ICS65.020.30CCSB41DB42法CompetitiveELISAfordetectionofantibodiesagainstH7subtypeaviani湖北省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB42/TXXXXX—2020前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語與定義 14檢測(cè)原理 15檢測(cè)條件 16操作步驟 27結(jié)果判定 2附錄A（資料性附錄）酶標(biāo)抗體的制備 4附錄B（資料性附錄）對(duì)照品的制備 7附錄C（規(guī)范性附錄）試劑配制 8附錄D（資料性附錄）樣品處理注意事項(xiàng) 9DB42/TXXXXX—2020本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。本文件由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本文件由湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口管理。本文件起草單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、武漢科前生物股份有限公司。本文件主要起草人：金梅林、范俊青、李冉、董俊、王園園、但漢并、吳超、董曉輝、徐高原。本文件實(shí)施應(yīng)用中的疑問，可咨詢湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，聯(lián)系電話郵箱：hbsnab@126.com；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，聯(lián)系電話郵箱：xys@。對(duì)本文件的有關(guān)修改意見建議請(qǐng)反饋至華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，電話郵箱：jml8328@126.com。DB42/TXXXXX—2020禽流感（avianinfluenza,AI）是由甲型流感病毒感染引起的禽類急性傳染病。按照致病力的強(qiáng)弱可分為無致病性禽流感、低致病性禽流感、中致病性禽流感和高致病性禽流感。禽流感病毒H7亞型屬于高致病性禽流感，OIE將高致病性禽流感列為必須上報(bào)的傳染病，我國(guó)將其列為是優(yōu)先防治和重點(diǎn)防范的人獸共患病。目前，檢測(cè)H7亞型禽流感病毒抗體的經(jīng)典方法是血凝抑制（HI）試驗(yàn)，該方法的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)試驗(yàn)條件要求低，缺點(diǎn)是：操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差，靈敏度低，凝集情況的準(zhǔn)確判斷需要大量觀察后總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，受主觀影響因素較大。H7亞型禽流感病毒競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)方法是用純化的病毒作為包被抗原，包被酶標(biāo)板，同時(shí)加入待檢血清和抗HA蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)記物，使血清中的抗體與單抗競(jìng)爭(zhēng)包被板上的抗原表位，從而判斷血清中是否含有H7亞型禽流感病毒抗體的一種方法，是一種操作簡(jiǎn)便、檢出率高、敏感性高、特異性強(qiáng)的方法，且能實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果更客觀，判定方便、直觀、快速準(zhǔn)確。DB42/TXXXXX—20201H7亞型禽流感病毒競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)方法本文件規(guī)定了H7亞型禽流感病毒競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)的術(shù)語與定義、檢測(cè)原理、檢測(cè)條件、操作步驟、結(jié)果判定。本文件適用于H7亞型禽流感病毒抗體的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語與定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1辣根過氧化物酶HRP（horseradishperoxidase,HRP）通常來源于辣根，因此稱辣根過氧化物酶，是臨床檢驗(yàn)試劑中的常用酶。