前 范 規(guī)范性引用文 術(shù)語和定 方 儀器設(shè) 試劑和溶液配 檢驗(yàn)程 結(jié)果判 結(jié)果報 質(zhì)量保 廢棄物處 附錄 TT/CACM013—本標(biāo)準(zhǔn)的全部技術(shù)內(nèi)容為推薦性《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心、國藥種業(yè)有限公司本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:袁媛、黃璐琦、蔣超、趙玉洋、周駿輝、何雅莉、王繼永請注意本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容有可能涉及專利,本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)不應(yīng)承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任金銀花快速PCR本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了使用快速PCR鑒定金銀花藥材和飲片、種子種苗的通用方法和要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于金銀花藥材和飲片、種子種苗鑒定。下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件,其最新版《中華人民共和國藥典GBT6682《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T23632《進(jìn)境植物檢疫截獲有害生物鑒定復(fù)核規(guī)程》GB/T27403《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測》GBT35431《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程總則》GBT35435《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程真實(shí)性和品種純度鑒定下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)

DNADNA從樣品中提取出DNA的方法DNA擴(kuò)增DNA通過一定技術(shù)使一段特定的DNA片段拷貝數(shù)增加的過程,可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)polymerasechainreaction模板DNA先經(jīng)高溫變性為單鏈,兩條引物分別與模板DNA火DNA聚合酶的作用下,以四種脫氧核糖核酸(dNTP)為底物,使退火引物得以延伸,然后不斷重復(fù)變性、退火和延伸這一循環(huán),使位于兩段已知序列之間的DNA片段拷貝數(shù)呈幾何倍數(shù)增長。positive一般使用對照樣品代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測過程,用于證明鑒定過使用常見偽品藥材代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測過程TT/CACM013—TT/CACM013—

blank以水代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測過程,污染standard對照樣品包括對照藥材和種子種苗對照樣品。種子種苗對照樣品是由中藥材種子種苗標(biāo)準(zhǔn)起草單位提交,經(jīng)全國中藥材種子(種苗)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會認(rèn)定并保存,與品種名稱相符的種子種苗樣品。金銀花快速CR鑒定應(yīng)采用抽取有代表性的送檢樣品與對照樣品比較的驗(yàn)證方式,即依據(jù)金銀花特異性A位點(diǎn)差異,使用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記法進(jìn)行鑒定。利用堿裂解法提取金銀花模板A,以提取的A為模板進(jìn)行CR擴(kuò)增,熒光檢測或瓊脂糖凝膠電泳檢測CR擴(kuò)增產(chǎn)物。所有制備樣品使用的器具在使用前應(yīng)滅菌處理51PCR使用前應(yīng)進(jìn)行溫度校準(zhǔn)52365nm紫外波長5301~25滋L05~100滋L10~100滋L、100~1000滋L并包括配套一次性4420益溫區(qū)除另有規(guī)定外,實(shí)驗(yàn)試劑為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑;實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682的要求;所配制的試劑均應(yīng)滅菌后保存,并在容器上注明試劑名稱、濃度、配制時間、保存條件、失效日期和配制者姓名;PCR。DNA05mol/LNaOH)、140PVP40)、1TritonX100)溶液:在800mL去離子水中溶解200gNaOH,冷卻至室溫后加入10gPVP10mLTritonX1001L,分裝后濾過除菌。