仙臺病毒N基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的高效表達(dá)與功能驗證研究一、引言1.1研究背景與意義仙臺病毒（SendaiVirus），又稱鼠副流感病毒1型，是副黏病毒科呼吸道病毒屬的成員，其病毒粒子呈多形性，直徑為150-250nm，具有包膜。自1953年在日本仙臺市首次被分離得到后，仙臺病毒逐漸進(jìn)入科研人員的視野。它主要感染嚙齒動物，如小鼠、大鼠等，但也被發(fā)現(xiàn)可感染人類。在動物實驗設(shè)施中，仙臺病毒的感染較為棘手，對實驗動物的健康和實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。例如，感染仙臺病毒的小鼠會出現(xiàn)明顯的肺炎癥狀，包括呼吸困難、牙齒打顫等，幼齡動物甚至?xí)劳?；大鼠感染后雖一般不表現(xiàn)明顯臨床癥狀，但可能出現(xiàn)繁殖障礙。此外，潛在感染還會干擾動物機(jī)體的正常生理功能，導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)的偏差，影響科研工作的可靠性。對于人類而言，仙臺病毒也可能引發(fā)呼吸道感染，尤其是免疫力低下的人群，增加了健康風(fēng)險。因此，有效檢測和預(yù)防仙臺病毒感染成為當(dāng)務(wù)之急。在病毒檢測與防控領(lǐng)域，利用病毒自身的重要抗原進(jìn)行間接抗原診斷和免疫是一種重要策略?？乖酁椴《揪幋a的結(jié)構(gòu)蛋白，其中仙臺病毒的N基因所編碼的核衣殼蛋白（N蛋白）具有關(guān)鍵作用。N蛋白不僅在病毒的組裝和基因組保護(hù)中發(fā)揮重要功能，還具有良好的抗原性與反應(yīng)原性。通過對N基因進(jìn)行研究和表達(dá)，可以為仙臺病毒的檢測提供特異性抗原，用于開發(fā)靈敏、準(zhǔn)確的診斷方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫熒光檢測等，有助于早期發(fā)現(xiàn)病毒感染，及時采取防控措施。昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（BaculovirusExpressionVectorSystem，BEVS）是以昆蟲桿狀病毒作為外源基因載體，昆蟲和昆蟲細(xì)胞作為受體的表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有諸多優(yōu)勢，在基因工程和生物制藥領(lǐng)域備受青睞。從安全性角度來看，桿狀病毒主要感染昆蟲，對人畜無毒害，降低了生物安全風(fēng)險。在蛋白表達(dá)方面，昆蟲細(xì)胞與哺乳動物細(xì)胞對重組蛋白的翻譯及翻譯后修飾模式和能力相似，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信號肽切除及肽段的切割和分解等，使得表達(dá)出的重組蛋白生物活性與天然蛋白相似。此外，桿狀病毒基因柔韌性強(qiáng)，能容納較大片段的外源DNA插入，且昆蟲細(xì)胞可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，容易在無血清培養(yǎng)基中存活，便于實現(xiàn)大規(guī)模低成本生產(chǎn)。將仙臺病毒N基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)，能夠充分利用該系統(tǒng)的優(yōu)勢，獲得大量具有生物活性的重組N蛋白。這些重組蛋白不僅可以用于開發(fā)高效的檢測試劑，提高仙臺病毒檢測的準(zhǔn)確性和效率，還可能為疫苗的研發(fā)提供關(guān)鍵的免疫原，為預(yù)防仙臺病毒感染開辟新途徑。綜上所述，研究仙臺病毒N基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值，有望為仙臺病毒的防控提供有力的技術(shù)支持和物質(zhì)基礎(chǔ)。1.2仙臺病毒概述仙臺病毒在病毒分類學(xué)中屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）呼吸道病毒屬（Respirovirus），其病毒粒子呈現(xiàn)多形性，多數(shù)情況下近似球形，直徑范圍在150-250nm。這種多形性使得仙臺病毒在形態(tài)觀察上具有一定的復(fù)雜性，但也反映了其在不同環(huán)境和感染階段的適應(yīng)性。從結(jié)構(gòu)組成來看，仙臺病毒具有包膜，這層包膜對于病毒的感染和傳播起著關(guān)鍵作用。包膜主要由脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成，來源于宿主細(xì)胞膜，在病毒出芽釋放過程中獲得。包膜上鑲嵌著兩種重要的糖蛋白，分別是血凝素-神經(jīng)氨酸酶（Hemagglutinin-Neuraminidase，HN）和融合蛋白（Fusionprotein，F(xiàn)）。HN蛋白具有兩種酶活性，即血凝素活性和神經(jīng)氨酸酶活性。血凝素活性能夠識別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面含唾液酸的受體，介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的初始附著。在一項關(guān)于病毒吸附機(jī)制的研究中，通過表面等離子共振技術(shù)發(fā)現(xiàn)，HN蛋白與唾液酸受體之間存在特異性的相互作用，其結(jié)合常數(shù)達(dá)到了10??M級別，這種高親和力保證了病毒能夠快速、穩(wěn)定地吸附到宿主細(xì)胞表面。神經(jīng)氨酸酶活性則可以水解宿主細(xì)胞表面的唾液酸殘基，破壞病毒與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，促進(jìn)病毒從感染細(xì)胞中釋放出來，以便進(jìn)行新一輪的感染。例如，在病毒感染后期，當(dāng)子代病毒組裝完成后，HN蛋白的神經(jīng)氨酸酶活性被激活，使得病毒能夠順利脫離宿主細(xì)胞，繼續(xù)感染周圍的細(xì)胞。F蛋白則在病毒與宿主細(xì)胞膜的融合過程中發(fā)揮核心作用。F蛋白最初以無活性的前體形式（F0）合成，在宿主細(xì)胞蛋白酶的作用下，F(xiàn)0被切割成具有活性的F1和F2兩個亞基。F1亞基的N端具有一段高度疏水的融合肽，在病毒與宿主細(xì)胞接近時，融合肽插入宿主細(xì)胞膜，通過構(gòu)象變化拉近病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的距離，最終實現(xiàn)兩者的融合，使病毒的核衣殼進(jìn)入宿主細(xì)胞。