該產(chǎn)品不但廣泛用于多個(gè)生化檢測(cè)項(xiàng)目，也廣泛運(yùn)用于免疫類(ELISA)試劑盒。4檢測(cè)原理本文件采用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法（cELISA）的原理，待檢血清中的抗體和酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合，如檢血清中抗體含量越多，則與固相抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體就越少，經(jīng)底物催化后顯色越淺。將H7亞型禽流感病毒血凝抑制試驗(yàn)抗原吸附到固相載體的表面形成固相抗原，待檢血清和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入包被板，若待檢血清中含有抗體，則可與抗原相結(jié)合，同時(shí)酶標(biāo)抗體也抗原的結(jié)合量減少；加入底物后，底物被酶標(biāo)抗體中的HRP催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與待檢血清中抗體的量呈負(fù)相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使檢測(cè)方法具有良好的敏感性。5檢測(cè)條件5.1儀器與耗材Ⅱ級(jí)生物安全柜或者超凈工作臺(tái)、酶標(biāo)儀（配制450nm波長(zhǎng)濾光片）、離心機(jī)（4000r/min）、微量可調(diào)移液器（200μL、1mL）、槍頭（200μL、1mL）、恒溫箱（37℃)、電子天平（0.01g-300g）、聚苯乙烯微量反應(yīng)板（96孔）、離心管（1.5mL、2mL、5mL）。5.2試劑2DB42/TXXXXX—2020HRP標(biāo)的記H7亞型禽流感病毒單克隆抗體、H7亞型禽流感病毒血凝抑制試驗(yàn)抗原、底物液、終止液、包被液、封閉液、20倍濃縮洗滌液、樣品稀釋液、陰性對(duì)照品、陽性對(duì)照品。H7亞型禽流感病毒單克隆抗體的制備、純化及HRP標(biāo)記方法見附錄A。陰性對(duì)照品、陽性對(duì)照品的制備方法見附錄B。試劑配制方法見附錄C。6操作步驟6.1樣品處理取動(dòng)物全血，待血液充分凝固后，4000r/min離心10min，收集上清。要求血清清亮，無溶血。樣品處理過程中應(yīng)防止樣品的污染，注意個(gè)人安全防護(hù)，具體注意事項(xiàng)見附錄D。6.2抗原包被板的制備6.2.1包被用包被液將H7亞型禽流感病毒血凝抑制試驗(yàn)抗原稀釋至工作濃度（0.2μg/mL）加至酶標(biāo)板孔中，每孔100μL，在2～8℃放置15h。6.2.2封閉棄去包被液，每孔加入封閉液200μL，置37℃孵育2h；棄去封閉液，拍干，再置37℃干燥2h。6.3洗滌液的配制使用前，將20倍濃縮洗滌液恢復(fù)至室溫（22-25℃)并搖動(dòng)使沉淀溶解，按照50mL20倍濃縮洗滌液加入950mL去離子水的比例稀釋，稀釋好的洗滌液在2-8℃保存，有效期為7日。6.4洗滌棄去孔中液體，每孔加入配制好的洗滌液200μL，棄去孔中液體。洗滌4次，最后一次在吸水紙上拍干。6.5待檢血清的稀釋待檢血清在血清稀釋板中按10倍稀釋。例如10μL血清加入到90μL樣品稀釋液中，混勻備用。6.6加入待檢樣品和酶標(biāo)記物取制備好的抗原包被板，用配制的洗滌液洗滌抗原包被板1次，將稀釋好的待檢血清、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照各取50μL加至抗原包被板中，待檢血清各設(shè)1孔，陰、陽性對(duì)照各設(shè)2孔，同時(shí)加入酶標(biāo)記物50μL。輕輕振勻孔中樣品，置37℃下溫育45min。洗滌4次，最后一次在吸水紙上拍干。6.7顯色和終止反應(yīng)每孔加入底物液100μL，置20～25℃下避光顯色15min。每孔加終止液50μL。10min內(nèi)在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD值）。7結(jié)果判定DB42/TXXXXX—202037.1試驗(yàn)成立條件陰性對(duì)照的平均OD450nm值＞1.0，陽性對(duì)照的抑制率（PI值50%。7.2結(jié)果計(jì)算PI值按式（1）確定：(N,PI值=|(1-S)×(N,式中：PI——樣品的抑制率；S——樣品孔OD450nm值；N——陰性對(duì)照孔平均OD450nm值。7.3結(jié)果判定被檢樣品的PI值＜40%，該樣品判為陰性；被檢樣品的PI值≥40%，該樣品判為陽性。