01mol/LTrisHCl)溶液,pH80:800mL去離子水中121gTrispH80,加水定容至1L,分裝后高壓滅菌。dNTPdATP、dCTP、dGTP、dTTP10mmolL10伊PCRTaq10伊PCR緩沖液20PVP80mL200gPVP40,加水定容至100mL,分裝后濾過除菌,冷卻后-20保存10mg/mL80mL10gBSA,加水定容至100mL,分裝后濾過除菌,冷卻后-20益保存TaqDNATaqDNA3寅5爺核酸外切酶活性,TaqDNA20益下保存,使用JYHF5爺AGTCCCTCTATCCCCAAA3爺JYHR:5爺TGGATGAGAAATATAACGAATTAG3爺。ddH2O10滋molL50伊TAE800mL242gTris,372gNa2EDTA·2H2O,加入571ml1L50。106伊80mL去離子水中溶解溴酚藍(lán)250mg、二甲苯青250mg、蔗糖250mg,加水定容至分裝為防止交叉污染,收樣、取樣、粉碎、A提取、核酸擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測應(yīng)在不同操作間或在同一操作間不同隔離區(qū)域進(jìn)行,進(jìn)入各區(qū)域應(yīng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行,即樣品制備區(qū)寅核酸制備區(qū)寅擴(kuò)增區(qū)寅檢測區(qū)。23份,總量不低于100g。收樣時應(yīng)檢查包裝的完整性,并在樣品袋上貼上標(biāo)簽,填寫采集數(shù)據(jù)表。對商品包裝和送樣說明進(jìn)行拍照記錄,照片隨樣品一11藥材和飲片2015年版《中華人民共和國藥典》進(jìn)行取樣。去除藥材和飲片表面附著物,75712送驗(yàn)樣品、試樣的抽取、分取應(yīng)有代表性。在生產(chǎn)基地取樣,送驗(yàn)樣品可以為組織或器官;在加工或銷售地點(diǎn)取樣,送驗(yàn)樣品為種子或種苗。取送檢樣品置乳缽、勻漿機(jī)或球磨粉碎儀中充分研磨粉碎,必要時加適量液氮研磨DNA20mg20mL離心管中;加入200滋L提取緩沖液,充分混勻;加入800滋L中和緩沖液,充分混勻;12000rmin1min或靜置5min;轉(zhuǎn)移500滋L上清液至一新的1.5mL500滋L12000r/min1min5min;轉(zhuǎn)移上清液DNA20益保存?zhèn)溆?。每個送檢樣品必須重復(fù)2次,每1次從送檢樣品提取核酸的1個提取空白對照。DNA43207天,不宜長期保存PCR首次使用本方法時,應(yīng)校對PCR儀溫控準(zhǔn)確性,并使用陽性對照和陰性對照以核對使用的聚合酶的適用性741PCR2次,并設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照742PCR200滋LPCR25滋L10PCR25滋L、dNTP10mmol/L1滋L、鑒定引物(10滋mol/L02滋L、TaqDNA聚合酶1滋L、模板DNA(10~50ng1滋L191滋L。。743PCRPCRPCRPCR。反應(yīng)程序?yàn)?94益預(yù)變性1min;94益變性10s,62益退火10s,35。4益下保存。751PCRPCR2滋L100SYBRGreen玉染料,混勻后于365nm長下檢測熒光,若PCR產(chǎn)物出現(xiàn)與陽性對照相同的熒光即為陽性結(jié)果,反之為陰性結(jié)果。752PCR6伊上樣緩沖液混勻,2%瓊脂糖凝膠電泳染色,紫外波長下檢測。陰性100~200bp有一條DNA條帶為陽性結(jié)果,否則為在陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果符合規(guī)定的情況下,若送檢樣品與陽性對照一致,則判定測試結(jié)果為陽性,否則為陰性。定性檢測結(jié)果應(yīng)表示為陽性“冶或陰性冶。樣品經(jīng)檢測后,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體操作程序和結(jié)果做好詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)記錄,出具檢測報告。送檢樣品的名稱、狀態(tài)和明確的標(biāo)識;陽性對照、陰性對照、特定方法取得的結(jié)果,結(jié)果使用的單位及計算方法;檢測結(jié)果應(yīng)來自同一實(shí)驗(yàn)室樣品的兩份送檢樣品。當(dāng)一份送檢樣品的結(jié)果為陽性,另一份為陰性時,要重新測試。DNA模板量,使兩份樣品得到相同結(jié)果。每個樣品應(yīng)至少制備兩份DNA,必要時需檢測模板DNA的質(zhì)量,確保提取的DNA片段大于擴(kuò)增片段。核PCR抑制劑對照。如果經(jīng)過兩次以上從核酸提取開始的重復(fù)檢測,檢測結(jié)果不一致,可在檢測報告中注明檢測低限,檢測低限應(yīng)符合最低含量水平檢測過程中的廢棄物,收集后在焚燒爐中焚燒處理,有毒有害廢棄物應(yīng)經(jīng)過除害再進(jìn)行處理,處PCRLonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花,主要活性成分為綠原酸、木犀草苷等酚酸、黃酮類物質(zhì),臨床應(yīng)用非常廣泛。