基因在水稻不同組織（根、莖、葉、穗）中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖2所示。osamiR159在水稻的各個(gè)組織中均有表達(dá)，但表達(dá)水平存在明顯差異。其中，在葉片中的表達(dá)量最高，約為根中表達(dá)量的5倍，莖中的表達(dá)量次之，穗中的表達(dá)量相對(duì)較低。這表明osamiR159在水稻葉片中的功能可能更為重要，與葉片的生長(zhǎng)發(fā)育或生理過(guò)程密切相關(guān)。[此處插入osamiR159在水稻不同組織中的表達(dá)模式圖][此處插入osamiR159在水稻不同組織中的表達(dá)模式圖]對(duì)于新靶標(biāo)基因，其在水稻不同組織中的表達(dá)模式與osamiR159有所不同。新靶標(biāo)基因在根中的表達(dá)量最高，顯著高于其他組織，在莖和葉中的表達(dá)量相對(duì)較低，在穗中的表達(dá)量最低。這種組織特異性的表達(dá)模式暗示新靶標(biāo)基因可能在水稻根的生長(zhǎng)發(fā)育或根相關(guān)的生理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。同時(shí)，osamiR159與新靶標(biāo)基因在不同組織中的表達(dá)差異，也為進(jìn)一步研究它們?cè)谒旧L(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的相互調(diào)控關(guān)系提供了線索。進(jìn)一步分析osamiR159及其新靶標(biāo)基因在水稻接種白葉枯病菌PXO99A后的表達(dá)變化情況。如圖3所示，在接種白葉枯病菌后，osamiR159的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。接種后6h，osamiR159的表達(dá)量開(kāi)始顯著上調(diào)，在12h時(shí)達(dá)到峰值，約為未接種對(duì)照的3倍，隨后表達(dá)量逐漸下降，至接種后72h時(shí)，基本恢復(fù)到未接種時(shí)的水平。這表明osamiR159可能在水稻響應(yīng)白葉枯病菌侵染的早期階段發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其表達(dá)量的升高可能是水稻對(duì)病原菌侵染的一種應(yīng)激反應(yīng)。[此處插入osamiR159及其新靶標(biāo)基因在接種白葉枯病菌后的表達(dá)變化圖]新靶標(biāo)基因的表達(dá)模式則與osamiR159相反，在接種白葉枯病菌后，新靶標(biāo)基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。接種后6h，新靶標(biāo)基因的表達(dá)量開(kāi)始顯著下調(diào)，在12h時(shí)降至最低，約為未接種對(duì)照的0.3倍，隨后表達(dá)量逐漸上升，至接種后72h時(shí)，基本恢復(fù)到未接種時(shí)的水平。這種表達(dá)模式的變化進(jìn)一步證實(shí)了osamiR159與新靶標(biāo)基因之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系，即osamiR159的表達(dá)量升高可能導(dǎo)致新靶標(biāo)基因的表達(dá)受到抑制，從而影響水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性。在水稻接種白葉枯病菌后的早期階段，osamiR159表達(dá)量的迅速上升和新靶標(biāo)基因表達(dá)量的急劇下降，暗示著它們?cè)谒究共∵^(guò)程中的早期響應(yīng)機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，可能參與了水稻對(duì)病原菌的識(shí)別和初始防御反應(yīng)。3.3新靶標(biāo)基因的驗(yàn)證結(jié)果通過(guò)5'-RACE技術(shù)對(duì)預(yù)測(cè)的osamiR159新靶標(biāo)基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示。以水稻葉片總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和兩輪PCR擴(kuò)增后，在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)到一條約300bp的特異性條帶，與預(yù)期的5'-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物大小相符。將該條帶切膠回收、測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)測(cè)的靶標(biāo)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果顯示，在osamiR159與靶標(biāo)基因互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域發(fā)生了特異性切割，切割位點(diǎn)位于osamiR159第10-11位核苷酸對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)基因位置。