DB42/TXXXXX—20204（資料性）酶標(biāo)抗體的制備A.1H7亞型禽流感病毒單克隆抗體的制備A.1.1免疫原在禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原中加入pH值7.4的PBS2mL溶解，重懸后的溶液加入等體積飽和硫酸銨攪勻，置2～8℃作用15h后，2～8℃8000r/min離心40min，收集沉淀物加入原病毒液1/20體積的生理鹽水溶解，裝透析袋內(nèi)，用PBS透析15h除鹽。測(cè)定濃縮抗原液的蛋白含量，加入終濃度為0.04％硫柳汞鈉，并調(diào)整病毒液的蛋白濃度至2±0.05mg/mL，同時(shí)用HA試驗(yàn)檢測(cè)該病毒液的效價(jià)，當(dāng)其HA效價(jià)≥28即可作為免疫原。A.1.2小鼠免疫首次免疫取免疫原與弗氏完全佐劑按照體積1:1進(jìn)行乳化，6～8周齡雌性BALB/c小鼠3只，皮下分點(diǎn)注射200μg/只，每個(gè)點(diǎn)約注射20μg。以后每間隔2周免疫一次，第二、三次免疫將免疫原與弗氏不完全佐劑乳化，皮下分點(diǎn)注射100μg/只。第三次免疫后一周后，自小鼠尾靜脈采血用ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)，選擇效價(jià)高的小鼠在融合前3天腹腔注射抗原（不含佐劑）約200μg進(jìn)行加強(qiáng)免疫。A.1.3骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)融合前一周復(fù)蘇SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，培養(yǎng)在含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0，以RPMI1640培養(yǎng)基洗滌兩次后，用約10mLRPMI1640培養(yǎng)基將其吹下。收集于50mL離心管，1000r/min離心5min，棄上清液，輕輕敲打管底使細(xì)胞松散，加入10mLRPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液10倍稀釋后計(jì)數(shù)，準(zhǔn)備融合。A.1.4免疫脾細(xì)胞的制備取加強(qiáng)免疫4天后的小鼠，摘取眼球眼眶放血，獲得陽性血清，脫頸處死，置于75%的酒精中浸泡10min，無菌取出脾臟，先用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌數(shù)次，去除附著的結(jié)締組織；再將脾臟移入另一置有300目微孔濾網(wǎng)的新鮮RPMI1640培養(yǎng)基中，眼科剪刀剪開一個(gè)小口，用研磨棒輕輕擠壓，釋放脾細(xì)胞，制成脾細(xì)胞懸液，移至10mL離心管中，置37℃,含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)自然沉降10min，吸取上層細(xì)胞懸液于50mL離心管中，再加入3mLRPMI1640培養(yǎng)基重復(fù)洗滌2次。以1000r/min離心10min，棄上清液。加入10mLRPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液10倍稀釋后計(jì)數(shù)。A.1.5飼養(yǎng)細(xì)胞的制備取空白BALB/c小鼠一只，摘取眼球眼眶放血，獲得陰性血清，脫頸處死，置于75%的酒精中浸泡10min，無菌取出脾臟，先用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次，去除附著的結(jié)締組織；再將脾臟移入另一置有200目微孔濾網(wǎng)的RPMI1640培養(yǎng)基中，眼科剪刀剪開一個(gè)小口，用研磨棒輕輕擠壓，吸取上層細(xì)胞懸液于50mL離心管中，再加入3mLRPMI1640培養(yǎng)基重復(fù)洗滌2次。以1000r/min離心10min，棄上清液。加入10mLRPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。A.1.6細(xì)胞融合將一瓶含20%胎牛血清、1%HAT的RPMI1640培養(yǎng)基、1mL50%PEG1450、放入37℃溫箱中預(yù)熱。將重懸后的免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在50mL離心管中混勻，1000r/min離心10min，棄去上清液，用濾紙將管壁上殘留的液體吸干，用手指尖輕輕彈管底，使兩種細(xì)胞充分混勻，將離心管置于37℃水浴中；吸取預(yù)熱的PEG溶液0.8mL，向細(xì)胞沉淀緩緩滴加，邊滴邊輕輕攪拌，在1min內(nèi)加完。內(nèi)加完。融合完成后，1000r/min離心10min，棄上清液。