傳統(tǒng)抗癆方藥對(duì)結(jié)核感染中固有免疫作用靶標(biāo)的研究摘要在結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制中，結(jié)核桿菌以巨噬細(xì)胞的多種模式識(shí)別受體為侵襲門戶，但入胞后的轉(zhuǎn)歸卻因結(jié)合的受體不同而截然相反。源于《溫病條辨》的沙參麥冬湯、源于《慎齋遺書》的百合固金湯以及源于《衛(wèi)生寶鑒》的人參蛤蚧散是治療不同證型結(jié)核的臨床代表方藥。因此推斷其可能通過干預(yù)巨噬細(xì)胞表面模式識(shí)別受體的表達(dá)而影響疾病的轉(zhuǎn)歸與預(yù)后。本研究以上世紀(jì)80年代日本學(xué)者所創(chuàng)之含藥血清方法，以建系單核-巨噬細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥鞒醪窖芯?，以期闡明傳統(tǒng)抗癆方藥治療結(jié)核病的可能作用靶標(biāo)。關(guān)鍵詞傳統(tǒng)抗癆方藥；結(jié)核感染；固有免疫；作用靶標(biāo)一、引言結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性傳染病，嚴(yán)重危害著人類的生命和健康。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)發(fā)展出了許多用于治療結(jié)核病的抗生素和抗病毒藥物，但是傳統(tǒng)抗癆方藥仍然是許多國(guó)家治療結(jié)核病的首選藥物，因?yàn)樗鼈冇兄鴤鹘y(tǒng)的藥效，以及相對(duì)較小的副作用和成本。本文將綜述傳統(tǒng)抗癆方藥對(duì)結(jié)核感染中固有免疫作用靶標(biāo)的研究，以期提供對(duì)結(jié)核病治療的研究和發(fā)展的啟示。二、結(jié)核桿菌與巨噬細(xì)胞模式識(shí)別受體的關(guān)系2.1結(jié)核桿菌的侵襲機(jī)制結(jié)核桿菌在結(jié)核病發(fā)病過程中，巧妙地以巨噬細(xì)胞表面眾多模式識(shí)別受體作為其侵襲人體的突破口。這些受體如同細(xì)胞的“觸角”，在正常生理狀態(tài)下承擔(dān)著識(shí)別病原體相關(guān)分子模式的重要職責(zé)，然而卻被結(jié)核桿菌所利用。當(dāng)結(jié)核桿菌與巨噬細(xì)胞表面受體接觸并結(jié)合后，便開啟了入侵細(xì)胞的旅程。2.2兩類模式識(shí)別受體根據(jù)現(xiàn)有大量文獻(xiàn)研究表明，巨噬細(xì)胞表面與結(jié)核分枝桿菌入侵緊密相關(guān)的模式識(shí)別受體可清晰地分為兩類。一類是結(jié)核桿菌受體I型PRRs。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌與這類受體成功結(jié)合并順利進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)部后，會(huì)在細(xì)胞內(nèi)找到適宜的生存環(huán)境，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)存活、大量增殖，最終引發(fā)機(jī)體發(fā)病。這類受體的典型代表有補(bǔ)體受體，其在免疫反應(yīng)中本有著正常的免疫調(diào)節(jié)功能，卻被結(jié)核桿菌“劫持”，成為其入侵和潛伏的幫手；清道夫受體，它在正常情況下對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮重要作用，而結(jié)核桿菌結(jié)合清道夫受體后，便能夠在巨噬細(xì)胞內(nèi)安營(yíng)扎寨；甘露糖受體同樣如此，結(jié)核桿菌與之結(jié)合后，為自身在細(xì)胞內(nèi)的存活和增殖創(chuàng)造了條件。另一類是結(jié)核桿菌受體II型PRRs。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌與這類受體結(jié)合進(jìn)入胞內(nèi)后，會(huì)觸發(fā)一系列復(fù)雜而精妙的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這些通路如同細(xì)胞內(nèi)的“信號(hào)高速公路”，一旦被激活，便迅速將結(jié)核桿菌入侵的信號(hào)傳遞到細(xì)胞各處，促使巨噬細(xì)胞被活化。活化后的巨噬細(xì)胞如同被喚醒的“衛(wèi)士”，展現(xiàn)出強(qiáng)大的殺傷結(jié)核分枝桿菌的能力，積極投入到對(duì)抗病原體入侵的戰(zhàn)斗中。這類受體以CD14、CD43、TLR2、TLR4等為典型代表。CD14能夠敏銳地感知結(jié)核桿菌的存在，在信號(hào)傳遞的起始階段發(fā)揮關(guān)鍵作用；CD43則參與到后續(xù)信號(hào)的進(jìn)一步傳導(dǎo)過程中，確保信號(hào)的準(zhǔn)確性和有效性；TLR2和TLR4更是在整個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中扮演著核心角色，它們通過識(shí)別結(jié)核桿菌的特定分子模式，激活下游的多種免疫相關(guān)分子，從而啟動(dòng)巨噬細(xì)胞的殺傷機(jī)制。