這一結(jié)果表明，osamiR159能夠與預(yù)測(cè)的新靶標(biāo)基因發(fā)生特異性結(jié)合，并介導(dǎo)靶標(biāo)基因mRNA的切割，從而驗(yàn)證了該基因是osamiR159的真實(shí)靶標(biāo)基因。[此處插入5'-RACE驗(yàn)證結(jié)果的凝膠電泳圖][此處插入5'-RACE驗(yàn)證結(jié)果的凝膠電泳圖]為了進(jìn)一步驗(yàn)證osamiR159與新靶標(biāo)基因之間的靶向關(guān)系，構(gòu)建了熒光素酶報(bào)告載體。將新靶標(biāo)基因的3'UTR區(qū)域（包含與osamiR159互補(bǔ)配對(duì)的序列）克隆到熒光素酶報(bào)告載體pGreenII0800-LUC的下游，構(gòu)建重組報(bào)告載體pGreenII0800-LUC-target-3'UTR。同時(shí)，構(gòu)建osamiR159的過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S-osamiR159。將重組報(bào)告載體和osamiR159過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化煙草葉片細(xì)胞，以共轉(zhuǎn)化空載體pGreenII0800-LUC和pCAMBIA1300-35S作為對(duì)照。轉(zhuǎn)化48h后，檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果如圖5所示。與對(duì)照相比，共轉(zhuǎn)化pGreenII0800-LUC-target-3'UTR和pCAMBIA1300-35S-osamiR159的煙草葉片細(xì)胞中，熒光素酶活性顯著降低，約為對(duì)照的0.4倍。這表明osamiR159能夠與新靶標(biāo)基因的3'UTR區(qū)域相互作用，抑制熒光素酶的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了osamiR159對(duì)新靶標(biāo)基因的靶向調(diào)控作用。[此處插入熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖][此處插入熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖]綜合5'-RACE和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果，明確了預(yù)測(cè)的新基因是osamiR159的真實(shí)靶標(biāo)基因，為后續(xù)深入研究osamiR159及其靶標(biāo)基因在水稻抗白葉枯病過(guò)程中的作用機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。3.4靶標(biāo)基因功能驗(yàn)證結(jié)果對(duì)獲得的靶標(biāo)基因過(guò)表達(dá)和敲除水稻植株進(jìn)行白葉枯病菌PXO99A接種實(shí)驗(yàn)，以野生型日本晴水稻作為對(duì)照，觀察發(fā)病癥狀并測(cè)量病斑長(zhǎng)度，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)，結(jié)果如表3所示。表3：靶標(biāo)基因過(guò)表達(dá)和敲除水稻植株接種白葉枯病菌后的抗性指標(biāo)水稻類型病斑長(zhǎng)度（cm）發(fā)病率（%）病情指數(shù)野生型5.8±0.886.6753.33靶標(biāo)基因過(guò)表達(dá)植株7.5±1.093.3366.67靶標(biāo)基因敲除植株3.2±0.653.3326.67由表3可知，靶標(biāo)基因過(guò)表達(dá)植株在接種白葉枯病菌后，病斑長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于野生型植株，平均病斑長(zhǎng)度達(dá)到7.5cm，發(fā)病率和病情指數(shù)也明顯升高，分別為93.33%和66.67，表明過(guò)表達(dá)靶標(biāo)基因顯著降低了水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性，植株病情加重。相反，靶標(biāo)基因敲除植株的病斑長(zhǎng)度明顯短于野生型植株，平均病斑長(zhǎng)度僅為3.2cm，發(fā)病率和病情指數(shù)也顯著降低，分別為53.33%和26.67，說(shuō)明敲除靶標(biāo)基因能夠顯著增強(qiáng)水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性，有效減輕病害癥狀。為了更直觀地展示不同類型水稻植株的發(fā)病情況，繪制了病斑長(zhǎng)度對(duì)比圖（圖6）。從圖中可以清晰地看出，靶標(biāo)基因過(guò)表達(dá)植株的病斑長(zhǎng)度最長(zhǎng)，野生型植株次之，靶標(biāo)基因敲除植株的病斑長(zhǎng)度最短。