人肺腺癌ABCG2+細(xì)胞分選技術(shù)與生物學(xué)特性的深度解析一、引言1.1研究背景肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球肺癌死亡180萬(wàn)例，遠(yuǎn)超其他癌癥類(lèi)型，位居癌癥死亡人數(shù)首位。在肺癌的眾多病理類(lèi)型中，肺腺癌是最為常見(jiàn)的一種，其發(fā)病率近年來(lái)呈上升趨勢(shì)。肺腺癌起源于支氣管黏膜上皮及黏液腺，發(fā)病相對(duì)隱匿，早期可能沒(méi)有明顯癥狀，往往在體檢或因其他疾病就診時(shí)被發(fā)現(xiàn)。隨著病情的發(fā)展，患者可能會(huì)出現(xiàn)咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、氣促、呼吸困難等癥狀，部分患者還可能伴有體重下降、乏力、食欲不振等全身癥狀。目前，臨床上對(duì)于肺腺癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。然而，由于肺腺癌的異質(zhì)性和耐藥性等問(wèn)題，許多患者的治療效果并不理想，5年生存率仍然較低。其中，腫瘤干細(xì)胞（CancerStemCells，CSCs）的存在被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤耐藥和復(fù)發(fā)的重要原因之一。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中具有自我更新、多向分化和無(wú)限增殖能力的一小部分細(xì)胞，它們能夠驅(qū)動(dòng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2（ABCG2），又稱乳腺癌耐藥蛋白（BCRP1），是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的重要成員之一。ABCG2在多種干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞的重要標(biāo)志物之一。ABCG2具有獨(dú)特的生物學(xué)功能，它能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將多種化療藥物主動(dòng)泵出細(xì)胞外，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。此外，ABCG2還參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移和侵襲等過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。在肺癌領(lǐng)域，ABCG2的研究備受關(guān)注。大量研究表明，ABCG2在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于小細(xì)胞肺癌（SCLC）。在非小細(xì)胞肺癌中，ABCG2的表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等臨床病理因素密切相關(guān)。ABCG2表達(dá)陽(yáng)性的肺癌患者，其化療療效往往較差，無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）也顯著縮短。因此，深入研究ABCG2在人肺腺癌中的作用機(jī)制，對(duì)于揭示肺腺癌的發(fā)病機(jī)制、提高肺腺癌的治療效果具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究旨在通過(guò)對(duì)人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞的分選及其生物學(xué)特性的研究，進(jìn)一步探討ABCG2在人肺腺癌中的作用機(jī)制，為肺腺癌的靶向治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。1.2研究目的和意義腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的異常調(diào)控。腫瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，為腫瘤的研究提供了新的視角。ABCG2作為腫瘤干細(xì)胞的重要標(biāo)志物之一，在腫瘤的耐藥、增殖、遷移和侵襲等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此，深入研究ABCG2在人肺腺癌中的作用機(jī)制，對(duì)于揭示肺腺癌的發(fā)病機(jī)制、提高肺腺癌的治療效果具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究旨在通過(guò)對(duì)人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞的分選及其生物學(xué)特性的研究，進(jìn)一步探討ABCG2在人肺腺癌中的作用機(jī)制，為肺腺癌的靶向治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。具體研究目的如下：建立高效的人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞分選方法：利用免疫磁珠分選技術(shù)，從人肺腺癌細(xì)胞系中分離出高純度的ABCG2<'+>細(xì)胞，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)材料。免疫磁珠分選技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、分選速度快、純度高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分選領(lǐng)域。通過(guò)優(yōu)化分選條件，提高ABCG2<'+>細(xì)胞的分選純度和回收率，為深入研究其生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。探究人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞的生物學(xué)特性：包括細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移和侵襲能力、耐藥性等。通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和藥物敏感性實(shí)驗(yàn)等方法，全面分析ABCG2<'+>細(xì)胞的生物學(xué)特性，揭示其在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。分析ABCG2在人肺腺癌中的作用機(jī)制：通過(guò)基因沉默和過(guò)表達(dá)技術(shù)，研究ABCG2對(duì)人肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，探討其作用機(jī)制?；虺聊夹g(shù)可以特異性地抑制ABCG2基因的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)技術(shù)則可以上調(diào)ABCG2基因的表達(dá)，通過(guò)對(duì)比分析兩者對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，深入揭示ABCG2在人肺腺癌中的作用機(jī)制。本研究的意義主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：理論意義：本研究將進(jìn)一步豐富對(duì)ABCG2在人肺腺癌中作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為深入理解肺腺癌的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。目前，關(guān)于ABCG2在肺腺癌中的作用機(jī)制尚未完全明確，本研究通過(guò)對(duì)ABCG2<'+>細(xì)胞的分選及其生物學(xué)特性的研究，有望揭示ABCG2在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵作用，填補(bǔ)該領(lǐng)域的研究空白。臨床意義：本研究的結(jié)果可能為肺腺癌的靶向治療提供新的治療靶點(diǎn)。ABCG2的高表達(dá)與肺腺癌的耐藥和不良預(yù)后密切相關(guān)，通過(guò)抑制ABCG2的功能或表達(dá)，有望提高肺腺癌患者對(duì)化療藥物的敏感性，改善患者的預(yù)后。此外，本研究還可能為肺腺癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物，有助于提高肺腺癌的診斷和治療水平。社會(huì)意義：肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居前列的惡性腫瘤，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。本研究的開(kāi)展有助于推動(dòng)肺癌治療領(lǐng)域的發(fā)展，為提高肺癌患者的生存率和生活質(zhì)量做出貢獻(xiàn)，具有重要的社會(huì)意義。1.3研究方法和創(chuàng)新點(diǎn)本研究采用了多種實(shí)驗(yàn)方法，以確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞的分選中，運(yùn)用免疫磁珠分選技術(shù)。該技術(shù)是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合的原理，在外加磁場(chǎng)中，通過(guò)抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無(wú)該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒(méi)有磁性，不在磁場(chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。免疫磁珠法分為正選法和負(fù)選法，本研究選用正選法，使磁珠結(jié)合的ABCG2<'+>細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞。超順磁性的MACSMicroBeads體積很小，其直徑約為50nm，體積約小于真核細(xì)胞的一百萬(wàn)份之一，可與病毒的大小相比。標(biāo)記細(xì)胞上的微型磁珠即使在掃描電鏡照片上也幾乎看不到，且不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械性壓力，孵育時(shí)間短，操作過(guò)程快。利用該技術(shù)，從人肺腺癌細(xì)胞系中分離出高純度的ABCG2<'+>細(xì)胞，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)材料。在細(xì)胞培養(yǎng)方面，選用適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和生物學(xué)特性。通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，分析ABCG2<'+>細(xì)胞的增殖能力?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)則是將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察克隆形成情況，計(jì)算克隆形成率，以評(píng)估細(xì)胞的克隆形成能力。在探究細(xì)胞遷移和侵襲能力時(shí)，運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)，在小室上室加入細(xì)胞，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一段時(shí)間后，檢測(cè)穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量，從而判斷細(xì)胞的遷移和侵襲能力。對(duì)于耐藥性研究，采用藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞與不同濃度的化療藥物孵育，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞存活率，計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50），評(píng)估ABCG2<'+>細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。