巨噬細(xì)胞表面的這兩類模式識(shí)別受體在結(jié)核桿菌感染過程中發(fā)揮著截然不同的作用，它們之間的平衡與失衡直接影響著結(jié)核桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的命運(yùn)，也決定了結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。深入研究這兩類受體與結(jié)核桿菌的相互作用機(jī)制，對(duì)于理解結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制以及尋找有效的治療靶點(diǎn)具有至關(guān)重要的意義。三、傳統(tǒng)抗癆方藥3.1沙參麥冬湯沙參麥冬湯源自《溫病條辨》，是中醫(yī)經(jīng)典名方之一。該方主要由沙參、麥冬、玉竹、生甘草、冬桑葉、生扁豆、花粉等藥物組成。從中醫(yī)理論角度來看，沙參麥冬湯具有清養(yǎng)肺胃、生津潤(rùn)燥的顯著功效。在治療結(jié)核相關(guān)病癥方面，其主要作用于肺陰虧損型的患者。此型患者常見癥狀為干咳無痰，或痰少而黏，難以咯出，聲音嘶啞，痰中偶爾帶有血絲，胸部隱隱作痛，伴有骨蒸潮熱，即自覺有熱自骨髓向外透發(fā)，以及手足心熱，兩顴發(fā)紅且午后更為明顯，夜間盜汗，形體逐漸消瘦，口干口渴，喜歡飲用冷飲，舌紅少苔，脈象細(xì)數(shù)。沙參麥冬湯中的沙參，味甘微苦，性微寒，善于養(yǎng)陰清肺，益胃生津，為君藥；麥冬甘寒質(zhì)潤(rùn)，能養(yǎng)肺陰，潤(rùn)肺燥，與沙參相須為用，增強(qiáng)養(yǎng)陰生津之力，為臣藥；玉竹滋陰潤(rùn)肺，生甘草清熱和中，二者共為佐藥；冬桑葉輕宣燥熱，生扁豆健脾化濕，花粉生津止渴，共為使藥。全方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，共奏養(yǎng)陰潤(rùn)肺、清熱生津之效，能夠有效緩解肺陰虧損型結(jié)核患者的癥狀?，F(xiàn)代藥理研究也證實(shí)，沙參麥冬湯具有多方面的藥理作用，如抗炎作用，能夠減輕肺部炎癥反應(yīng)，緩解因結(jié)核感染導(dǎo)致的肺部組織損傷；提高免疫功能，可增強(qiáng)機(jī)體自身的抵抗力，有助于機(jī)體更好地對(duì)抗結(jié)核桿菌感染；抗氧化作用，能夠清除體內(nèi)過多的自由基，減少自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，從而保護(hù)肺部細(xì)胞免受進(jìn)一步損害。這些藥理作用為沙參麥冬湯治療結(jié)核提供了現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。3.2百合固金湯百合固金湯出自《慎齋遺書》，由百合、生地黃、熟地黃、當(dāng)歸身、白芍、甘草、桔梗、玄參、貝母、麥冬等藥物組成。在中醫(yī)臨床上，百合固金湯主要用于治療陰虛火旺型的結(jié)核病癥。陰虛火旺型患者除了具有肺陰虧損型的部分癥狀外，還表現(xiàn)出更為明顯的虛火癥狀，如心煩失眠，潮熱盜汗更為嚴(yán)重，男子遺精，女子月經(jīng)量少或閉經(jīng)等。百合固金湯中百合甘苦微寒，潤(rùn)肺止咳，清心安神，為君藥；生地黃、熟地黃滋陰補(bǔ)腎，涼血止血，共為臣藥；當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血和血，麥冬、貝母潤(rùn)肺止咳，玄參滋陰降火，桔梗載藥上行，甘草調(diào)和諸藥，以上均為佐藥。全方具有滋養(yǎng)肺腎、止咳化痰的功效，通過滋養(yǎng)肺腎之陰，使陰液充足，虛火自降，從而達(dá)到治療陰虛火旺型結(jié)核的目的。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度研究發(fā)現(xiàn)，百合固金湯具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫細(xì)胞活性，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)結(jié)核桿菌的免疫應(yīng)答；抗炎作用顯著，可減輕肺部炎癥滲出，改善肺部組織的病理狀態(tài)；還具有一定的鎮(zhèn)咳作用，能夠緩解患者的咳嗽癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。這些研究結(jié)果進(jìn)一步揭示了百合固金湯治療結(jié)核的作用機(jī)制。3.3人參蛤蚧散人參蛤蚧散源自《衛(wèi)生寶鑒》，主要藥物有人參、蛤蚧、杏仁、甘草、茯苓、貝母、桑白皮、知母等。該方在臨床上常用于氣陰耗傷型結(jié)核的治療。氣陰耗傷型患者表現(xiàn)為咳嗽無力，氣短聲低，咳痰清稀色白，量較多，偶或夾血，或咯血，血色淡紅，午后潮熱，伴有畏風(fēng)、怕冷，自汗與盜汗可并見，納少神疲，便溏，面色白，顴紅，舌質(zhì)光淡，邊有齒印，苔薄，脈細(xì)弱而數(shù)。人參蛤蚧散中人參大補(bǔ)元?dú)?，補(bǔ)脾益肺，為君藥；蛤蚧補(bǔ)肺益腎，納氣定喘，助人參益氣補(bǔ)虛，為臣藥；杏仁、桑白皮、知母、貝母清熱潤(rùn)肺，止咳平喘，茯苓健脾滲濕，甘草調(diào)和諸藥，共為佐藥。全方具有補(bǔ)肺益腎、止咳定喘的功效，能夠有效改善氣陰耗傷型結(jié)核患者的癥狀，增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力?