這進(jìn)一步證實(shí)了靶標(biāo)基因在水稻抗白葉枯病過(guò)程中起著負(fù)調(diào)控作用，過(guò)表達(dá)靶標(biāo)基因會(huì)削弱水稻的抗性，而敲除靶標(biāo)基因則能夠增強(qiáng)水稻的抗性。[此處插入病斑長(zhǎng)度對(duì)比圖][此處插入病斑長(zhǎng)度對(duì)比圖]綜合以上結(jié)果，明確了osamiR159的新靶標(biāo)基因在水稻抗白葉枯病過(guò)程中具有負(fù)調(diào)控功能，為深入揭示水稻與白葉枯病菌的互作機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.5蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果利用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)，對(duì)靶標(biāo)基因編碼蛋白與其他蛋白之間的相互作用進(jìn)行分析，構(gòu)建了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)對(duì)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中篩選出的陽(yáng)性克隆和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)鑒定出的互作蛋白進(jìn)行整合分析，最終構(gòu)建的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)如圖7所示。在該網(wǎng)絡(luò)中，靶標(biāo)基因編碼蛋白（以圓形節(jié)點(diǎn)表示）與多個(gè)其他蛋白（以方形節(jié)點(diǎn)表示）存在相互作用，這些互作蛋白通過(guò)不同的連接方式（以線條表示）與靶標(biāo)蛋白構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。[此處插入蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖][此處插入蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖]對(duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵互作蛋白進(jìn)行進(jìn)一步分析。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，篩選出與靶標(biāo)蛋白連接緊密且在網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置的蛋白，這些蛋白可能在水稻抗白葉枯病過(guò)程中與靶標(biāo)蛋白協(xié)同發(fā)揮重要作用。其中，蛋白A與靶標(biāo)蛋白的互作強(qiáng)度最高，在網(wǎng)絡(luò)中具有較高的介度中心性和接近中心性，表明其在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位，可能在信息傳遞和功能調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過(guò)對(duì)蛋白A的功能注釋分析，發(fā)現(xiàn)其是一種參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白，可能通過(guò)與靶標(biāo)蛋白相互作用，影響植物激素信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性。此外，蛋白B和蛋白C也與靶標(biāo)蛋白存在緊密的相互作用。蛋白B是一種轉(zhuǎn)錄因子，其可能通過(guò)與靶標(biāo)蛋白結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，從而參與水稻抗白葉枯病的分子機(jī)制。蛋白C則是一種參與活性氧代謝的酶，其與靶標(biāo)蛋白的互作可能影響水稻體內(nèi)活性氧的平衡，進(jìn)而影響水稻的抗病能力。這些關(guān)鍵互作蛋白的發(fā)現(xiàn)，為深入理解osamiR159的新靶標(biāo)基因介導(dǎo)的水稻白葉枯病菌抗性負(fù)調(diào)控機(jī)制提供了重要線索，有助于進(jìn)一步揭示水稻與白葉枯病菌互作過(guò)程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。四、討論4.1OsamiR159新靶標(biāo)基因負(fù)調(diào)控抗性的機(jī)制探討本研究鑒定出的osamiR159新靶標(biāo)基因在水稻對(duì)白葉枯病菌抗性中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，其作用機(jī)制可能與多個(gè)方面相關(guān)。從基因表達(dá)調(diào)控層面來(lái)看，在正常生長(zhǎng)條件下，osamiR159和靶標(biāo)基因維持著相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)水平，共同參與水稻的基礎(chǔ)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。