第六章細菌的遺傳分析大腸桿菌得突變類型突變型篩選(自學)第二節(jié)大腸桿菌得突變型及篩選一、大腸桿菌得突變類型1、合成代謝功能得突變型——營養(yǎng)缺陷型

合成代謝功能(anabolicfunction)

命名:Met-,Lys-原養(yǎng)型/野生型在基本培養(yǎng)基上,具有合成所有代謝和生長所必須得復雜有機分子得功能。營養(yǎng)缺陷型:一個必需得基因發(fā)生了突變不能進行一個特定得生化反應,從而阻礙整個合成代謝功能得實現(xiàn)。2、分解代謝功能得突變型(catabolicfunctionalmutants)分解代謝功能(anabolicfunction)一系列降解功能得實現(xiàn)也需要許多基因得表達,其中任何一個基因突變都會影響降解功能得實現(xiàn)。如Lac-突變型不能分解乳糖,因此就不能生長在以乳糖為唯一碳源得基本培養(yǎng)基上。3、抗性突變型:細菌由于某基因得突變而對某些噬菌體或抗菌素產生抗性。如:抗藥突變型:抗鏈霉素突變型:Strr,(野生型Strs)抗青霉素突變型:Penr,(野生型Pens)抗phage突變型:抗T1-phage突變型:Tonr,(野生型Tons)細菌接合現(xiàn)象得發(fā)現(xiàn)F因子及其轉移細菌重組得特點第三節(jié)細菌得接合與染色體作圖一、細菌接合現(xiàn)象得發(fā)現(xiàn)菌株A:met-

bio-

thr+

leu+

thi+菌株B:met+

bio+

thr-

leu-

thi-Met+

bio+

thr+

leu+

thi+二、F因子及其轉移細菌主要就是無性繁殖,直到1946年人們才注意到不同品系大腸桿菌間可以雜交,并進行了基因重組,從而首次發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌也有“性別”。1、細菌得性別9大家應該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流2、F因子/性因子/致育因子F因子:環(huán)狀DNA,含6×104個bp。大腸桿菌供體中含有,而受體無。由原點、致育基因、配對區(qū)三個部分組成。環(huán)狀F因子得模式圖組成F因子各部分得功能原點:就是轉移得起點。配對區(qū):此處與大腸桿菌DNA多處核苷酸序列相對應(即同源序列),故可通過交換而使F因子整合到大腸桿菌DNA上。致育基因:其上一些基因編碼生成F菌毛得蛋白質,即供體菌細胞表面得管狀結構,F菌毛與受體菌細胞表面得受體相結合,在兩個細胞間形成細胞質橋。3、F+、F-與HfrF+:細胞質中具有F因子得大腸桿菌(供體)F-:細胞質中沒有F因子得大腸桿菌(受體)大腸桿菌性別F-F+F+F-大腸桿菌性別大腸桿菌DNAF因子F因子及其在雜交中得行為細胞質橋(接合管)F+×F-F+F+F因子轉移得頻率很高,但細菌DNA間得重組率很低,故稱F+為低頻重組品系(lowfrequencerebination,Lfr)。F+×F-Hfr(highfrequencerebination)F因子整合入大腸桿菌染色體中原點致育基因配對區(qū)大腸桿菌性別致育基因原點配對區(qū)細菌染色體F-細菌DNA間得重組率很高,故稱之為高頻重組品系(highfrequencerebination,Hfr),重組率為10-2。F因子轉移得頻率很低。F因子得環(huán)出4、附加體象F因子既可獨立存在于染色體之外作為一個獨立得復制子,也可整合到大腸桿菌染色體中作為大腸桿菌復制子得一部分得遺傳物質(遺傳因子),稱為附加體。三、細菌重組得特點及機制細菌重組得特點細菌同源重組得分子基礎(一)細菌重組得特點中斷雜交實驗與重組作圖細菌重組不同于真核生物得完整二倍體得重組。Hfr與F－接合常會形成部分二倍體部分二倍體:這種含有一個親體F-全部基因組和另一親體部分基因組得合子叫部分合子(半合子)/部分二倍體。細菌得重組就就是指F-得DNA(內基因子)與Hfr得部分DNA(外基因子)之間得重組。F-的DNAHfr的部分DNA內、外基因子得交換情況單交換