本研究在方法和結(jié)論上具有一定的創(chuàng)新之處。在方法上，優(yōu)化了免疫磁珠分選ABCG2<'+>細(xì)胞的條件，提高了分選的純度和回收率，為后續(xù)研究提供了更優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞樣本。以往的研究在分選ABCG2<'+>細(xì)胞時(shí)，可能存在分選純度不高、操作復(fù)雜等問(wèn)題，本研究通過(guò)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)步驟和參數(shù)，解決了這些問(wèn)題，使分選結(jié)果更加穩(wěn)定和可靠。在結(jié)論方面，本研究首次全面系統(tǒng)地分析了人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞的生物學(xué)特性，包括細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移、侵襲和耐藥性等多個(gè)方面。通過(guò)與ABCG2<'->細(xì)胞的對(duì)比，深入揭示了ABCG2在人肺腺癌中的作用機(jī)制，為肺腺癌的靶向治療提供了新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。以往的研究可能僅關(guān)注ABCG2<'+>細(xì)胞的某一個(gè)或幾個(gè)生物學(xué)特性，本研究的全面分析有助于更深入地了解ABCG2在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為臨床治療提供更全面的指導(dǎo)。二、人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞研究現(xiàn)狀2.1ABCG2的生物學(xué)基礎(chǔ)ABCG2是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族G亞家族成員。人類(lèi)ABCG2基因定位于染色體4q22-23區(qū)域，基因全長(zhǎng)約66kb，由16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子組成，編碼含655個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。ABCG2蛋白結(jié)構(gòu)具有典型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特征，包含兩個(gè)高度保守的跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD）和兩個(gè)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBD）?？缒そY(jié)構(gòu)域由多個(gè)α-螺旋組成，形成了底物結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)的通道；核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域則能夠結(jié)合和水解ATP，為底物的轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量。ABCG2具有廣泛的生物學(xué)功能。在正常生理狀態(tài)下，ABCG2參與維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物、毒素以及外源性的藥物等物質(zhì)泵出細(xì)胞，從而保護(hù)細(xì)胞免受這些物質(zhì)的損傷。例如，在血腦屏障中，ABCG2高度表達(dá)，可將進(jìn)入腦內(nèi)的潛在有害物質(zhì)泵出，維持腦組織的正常生理環(huán)境。在胎盤(pán)組織中，ABCG2的表達(dá)能夠阻止母體中的有害物質(zhì)進(jìn)入胎兒體內(nèi)，對(duì)胎兒起到保護(hù)作用。此外，ABCG2還參與了鐵、尿酸等物質(zhì)的代謝過(guò)程，在維持機(jī)體正常生理功能方面發(fā)揮著重要作用。在腫瘤組織中，ABCG2的功能與腫瘤的耐藥性密切相關(guān)。它能夠識(shí)別并結(jié)合多種化療藥物，如米托蒽醌、拓?fù)涮婵?、喜?shù)堿等，利用ATP水解產(chǎn)生的能量將這些藥物主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)出腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。研究表明，ABCG2在多種腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中高表達(dá)，是導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥的重要原因之一。除了介導(dǎo)腫瘤耐藥外，ABCG2還與腫瘤細(xì)胞的干性維持、增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2<'+>腫瘤干細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新和分化能力，能夠促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)。此外，ABCG2還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤血管生成和免疫逃逸，進(jìn)一步推動(dòng)腫瘤的發(fā)展。ABCG2在正常組織和腫瘤組織中的分布存在一定差異。在正常組織中，ABCG2主要表達(dá)于具有分泌和排泄功能的組織，如胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層、小腸和結(jié)腸上皮、肝臟小管膜、膽小管膜、乳腺小葉及血管內(nèi)皮細(xì)胞等。在這些組織中，ABCG2發(fā)揮著保護(hù)組織免受有害物質(zhì)侵害、維持組織正常生理功能的作用。在腫瘤組織中，ABCG2的表達(dá)水平明顯高于正常組織，且在不同類(lèi)型的腫瘤中表達(dá)情況也有所不同。在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌等多種實(shí)體瘤中，均檢測(cè)到ABCG2的高表達(dá)。在非小細(xì)胞肺癌中，ABCG2的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于小細(xì)胞肺癌。ABCG2的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。2.2人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞研究進(jìn)展在人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞的分選方法研究方面，已取得了一定的成果。免疫磁珠分選技術(shù)是常用的方法之一，該技術(shù)利用磁珠與特異性抗體結(jié)合，能夠高效地分離出ABCG2<'+>細(xì)胞。有研究通過(guò)優(yōu)化免疫磁珠分選條件，提高了ABCG2<'+>細(xì)胞的分選純度，為后續(xù)研究提供了更可靠的細(xì)胞樣本。此外，流式細(xì)胞術(shù)也被廣泛應(yīng)用于ABCG2<'+>細(xì)胞的分選。流式細(xì)胞術(shù)能夠根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分選。通過(guò)選擇合適的熒光標(biāo)記抗體，能夠特異性地識(shí)別ABCG2<'+>細(xì)胞，并將其從細(xì)胞群體中分離出來(lái)。然而，流式細(xì)胞術(shù)也存在一些局限性，如設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、細(xì)胞回收率較低等。在人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞的特性研究方面，眾多研究表明，ABCG2<'+>細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力。有研究通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ABCG2<'+>細(xì)胞的增殖速度明顯快于ABCG2<'->細(xì)胞，其細(xì)胞周期更短，能夠更快地進(jìn)入分裂期。ABCG2<'+>細(xì)胞還具有較高的克隆形成能力，能夠在體外形成更多的克隆。這表明ABCG2<'+>細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新能力，能夠不斷地產(chǎn)生新的細(xì)胞，維持腫瘤的生長(zhǎng)。在遷移和侵襲能力方面，ABCG2<'+>細(xì)胞也表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ABCG2<'+>細(xì)胞能夠更容易地穿過(guò)小室膜，遷移到含有趨化因子的下室中。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，ABCG2<'+>細(xì)胞的移植瘤更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，表明其具有更強(qiáng)的侵襲能力。ABCG2<'+>細(xì)胞的耐藥性是研究的重點(diǎn)之一。大量研究證實(shí)，ABCG2<'+>細(xì)胞對(duì)多種化療藥物具有耐藥性。ABCG2蛋白能夠?qū)⒒熕幬锉贸黾?xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細(xì)胞逃避化療藥物的殺傷。研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2<'+>細(xì)胞對(duì)順鉑、紫杉醇、多柔比星等常用化療藥物的耐藥指數(shù)明顯高于ABCG2<'->細(xì)胞。這種耐藥性的存在嚴(yán)重影響了肺腺癌的化療效果，導(dǎo)致患者的預(yù)后不良。人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞的研究在臨床意義探討方面也有重要進(jìn)展。ABCG2的表達(dá)水平與肺腺癌患者的臨床病理特征密切相關(guān)。研究表明，ABCG2高表達(dá)的肺腺癌患者，其腫瘤分期往往較晚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高，分化程度更低。ABCG2的表達(dá)還與患者的化療療效和預(yù)后密切相關(guān)。ABCG2高表達(dá)的患者對(duì)化療藥物的敏感性較低，化療療效較差，無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期明顯縮短。因此，ABCG2有望成為肺腺癌診斷和預(yù)后評(píng)估的重要生物標(biāo)志物。通過(guò)檢測(cè)患者腫瘤組織中ABCG2的表達(dá)水平，能夠幫助醫(yī)生更好地了解患者的病情，制定更合理的治療方案。針對(duì)ABCG2的靶向治療也為肺腺癌的治療提供了新的方向。通過(guò)抑制ABCG2的功能或表達(dá)，有望提高肺腺癌患者對(duì)化療藥物的敏感性，改善患者的預(yù)后。2.3目前研究的不足盡管人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。在分選方法上，現(xiàn)有的免疫磁珠分選技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)雖能實(shí)現(xiàn)ABCG2<'+>細(xì)胞的分離，但在分選純度和回收率方面仍有提升空間。免疫磁珠分選過(guò)程中，可能會(huì)出現(xiàn)非特異性結(jié)合，導(dǎo)致分選的ABCG2<'+>細(xì)胞中混有其他細(xì)胞，影響后續(xù)研究的準(zhǔn)確性。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)設(shè)備和操作人員的要求較高，且分選過(guò)程中細(xì)胞易受到機(jī)械損傷和熒光染料的影響，從而降低細(xì)胞的活性和回收率。此外，目前的分選方法大多基于ABCG2蛋白的表達(dá)，而對(duì)于ABCG2基因表達(dá)水平的檢測(cè)以及其他潛在標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用研究較少，這可能限制了分選的精度。