將沉淀的細(xì)胞輕輕懸浮于20%胎牛血清、1%HAT的RPMI1640培養(yǎng)基中，加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞后，置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，約200μL/孔，置37℃,含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第五天補(bǔ)加1滴HAT培養(yǎng)基，第8天棄去孔中液體，補(bǔ)加200μLHAT培養(yǎng)基，待融合集落長(zhǎng)至孔底面積的1/4時(shí)，取上清進(jìn)行抗體檢測(cè)。DB42/TXXXXX—20205A.1.7陽性雜交瘤細(xì)胞篩選用禽流感病毒H7亞型HI試驗(yàn)篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。將細(xì)胞上清作為待檢樣品加入反應(yīng)板中，同時(shí)設(shè)定SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照，免疫小鼠血清做為陽性對(duì)照。A.1.8有競(jìng)爭(zhēng)效果的細(xì)胞株的篩選用禽流感病毒H7亞型HI試驗(yàn)篩選出陽性血清1份，陰性血清1份。將篩選出的陽性血清和陰性血清用樣品稀釋液2倍稀釋，加入包被好的酶標(biāo)板中，100μL/孔，37℃作用30min。棄去孔中液體，洗滌5次，拍干，分別加入陽性細(xì)胞上清各100μL，37℃作用30min。洗滌5次，拍干，加入1:5000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP，每孔加入100μL，37℃作用30min。洗滌5次，拍干，每孔加底物顯色液100μL，室溫顯色15min。每孔加入50μL終止液，用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定各孔OD450nm值。A.1.9雜交瘤細(xì)胞的亞克隆采用有限稀釋法對(duì)連續(xù)3次檢測(cè)均為陽性且HI抗體效價(jià)高者進(jìn)行亞克隆。首先制備小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞，鋪于96孔細(xì)胞板中，100μL/孔；將陽性孔中的雜交瘤細(xì)胞用培養(yǎng)基吹下，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用有限稀釋法按照5:3:1的比例加入96孔板，即96孔板的前四排細(xì)胞數(shù)為5個(gè)/孔，中間四排細(xì)胞數(shù)為3個(gè)/孔，最后四排細(xì)胞數(shù)為1個(gè)/孔，加完后置37℃,含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第七日用新的培養(yǎng)基置換出96孔板中培養(yǎng)基，以后每天觀察，待上清變黃對(duì)出現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞克隆孔用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)；連續(xù)3次亞克隆且檢測(cè)陽性者可以定株。將定株的單克隆細(xì)胞擴(kuò)大至24孔板，長(zhǎng)滿后轉(zhuǎn)至6孔板，最后擴(kuò)大培養(yǎng)至25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，一部分凍存，每株雜交瘤細(xì)胞保存6份；一部分?jǐn)U大培養(yǎng)用于制備腹水。A.1.10腹水法制備單克隆抗體選用8～10周齡BALB/c雌性小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟，0.5mL/只；1周后腹腔注射用PBS稀釋的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，1×105個(gè)/只；7～10日后采集腹水，1200r/min離心10min，去除脂肪組織，吸取上清，-70℃及以下保存?zhèn)溆?。A.2單克隆抗體的純化及驗(yàn)證A.2.1腹水單克隆抗體的純化將上述腹水取1mL，加入4mLpH值4.5醋酸緩沖液，加入辛酸25μL，攪拌30min，靜置2h。12000r/min離心10min；棄沉淀，上清用濾紙過濾后將pH值調(diào)至7.4，緩慢逐滴加入上述液體體積45%的飽和硫酸銨溶液，繼續(xù)攪拌30min，在2～8℃靜置2h；以12000r/min離心30min，棄上清。用原腹水1/2體積的10mmol/LTris-HCL（pH值9.0）將沉淀重懸，轉(zhuǎn)入透析袋中，在10mmol/LTris-HCL（pH值9.0）中2～8℃透析15h。