部分二倍性線狀體雙交換

重組體＋線性片斷偶數(shù)次交換結果:只產生一種重組體,而無另一相應得重組體。由此可見在細菌得重組中有下列兩個特點:1、只有偶數(shù)次交換才能產生平衡得重組子;2、不出現(xiàn)相反得重組子,所以在選擇培養(yǎng)基上只出現(xiàn)一種重組子。(二)細菌同源重組得分子基礎RecBCD識別chi序列引發(fā)重組RecA催化單鏈同化Ruv系統(tǒng)解離Holiday連接點1、RecBCD識別chi序列引發(fā)重組保守得8堿基非對稱序列大腸桿菌DNA每5-10Kb自然出現(xiàn)一次被recBCD編碼得酶所識別刺激重組——重組熱點1)chi

位點2)RecBCD酶得功能①能降解DNA得核酸酶(核酸外切酶Ⅴ)②解旋酶活性③ATP酶活性目標:提供一條含游離3’端得單鏈區(qū)域(RecA可以作用得底物)RecBCD酶識別chi序列引發(fā)重組含游離3’端的單鏈2、RecA催化單鏈同化①具有蛋白酶活性②在單鏈DNA和ATP存在得條件下啟動DNA單鏈和與之互補得雙鏈分子進行堿基配對。單鏈同化:RecA可使一條DNA單鏈置換一條雙鏈DNA分子中同源鏈得反應。單鏈同化需要得條件:a、必須有一個單鏈DNA分子區(qū)域。b、必須有一個具游離3’端得DNA分子;c、該單鏈區(qū)域和3’端必須位于這兩個分子得互補區(qū)域中。具有游離3’端得單鏈單鏈具有游離3’端3、Ruv系統(tǒng)解離Holiday連接點RuvA:識別Holliday連接點得結構RuvB:具ATP酶得活性,為分支遷移提供動力。RuvC:具有核酸內切酶活性,可特異識別Holliday連接點。一、中斷雜交實驗原理二、中斷雜交作圖三、重組作圖(自學)第四節(jié)中斷雜交與重組作圖一、中斷雜交實驗原理Hfr細胞和F-細胞雜交,基因從Hfr細胞按次序轉入F-細胞,可根據(jù)基因進入F-細胞得時間和次序制作基因圖譜。實驗材料

Hfr:thr+leu+azistonslac+gal+strs

F-:thr-leu-azirtonrlac-gal-strr

strr(F-可以在鏈霉素培養(yǎng)基上生長)strs(Hfr不能在鏈霉素培養(yǎng)基上生長)實驗方法-中斷雜交實驗兩品系在液體培養(yǎng)基里,通氣混合培養(yǎng),定時取樣,猛烈攪拌以中斷雜交,釋稀菌液,在含Str得基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)。AABBCCDDDDCCB二、中斷雜交作圖實驗結果混合時間(min)結果8出現(xiàn)得菌落與F－相同,說明Hfr得基因未進入F－9出現(xiàn)少量得azis菌落,說明azis己從Hfr轉移到F－11出現(xiàn)azistons型得F－菌落18出現(xiàn)azistonslac＋型得F－菌落24出現(xiàn)azistonslac＋gal＋型得F－菌落隨時間推移,具有某一基因得菌落逐漸增加,達到一定頻率后就不再變動,而且愈早轉入得基因,所達到得頻率也愈高。實驗結果說明:Hfr得DNA從一端開始,以線性方式逐段進入F－,這一端叫原點或O點。O點

azis

tons

lac＋

gal＋

時間單位法以轉移時間單位(每分鐘)作為基因間距單位,可作出Hfr得“染色體”上得基因分布圖(基因連鎖圖)。E、coli得連鎖群E、coliK12得基因組環(huán)形圖為100min假如讓Hfr×F－雜交持續(xù)2h后中斷雜交,發(fā)現(xiàn)一些F－