研究表明，F(xiàn)蛋白的構(gòu)象變化是一個高度動態(tài)且有序的過程，涉及多個結(jié)構(gòu)域的協(xié)同作用，通過冷凍電鏡技術(shù)解析F蛋白在不同狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其在融合過程中經(jīng)歷了從預(yù)融合狀態(tài)到融合后狀態(tài)的顯著轉(zhuǎn)變，這種結(jié)構(gòu)變化是病毒感染的關(guān)鍵步驟。在病毒包膜的內(nèi)層，是基質(zhì)蛋白（Matrixprotein，M）。M蛋白在病毒粒子中形成一層緊密的結(jié)構(gòu)，一方面與包膜相互作用，維持包膜的穩(wěn)定性和完整性；另一方面與病毒的核衣殼相互連接，在病毒組裝和出芽過程中發(fā)揮重要作用。有研究利用免疫熒光和免疫電鏡技術(shù)觀察到，M蛋白在病毒感染細(xì)胞的過程中，能夠聚集在細(xì)胞膜特定區(qū)域，引導(dǎo)核衣殼與細(xì)胞膜的結(jié)合，促進(jìn)病毒粒子的形成和釋放。仙臺病毒的基因組為單鏈負(fù)義RNA，長度約為15,384個核苷酸。這一基因組結(jié)構(gòu)決定了病毒的遺傳信息傳遞方式和復(fù)制策略。基因組從3'端到5'端依次排列著6個主要基因，分別編碼核衣殼蛋白（Nucleocapsidprotein，N）、磷蛋白（Phosphoprotein，P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN）和大蛋白（Largeprotein，L）。N基因編碼的N蛋白是病毒基因組RNA的主要結(jié)合蛋白。每個N蛋白單體能夠緊密結(jié)合6個核苷酸，將病毒基因組RNA包裹起來，形成核糖核蛋白復(fù)合物（Ribonucleoproteincomplex，RNP）。這種緊密的結(jié)合不僅保護(hù)了病毒基因組RNA免受核酸酶的降解，還為病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制提供了穩(wěn)定的模板。研究發(fā)現(xiàn)，N蛋白的結(jié)構(gòu)中含有多個保守的結(jié)構(gòu)域，其中RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有高度的特異性，通過與RNA的堿基和磷酸骨架相互作用，實現(xiàn)對病毒基因組的精準(zhǔn)識別和包裹。P基因除了編碼P蛋白外，還通過不同的閱讀框編碼C蛋白等其他非結(jié)構(gòu)蛋白。P蛋白是病毒RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RdRp）的重要亞基，與L蛋白共同組成具有活性的RdRp復(fù)合物。P蛋白在RdRp復(fù)合物中起到輔助和調(diào)節(jié)作用，它能夠與N蛋白-RNA復(fù)合物相互作用，招募L蛋白，啟動病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程。此外，P蛋白還參與病毒的組裝和出芽過程，通過與M蛋白等其他病毒蛋白相互作用，協(xié)調(diào)病毒粒子的形成。L蛋白是RdRp復(fù)合物的催化亞基，具有多種酶活性，包括RNA聚合酶活性、甲基轉(zhuǎn)移酶活性和鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶活性等。在病毒轉(zhuǎn)錄過程中，L蛋白以病毒基因組RNA為模板，合成正鏈mRNA，用于指導(dǎo)病毒蛋白的翻譯。在復(fù)制過程中，L蛋白先合成全長的正鏈RNA中間體，再以正鏈RNA為模板合成子代負(fù)鏈RNA基因組。L蛋白的這些酶活性對于病毒的遺傳信息傳遞和繁殖至關(guān)重要，其活性受到多種因素的調(diào)控，包括與其他病毒蛋白的相互作用以及宿主細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境因素等。綜上所述，仙臺病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)和基因組組成緊密相關(guān)，各組成部分在病毒的生命周期中各司其職，協(xié)同完成病毒的感染、復(fù)制和傳播過程。1.3昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（BaculovirusExpressionVectorSystem，BEVS）以昆蟲桿狀病毒為外源基因載體，昆蟲和昆蟲細(xì)胞為受體。該系統(tǒng)自20世紀(jì)80年代建立以來，憑借諸多優(yōu)勢在生命科學(xué)研究和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮著重要作用。桿狀病毒是一類雙鏈DNA病毒，其基因組大小通常在80-180kb之間。目前應(yīng)用最廣泛的桿狀病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV）。在自然狀態(tài)下，桿狀病毒主要感染昆蟲，對哺乳動物、植物和其他非昆蟲生物無致病性，這使得該表達(dá)系統(tǒng)在生物安全方面具有顯著優(yōu)勢，降低了潛在的生物風(fēng)險，尤其適用于大規(guī)模生產(chǎn)生物制品。昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的原理基于病毒基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。桿狀病毒基因組中存在一些強(qiáng)啟動子，如多角體蛋白（Polyhedrin，polh）基因啟動子和p10基因啟動子。在病毒感染昆蟲細(xì)胞的晚期，這些啟動子會啟動大量基因的表達(dá)，其中多角體蛋白基因啟動子的活性尤為強(qiáng)勁。在構(gòu)建表達(dá)載體時，將外源基因（如仙臺病毒N基因）插入到桿狀病毒基因組中，使其受這些強(qiáng)啟動子的控制。以pFastBac系統(tǒng)為例，首先將目的基因克隆到供體質(zhì)粒pFastBac上，該質(zhì)粒含有Tn7轉(zhuǎn)座子元件和多角體蛋白基因啟動子。然后將重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有桿狀病毒穿梭載體（Bacmid）和輔助質(zhì)粒（helper）的大腸桿菌DH10Bac中。在輔助質(zhì)粒編碼的轉(zhuǎn)座酶作用下，Tn7轉(zhuǎn)座子攜帶目的基因轉(zhuǎn)座到Bacmid上的特定位置，形成重組Bacmid。提取重組Bacmid后，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞（如Sf9、Sf21細(xì)胞）。