然而，當(dāng)水稻受到白葉枯病菌侵染時(shí)，osamiR159的表達(dá)迅速上調(diào)，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，特異性地識(shí)別并結(jié)合靶標(biāo)基因的mRNA序列，在AGO蛋白等組成的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）作用下，介導(dǎo)靶標(biāo)基因mRNA的切割，從而導(dǎo)致靶標(biāo)基因的表達(dá)量顯著降低。這種表達(dá)水平的改變是啟動(dòng)負(fù)調(diào)控抗性機(jī)制的關(guān)鍵起始步驟。從信號(hào)傳導(dǎo)通路角度分析，靶標(biāo)基因可能參與多條與水稻抗病相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。其中，植物激素信號(hào)通路是重要的一環(huán)。已有研究表明，水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）等植物激素在植物抗病過(guò)程中發(fā)揮著核心信號(hào)傳導(dǎo)作用。本研究中，通過(guò)蛋白互作分析發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)蛋白與參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白存在緊密相互作用。推測(cè)靶標(biāo)基因編碼蛋白可能作為信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，正調(diào)控SA、JA和ET等激素信號(hào)通路。當(dāng)靶標(biāo)基因正常表達(dá)時(shí)，能夠促進(jìn)這些激素信號(hào)通路的激活，進(jìn)而啟動(dòng)一系列抗病相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)水稻的基礎(chǔ)抗病能力。但在白葉枯病菌侵染后，osamiR159表達(dá)上調(diào)，靶標(biāo)基因表達(dá)受抑制，導(dǎo)致其無(wú)法有效激活植物激素信號(hào)通路，使得水稻的抗病信號(hào)傳導(dǎo)受阻，無(wú)法及時(shí)啟動(dòng)有效的防御反應(yīng)，從而負(fù)向調(diào)控水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性?；钚匝酰≧OS）代謝平衡也是植物抗病的重要機(jī)制之一。正常情況下，植物體內(nèi)的ROS維持著動(dòng)態(tài)平衡，在抵御病原菌侵染時(shí)，ROS的爆發(fā)是植物免疫反應(yīng)的重要特征，能夠直接殺傷病原菌，并作為信號(hào)分子激活下游的防御反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，靶標(biāo)蛋白與參與活性氧代謝的酶存在相互作用，表明靶標(biāo)基因可能參與調(diào)控水稻體內(nèi)的ROS代謝。當(dāng)靶標(biāo)基因正常表達(dá)時(shí)，有助于維持ROS的動(dòng)態(tài)平衡，在病原菌侵染時(shí)能夠及時(shí)引發(fā)ROS爆發(fā)，激活防御反應(yīng)。而當(dāng)osamiR159介導(dǎo)靶標(biāo)基因表達(dá)下調(diào)后，可能破壞了ROS代謝的平衡，導(dǎo)致ROS積累不足或清除過(guò)快，無(wú)法有效激活防御反應(yīng)，進(jìn)而削弱了水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性。轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在植物應(yīng)對(duì)病原菌侵染過(guò)程中也起著至關(guān)重要的作用。靶標(biāo)基因編碼的蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，能夠與其他轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控元件相互作用，形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在白葉枯病菌侵染時(shí)，正常表達(dá)的靶標(biāo)基因可以通過(guò)調(diào)控下游一系列抗病相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)水稻的抗性。然而，osamiR159對(duì)靶標(biāo)基因的抑制作用，破壞了這一轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的平衡，導(dǎo)致下游抗病基因無(wú)法正常表達(dá)，使得水稻失去了對(duì)病原菌的有效防御能力，從而負(fù)向調(diào)控了水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性。