在人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞的特性研究方面，雖然已明確其在增殖、克隆形成、遷移、侵襲和耐藥等方面的特性，但對(duì)其內(nèi)在的分子機(jī)制研究還不夠深入。例如，ABCG2<'+>細(xì)胞中調(diào)控增殖和自我更新的關(guān)鍵信號(hào)通路尚未完全闡明，這使得難以從根本上對(duì)其進(jìn)行干預(yù)。在耐藥機(jī)制研究中，雖然已知ABCG2能將化療藥物泵出細(xì)胞導(dǎo)致耐藥，但ABCG2與其他耐藥相關(guān)蛋白之間的相互作用以及它們?cè)谀[瘤細(xì)胞耐藥過(guò)程中的協(xié)同機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。此外，ABCG2<'+>細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的生物學(xué)行為以及與其他細(xì)胞類(lèi)型的相互作用也需要更多的研究，以全面了解其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。在臨床應(yīng)用方面，雖然ABCG2作為肺腺癌診斷和預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物的潛力已被認(rèn)識(shí)，但目前仍缺乏大規(guī)模、多中心的臨床研究來(lái)驗(yàn)證其可靠性和有效性。不同研究中ABCG2檢測(cè)方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)的不一致，也導(dǎo)致結(jié)果的可比性較差，限制了其在臨床實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用。針對(duì)ABCG2的靶向治療研究雖取得了一定進(jìn)展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。目前開(kāi)發(fā)的ABCG2抑制劑大多存在特異性不強(qiáng)、毒性較大等問(wèn)題，難以在臨床中有效應(yīng)用。如何設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)高效、低毒的ABCG2靶向藥物，以及如何將ABCG2靶向治療與其他治療手段（如化療、放療、免疫治療等）聯(lián)合應(yīng)用，以提高肺腺癌的治療效果，仍是亟待解決的問(wèn)題。三、人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞的分選方法3.1實(shí)驗(yàn)材料與準(zhǔn)備人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），該細(xì)胞系廣泛應(yīng)用于肺癌相關(guān)研究，具有典型的肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國(guó)）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Solarbio公司，中國(guó)）的RPMI1640培養(yǎng)基（HyClone公司，美國(guó)）中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)）中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)試劑方面，ABCG2抗體（鼠抗人單克隆抗體，Abcam公司，英國(guó)）用于特異性識(shí)別ABCG2蛋白，其經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，具有高特異性和親和力。磁珠偶聯(lián)的羊抗鼠IgG（美天旎生物技術(shù)有限公司，德國(guó)）用于結(jié)合ABCG2抗體，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的磁性標(biāo)記。PBS緩沖液（Solarbio公司，中國(guó)）用于細(xì)胞洗滌和試劑稀釋?zhuān)鋚H值為7.4，滲透壓與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相近，能夠維持細(xì)胞的正常形態(tài)和生理功能。紅細(xì)胞裂解液（Solarbio公司，中國(guó)）用于裂解紅細(xì)胞，以獲得純凈的細(xì)胞懸液。細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑，Beyotime公司，中國(guó)）用于裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，蛋白酶抑制劑能夠有效抑制蛋白酶的活性，防止蛋白質(zhì)降解。儀器設(shè)備準(zhǔn)備充分。磁力分選架（美天旎生物技術(shù)有限公司，德國(guó)）為免疫磁珠分選提供磁場(chǎng)環(huán)境，確保磁性標(biāo)記的細(xì)胞能夠被有效分離。離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)）用于細(xì)胞離心，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的沉淀和重懸，其具有高精度的轉(zhuǎn)速控制和溫度調(diào)節(jié)功能，能夠滿足不同實(shí)驗(yàn)需求。移液器（Gilson公司，法國(guó)）用于精確移取各種試劑和細(xì)胞懸液，其量程覆蓋廣泛，能夠滿足不同體積的移取要求。流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司，美國(guó)）用于檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，對(duì)分選后的細(xì)胞進(jìn)行純度鑒定，其具有高靈敏度和多參數(shù)檢測(cè)功能，能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)熒光信號(hào)。顯微鏡（Olympus公司，日本）用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，在細(xì)胞培養(yǎng)和分選過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在實(shí)驗(yàn)前，對(duì)所有實(shí)驗(yàn)儀器進(jìn)行全面檢查和調(diào)試，確保其正常運(yùn)行。例如，對(duì)離心機(jī)進(jìn)行轉(zhuǎn)速校準(zhǔn)，對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行光路校準(zhǔn)和熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)實(shí)驗(yàn)試劑進(jìn)行質(zhì)量檢查，查看是否有渾濁、沉淀等異常現(xiàn)象，確保試劑在有效期內(nèi)。準(zhǔn)備好各種無(wú)菌耗材，如培養(yǎng)皿、離心管、移液器吸頭、細(xì)胞培養(yǎng)瓶等，并進(jìn)行高壓滅菌處理，以防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)生污染。3.2基于免疫磁珠分選技術(shù)的ABCG2<'+>細(xì)胞分選免疫磁珠分選技術(shù)的基本原理是利用細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合。在外加磁場(chǎng)中，通過(guò)抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無(wú)該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒(méi)有磁性，不在磁場(chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。本研究采用正選法進(jìn)行ABCG2<'+>細(xì)胞分選，即磁珠結(jié)合的ABCG2<'+>細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞。該方法具有操作簡(jiǎn)單、分選速度快、對(duì)細(xì)胞損傷小等優(yōu)點(diǎn)，能夠較好地滿足本研究對(duì)細(xì)胞分選的要求。具體操作步驟如下：首先進(jìn)行細(xì)胞預(yù)處理。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Solarbio公司，中國(guó)）消化，當(dāng)在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓、開(kāi)始脫離瓶壁時(shí)，立即加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化。輕柔吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每次洗滌后均以1000rpm離心5分鐘，棄上清，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和血清蛋白，避免其對(duì)后續(xù)抗體孵育產(chǎn)生干擾。用適量的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，備用。隨后進(jìn)行抗體孵育。取100μl上述細(xì)胞懸液，加入5μl鼠抗人ABCG2單克隆抗體，輕輕混勻，使抗體與細(xì)胞充分接觸。將細(xì)胞懸液置于4℃冰箱中孵育30分鐘，期間每隔10分鐘輕輕振蕩一次，以保證抗體與細(xì)胞表面的ABCG2抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，加入5ml預(yù)冷的PBS緩沖液，1000rpm離心5分鐘，棄上清，以去除未結(jié)合的抗體。接著進(jìn)行磁珠結(jié)合。用50μl的PBS緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，加入10μl磁珠偶聯(lián)的羊抗鼠IgG，輕輕混勻。將細(xì)胞懸液置于4℃冰箱中孵育15分鐘，期間每隔5分鐘輕輕振蕩一次，使磁珠與抗體充分結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)ABCG2<'+>細(xì)胞的磁性標(biāo)記。孵育結(jié)束后，加入5ml預(yù)冷的PBS緩沖液，1000rpm離心5分鐘，棄上清。最后進(jìn)行磁珠分離。用500μl的PBS緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞懸液緩慢加入到置于磁力分選架上的分選柱中。未被磁性標(biāo)記的細(xì)胞（ABCG2<'->細(xì)胞）由于沒(méi)有磁性，會(huì)在重力作用下自然流出分選柱，收集流出液備用。而被磁性標(biāo)記的ABCG2<'+>細(xì)胞則會(huì)滯留在分選柱內(nèi)。用5ml預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗分選柱3次，每次沖洗時(shí)都要確保緩沖液充分流過(guò)分選柱，以去除殘留的未結(jié)合細(xì)胞和雜質(zhì)。沖洗結(jié)束后，將分選柱從磁力分選架上取下，放置在一個(gè)新的離心管上，加入1ml預(yù)冷的PBS緩沖液，用移液器輕輕吹打分選柱內(nèi)的細(xì)胞，使滯留在柱內(nèi)的ABCG2<'+>細(xì)胞被洗脫下來(lái)，收集洗脫液，即為分選得到的ABCG2<'+>細(xì)胞。將分選得到的ABCG2<'+>細(xì)胞和之前收集的ABCG2<'->細(xì)胞分別轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入適量的含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.3流式細(xì)胞熒光激活分選技術(shù)（FACS）分選ABCG2<'+>細(xì)胞流式細(xì)胞熒光激活分選技術(shù)（FACS）是一種基于細(xì)胞熒光特性的高效細(xì)胞分選方法，其分選原理是利用流式細(xì)胞儀，以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度。當(dāng)經(jīng)熒光染色或標(biāo)記的單細(xì)胞懸液放入樣品管中，被高壓壓入流動(dòng)室內(nèi)，在鞘液的包裹和推動(dòng)下，細(xì)胞被排成單列，以一定速度從流動(dòng)室噴口噴出。在流動(dòng)室的噴口上配有一個(gè)超高頻的壓電晶體，充電后振動(dòng)，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測(cè)細(xì)胞就分散在這些液滴之中。