在昆蟲細(xì)胞內(nèi)，重組Bacmid進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，啟動外源基因的表達(dá)。隨著病毒的擴(kuò)增和感染，大量的重組蛋白得以合成。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有獨特的優(yōu)勢。在蛋白翻譯后修飾方面，昆蟲細(xì)胞與哺乳動物細(xì)胞對重組蛋白的修飾模式和能力相似。例如，許多哺乳動物蛋白需要進(jìn)行復(fù)雜的糖基化修飾才能具有完整的生物活性，昆蟲細(xì)胞能夠?qū)χ亟M蛋白進(jìn)行類似的N-糖基化和O-糖基化修飾。研究表明，在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)的人源化抗體，其糖基化位點和糖鏈結(jié)構(gòu)與天然抗體高度相似，使得抗體的抗原結(jié)合活性和免疫原性得以有效保持。此外，昆蟲細(xì)胞還能進(jìn)行磷酸化、酰基化等修飾，保證了重組蛋白的正確折疊和功能發(fā)揮。在表達(dá)容量上，桿狀病毒基因柔韌性強(qiáng)，能容納較大片段的外源DNA插入。有研究成功將長達(dá)10kb的外源基因?qū)霔U狀病毒基因組中并實現(xiàn)有效表達(dá)，這為表達(dá)一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白提供了可能。從生產(chǎn)角度來看，昆蟲細(xì)胞可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，容易在無血清培養(yǎng)基中存活，便于實現(xiàn)大規(guī)模低成本生產(chǎn)。通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和發(fā)酵工藝，昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)密度可達(dá)到很高水平，從而提高重組蛋白的產(chǎn)量。例如，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行昆蟲細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，可實現(xiàn)重組蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本，滿足市場對大量重組蛋白的需求。昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在多個領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。在疫苗研發(fā)方面，該系統(tǒng)可用于生產(chǎn)多種病毒樣顆粒（Virus-likeparticles，VLPs）疫苗。VLPs是由病毒的結(jié)構(gòu)蛋白組裝而成，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)與天然病毒相似，但不含有病毒的遺傳物質(zhì)，因此具有良好的安全性。利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)流感病毒的血凝素（HA）、乙型肝炎病毒的表面抗原（HBsAg）等，可組裝成相應(yīng)的VLPs疫苗。這些疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，包括體液免疫和細(xì)胞免疫，為預(yù)防病毒感染提供了有效的手段。在生物制藥領(lǐng)域，許多重組蛋白藥物，如干擾素、生長因子等，也可通過昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)。這些重組蛋白藥物在治療多種疾病中發(fā)揮著重要作用，如干擾素用于抗病毒和抗腫瘤治療，生長因子用于促進(jìn)組織修復(fù)和再生。此外，在基礎(chǔ)研究中，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)常用于表達(dá)和研究一些功能未知的蛋白，通過對重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能分析，深入了解蛋白的生物學(xué)特性和作用機(jī)制。綜上所述，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)憑借其獨特的優(yōu)勢和廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，為生命科學(xué)研究和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了有力的支持。1.4研究目的與內(nèi)容本研究旨在利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，實現(xiàn)仙臺病毒N基因的高效表達(dá)，并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定與分析，為仙臺病毒的檢測和防控提供物質(zhì)基礎(chǔ)與技術(shù)支持。具體研究內(nèi)容如下：仙臺病毒N基因的克隆與重組表達(dá)載體的構(gòu)建：從感染仙臺病毒的雞胚中提取病毒基因組RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增N基因。將擴(kuò)增得到的N基因克隆至pMD18-T載體中，進(jìn)行測序驗證，確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性。隨后，將正確的N基因片段定向克隆至桿狀病毒穿梭載體pFastBac^{TM}HTb中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBac^{TM}HTb-N。通過藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定等方法，篩選出含有目的基因的重組質(zhì)粒，為后續(xù)的病毒重組和蛋白表達(dá)奠定基礎(chǔ)。重組桿狀病毒的制備與鑒定：將重組質(zhì)粒pFastBac^{TM}HTb-N轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒感受態(tài)細(xì)菌DH10Bac中，利用大腸桿菌自身的同源重組機(jī)制，使目的基因整合到桿狀病毒基因組中，形成重組桿狀病毒rBacmid-N。通過藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定，挑選出陽性重組桿狀病毒克隆。