4.2研究結(jié)果與前人研究的比較與聯(lián)系在水稻白葉枯病抗性研究領(lǐng)域，諸多學(xué)者已取得了一系列成果，本研究結(jié)果與前人研究既存在一定的相似性，也有明顯的差異。與前人研究的相似之處在于，均證實(shí)了基因調(diào)控在水稻抗白葉枯病過(guò)程中的關(guān)鍵作用。前人研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因參與水稻對(duì)白葉枯病的抗性調(diào)控，如Xa21等基因通過(guò)激活免疫反應(yīng)來(lái)增強(qiáng)水稻的抗性。本研究同樣表明，osamiR159及其新靶標(biāo)基因參與了水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性調(diào)控過(guò)程，進(jìn)一步豐富了基因調(diào)控水稻抗病性的研究?jī)?nèi)容。在植物激素信號(hào)通路方面，前人研究揭示了SA、JA和ET等植物激素在水稻抗白葉枯病信號(hào)傳導(dǎo)中的重要作用，本研究通過(guò)蛋白互作分析發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)蛋白與參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白存在相互作用，表明靶標(biāo)基因可能通過(guò)調(diào)控植物激素信號(hào)通路影響水稻的抗病性，這與前人研究結(jié)果相互印證，共同強(qiáng)調(diào)了植物激素信號(hào)通路在水稻抗病中的重要地位。然而，本研究也有獨(dú)特的發(fā)現(xiàn)。以往對(duì)osamiR159的研究主要集中在其參與水稻生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)方面，如調(diào)控種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)以及對(duì)干旱、鹽脅迫的響應(yīng)等，而本研究首次揭示了osamiR159在水稻抗白葉枯病過(guò)程中的負(fù)調(diào)控作用及其新靶標(biāo)基因，拓展了osamiR159的功能研究領(lǐng)域。在靶標(biāo)基因功能方面，前人研究中尚未有關(guān)于本研究中osamiR159新靶標(biāo)基因在水稻抗白葉枯病中作用的報(bào)道。本研究通過(guò)基因功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，明確了該靶標(biāo)基因?qū)λ究拱兹~枯病能力的負(fù)調(diào)控作用，為水稻抗病機(jī)制的研究提供了新的視角。此外，在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)方面，本研究構(gòu)建的靶標(biāo)基因編碼蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)中，發(fā)現(xiàn)了一些與水稻抗病相關(guān)的新的蛋白互作關(guān)系，這些新的互作關(guān)系可能參與了獨(dú)特的抗病調(diào)控途徑，與前人報(bào)道的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)有所不同。本研究結(jié)果與前人研究存在差異的原因可能是多方面的。首先，研究對(duì)象和實(shí)驗(yàn)材料的不同可能導(dǎo)致結(jié)果的差異。不同水稻品種對(duì)病原菌的抗性反應(yīng)存在差異，本研究選用的日本晴水稻品種，其遺傳背景和生理特性與前人研究中使用的其他水稻品種可能有所不同，這可能影響osamiR159及其靶標(biāo)基因的表達(dá)和功能。其次，研究方法和技術(shù)手段的差異也可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，不同研究采用的基因預(yù)測(cè)、驗(yàn)證方法以及蛋白互作分析技術(shù)等可能存在差異，這些差異可能導(dǎo)致研究結(jié)果的不一致。此外，病原菌的多樣性和復(fù)雜性也是導(dǎo)致結(jié)果差異的重要因素。白葉枯病菌存在多個(gè)生理小種，不同小種的致病機(jī)制和與水稻的互作方式可能不同，本研究中使用的PXO99A菌株與前人研究中使用的病原菌菌株可能存在差異，從而導(dǎo)致研究結(jié)果的不同。4.3研究的創(chuàng)新點(diǎn)與不足本研究在水稻抗白葉枯病機(jī)制研究方面具有一定的創(chuàng)新之處。在研究方法上，綜合運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、5'-RACE實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、基因編輯技術(shù)以及蛋白互作分析等多種先進(jìn)技術(shù)手段，從基因、轉(zhuǎn)錄和蛋白水平全面深入地探究osamiR159新靶標(biāo)基因介導(dǎo)的抗性負(fù)調(diào)控機(jī)制，為揭示水稻與病原菌互作的分子機(jī)制提供了系統(tǒng)的研究思路和方法體系，具有方法學(xué)上的創(chuàng)新性。