ICSCCS T/CSES81—淡水生物監(jiān)測DNAFreshwaterbiomonitoring—EnvironmentalDNAmetabarcoding 發(fā)T/CSEST/CSES81— 環(huán)境DNA樣品采 環(huán)境DNA提 附錄A（資料性）環(huán)境DNA固定 附錄B（資料性）環(huán)境DNA采樣記錄 附錄C（資料性）分子分類單元累積曲線構(gòu)建方 附錄D（資料性）常用DNA條形碼擴(kuò)增引物信 附錄E（資料性）分子實(shí)驗(yàn)記錄 附錄F（資料性）生物信息學(xué)分析記錄 附錄G（資料性）生物統(tǒng)計(jì) 附錄H（規(guī)范性）野外質(zhì)量保 附錄I（規(guī)范性）實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定 T/CSEST/CSES81—淡水生物監(jiān)測DNAGB 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要GB/T GB/T GB/T GB/T 環(huán)境微生物宏基因組檢測高通HJ 水質(zhì)采樣技術(shù)指HJ 生物多樣性觀測技術(shù)導(dǎo)則淡水底棲大型無脊椎動SC/T SN/T SN/T DB32/T 高通量測序high-throughputDNAenvironmentalDNADNA16SDNA16SribosomalDNA；16S18SDNA18SribosomalDNA；18S12SDNAmitochondrial12SribosomalDNA；Mt12ScImitochondrialcytochromecoxidase擴(kuò)增子DNADNAmetabarcoding索引序列相似性sequence序列相似性閾值cutoffvalueofsequence操作分類單元operationaltaxonomic擴(kuò)增序列變體ampliconsequence分子分類單元moleculartaxonomic嵌合體序列相對豐度relativeabundanceof陰性對照negative陽性對照positive DNA固定劑，見A。DNA提取試劑。 通用PCR PCR 通用DNA濃度測定試劑盒：主要成分包括緩沖液和染色劑。 豎式采水器：2L5L 13000rpm，溫控范圍低4超微量紫外分光光度計(jì)：測量體積最1μL，波長范圍230nm、260nm280nmPCR高壓蒸汽滅菌儀：可達(dá)121℃、18min滅菌 低溫冰箱：4℃、-20℃和-80采樣瓶：100mL1000mL等微量移液器：0.5～10μL、20～200μL100～1000μL等離心管：1.5mL、2mL、5mL50mL，DNA無菌微孔濾膜：0.22μm、0.45μm、1.2μm5μm等PCR管、96孔板等類似PCR反應(yīng)容器：DNA 圖1DNA 表1DNAHJ494的規(guī)定執(zhí)行，現(xiàn)場過濾至一定孔徑（一0.45μm，大型底棲無脊椎動物和魚0.45～1.2μm）的濾膜上，野外干冰或-20℃保存，實(shí)驗(yàn)室-20℃保存；或者加入附錄A推薦的固定劑，常溫保存。采樣體積一般不小1L，浮游植物和水生維管束植物一1L，大的采樣體積，相關(guān)示例見C。HJ49450mL的表層沉積物（0～5cm），應(yīng)剔除礫石、木屑、雜草、貝殼及其他大體積生物殘體，收集至無菌離心管中，野外干冰或-20℃保存，實(shí)驗(yàn)室-20℃保存；或者加入（一般為25cm2）的樣品，無菌水清洗至采樣瓶中。野外干冰或-20℃保存，實(shí)驗(yàn)室-20℃保存；或者SC/T9402的規(guī)定用浮游生物網(wǎng)采集浮游動物樣品，采樣體積一20L，過濾至一定孔徑（一5μm）的濾膜上，野外干冰或-20℃保存，實(shí)驗(yàn)室-20℃保存；或者加A推薦的算1mL，常溫保存。 生物膜：4℃解凍，振蕩混2mL樣品，高速（不低12000rpm）20min等雜質(zhì)，可采用離心柱法或磁珠法等常規(guī)分子生物學(xué)操作純化DNA，操作步驟見GB/T40226。樣本DNA濃度應(yīng)不低于1ng/μL，最佳濃度范圍為10～100ng/μL，260nm和280nm波長處的吸光度值比值（OD260nm/OD280nm）應(yīng)在1.7～2.0范圍內(nèi)，OD260nm/OD230nm應(yīng)大于2.0。DNA在-20℃ 知可以有效擴(kuò)增）的等量混合物，濃度一般為1ng/μL。也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要和實(shí)驗(yàn)條件在DNA提取和測表2環(huán)境DNADNAPCRDNAFN= ????=??2························································· 廢棄物的分類、收集、存放和集中處理應(yīng)按照GB19489和SN/T4835的規(guī)定執(zhí)行，其中生物廢棄物附錄DNA以在常溫下穩(wěn)定儲存3～6個月。乙醇保存樣本不可在-10℃以下儲存。將100mL三羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液（Tris-HCl，1mol/L）、200mL乙二胺四乙酸溶液1LLongmire’s固定劑需浸沒整個樣本，常溫下，樣本在Longmire's固定劑中可以穩(wěn)定儲存2～6附錄 水溫（℃）pHDNA □-20 □-20混合大型底棲無脊采樣工具：□抓斗式采泥 □彼得森采樣器附錄 accu<-specaccum(samp,plot(accuci.type="poly"col="blue"lwd=2ci.lty=0ci.col="lightblue",xlab="樣品數(shù)",ylab="分子分類 附錄 Mt12SrDNA-Mt12SrDNA-Mt12SrDNA-Mt12SrDNA-Mt16S附錄 樣品類型：□水樣□沉積物□生物膜□混合浮游動物組織□混合大型底棲無脊椎動物OD260