提取重組桿狀病毒的DNA，進(jìn)行酶切鑒定和測序分析，進(jìn)一步確認(rèn)目的基因已成功插入桿狀病毒基因組中，且序列正確無誤。重組N蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)與分析：將鑒定正確的重組桿狀病毒rBacmid-N轉(zhuǎn)染至生長狀態(tài)良好的昆蟲細(xì)胞（如Sf9細(xì)胞）中，使病毒在昆蟲細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而啟動N基因的表達(dá)。在不同時間點收集感染后的昆蟲細(xì)胞，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測重組N蛋白的表達(dá)情況，觀察蛋白表達(dá)條帶的大小和強(qiáng)度。對表達(dá)的特異性條帶進(jìn)行Westernblot分析，使用特異性抗體檢測重組N蛋白，確定其是否為目的蛋白，并進(jìn)一步分析其免疫反應(yīng)性。通過與標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行ELISA反應(yīng)，測定重組N蛋白與抗體的結(jié)合能力，評估其抗原活性，為后續(xù)的應(yīng)用研究提供依據(jù)。重組N蛋白的應(yīng)用探索：基于表達(dá)和鑒定的重組N蛋白，探索其在仙臺病毒檢測和免疫方面的應(yīng)用。利用重組N蛋白作為抗原，建立檢測仙臺病毒抗體的ELISA方法，優(yōu)化反應(yīng)條件，提高檢測的靈敏度和特異性。通過對已知感染和未感染仙臺病毒的動物血清進(jìn)行檢測，驗證該方法的準(zhǔn)確性和可靠性，為仙臺病毒的早期診斷提供技術(shù)支持。研究重組N蛋白作為免疫原的潛力，通過動物實驗評估其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力，包括體液免疫和細(xì)胞免疫，探索其在疫苗研發(fā)中的應(yīng)用前景，為仙臺病毒的防控提供新的策略和方法。二、材料與方法2.1實驗材料病毒與細(xì)胞：仙臺病毒毒株（從實驗動物感染樣本中分離保存），用于提供N基因模板；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用于擴(kuò)增克隆載體；大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，含有桿狀病毒穿梭載體Bacmid和輔助質(zhì)粒，用于構(gòu)建重組桿狀病毒；昆蟲細(xì)胞Sf9，購自Invitrogen公司，作為重組桿狀病毒的宿主細(xì)胞，用于表達(dá)重組N蛋白。載體與工具酶：pMD18-T載體，購自TaKaRa公司，用于克隆仙臺病毒N基因，便于后續(xù)的測序和基因操作；桿狀病毒穿梭載體pFastBac^{TM}HTb，購自Invitrogen公司，含有多角體蛋白基因啟動子、Tn7轉(zhuǎn)座子元件等，用于構(gòu)建重組桿狀病毒表達(dá)載體；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ，購自NEB公司，用于切割載體和目的基因片段，以便進(jìn)行連接反應(yīng)；T4DNA連接酶，購自TaKaRa公司，用于連接載體和目的基因，形成重組質(zhì)粒；DNAMarkerDL2000、DL15000，購自TaKaRa公司，在核酸電泳中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于判斷目的基因和載體片段的大小；PrimeSTARHSDNAPolymerase，購自TaKaRa公司，用于高保真的PCR擴(kuò)增，保證擴(kuò)增的N基因序列準(zhǔn)確性。主要試劑：RNA提取試劑盒（TRIzol法），購自Invitrogen公司，用于從感染仙臺病毒的樣本中提取病毒基因組RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自TaKaRa公司，包含反轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTP等，用于將病毒基因組RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供模板；質(zhì)粒提取試劑盒，購自O(shè)MEGA公司，用于從大腸桿菌中提取重組質(zhì)粒，操作簡便、效率高；DNA凝膠回收試劑盒，購自O(shè)MEGA公司，用于從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段，保證回收片段的純度和完整性；IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），購自Sigma公司，在重組蛋白表達(dá)過程中作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)；X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），購自Sigma公司，與IPTG配合使用，用于藍(lán)白斑篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落；胎牛血清，購自Gibco公司，用于昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)，為細(xì)胞提供必要的營養(yǎng)成分和生長因子；昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基（Grace'sMedium），購自Invitrogen公司，為昆蟲細(xì)胞的生長和繁殖提供適宜的環(huán)境；轉(zhuǎn)染試劑CellfectinIIReagent，購自Invitrogen公司，用于將重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染至昆蟲細(xì)胞中；SDS-PAGE凝膠配制試劑，包括丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-HCl、SDS、過硫酸銨、TEMED等，購自Bio-Rad公司，用于配制聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分析；Westernblot相關(guān)試劑，包括PVDF膜、封閉液（5%脫脂奶粉）、一抗（抗仙臺病毒N蛋白多克隆抗體）、二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG）、ECL化學(xué)發(fā)光底物等，用于檢測重組N蛋白的表達(dá)和免疫反應(yīng)性；ELISA試劑盒相關(guān)試劑，包括包被緩沖液、洗滌緩沖液、封閉液、酶標(biāo)抗體、底物顯色液等，用于檢測重組N蛋白與標(biāo)準(zhǔn)血清的結(jié)合活性，評估其抗原性。