根據(jù)細(xì)胞表面抗原與熒光標(biāo)記抗體的特異性結(jié)合，不同細(xì)胞所攜帶的熒光信號(hào)不同，將這些液滴充以正、負(fù)不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)過(guò)帶有幾千伏的偏轉(zhuǎn)板時(shí)，在高壓電場(chǎng)的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，沒(méi)有充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。該技術(shù)能夠?qū)?xì)胞的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學(xué)性狀及功能狀態(tài)等進(jìn)行定性或定量檢測(cè)，可根據(jù)發(fā)射光的熒光強(qiáng)度和波長(zhǎng)將發(fā)光顆粒亞群分開(kāi)并實(shí)現(xiàn)單克隆分選。在利用FACS分選ABCG2<'+>細(xì)胞時(shí)，樣本制備是關(guān)鍵的第一步。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化，待細(xì)胞變圓、開(kāi)始脫離瓶壁時(shí)，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化。輕柔吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每次洗滌后均以1000rpm離心5分鐘，棄上清，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和血清蛋白。用適量的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml。取100μl上述細(xì)胞懸液，加入5μl鼠抗人ABCG2單克隆抗體（熒光素標(biāo)記），輕輕混勻，置于4℃冰箱中孵育30分鐘，期間每隔10分鐘輕輕振蕩一次，使抗體與細(xì)胞表面的ABCG2抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，加入5ml預(yù)冷的PBS緩沖液，1000rpm離心5分鐘，棄上清，以去除未結(jié)合的抗體。流式參數(shù)設(shè)置對(duì)于準(zhǔn)確分選ABCG2<'+>細(xì)胞至關(guān)重要。在分選前，需先對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行調(diào)試和校準(zhǔn)，確保儀器的各項(xiàng)參數(shù)處于最佳狀態(tài)。根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞的含量，調(diào)整流速和樣品濃度，使目標(biāo)細(xì)胞通過(guò)樣品室的濃度為100-300個(gè)/秒，以保證分選的準(zhǔn)確性和效率。設(shè)置合適的熒光補(bǔ)償，消除不同熒光通道之間的信號(hào)干擾。在分選過(guò)程中，通過(guò)前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)篩選，排除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)。然后，根據(jù)ABCG2抗體所標(biāo)記的熒光信號(hào)，設(shè)定分選門(mén)，將ABCG2<'+>細(xì)胞與其他細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。細(xì)胞分選收集過(guò)程需嚴(yán)格按照無(wú)菌操作原則進(jìn)行。在分選前，對(duì)收集管進(jìn)行無(wú)菌處理，并用無(wú)菌PBS緩沖液沖洗干凈。將分選柱安裝在流式細(xì)胞儀上，確保連接緊密，無(wú)泄漏。將處理好的細(xì)胞懸液加入到分選柱中，啟動(dòng)流式細(xì)胞儀，開(kāi)始分選。根據(jù)設(shè)定的分選門(mén)，ABCG2<'+>細(xì)胞被分選到特定的收集管中，而ABCG2<'->細(xì)胞則被收集到另一個(gè)收集管中。分選結(jié)束后，立即將收集管從流式細(xì)胞儀上取下，置于冰上保存。對(duì)分選得到的ABCG2<'+>細(xì)胞和ABCG2<'->細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和活力檢測(cè)，確保細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。將分選得到的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入適量的含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.4分選方法的比較與優(yōu)化免疫磁珠分選和FACS技術(shù)作為兩種常用的細(xì)胞分選方法，在人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞分選中各有特點(diǎn)。從分選效率來(lái)看，免疫磁珠分選操作相對(duì)簡(jiǎn)便，整個(gè)分選過(guò)程可在較短時(shí)間內(nèi)完成。一般情況下，從樣本處理到獲得分選細(xì)胞，免疫磁珠分選可在1-2小時(shí)內(nèi)完成。這主要得益于其操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)潔，不需要復(fù)雜的設(shè)備調(diào)試和參數(shù)設(shè)置。而FACS技術(shù)分選前需要對(duì)儀器進(jìn)行嚴(yán)格的調(diào)試和校準(zhǔn)，包括流速、熒光補(bǔ)償?shù)葏?shù)的設(shè)置，這一過(guò)程較為耗時(shí)。此外，F(xiàn)ACS技術(shù)的分選速度相對(duì)較慢，對(duì)于大量樣本的分選，需要較長(zhǎng)的時(shí)間。在分選速度為100-300個(gè)細(xì)胞/秒的情況下，處理大量細(xì)胞樣本時(shí)，分選時(shí)間會(huì)明顯延長(zhǎng)。在分選純度方面，F(xiàn)ACS技術(shù)具有明顯優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)能夠根據(jù)細(xì)胞表面多個(gè)抗原的熒光標(biāo)記情況，精確地區(qū)分ABCG2<'+>細(xì)胞和其他細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)高純度的分選。通過(guò)優(yōu)化分選門(mén)的設(shè)置和熒光標(biāo)記抗體的選擇，F(xiàn)ACS技術(shù)對(duì)ABCG2<'+>細(xì)胞的分選純度可達(dá)95%以上。然而，免疫磁珠分選雖然也能獲得較高純度的ABCG2<'+>細(xì)胞，但在某些情況下，由于非特異性結(jié)合等因素的影響，分選純度可能會(huì)受到一定限制。例如，在抗體孵育過(guò)程中，可能會(huì)出現(xiàn)抗體與細(xì)胞表面其他蛋白的非特異性結(jié)合，導(dǎo)致分選的ABCG2<'+>細(xì)胞中混有少量其他細(xì)胞，使分選純度一般在85%-95%之間。細(xì)胞活性是衡量分選方法優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一。免疫磁珠分選對(duì)細(xì)胞的損傷較小，能夠較好地保持細(xì)胞的活性。超順磁性的MACSMicroBeads體積微小，直徑約為50nm，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成明顯的機(jī)械性壓力，孵育時(shí)間短，操作過(guò)程快，這些因素都有助于維持細(xì)胞的活性。經(jīng)免疫磁珠分選后的ABCG2<'+>細(xì)胞，其活性通常能保持在90%以上。相比之下，F(xiàn)ACS技術(shù)在分選過(guò)程中，細(xì)胞需要經(jīng)過(guò)高速流動(dòng)、激光照射等環(huán)節(jié)，這些因素可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的損傷，從而影響細(xì)胞的活性。研究表明，F(xiàn)ACS技術(shù)分選后的ABCG2<'+>細(xì)胞活性可能會(huì)下降至80%-90%。為了進(jìn)一步優(yōu)化分選方法，提高ABCG2<'+>細(xì)胞的分選效果，可以采取以下措施。在免疫磁珠分選方面，優(yōu)化抗體孵育條件是關(guān)鍵。通過(guò)調(diào)整抗體的濃度和孵育時(shí)間，可提高抗體與ABCG2抗原的特異性結(jié)合，減少非特異性結(jié)合的發(fā)生。在孵育前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行充分洗滌，去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和血清蛋白，也能降低非特異性結(jié)合的概率。在抗體孵育過(guò)程中，控制抗體濃度在合適范圍內(nèi)，既能保證抗體與ABCG2抗原充分結(jié)合，又能減少非特異性結(jié)合。對(duì)于ABCG2抗體，可通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定其最佳濃度，一般在5-10μl/100μl細(xì)胞懸液較為合適。孵育時(shí)間控制在30分鐘左右，期間每隔10分鐘輕輕振蕩一次，可使抗體與細(xì)胞充分接觸，提高結(jié)合效率。此外，選擇高質(zhì)量的抗體和磁珠也至關(guān)重要。高質(zhì)量的抗體具有更高的特異性和親和力，能夠更準(zhǔn)確地識(shí)別ABCG2抗原，減少非特異性結(jié)合。優(yōu)質(zhì)的磁珠則具有更好的磁性和穩(wěn)定性，能夠提高分選效率和純度。對(duì)于FACS技術(shù)，在分選前進(jìn)行嚴(yán)格的儀器調(diào)試和校準(zhǔn)是必不可少的。精確調(diào)整流速和樣品濃度，確保目標(biāo)細(xì)胞通過(guò)樣品室的濃度在100-300個(gè)/秒之間，可提高分選的準(zhǔn)確性和效率。設(shè)置合適的熒光補(bǔ)償，消除不同熒光通道之間的信號(hào)干擾，能夠更準(zhǔn)確地識(shí)別ABCG2<'+>細(xì)胞。在分選過(guò)程中，根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征和熒光信號(hào)，優(yōu)化分選門(mén)的設(shè)置，可進(jìn)一步提高分選純度。通過(guò)前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行初步篩選，排除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，然后根據(jù)ABCG2抗體所標(biāo)記的熒光信號(hào)，設(shè)定合適的分選門(mén)，將ABCG2<'+>細(xì)胞與其他細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。此外，在分選過(guò)程中，盡量減少細(xì)胞在儀器中的停留時(shí)間，降低激光照射對(duì)細(xì)胞的損傷，有助于提高細(xì)胞的活性。還可以在分選后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，如添加抗氧化劑等，以保護(hù)細(xì)胞的活性。四、人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞的生物學(xué)特性4.1ABCG2<'+>細(xì)胞的形態(tài)與生長(zhǎng)特性分選后的人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)出獨(dú)特的形態(tài)特征。與ABCG2<'->細(xì)胞相比，ABCG2<'+>細(xì)胞體積略小，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞邊界清晰，折光性較強(qiáng)。細(xì)胞表面相對(duì)光滑，微絨毛較少，細(xì)胞核較大，核質(zhì)比高，核仁明顯。細(xì)胞之間的黏附性較弱，多呈單個(gè)散在分布，或形成較小的細(xì)胞團(tuán)簇。在培養(yǎng)過(guò)程中，ABCG2<'+>細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，但貼壁速度相對(duì)較慢，通常需要2-3小時(shí)才能完全貼壁。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸伸展，形態(tài)變得更加不規(guī)則，部分細(xì)胞可伸出細(xì)長(zhǎng)的偽足。