2005《中國藥典》中已明確將忍冬作為金銀花唯一植物來源,但之前各版《中國藥典根據(jù)臨床療效LHypoglaucaMiq華南忍冬LconfusaSweetDCLDasystylaRehd。且2005《中國藥典同時規(guī)定紅腺忍冬華南忍冬L.MacranthoidesHand.-Mazz.)和黃褐毛忍L.FulvotomentosaHsuetS.C.Cheng。此外,由于不同地區(qū)均有金銀?！吨袊参镏尽肥蛰d有102種忍冬屬植物,其中作為金銀花19。民間作為金銀花冶商品用藥的忍冬屬植物除金銀忍冬,盤葉忍冬、硬毛忍冬外均屬于忍冬組纏繞亞組,形態(tài)學(xué)非常類似,化學(xué)成分上均含有綠原酸類,藥理活性有所類似,常有混用現(xiàn)象。《中國藥典》(2015年版)藥材鑒定項下收載了金銀花性狀鑒定和薄層色譜鑒定方法。但破碎的中藥性狀鑒定特征會模糊化甚至消失,導(dǎo)致鑒定效力減弱;而通過薄層色譜對供試品中綠原酸進(jìn)行鑒定存在一定缺陷,主要表現(xiàn)為:①綠原酸在多種植物中均存在,作為專屬性鑒定成分值得商榷;于該方法無法鑒定金銀花及其近緣種。與傳統(tǒng)中藥鑒定方法相比,中藥分子鑒定具有準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn),且不受樣品形態(tài)的限制,原藥材、飲片、粉末乃至含有生藥原型的中成藥(丸劑、散劑等),以及中藥材種子種苗和種質(zhì)資源均可應(yīng)用,由于其所需檢樣量少,對珍稀藥材及化石標(biāo)本的鑒定更具應(yīng)用價值。建立金銀花快速CR鑒定標(biāo)準(zhǔn),有利于滿足中藥材和中藥飲片、種子種苗真?zhèn)舞b定的需求,保證中藥質(zhì)量可控。本附錄收集了9種金銀花常見偽品用于設(shè)計特異性CR引物,具體樣品信息見樣品表。trnLtrnF625位G/TPCRA1)。鑒定引物序列為:JYHF5爺AGTCCCTCTATCCCCAAA3爺;JYHR:5爺TGGATGAGAAATATAACGAATTAG3爺。

A18916個近緣種偽品材料進(jìn)行快速PCR研究。植物樣品采自廣西、河南、山東、北京、中心和廣西藥用植物園A1。A郾1Ltataricacv.fanguoPCR200滋LPCR。20滋LPCR2滋L10rTaqbuffer、1滋L10mmol/LdNTPs、025滋L10滋mol/L、05UTaq、1滋L20PVP40溶液、05滋L10g/LBSA、1滋L10ng)DNA模板。將反應(yīng)液振蕩混勻。PCRPCRPCR。PCR94益預(yù)變性1min;94益變性10s,60益退火延伸10s,35個循環(huán),獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR4益下保存。5滋L155Vcm20min,電泳結(jié)束后,將凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。PCR。A4120mg干燥材料,使用堿裂解法提取總DNA,所提取DNA50倍用于PCR反應(yīng)。通用引物trnLF/trnLRPCR反應(yīng)以檢測DNAPCR反應(yīng)體系包含2滋L10rTaqbuffer、1滋L10mmolLdNTPs、025滋molL、05UTaq、1滋L20PVP40、05滋10gLBSA、1滋L10ng)DNA94益30s,56益30s,72益45s,35727min。1trnLF/trnLR金銀花9個同屬混1050bptrnLtrnFA2),說明堿裂解法提取的DNAPCR反應(yīng)的要求。A2AmplificationresultofLonicerajaponicaanditsadulterantsbyuniversalprimertrnLFtrnFM:DL2000marker123:灰氈毛忍冬;4:華南忍冬;5:黃褐毛忍冬;6:水忍冬;7:金銀忍冬;89A42PCR利用金銀花(忍冬)SNP鑒定引物JYHFJYHR進(jìn)行位點(diǎn)特異性PCR反應(yīng),并分別考察:60益62益64益66益;于PCR303540個循環(huán);盂變性溫度:95益、91益89益、87益、85益、83益;榆變性和退火時間:10s、5s、3s、1s;虞TaqrTaqDNA合酶SpeedSTARHSTaqDNA聚合酶AptaTaqfastDNAMixTransfastTaqDNA聚合酶;愚PCR9700PCRABI公司)PTC100PCRMJResearch集團(tuán))MastercyclerPCREppendorf、TC512PCRTECHNE公司)對PCR反應(yīng)穩(wěn)定性的影響。對金銀花鑒定結(jié)果進(jìn)行考察,結(jié)果表明,使用快速PCR鑒定引物擴(kuò)增時,如當(dāng)退火溫度為66益時,偽品也有熒光;當(dāng)退火溫度為70益和72益時,均無熒光;當(dāng)退火溫度為68益時,僅正品有熒PCR68益A3A)。減少PCR68益時,逐漸減少循環(huán)數(shù)。當(dāng)循環(huán)數(shù)為27PCR產(chǎn)物A3B)。27/20s30。A3PCRAB:循環(huán)數(shù);C:變性溫度;D:變性時間,其中退火時間與變性時間一致;E:TaqHSTaqSpeedSTARHSTaqDNAAptaTaqAptaTaqfastDNAMix,TransTaqTransfastTaqDNA聚合酶,rTaqTaKaRar