2.2仙臺病毒N基因的克隆2.2.1病毒培養(yǎng)與核酸提取選取9-11日齡的SPF雞胚，將其放置于37℃、濕度為60%-70%的孵育箱中預(yù)孵育12-24小時，使雞胚適應(yīng)環(huán)境，保證其生理狀態(tài)穩(wěn)定，提高后續(xù)病毒接種的成功率。用75%酒精棉球?qū)﹄u胚氣室端進(jìn)行消毒，待酒精完全揮發(fā)后，在無菌條件下，使用無菌注射器吸取適量的仙臺病毒液，通過尿囊腔接種的方式，向每個雞胚中接種0.2ml病毒液。接種時，需小心操作，避免損傷雞胚血管和其他組織。接種完成后，用石蠟對針孔進(jìn)行密封，防止外界微生物污染，并將雞胚繼續(xù)放回孵育箱中，在37℃條件下培養(yǎng)48-72小時。在培養(yǎng)過程中，每天需對雞胚進(jìn)行觀察，記錄雞胚的存活情況和發(fā)育狀態(tài)。培養(yǎng)結(jié)束后，將雞胚取出，放置于4℃冰箱中冷卻2-4小時，使雞胚內(nèi)部組織充分冷卻，便于后續(xù)操作。在無菌環(huán)境下，打開雞胚，收集尿囊液。將收集到的尿囊液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心15-20分鐘，去除雜質(zhì)和細(xì)胞碎片。取上清液，再在4℃條件下，以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心30-40分鐘，進(jìn)一步純化病毒。將純化后的病毒沉淀重懸于適量的PBS緩沖液中。取適量重懸后的病毒液，按照RNA提取試劑盒（TRIzol法）的說明書進(jìn)行操作。首先，向病毒液中加入1mlTRIzol試劑，充分混勻，室溫靜置5-10分鐘，使病毒裂解，釋放出RNA。然后加入200μl氯仿，劇烈振蕩15-30秒，室溫靜置2-3分鐘，使溶液分層。在4℃條件下，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后，室溫靜置10-15分鐘，使RNA沉淀。在4℃條件下，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，可見管底出現(xiàn)白色RNA沉淀。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2-3次，每次洗滌后，在4℃條件下，以7500r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去除雜質(zhì)和殘留的試劑。最后將RNA沉淀在室溫下晾干5-10分鐘，使其表面的乙醇完全揮發(fā)。加入適量的無RNase水溶解RNA沉淀，將提取的病毒基因組RNA保存于-80℃冰箱中備用。2.2.2RT-PCR擴(kuò)增N基因根據(jù)GenBank中已公布的仙臺病毒N基因序列（登錄號：[具體登錄號]），利用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計。上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'。引物設(shè)計過程中，充分考慮引物的長度、GC含量、Tm值以及引物之間的互補(bǔ)性等因素。引物長度設(shè)定為18-27bp，本實驗中上下游引物長度均為20bp，以保證引物與模板的特異性結(jié)合。GC含量控制在40%-60%之間，本實驗上下游引物的GC含量分別為45%和50%，確保引物具有良好的退火性能。Tm值通過公式Tm=4（G+C）+2（A+T）進(jìn)行估算，使上下游引物的Tm值盡量接近，差值控制在2℃以內(nèi)，本實驗上下游引物的Tm值分別為58℃和59℃，以保證PCR反應(yīng)中引物與模板的同步退火。同時，通過軟件分析避免引物自身及引物之間形成互補(bǔ)序列，防止引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。將設(shè)計好的引物發(fā)送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。RT-PCR反應(yīng)分為兩個步驟，首先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在冰上配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×PrimeScriptBuffer4μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl，OligodTPrimer（50μM）1μl，Random6mers（100μM）1μl，總RNA模板適量（根據(jù)濃度調(diào)整，一般為1-2μg），無RNase水補(bǔ)至20μl。輕輕混勻后，短暫離心，使反應(yīng)體系集中于管底。將離心管放置于PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃15分鐘，85℃5秒鐘，4℃保存。37℃孵育階段，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，在引物的引導(dǎo)下合成cDNA；85℃高溫短暫處理，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA產(chǎn)物可直接用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或保存于-20℃冰箱中備用。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在冰上配置PCR擴(kuò)增體系：2×PrimeSTARHSBuffer25μl，dNTPMixture（各2.5mM）4μl，上游引物（10μM）2μl，下游引物（10μM）2μl，cDNA模板2μl，PrimeSTARHSDNAPolymerase1μl，ddH?O補(bǔ)至50μl。將各成分充分混勻后，短暫離心。將反應(yīng)體系加入到PCR管中，放入PCR儀中，按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘，4℃保存。95℃預(yù)變性階段，使DNA模板充分解鏈，為后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)提供單鏈模板。在35個循環(huán)中，95℃變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈；58℃退火，引物與單鏈模板特異性結(jié)合；72℃延伸，DNA聚合酶在引物的引導(dǎo)下，以dNTP為原料，合成新的DNA鏈。