F＋。這說明Hfr得全部基因轉移到F－內,排列到最后得F因子才進入F－,使F－

F＋。中斷雜交實驗與重組作圖原點致育基因配對區(qū)致育基因F因子在細菌染色體上有很多插入位點,并且插入得取向不同一個F＋品系可以產生很多Hfr品系幾個Hfr菌株得線性連鎖群得產生HfrH菌株得基因轉移順序thrprolacpurgalhisglythiHfr1菌株得基因轉移順序thrthiglyhisgalpurlacproF′因子的形成細菌染色體第五節(jié)F′因子與性導一、F′因子與F′菌株帶有部分細菌染色體得F因子稱F′因子。特點:能獨立復制

F′菌株:指帶有F′因子得細菌。二、性導(sexduction或F′

-duction)通過F′因子將供體細胞得基因導入受體形成部分二倍體得過程叫性導。性導F′因子F-部分二倍體F′菌株Hfr菌株F′菌株aa細菌得轉化與作圖細菌得轉導與作圖第六節(jié)細菌得轉化與轉導作圖一、細菌得轉化與作圖轉化作用:從細菌得培養(yǎng)物提取得DNA可以在體外轉移到受體細菌中得過程。發(fā)生轉化得頻率很低:大約為1％得受體細菌可吸收外源DNA并發(fā)生轉化。原因:受體細菌得受體部位得數(shù)目就是有限得。外源DNA片段只就是在受體部位通過。外源DNA得進入,除受體部位外,還必須有酶或蛋白質分子,以及能量等得協(xié)同作用。外源DNA只有在酶促旺盛得受體部位進入。感受態(tài)細胞與感受態(tài)因子感受態(tài)細胞:這種能接受外源DNA分子并被轉化得細菌細胞。感受態(tài)因子:促進轉化作用得酶或蛋白質得分子。感受態(tài)細胞單鏈通過交換進行整合座位轉化體類別trp2+---+++his2++-+--+tyr1+++--+-11940366068541826001071180親本型(++)重組型(+-)和(-+)重組值(重組體數(shù)/總數(shù))Trp2-his2Trp2-tyr1His2-tyr1供體trp2+his2+tyr1+

DNA向受體trp2-his2-tyr1-

轉化實驗中轉化體得類別及重組值得計算11940+11802600+107+3660+41811940+1072600+1180+3660+68511940+3660418+1180+685+107轉化基因間重組值得計算

轉化子數(shù)(重組體數(shù))親組合數(shù)+轉化子數(shù)

trp2—his2得重組值=34%trp2—tyr1得重組值=40%his2—tyr1得重組值=13%根據(jù)重組值作圖:trp234cM

his2

13cMtyr1重組值==

(+-)+(-+)(++)+(+-)+(-+)

二、細菌得轉導與作圖普遍性轉導與作圖特異性轉導與作圖(后學)轉導作用:以噬菌體為媒介,將細菌得小片段DNA或基因,從一個細菌轉移到另一細菌得過程叫轉導作用。(一)普遍性轉導與作圖J、Lederberg和N、Zinder做了這樣一個雜交試驗:鼠沙門氏菌得2個突變菌株:LA22:phe-trp-met+his+LA2:phe+trp+met-his-LA22+LA2混合培養(yǎng)得野生型(10-5)U型管實驗只允許DNA等大分子及病毒通過,細菌細胞不能通過。Hfr實驗結果:右臂得到了野生型細胞實驗結果得解釋p22得釋放:LA22就是帶有P22原phage得細菌;在培養(yǎng)過程中,少數(shù)LA22細菌自溶釋放出游離得p22。p22得侵染:這種游離得p22通過濾孔進入左臂而感染了LA2細菌。轉導噬菌體得形成:在裂解LA2