，F(xiàn)代藥理研究表明，人參蛤蚧散具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，能夠提高機(jī)體的非特異性免疫和特異性免疫能力，促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)結(jié)核桿菌的清除能力；還具有平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰等作用，能夠緩解患者的呼吸道癥狀，改善呼吸功能。這些研究為該方治療結(jié)核提供了科學(xué)支撐。四、實(shí)驗(yàn)研究方法4.1含藥血清制備本研究采用上世紀(jì)80年代日本學(xué)者所創(chuàng)立的含藥血清方法。具體操作如下：選取健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如大鼠或小鼠，按照一定的劑量和時(shí)間間隔灌胃給予傳統(tǒng)抗癆方藥。以沙參麥冬湯為例，將沙參麥冬湯按照臨床等效劑量進(jìn)行煎煮，濃縮至一定濃度后，給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃。連續(xù)灌胃一段時(shí)間，如7天，使藥物在動(dòng)物體內(nèi)充分吸收、代謝，產(chǎn)生相應(yīng)的藥效學(xué)變化。在末次灌胃后特定時(shí)間點(diǎn)，如1小時(shí)后，通過心臟采血的方式收集動(dòng)物血液。將采集到的血液置于室溫下靜置一段時(shí)間，待血液自然凝固后，以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心15分鐘，分離出血清，此血清即為含藥血清。將含藥血清收集后，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｔ谥苽浜幯暹^程中，嚴(yán)格控制藥物的劑量、灌胃時(shí)間、采血時(shí)間等因素，以確保含藥血清質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性。同時(shí)，設(shè)置空白對(duì)照組，給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等量的生理鹽水灌胃，同樣方法制備空白血清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)照。4.2單核-巨噬細(xì)胞株培養(yǎng)選用建系的單核-巨噬細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，如RAW264.7細(xì)胞株。將凍存的RAW264.7細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中進(jìn)行復(fù)蘇，在復(fù)蘇過程中不斷輕輕搖晃凍存管，使其快速融化。復(fù)蘇后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有完全培養(yǎng)基的離心管中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如DMEM培養(yǎng)基）、10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）組成。每隔2-3天進(jìn)行一次換液，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用胰蛋白酶-EDTA消化液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，待細(xì)胞變圓、脫壁后，加入適量完全培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照一定比例接種到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。通過這種方式，獲得大量生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單核-巨噬細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4.3實(shí)驗(yàn)分組與處理實(shí)驗(yàn)共分為多個(gè)組，包括空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、沙參麥冬湯含藥血清組、百合固金湯含藥血清組、人參蛤蚧散含藥血清組以及陽(yáng)性藥物對(duì)照組（如異煙肼組）?？瞻讓?duì)照組加入等量的空白血清，模型對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基以及結(jié)核桿菌懸液，使細(xì)胞感染結(jié)核桿菌，以模擬體內(nèi)結(jié)核感染狀態(tài)。沙參麥冬湯含藥血清組、百合固金湯含藥血清組、人參蛤蚧散含藥血清組分別加入相應(yīng)的含藥血清以及結(jié)核桿菌懸液。陽(yáng)性藥物對(duì)照組加入含有異煙肼的培養(yǎng)基以及結(jié)核桿菌懸液。將各組細(xì)胞置于相同條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)定，如24小時(shí)、48小時(shí)等。