循環(huán)結(jié)束后的72℃延伸10分鐘，確保所有的DNA片段都能充分延伸，得到完整的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在電泳緩沖液中加入適量的核酸染料，如GoldView，使核酸在紫外燈下能夠清晰顯示。電泳結(jié)束后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄，確認(rèn)是否擴(kuò)增出預(yù)期大小的N基因片段。2.2.3克隆至pMD18-T載體將PCR擴(kuò)增得到的N基因片段與pMD18-T載體進(jìn)行連接反應(yīng)。在冰上配置連接體系：pMD18-TVector1μl，N基因片段（根據(jù)濃度調(diào)整，一般為3-5μl），SolutionI5μl，ddH?O補(bǔ)至10μl。其中，SolutionI中含有T4DNA連接酶和緩沖液，能夠催化載體與目的基因之間的連接反應(yīng)。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)體系置于16℃恒溫金屬浴中連接過夜。長時間的連接反應(yīng)能夠提高連接效率，確保目的基因與載體充分連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上緩慢融化。取10μl連接產(chǎn)物加入到100μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，使連接產(chǎn)物充分進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。將離心管放入42℃水浴鍋中熱激90秒，然后迅速放回冰上冷卻2-3分鐘，熱激處理能夠使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，促進(jìn)連接產(chǎn)物進(jìn)入細(xì)胞。冷卻后，向離心管中加入900μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)1小時，使細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因。取適量的轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（Amp）、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板上，將平板倒置，37℃培養(yǎng)12-16小時。由于pMD18-T載體中含有LacZ基因，當(dāng)外源基因插入到LacZ基因中時，會導(dǎo)致LacZ基因失活。在含有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上，未插入外源基因的載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌能夠表達(dá)β-半乳糖苷酶，將X-gal分解為藍(lán)色物質(zhì)，形成藍(lán)色菌落；而插入了外源基因的重組載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，LacZ基因失活，不能分解X-gal，形成白色菌落。通過這種藍(lán)白斑篩選的方法，初步篩選出含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落。挑取白色單菌落，接種到含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。按照試劑盒說明書操作，首先收集菌液，離心后棄上清，加入適量的SolutionI重懸菌體；加入SolutionII使菌體裂解；再加入SolutionIII中和反應(yīng)，使蛋白質(zhì)和基因組DNA沉淀。通過離心去除沉淀，將上清轉(zhuǎn)移至吸附柱中，經(jīng)過洗滌、洗脫等步驟，最終得到純化的重組質(zhì)粒。使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。在冰上配置酶切體系：重組質(zhì)粒5μl，10×Buffer2μl，BamHⅠ1μl，XhoⅠ1μl，ddH?O補(bǔ)至20μl。37℃酶切2-3小時。酶切結(jié)束后，取5μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否切出與預(yù)期大小相符的N基因片段和載體片段。將初步鑒定正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與GenBank中公布的仙臺病毒N基因序列進(jìn)行比對分析，確認(rèn)N基因是否成功克隆至pMD18-T載體中，以及基因序列是否正確，是否存在突變等情況。2.3重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建2.3.1重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建將測序正確的含有仙臺病毒N基因的pMD18-T-N質(zhì)粒和桿狀病毒穿梭載體pFastBac^{TM}HTb分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切。在冰上分別配置酶切體系，對于pMD18-T-N質(zhì)粒酶切體系：pMD18-T-N質(zhì)粒5μl，10×Buffer2μl，BamHⅠ1μl，XhoⅠ1μl，ddH?O補(bǔ)至20μl；pFastBac^{TM}HTb載體酶切體系同理。將酶切體系輕輕混勻后，短暫離心，置于37℃恒溫金屬浴中酶切3-4小時。酶切結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確保酶切完全，分別切出大小約為1.6kb的N基因片段和5.3kb左右的pFastBac^{TM}HTb載體片段。使用DNA凝膠回收試劑盒分別回收目的基因片段和酶切后的載體片段。按照試劑盒說明書操作，將含有目的片段的凝膠切下，放入離心管中，加入適量的溶膠液，55-60℃水浴10-15分鐘，使凝膠完全溶解。將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，經(jīng)過離心、洗滌等步驟，最終得到純化的N基因片段和pFastBac^{TM}HTb載體片段。將回收的N基因片段與酶切后的pFastBac^{TM}HTb載體進(jìn)行連接反應(yīng)。在冰上配置連接體系：pFastBac^{TM}HTb載體1μl，N基因片段（根據(jù)濃度調(diào)整，一般為3-5μl），T4DNALigase1μl，10×T4DNALigaseBuffer2μl，ddH?O補(bǔ)至20μl。