超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定單克隆抗體濃度，分裝，-70℃及以下保存。A.2.2單克隆抗體的鑒定A.2.2.1濃度將純化后的單克隆抗體用超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定蛋白濃度，濃度為4.2mg/mL。A.2.2.2純度用SDS電泳檢測(cè)單抗純度，結(jié)果見圖A.1。電泳顯示結(jié)果應(yīng)為兩條清晰的目的條帶，即在50KD和25KD附近各有一條清晰的目的條帶，分別為重鏈和輕鏈，無其他雜帶。DB42/TXXXXX—20206圖A.1單克隆抗體的純度鑒定A.2.3酶標(biāo)抗體的制備A.2.3.1辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記單克隆抗體用過碘酸鹽氧化法標(biāo)記單克隆抗體，步驟如下：稱取5mg辣根過氧化物酶（HRP）溶于lmL雙蒸水中，加入500μL新鮮配制的0.06mol/L的NaIO4，2℃~8℃反應(yīng)30min，溶液呈草綠色，再加入0.5mL乙二醇（0.16mol/L混勻后室溫避光反應(yīng)30min。然后加入5mg純化的單克隆抗體，在0.05mol/LpH值9.5的碳酸鹽緩沖液中2～8℃透析15h。次日，在溶液中加入5mg/mL新鮮配制的NaBH40.2mL，混勻后2℃~8℃反應(yīng)2h，再加入等體積的飽和硫酸銨溶液，2℃~8℃靜置30min，7000r/min離心10min，棄上清，用PB重懸，在PB中2℃~8℃透析15h。收集透析袋內(nèi)容物，調(diào)整酶標(biāo)記物濃度為4±0.05mg/mL，加入等體積甘油作為酶標(biāo)記物貯備液，分裝1mL/管，-70℃及以下保存?zhèn)溆?。A.2.3.2酶標(biāo)抗體的制備用保護(hù)劑將酶標(biāo)記物貯備液稀釋1000倍，用0.22μm濾膜過濾除菌，即為酶標(biāo)抗體。DB42/TXXXXX—20207（資料性）對(duì)照品的制備B.1陰性對(duì)照品的制備及檢驗(yàn)B.1.1陰性對(duì)照品的制備B.1.1.1制造用動(dòng)物為40日齡SPF雞。B.1.1.2陰性血清的制備選用40日齡SPF雞，用禽流感病毒H7亞型HI試驗(yàn)檢測(cè)免疫前血清，其HI抗體效價(jià)應(yīng)低于2log2。將檢測(cè)HI抗體效價(jià)＜2log2的雞進(jìn)行頸動(dòng)脈采血，待血液充分凝固后，4000r/min離心10min，分離血清，并加入終濃度為0.04％硫柳汞鈉防腐，-70℃及以下長(zhǎng)期保存。B.1.1.3陰性對(duì)照品的配制將制備的陰性血清用保護(hù)劑稀釋4倍，用0.22μm濾膜過濾除菌，即為陰性對(duì)照品。B.1.2陰性對(duì)照品的檢驗(yàn)B.1.2.1性狀檢驗(yàn)澄清液體，有時(shí)有少量懸浮物。B.1.2.2無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，無菌生長(zhǎng)。B.1.2.3HI抗體效價(jià)檢驗(yàn)用禽流感病毒H7亞型HI試驗(yàn)檢將陰性對(duì)照品進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)（設(shè)8孔重復(fù)HI抗體效價(jià)均＜2log2。B.2陽性對(duì)照品的制備及檢驗(yàn)B.2.1陽性對(duì)照品的制備B.2.1.1制造用動(dòng)物選用20日齡SPF雞，免疫前檢測(cè)血清中禽流感病毒H7亞型抗體HI抗體效價(jià)應(yīng)低于2log2。B.2.1.2免疫方法首次免疫取H7亞型禽流感病毒血凝抑制試驗(yàn)抗原與弗氏完全佐劑按照體積1:1進(jìn)行乳化，通過腿部肌肉注射，接種量0.5mL/羽。第二、三次免疫將免疫原與弗氏不完全佐劑乳化，通過腿部肌肉注射，接種量0.5mL/羽，每次間隔14日。B.2.1.3血清采集及處理第三次免疫后7日采血，分離血清，用HI試驗(yàn)檢測(cè)血清效價(jià)，當(dāng)血清HI抗體效價(jià)≥8log2時(shí)，采血。待血液充分凝固后，4000r/min離心10min分離血清，并加入終濃度為0.04％硫柳汞鈉防腐，-70℃及下長(zhǎng)期保存。B.2.1.4陽性對(duì)照品的配制使用前將制備的陽性血清用保護(hù)劑稀釋4倍，用0.22μm濾膜過濾除菌，即為陽性對(duì)照品。B.2.2陽性對(duì)照品的檢驗(yàn)B.2.2.1性狀檢驗(yàn)澄清液體，有時(shí)有少量懸浮物。B.2.2.2無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，無菌生長(zhǎng)