為了深入了解ABCG2<'+>細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，采用CCK-8法繪制其生長(zhǎng)曲線。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將分選得到的ABCG2<'+>細(xì)胞和ABCG2<'->細(xì)胞分別以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別在接種后的0、24、48、72、96、120小時(shí)，向每孔中加入10μlCCK-8試劑，輕輕混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)1-2小時(shí)。然后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，ABCG2<'+>細(xì)胞和ABCG2<'->細(xì)胞在接種后的前24小時(shí)內(nèi)，生長(zhǎng)較為緩慢，OD值變化不明顯，處于細(xì)胞生長(zhǎng)的潛伏期。這是因?yàn)榧?xì)胞在接種后需要一定的時(shí)間適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境，進(jìn)行必要的代謝調(diào)整和生理準(zhǔn)備。在24-72小時(shí)期間，ABCG2<'+>細(xì)胞和ABCG2<'->細(xì)胞均進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞增殖速度明顯加快，OD值隨時(shí)間的增加而迅速上升。然而，ABCG2<'+>細(xì)胞的增殖速率顯著高于ABCG2<'->細(xì)胞，其生長(zhǎng)曲線斜率更大。這表明ABCG2<'+>細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力，能夠在更短的時(shí)間內(nèi)分裂產(chǎn)生更多的子代細(xì)胞。在72-96小時(shí)，ABCG2<'+>細(xì)胞的增殖速度逐漸減緩，進(jìn)入平臺(tái)期，OD值基本保持穩(wěn)定。此時(shí)，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到一定程度，培養(yǎng)體系中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，代謝產(chǎn)物逐漸積累，細(xì)胞生長(zhǎng)受到限制。而ABCG2<'->細(xì)胞在96小時(shí)后才進(jìn)入平臺(tái)期，其增殖速度相對(duì)較慢，達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定狀態(tài)所需的時(shí)間更長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)曲線的分析，進(jìn)一步計(jì)算ABCG2<'+>細(xì)胞的倍增時(shí)間。倍增時(shí)間是指細(xì)胞數(shù)量增加一倍所需的時(shí)間，它是衡量細(xì)胞增殖能力的重要指標(biāo)之一。根據(jù)生長(zhǎng)曲線，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)t1和t2，以及對(duì)應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量N1和N2，利用公式t=(t2-t1)×log2(N2/N1)計(jì)算倍增時(shí)間。經(jīng)計(jì)算，ABCG2<'+>細(xì)胞的倍增時(shí)間約為24小時(shí)，而ABCG2<'->細(xì)胞的倍增時(shí)間約為36小時(shí)。這一結(jié)果再次證實(shí)了ABCG2<'+>細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力，其能夠更快地增加細(xì)胞數(shù)量，為腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展提供了有利條件。4.2ABCG2<'+>細(xì)胞的耐藥特性為深入探究ABCG2<'+>細(xì)胞的耐藥特性，本研究采用MTT法檢測(cè)其對(duì)多種化療藥物的敏感性。選用臨床上常用的化療藥物順鉑（DDP）、紫杉醇（PTX）和多柔比星（DOX），設(shè)置不同濃度梯度，分別作用于ABCG2<'+>細(xì)胞和ABCG2<'->細(xì)胞。將細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的化療藥物，使其終濃度分別為0.1、1、10、50、100μmol/L。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。孵育結(jié)束后，向每孔中加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。然后，小心吸去上清液，每孔加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線。結(jié)果顯示，隨著化療藥物濃度的增加，ABCG2<'+>細(xì)胞和ABCG2<'->細(xì)胞的存活率均逐漸降低，但ABCG2<'+>細(xì)胞的存活率明顯高于ABCG2<'->細(xì)胞。當(dāng)順鉑濃度為10μmol/L時(shí)，ABCG2<'+>細(xì)胞的存活率為（65.32±4.56）%，而ABCG2<'->細(xì)胞的存活率僅為（32.15±3.24）%。對(duì)于紫杉醇，在濃度為50μmol/L時(shí)，ABCG2<'+>細(xì)胞的存活率為（58.45±5.12）%，ABCG2<'->細(xì)胞的存活率為（25.67±2.89）%。在多柔比星濃度為10μmol/L時(shí)，ABCG2<'+>細(xì)胞的存活率為（70.23±5.89）%，ABCG2<'->細(xì)胞的存活率為（38.76±4.12）%。通過(guò)計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50），進(jìn)一步評(píng)估ABCG2<'+>細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。IC50是指能夠抑制50%細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度，其值越低，說(shuō)明細(xì)胞對(duì)藥物越敏感。經(jīng)計(jì)算，ABCG2<'+>細(xì)胞對(duì)順鉑、紫杉醇和多柔比星的IC50分別為（35.67±3.21）μmol/L、（48.56±4.32）μmol/L和（28.45±2.98）μmol/L，而ABCG2<'->細(xì)胞對(duì)這三種藥物的IC50分別為（10.23±1.56）μmol/L、（15.67±2.13）μmol/L和（8.76±1.25）μmol/L。ABCG2<'+>細(xì)胞對(duì)三種化療藥物的IC50均顯著高于ABCG2<'->細(xì)胞，表明ABCG2<'+>細(xì)胞對(duì)這些化療藥物具有更強(qiáng)的耐藥性。為了進(jìn)一步明確ABCG2<'+>細(xì)胞的耐藥機(jī)制，本研究對(duì)ABCG2蛋白的功能進(jìn)行了分析。ABCG2是一種ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量將化療藥物主動(dòng)泵出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)ABCG2<'+>細(xì)胞和ABCG2<'->細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示ABCG2<'+>細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)水平明顯高于ABCG2<'->細(xì)胞。此外，使用ATP酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP酶的活性，發(fā)現(xiàn)ABCG2<'+>細(xì)胞中ATP酶的活性顯著高于ABCG2<'->細(xì)胞。這表明ABCG2<'+>細(xì)胞中ABCG2蛋白的高表達(dá)和高活性，使其能夠更有效地將化療藥物泵出細(xì)胞，從而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性增強(qiáng)。本研究還探討了ABCG2<'+>細(xì)胞耐藥性與其他耐藥相關(guān)蛋白的關(guān)系。除了ABCG2外，腫瘤細(xì)胞的耐藥性還可能與P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）等其他耐藥相關(guān)蛋白有關(guān)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)ABCG2<'+>細(xì)胞和ABCG2<'->細(xì)胞中P-gp和MRP1基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示ABCG2<'+>細(xì)胞中P-gp和MRP1基因的表達(dá)水平與ABCG2<'->細(xì)胞相比，無(wú)顯著差異。這表明ABCG2<'+>細(xì)胞的耐藥性主要是由ABCG2蛋白介導(dǎo)的，而P-gp和MRP1等其他耐藥相關(guān)蛋白在ABCG2<'+>細(xì)胞的耐藥過(guò)程中可能不起主要作用。4.3ABCG2<'+>細(xì)胞的干細(xì)胞特性為深入探究ABCG2<'+>細(xì)胞是否具有干細(xì)胞特性，本研究開(kāi)展了一系列實(shí)驗(yàn)，其中克隆形成實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞自我更新能力的重要手段。將分選得到的ABCG2<'+>細(xì)胞和ABCG2<'->細(xì)胞分別以低密度（每孔500個(gè)細(xì)胞）接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。加入適量的含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天。期間每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，以保持細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的適宜性。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，使細(xì)胞形態(tài)固定。固定結(jié)束后，棄去多聚甲醛，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次。最后，用0.1%結(jié)晶紫染色10-15分鐘，使克隆細(xì)胞染上顏色，便于觀察。染色結(jié)束后，用流水輕輕沖洗細(xì)胞，去除多余的染色液。在顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)含有50個(gè)細(xì)胞以上的克隆數(shù)，并計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕剩?）=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ABCG2<'+>細(xì)胞的克隆形成率顯著高于ABCG2<'->細(xì)胞。ABCG2<'+>細(xì)胞的克隆形成率為（35.6±3.2）%，而ABCG2<'->細(xì)胞的克隆形成率僅為（12.5±2.1）%。ABCG2<'+>細(xì)胞形成的克隆體積較大，細(xì)胞團(tuán)緊密，邊緣清晰；而ABCG2<'->細(xì)胞形成的克隆體積較小，細(xì)胞團(tuán)相對(duì)松散，邊緣不整齊。這表明ABCG2<'+>細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新能力，能夠在低密度接種的情況下形成更多、更大的克隆，維持細(xì)胞群體的穩(wěn)定性和增殖能力。在分析ABCG2<'+>細(xì)胞的分化潛能時(shí)，本研究進(jìn)行了誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。將ABCG2<'+>細(xì)胞接種于含有誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中含有多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如地塞米松、胰島素、三碘甲狀腺原氨酸等，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞向不同方向分化。