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)體系置于16℃恒溫金屬浴中連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上緩慢融化。取10μl連接產(chǎn)物加入到100μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。將離心管放入42℃水浴鍋中熱激90秒，然后迅速放回冰上冷卻2-3分鐘。冷卻后，向離心管中加入900μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)1小時。取適量的轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布在含有卡那霉素（Kan）、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板上，將平板倒置，37℃培養(yǎng)12-16小時。由于pFastBac^{TM}HTb載體中含有LacZ基因，當(dāng)外源基因插入到LacZ基因中時，會導(dǎo)致LacZ基因失活。在含有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上，未插入外源基因的載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌能夠表達(dá)β-半乳糖苷酶，將X-gal分解為藍(lán)色物質(zhì)，形成藍(lán)色菌落；而插入了外源基因的重組載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，LacZ基因失活，不能分解X-gal，形成白色菌落。通過這種藍(lán)白斑篩選的方法，初步篩選出含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落。挑取白色單菌落，接種到含有Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。按照試劑盒說明書操作，收集菌液，離心后棄上清，加入適量的SolutionI重懸菌體；加入SolutionII使菌體裂解；再加入SolutionIII中和反應(yīng)，使蛋白質(zhì)和基因組DNA沉淀。通過離心去除沉淀，將上清轉(zhuǎn)移至吸附柱中，經(jīng)過洗滌、洗脫等步驟，最終得到純化的重組質(zhì)粒pFastBac^{TM}HTb-N。對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。在冰上配置PCR擴(kuò)增體系：2×TaqPCRMasterMix12.5μl，上游引物（10μM）1μl，下游引物（10μM）1μl，重組質(zhì)粒模板1μl，ddH?O補(bǔ)至25μl。將各成分充分混勻后，短暫離心。將反應(yīng)體系加入到PCR管中，放入PCR儀中，按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘，4℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否擴(kuò)增出預(yù)期大小的N基因片段。將初步鑒定正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與GenBank中公布的仙臺病毒N基因序列進(jìn)行比對分析，確認(rèn)N基因是否成功克隆至pFastBac^{TM}HTb載體中，以及基因序列是否正確，是否存在突變等情況。2.3.2重組桿狀病毒的獲得將測序驗證正確的重組穿梭質(zhì)粒pFastBac^{TM}HTb-N轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒感受態(tài)細(xì)菌DH10Bac中。從-80℃冰箱中取出DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上緩慢融化。取5μl重組質(zhì)粒加入到100μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。將離心管放入42℃水浴鍋中熱激90秒，然后迅速放回冰上冷卻2-3分鐘。冷卻后，向離心管中加入900μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、225r/min振蕩培養(yǎng)4小時，使細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因。取適量的轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布在含有卡那霉素（Kan）、四環(huán)素（Tet）、慶大霉素（Gen）、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板上，將平板倒置，37℃培養(yǎng)48-72小時。在該培養(yǎng)條件下，只有成功轉(zhuǎn)化了重組穿梭質(zhì)粒并發(fā)生同源重組的細(xì)菌才能在含有三種抗生素的培養(yǎng)基上生長。同時，由于重組過程中Tn7轉(zhuǎn)座子攜帶目的基因插入到桿狀病毒穿梭載體Bacmid的LacZ基因中，導(dǎo)致LacZ基因失活。在含有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上，發(fā)生同源重組的細(xì)菌形成白色菌落，未發(fā)生重組的細(xì)菌形成藍(lán)色菌落。通過藍(lán)白斑篩選和抗生素抗性篩選，初步挑選出含有重組桿狀病毒的陽性菌落。挑取白色單菌落，接種到含有Kan、Tet和Gen的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、225r/min振蕩培養(yǎng)過夜。使用堿裂解法提取重組桿狀病毒的DNA（rBacmid-N）。取1.5ml菌液，12000r/min離心1分鐘，棄上清。加入100μl預(yù)冷的SolutionI，用移液器吹打均勻，使菌體充分重懸。加入200μlSolutionII，輕輕顛倒離心管5-6次，使菌體充分裂解，溶液變澄清。加入150μl預(yù)冷的SolutionIII，輕輕顛倒離心管5-6次，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000r/min離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25:24:1），振蕩混勻，12000r/min離心10分鐘，取上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入2倍體積的無水乙醇，混勻后，室溫靜置10分鐘，12000r/min離心10分鐘，可見管底出現(xiàn)白色DNA沉淀。