在研究結(jié)論方面，首次鑒定出osamiR159的新靶標(biāo)基因，并明確其在水稻抗白葉枯病過(guò)程中的負(fù)調(diào)控功能，拓展了osamiR159的功能研究領(lǐng)域，豐富了水稻抗白葉枯病的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為水稻抗病機(jī)制的研究提供了新的視角和理論依據(jù)。此外，通過(guò)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了與靶標(biāo)蛋白相互作用的關(guān)鍵蛋白，揭示了新的蛋白互作關(guān)系和潛在的抗病調(diào)控途徑，為深入理解水稻抗白葉枯病的分子機(jī)制提供了新的線索。然而，本研究也存在一定的局限性。在研究范圍上，僅針對(duì)osamiR159的一個(gè)新靶標(biāo)基因進(jìn)行了深入研究，未對(duì)osamiR159的其他潛在靶標(biāo)基因進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析，可能遺漏了一些在水稻抗白葉枯病過(guò)程中起重要作用的基因和調(diào)控途徑。在研究深度上，雖然初步揭示了osamiR159新靶標(biāo)基因負(fù)調(diào)控水稻抗白葉枯病的機(jī)制，但對(duì)于一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)和分子事件的具體細(xì)節(jié)仍有待進(jìn)一步深入探究。例如，osamiR159與靶標(biāo)基因mRNA結(jié)合后，如何精確調(diào)控RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的組裝和活性，以及靶標(biāo)基因編碼蛋白與其他蛋白相互作用后，如何具體調(diào)控下游基因的表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)通路等問(wèn)題，還需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明。此外，本研究主要在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，對(duì)于osamiR159及其靶標(biāo)基因在田間自然條件下對(duì)水稻抗白葉枯病的影響，以及與其他環(huán)境因素的互作關(guān)系，尚未進(jìn)行深入研究。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍，全面篩選和鑒定osamiR159的其他靶標(biāo)基因，深入探究其在水稻抗白葉枯病過(guò)程中的作用機(jī)制。同時(shí)，加強(qiáng)田間試驗(yàn)研究，分析osamiR159及其靶標(biāo)基因在自然環(huán)境下對(duì)水稻抗病性的影響，為將研究成果更好地應(yīng)用于水稻抗病育種提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。4.4研究對(duì)水稻抗病育種的潛在應(yīng)用價(jià)值本研究在水稻抗白葉枯病分子機(jī)制方面的成果，對(duì)水稻抗病育種具有重要的理論指導(dǎo)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。從理論層面來(lái)看，明確了osamiR159及其新靶標(biāo)基因在水稻抗白葉枯病過(guò)程中的負(fù)調(diào)控作用機(jī)制，為水稻抗病分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)增添了新的內(nèi)容，使科研人員能夠從miRNA-靶標(biāo)基因互作的角度深入理解水稻與白葉枯病菌的互作關(guān)系，為后續(xù)研究提供了重要的理論框架和研究思路。這有助于育種工作者在基因?qū)用婢珳?zhǔn)把握水稻抗病性的調(diào)控機(jī)制，為設(shè)計(jì)更有效的抗病育種策略奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。在實(shí)踐應(yīng)用方面，本研究為水稻抗病育種提供了新的基因資源和分子靶點(diǎn)。通過(guò)對(duì)osamiR159及其靶標(biāo)基因的研究，發(fā)現(xiàn)敲除靶標(biāo)基因能夠顯著增強(qiáng)水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性。這一發(fā)現(xiàn)為培育抗白葉枯病水稻新品種提供了直接的基因編輯靶點(diǎn)，育種工作者可以利用CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)，對(duì)水稻中的靶標(biāo)基因進(jìn)行精準(zhǔn)編輯，敲除或抑制其表達(dá)，從而獲得對(duì)白葉枯病具有更強(qiáng)抗性的水稻材料。這種基于基因編輯技術(shù)的抗病育種策略，相較于傳統(tǒng)育