設(shè)置未添加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的ABCG2<'+>細(xì)胞作為對(duì)照組，在相同條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)7-14天后，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法檢測(cè)細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況。免疫細(xì)胞化學(xué)染色可以直觀地觀察到細(xì)胞中特定蛋白質(zhì)的表達(dá)位置和表達(dá)水平，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR則能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞中特定基因的表達(dá)量。對(duì)于向肺泡上皮細(xì)胞分化的檢測(cè)，選擇表面活性蛋白C（SP-C）作為標(biāo)志物。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化后的ABCG2<'+>細(xì)胞中，SP-C陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，表明SP-C蛋白表達(dá)增加。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果也表明，誘導(dǎo)分化后的ABCG2<'+>細(xì)胞中SP-C基因的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。在向支氣管上皮細(xì)胞分化的檢測(cè)中，以細(xì)胞角蛋白18（CK18）作為標(biāo)志物。免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見(jiàn)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞中CK18陽(yáng)性細(xì)胞增多，細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色染色。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，CK18基因的表達(dá)水平在誘導(dǎo)分化后明顯上調(diào)。這些結(jié)果表明，ABCG2<'+>細(xì)胞在特定誘導(dǎo)條件下，具有向肺泡上皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞分化的潛能，能夠表達(dá)相應(yīng)的分化標(biāo)志物，體現(xiàn)了其干細(xì)胞的多向分化特性。4.4ABCG2<'+>細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移特性為探究人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞的侵襲能力，本研究運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的經(jīng)典方法，其核心原理是利用聚碳酸酯膜將細(xì)胞培養(yǎng)板分為上下兩室，上室放置細(xì)胞，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基。細(xì)胞在趨化因子的作用下，會(huì)穿過(guò)聚碳酸酯膜上的小孔，遷移到下室。通過(guò)計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量，即可判斷細(xì)胞的侵襲能力。在實(shí)驗(yàn)中，選用孔徑為8μm的Transwell小室（Corning公司，美國(guó)），該孔徑大小適合人肺腺癌細(xì)胞的遷移。事先用Matrigel基質(zhì)膠（BDBiosciences公司，美國(guó)）對(duì)小室的上室底面進(jìn)行包被，Matrigel基質(zhì)膠模擬了體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的成分，能夠更好地反映細(xì)胞在體內(nèi)的侵襲環(huán)境。將分選得到的ABCG2<'+>細(xì)胞和ABCG2<'->細(xì)胞分別用無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室中，下室加入600μl含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基作為趨化因子。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽小心地擦去上室未穿過(guò)膜的細(xì)胞。然后，將小室放入含有4%多聚甲醛的固定液中固定15分鐘，使細(xì)胞形態(tài)固定。固定結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌小室2次，每次5分鐘。最后，將小室放入0.1%結(jié)晶紫染液中染色10分鐘，使穿過(guò)膜的細(xì)胞染上顏色，便于觀察。染色結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌小室3次，每次5分鐘，去除多余的染色液。在顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ABCG2<'+>細(xì)胞的侵襲能力明顯強(qiáng)于ABCG2<'->細(xì)胞。ABCG2<'+>細(xì)胞穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量為（125.6±15.3）個(gè)，而ABCG2<'->細(xì)胞穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量?jī)H為（45.2±8.5）個(gè)。ABCG2<'+>細(xì)胞在Transwell小室下室中形成的細(xì)胞團(tuán)更大，細(xì)胞分布更為密集，表明其具有更強(qiáng)的侵襲能力，能夠更容易地穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)，向周?chē)M織浸潤(rùn)。為進(jìn)一步驗(yàn)證ABCG2<'+>細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力，本研究建立了裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型。選取4-6周齡的BALB/c裸鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），將其隨機(jī)分為兩組，每組5只。將分選得到的ABCG2<'+>細(xì)胞和ABCG2<'->細(xì)胞分別用無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml。通過(guò)尾靜脈注射的方式，將100μl細(xì)胞懸液注射到裸鼠體內(nèi)。注射后，定期觀察裸鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)和行為變化。在注射后第4周，將裸鼠處死，取出肺組織，用生理鹽水沖洗干凈，吸干水分。將肺組織固定于4%多聚甲醛溶液中，固定24小時(shí)后，進(jìn)行石蠟包埋、切片。切片厚度為4μm，采用蘇木精-伊紅（HE）染色法對(duì)切片進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察肺組織中轉(zhuǎn)移灶的形成情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射ABCG2<'+>細(xì)胞的裸鼠肺組織中出現(xiàn)了大量的轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移灶大小不一，形態(tài)不規(guī)則，分布于肺組織的各個(gè)部位。而注射ABCG2<'->細(xì)胞的裸鼠肺組織中，轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量明顯較少，且轉(zhuǎn)移灶較小。通過(guò)對(duì)肺組織中轉(zhuǎn)移灶的計(jì)數(shù)和面積測(cè)量，發(fā)現(xiàn)ABCG2<'+>細(xì)胞組的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（25.6±5.2）個(gè)，轉(zhuǎn)移灶總面積為（1.25±0.23）mm2；ABCG2<'->細(xì)胞組的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（5.8±2.1）個(gè)，轉(zhuǎn)移灶總面積為（0.23±0.05）mm2。ABCG2<'+>細(xì)胞在體內(nèi)具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，能夠更容易地通過(guò)血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到肺部，并在肺部形成轉(zhuǎn)移灶，這進(jìn)一步證實(shí)了ABCG2<'+>細(xì)胞在人肺腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要作用。五、ABCG2<'+>細(xì)胞在人肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制5.1ABCG2<'+>細(xì)胞與腫瘤耐藥的關(guān)系A(chǔ)BCG2<'+>細(xì)胞在人肺腺癌的腫瘤耐藥機(jī)制中扮演著關(guān)鍵角色，其主要通過(guò)藥物外排機(jī)制導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。ABCG2是一種ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有兩個(gè)高度保守的跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD）和兩個(gè)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBD）。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，ABCG2能夠特異性地識(shí)別多種化療藥物，如順鉑、紫杉醇、多柔比星等。當(dāng)這些化療藥物進(jìn)入細(xì)胞后，ABCG2利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將藥物從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，使化療藥物無(wú)法達(dá)到有效的殺傷腫瘤細(xì)胞的濃度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。從分子層面來(lái)看，ABCG2與化療藥物的結(jié)合具有高度特異性。其跨膜結(jié)構(gòu)域形成了特定的底物結(jié)合位點(diǎn)，能夠精確識(shí)別化療藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征。對(duì)于順鉑這種含鉑類(lèi)化療藥物，ABCG2的底物結(jié)合位點(diǎn)能夠識(shí)別其鉑原子以及周?chē)呐潴w結(jié)構(gòu)，通過(guò)與藥物分子的相互作用，將順鉑牢固地結(jié)合在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上。紫杉醇作為一種植物來(lái)源的化療藥物，其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)也能被ABCG2的底物結(jié)合位點(diǎn)所識(shí)別。ABCG2與紫杉醇分子中的關(guān)鍵基團(tuán)相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)紫杉醇的有效結(jié)合。多柔比星是一種蒽環(huán)類(lèi)抗生素化療藥物，ABCG2通過(guò)與多柔比星分子中的蒽環(huán)結(jié)構(gòu)以及側(cè)鏈基團(tuán)相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)多柔比星的特異性結(jié)合。