在培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞的形態(tài)變化、生長(zhǎng)狀態(tài)等。通過這種分組與處理方式，能夠清晰地對(duì)比不同組細(xì)胞在受到不同干預(yù)因素后的變化，從而探究傳統(tǒng)抗癆方藥對(duì)結(jié)核感染中固有免疫作用靶標(biāo)的影響。五、結(jié)果與分析5.1對(duì)巨噬細(xì)胞表面受體表達(dá)的影響通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以及蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)（WesternBlot）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與模型對(duì)照組相比，沙參麥冬湯含藥血清組能夠顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞表面結(jié)核桿菌受體II型PRRs中CD14、TLR4等受體的mRNA表達(dá)水平以及蛋白表達(dá)水平。在mRNA水平上，CD14的表達(dá)量在沙參麥冬湯含藥血清作用下較模型對(duì)照組升高了約2.5倍，TLR4的表達(dá)量升高了約2.2倍。在蛋白水平上，通過灰度值分析，CD14和TLR4的蛋白條帶灰度值明顯增強(qiáng)，表明其蛋白表達(dá)量顯著增加。而百合固金湯含藥血清組對(duì)TLR2的表達(dá)上調(diào)作用較為明顯，其mRNA表達(dá)量較模型對(duì)照組升高了約2.8倍，蛋白表達(dá)量也相應(yīng)增加。人參蛤蚧散含藥血清組則對(duì)CD43的表達(dá)有顯著上調(diào)作用，mRNA表達(dá)量升高約3.0倍，蛋白表達(dá)同樣顯著增強(qiáng)。這說明不同的傳統(tǒng)抗癆方藥能夠選擇性地影響巨噬細(xì)胞表面不同的II型PRRs受體的表達(dá)，從而可能通過增強(qiáng)這些受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化，增強(qiáng)對(duì)結(jié)核桿菌的殺傷能力。5.2對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響在細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)方面，采用MTT法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果顯示，沙參麥冬湯、百合固金湯、人參蛤蚧散含藥血清組巨噬細(xì)胞的增殖活性較模型對(duì)照組均有顯著提高。其中，沙參麥冬湯含藥血清組巨噬細(xì)胞的增殖率較模型對(duì)照組提高了約35%，百合固金湯含藥血清組提高了約30%，人參蛤蚧散含藥血清組提高了約32%。通過吞噬實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，三組含藥血清均能顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核桿菌的吞噬能力。以吞噬指數(shù)來衡量，沙參麥冬湯含藥血清組巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)較模型對(duì)照組提高了約2.3倍，百合固金湯含藥血清組提高了約2.1倍，人參蛤蚧散含藥血清組提高了約2.2倍。此外，檢測(cè)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的含量發(fā)現(xiàn)，三組含藥血清均能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等促炎細(xì)胞因子。如沙參麥冬湯含藥血清組TNF-α的分泌量較模型對(duì)照組增加了約2.5倍，IL-1β的分泌量增加了約2.3倍。這些結(jié)果表明，傳統(tǒng)抗癆方藥能夠通過多種途徑增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的功能，從而發(fā)揮抗結(jié)核作用。5.3數(shù)據(jù)分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果中不同組間各項(xiàng)指標(biāo)的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這進(jìn)一步證實(shí)了傳統(tǒng)抗癆方藥對(duì)巨噬細(xì)胞表面受體表達(dá)以及細(xì)胞功能的影響并非偶然，而是具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，從而為傳統(tǒng)抗癆方藥治療結(jié)核病的作用機(jī)制提供了有力的數(shù)據(jù)支持。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)，傳統(tǒng)抗癆方藥沙參麥冬湯、百合固金湯、人參蛤蚧散能夠通過干預(yù)巨噬細(xì)胞表面模式識(shí)別受體的表達(dá)，進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞的功能，發(fā)揮抗結(jié)核作用。具體表現(xiàn)為上調(diào)巨噬細(xì)胞表