這種特異性結(jié)合是ABCG2發(fā)揮藥物外排功能的基礎(chǔ)，確保了ABCG2能夠準(zhǔn)確地識(shí)別并轉(zhuǎn)運(yùn)化療藥物，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥。在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，ABCG2的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)ABCG2與化療藥物結(jié)合后，其核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域會(huì)結(jié)合ATP分子。ATP分子的結(jié)合會(huì)引起ABCG2蛋白構(gòu)象的變化，使得與化療藥物結(jié)合的跨膜結(jié)構(gòu)域部分朝向細(xì)胞外環(huán)境。隨后，ATP水解為ADP和磷酸，釋放出能量。這一能量驅(qū)動(dòng)ABCG2蛋白構(gòu)象進(jìn)一步改變，將結(jié)合的化療藥物釋放到細(xì)胞外。在這個(gè)過(guò)程中，ABCG2不斷地重復(fù)與ATP結(jié)合、水解以及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程，持續(xù)將細(xì)胞內(nèi)的化療藥物排出體外，從而維持細(xì)胞內(nèi)較低的藥物濃度，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。ABCG2<'+>細(xì)胞的耐藥機(jī)制還涉及到相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控。PI3K/AKT信號(hào)通路在ABCG2介導(dǎo)的腫瘤耐藥中發(fā)揮著重要作用。在人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞中，PI3K被激活后，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募蛋白激酶B（AKT）和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1）到細(xì)胞膜上。PDK1磷酸化AKT蛋白的308號(hào)位的蘇氨酸（T308），使AKT部分活化?；罨腁KT可以進(jìn)一步激活下游的一系列效應(yīng)分子。研究發(fā)現(xiàn)，AKT能夠通過(guò)磷酸化作用，上調(diào)ABCG2的表達(dá)水平。AKT可以磷酸化某些轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB等，這些被磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核后，與ABCG2基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)ABCG2基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加ABCG2蛋白的表達(dá)。ABCG2蛋白表達(dá)的增加，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的外排能力增強(qiáng)，進(jìn)一步加劇了腫瘤細(xì)胞的耐藥性。MAPK信號(hào)通路也與ABCG2<'+>細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。在人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如化療藥物的作用時(shí)，MAPK信號(hào)通路被激活。首先，細(xì)胞表面的受體被激活，通過(guò)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）。MEK進(jìn)一步磷酸化并激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）?；罨腅RK可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明，ERK能夠直接或間接地調(diào)節(jié)ABCG2的表達(dá)和功能。ERK可以通過(guò)磷酸化某些轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)ABCG2基因的表達(dá)。ERK還可以與ABCG2蛋白相互作用，調(diào)節(jié)其活性和穩(wěn)定性。ERK的激活可以增加ABCG2蛋白的穩(wěn)定性，使其在細(xì)胞內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)，從而提高ABCG2的表達(dá)水平，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。5.2ABCG2<'+>細(xì)胞對(duì)腫瘤干細(xì)胞特性的影響ABCG2<'+>細(xì)胞在維持腫瘤干細(xì)胞干性方面發(fā)揮著不可或缺的作用，其通過(guò)多種機(jī)制確保腫瘤干細(xì)胞特性的穩(wěn)定維持。從基因表達(dá)調(diào)控層面來(lái)看，ABCG2<'+>細(xì)胞中存在一系列與腫瘤干細(xì)胞干性相關(guān)的基因，這些基因的表達(dá)受到ABCG2的精細(xì)調(diào)控。例如，SOX2、OCT4和NANOG等基因是腫瘤干細(xì)胞干性維持的關(guān)鍵基因。在ABCG2<'+>細(xì)胞中，ABCG2可以與這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，或者通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)這些基因的表達(dá)。ABCG2可以激活某些轉(zhuǎn)錄因子，使其與SOX2基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，增強(qiáng)SOX2基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而維持SOX2在ABCG2<'+>細(xì)胞中的高表達(dá)水平。SOX2作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的自我更新和多向分化，對(duì)于維持腫瘤干細(xì)胞的干性至關(guān)重要。在細(xì)胞信號(hào)通路方面，ABCG2<'+>細(xì)胞中多條信號(hào)通路參與腫瘤干細(xì)胞干性的維持。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在其中發(fā)揮著核心作用。在ABCG2<'+>細(xì)胞中，Wnt信號(hào)分子與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的Dishevelled蛋白。Dishevelled蛋白抑制GSK-3β的活性，使得β-catenin蛋白無(wú)法被磷酸化降解，從而在細(xì)胞質(zhì)中積累。積累的β-catenin蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，啟動(dòng)一系列與腫瘤干細(xì)胞干性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1等。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物參與細(xì)胞增殖、自我更新等過(guò)程，對(duì)于維持腫瘤干細(xì)胞的干性具有重要意義。ABCG2可能通過(guò)與Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的某些關(guān)鍵分子相互作用，調(diào)節(jié)該信號(hào)通路的活性，進(jìn)而維持腫瘤干細(xì)胞的干性。研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2可以與Dishevelled蛋白相互作用，增強(qiáng)其活性，從而促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。ABCG2<'+>細(xì)胞對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的影響機(jī)制也十分復(fù)雜。腫瘤復(fù)發(fā)與腫瘤干細(xì)胞的自我更新和增殖能力密切相關(guān)。ABCG2<'+>細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新和增殖能力，能夠在腫瘤治療后存活下來(lái)，并重新增殖形成新的腫瘤組織，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。在腫瘤治療過(guò)程中，如化療和放療，雖然能夠殺死大部分腫瘤細(xì)胞，但ABCG2<'+>細(xì)胞由于其耐藥性和干細(xì)胞特性，能夠逃避治療的殺傷。ABCG2<'+>細(xì)胞通過(guò)高表達(dá)ABCG2蛋白，將化療藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。ABCG2<'+>細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我修復(fù)能力，能夠在受到放療損傷后迅速修復(fù)DNA損傷，維持細(xì)胞的存活和增殖能力。這些特性使得ABCG2<'+>細(xì)胞在腫瘤治療后能夠存活下來(lái)，并重新增殖形成腫瘤，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，ABCG2<'+>細(xì)胞通過(guò)多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。ABCG2<'+>細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等。VEGF可以促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)和運(yùn)輸通道。MMPs則能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞腫瘤細(xì)胞與周?chē)M織的連接，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。ABCG2<'+>細(xì)胞還能夠通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。在EMT過(guò)程中，ABCG2<'+>細(xì)胞的上皮標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞形態(tài)從上皮樣轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣，從而具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。研究表明，ABCG2可以通過(guò)調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，如Snail、Slug等，促進(jìn)EMT過(guò)程的發(fā)生，進(jìn)而增強(qiáng)ABCG2<'+>細(xì)胞的遷移和侵襲能力。5.3ABCG2<'+>細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)通路研究在人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞中，PI3K-AKT通路處于高度激活狀態(tài)，這對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ABCG2<'+>細(xì)胞中PI3K的催化亞基p110α和調(diào)節(jié)亞基p85的表達(dá)水平顯著高于ABCG2<'->細(xì)胞。p110α能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，招募蛋白激酶B（AKT）和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1）到細(xì)胞膜上。在ABCG2<'+>細(xì)胞中，PDK1對(duì)AKT蛋白308號(hào)位蘇氨酸（T308）的磷酸化水平明顯增強(qiáng)，使得AKT處于高度活化狀態(tài)。AKT的活化進(jìn)而調(diào)控一系列下游效應(yīng)分子，對(duì)ABCG2<'+>細(xì)胞的增殖、存活和耐藥等特性產(chǎn)生重要影響。在細(xì)胞增殖方面，AKT可以通過(guò)磷酸化作用激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）。mTOR是一種絲/蘇氨酸激酶，它能夠整合細(xì)胞內(nèi)外部的多種信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和代謝。在ABCG2<'+>細(xì)胞中，活化的AKT磷酸化TSC2蛋白的939位絲氨酸（Ser939）和1462位蘇氨酸（Thr1462），使TSC2失活。TSC2是結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體（TSC）的重要組成部分，具有GTP酶活化蛋白（GAP）活性，能夠?qū)TP形式的RHEB水解為GDP形式的RHEB，從而抑制mTORC1復(fù)合體的活性。當(dāng)TSC2失活后，RHEB保持活性狀態(tài)，激活mTORC1，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞周期進(jìn)程，從而推動(dòng)ABCG2<'+>細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞存活方面，AKT可以通過(guò)磷酸化Bcl-2相關(guān)死亡激動(dòng)蛋白（BAD），抑制其促凋亡活性。BAD是一種促凋亡蛋白，它能夠與抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL結(jié)合，形成異源二聚體，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在ABCG2<'+>細(xì)胞中，活化的AKT將BAD的112位絲氨酸（Ser112）磷酸化，磷酸化后的BAD與14-3-3蛋白結(jié)合，被隔離在細(xì)胞質(zhì)中，無(wú)法與Bcl-2和Bcl-XL結(jié)合，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)ABCG2<'+>細(xì)胞的存活。對(duì)于ABCG2<'+>細(xì)胞的耐藥性，PI3K-AKT通路也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，AKT能夠通過(guò)磷酸化作用上調(diào)ABCG2的表達(dá)水平。AKT可以磷酸化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的p65亞基，使其進(jìn)入細(xì)胞核，與ABCG2基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)ABCG2基因的轉(zhuǎn)錄。此外，AKT還可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路，間接影響ABCG2的表達(dá)和功能。ABCG2表達(dá)水平的上調(diào)，使得ABCG2<'+>細(xì)胞對(duì)化療藥物的外排能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性增加。除了PI3K-AKT通路，Wnt/β-catenin通路在ABCG2<'+>細(xì)胞中也起著重要作用。在ABCG2<'+>細(xì)胞中，Wnt信號(hào)分子與細(xì)胞表面的Frizzled受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）結(jié)合，激活下游的Dishevelled蛋白。Dishevelled蛋白抑制糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）的活性，使得β-catenin蛋白無(wú)法被磷酸化降解，從而在細(xì)胞質(zhì)中積累。積累的β-catenin蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，啟動(dòng)一系列與腫瘤干細(xì)胞干性和增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1等。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物參與細(xì)胞增殖、自我更新等過(guò)程，對(duì)于維持ABCG2<'+>細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性和促進(jìn)細(xì)胞增殖具有重要意義。研究還發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin通路與PI3K-AKT通路之間存在相互作用。PI3K-AKT通路可以通過(guò)磷酸化GSK-3β，抑制其活性，從而間接激活Wnt/β-catenin通路。這種相互作用進(jìn)一步增強(qiáng)了ABCG2<'+>細(xì)胞的增殖和存活能力，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。六、結(jié)論與展望6.1研究成果總結(jié)本研究成功建立了基于免疫磁珠分選技術(shù)和流式細(xì)胞熒光激活分選技術(shù)（FACS）的人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞分選方法。免疫磁珠分選技術(shù)操作簡(jiǎn)便、分選速度快，對(duì)細(xì)胞損傷小，能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得較高純度的ABCG2<'+>細(xì)胞，其分選純度一般在85%-95%之間，細(xì)胞活性通常能保持在90%以上。FACS技術(shù)則具有更高的分選純度，可達(dá)95%以上，能夠根據(jù)細(xì)胞表面多個(gè)抗原的熒光標(biāo)記情況，精確地區(qū)分ABCG2<'+>細(xì)胞和其他細(xì)胞，但該技術(shù)設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜，且分選過(guò)程中細(xì)胞易受到機(jī)械損傷和熒光染料的影響，細(xì)胞活性可能會(huì)下降至80%-90%。通過(guò)對(duì)兩種分選方法的比較與優(yōu)化，為后續(xù)研究提供了更優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞樣本。在人肺腺癌ABCG2<'+>細(xì)胞的生物學(xué)特性研究方面，發(fā)現(xiàn)ABCG2<'+>細(xì)胞具有獨(dú)特的形態(tài)與生長(zhǎng)特性。其體積略小，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞邊界清晰，折光性較強(qiáng)，細(xì)胞之間黏附性較弱，多呈單個(gè)散在分布或形成較小細(xì)胞團(tuán)簇。在生長(zhǎng)特性上，ABCG2<'+>細(xì)胞增殖能力顯著強(qiáng)于ABCG2<'->細(xì)胞，其生長(zhǎng)曲線在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期斜率更大，倍增時(shí)間約為24小時(shí)，明顯短于ABCG2<'->細(xì)胞的36小時(shí)。ABCG2<'+>細(xì)胞的耐藥特性也十分顯著。采用MTT法檢測(cè)其對(duì)順鉑、紫杉醇和多柔比星等多種化療藥物的敏感性，結(jié)果顯示ABCG2<'+>細(xì)胞對(duì)這些化療藥物具有更強(qiáng)的耐藥性。ABCG2<'+>細(xì)胞對(duì)順鉑、紫杉醇和多柔比星的IC50分別為（35.67±3.21）μmol/L、（48.56±4.32）μmol/L和（28.45±2.98）μmol/L，均顯著高于ABCG2<'->細(xì)胞。ABCG2蛋白通過(guò)藥物外排機(jī)制，利用ATP水解產(chǎn)生的能量將化療藥物主動(dòng)泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥。ABCG2<'+>細(xì)胞中ABCG2蛋白的高表達(dá)和高活性，使其能夠更有效地將化療藥物泵出細(xì)胞，從而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性增強(qiáng)。在干細(xì)胞特性方面，ABCG2<'+>細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ABCG2<'+>細(xì)胞的克隆形成率顯著高于ABCG2<'->細(xì)胞，為（35.6±3.2）%，且形成的克隆體積較大，細(xì)胞團(tuán)緊密。誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)表明，ABCG2<'+>細(xì)胞在特定誘導(dǎo)條件下，具有向肺泡上皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞分化的潛能，能夠表達(dá)相應(yīng)的分化標(biāo)志物。在侵襲與轉(zhuǎn)移特性研究中，Transwell實(shí)驗(yàn)和裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型證實(shí)ABCG2<'+>細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Transwell實(shí)驗(yàn)中，ABCG2<'+>細(xì)胞穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量為（125.6±15.3）個(gè)，明顯多于ABCG2<'->細(xì)胞的（45.2±8.5）個(gè)。在裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型中，注射ABCG2<'+>細(xì)胞的裸鼠肺組織中出現(xiàn)大量轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（25.6±5.2）個(gè)，轉(zhuǎn)移灶總面積為（1.25±0.23）mm2，而注射ABCG2<'->細(xì)胞的裸鼠肺組織中轉(zhuǎn)移灶數(shù)量和面積均明顯較少。在ABCG2<'+>細(xì)胞在人肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制研究中，明確了ABCG2<'+>細(xì)胞與腫瘤耐藥的關(guān)系。ABCG2通過(guò)藥物外排機(jī)制導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，其與化療藥物的結(jié)合具有高度特異性，通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)域的底物結(jié)合位點(diǎn)精確識(shí)別化療藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征。在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合并水解ATP，驅(qū)動(dòng)ABCG2蛋白構(gòu)象變化，將化療藥物排出細(xì)胞外。ABCG2<'+>細(xì)胞的耐藥機(jī)制還涉及PI3K/AKT和MAPK等信號(hào)通路的調(diào)控，這些信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)ABCG2的表達(dá)和活性，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。ABCG2<'+>細(xì)胞對(duì)腫瘤干細(xì)胞特性的維持也具有重要影響。通過(guò)基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)節(jié)，ABCG2<'+>細(xì)胞維持腫瘤干細(xì)胞干性。在基因表達(dá)調(diào)控方面，ABCG2可以促進(jìn)SOX2、OCT4和NANOG等腫瘤干細(xì)胞干性相關(guān)基因的表達(dá)。在細(xì)胞信號(hào)通路方面，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在ABCG2<'+>細(xì)胞中高度激活，通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)與腫瘤干細(xì)胞干性和增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。ABCG2<'+>細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性使其具有較強(qiáng)的自我更新和增殖能力，能夠在腫瘤治療后存活下來(lái)，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。通過(guò)分