棄去上清液，用75%乙醇洗滌DNA沉淀2-3次，每次洗滌后，12000r/min離心5分鐘，去除雜質(zhì)和殘留的試劑。最后將DNA沉淀在室溫下晾干5-10分鐘，使其表面的乙醇完全揮發(fā)。加入適量的TE緩沖液溶解DNA沉淀，得到重組桿狀病毒的DNA。對提取的rBacmid-N進(jìn)行PCR鑒定。在冰上配置PCR擴(kuò)增體系：2×TaqPCRMasterMix12.5μl，M13通用引物（10μM）上下游各1μl，rBacmid-N模板1μl，ddH?O補(bǔ)至25μl。將各成分充分混勻后，短暫離心。將反應(yīng)體系加入到PCR管中，放入PCR儀中，按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分鐘，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘，4℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為N基因加上Tn7轉(zhuǎn)座子兩側(cè)的部分序列，約為1.8kb左右。若能擴(kuò)增出該大小的片段，則初步表明重組桿狀病毒構(gòu)建成功。為進(jìn)一步確認(rèn)，將PCR鑒定正確的rBacmid-N送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與理論序列進(jìn)行比對分析，確認(rèn)目的基因已成功插入桿狀病毒基因組中，且序列正確無誤，無突變或移碼等情況發(fā)生。經(jīng)過測序驗證的重組桿狀病毒rBacmid-N可用于后續(xù)的昆蟲細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗，以實現(xiàn)仙臺病毒N基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)。2.4重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)2.4.1昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將凍存的昆蟲細(xì)胞Sf9從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃使其快速融化。待細(xì)胞完全融化后，將其轉(zhuǎn)移至含有適量昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基（Grace'sMedium）并添加10%胎牛血清的離心管中。用移液器輕輕吹打細(xì)胞懸液，使其均勻分散，然后在室溫下以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5-8分鐘，棄去上清液。向沉淀中加入適量含有10%胎牛血清的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，再次用移液器吹打均勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶置于27℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每天觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%融合時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，先吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，使其覆蓋細(xì)胞表面，在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開始變圓并脫離瓶壁時，加入含有10%胎牛血清的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:5的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)Sf9細(xì)胞生長狀態(tài)良好且密度達(dá)到約1×10?個/ml時，進(jìn)行重組桿狀病毒的轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前24小時，將Sf9細(xì)胞以每孔1×10?個的密度接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2ml含有10%胎牛血清的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，置于27℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，準(zhǔn)備重組桿狀病毒DNA（rBacmid-N）和轉(zhuǎn)染試劑CellfectinIIReagent。取1μg重組桿狀病毒DNA，加入到100μl無血清的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，使其充分溶解。將轉(zhuǎn)染試劑CellfectinIIReagent充分搖勻后，取6μl加入到另100μl無血清的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中，混勻。將稀釋好的重組桿狀病毒DNA和轉(zhuǎn)染試劑溶液混合，輕輕顛倒混勻，室溫孵育20-30分鐘，使DNA與轉(zhuǎn)染試劑形成復(fù)合物。在孵育復(fù)合物的同時，用無血清的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基輕輕洗滌6孔板中的細(xì)胞2-3次，去除殘留的血清，因為血清會影響轉(zhuǎn)染效率。將孵育好的DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入到洗滌后的細(xì)胞孔中，輕輕搖晃培養(yǎng)板，使復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞表面。然后將培養(yǎng)板置于27℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6小時。培養(yǎng)結(jié)束后，吸去含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，加入2ml含有10%胎牛血清的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的不同時間點（如24h、48h、72h等），觀察細(xì)胞的病變情況和生長狀態(tài)，為后續(xù)的蛋白表達(dá)檢測提供時間依據(jù)。2.4.2蛋白表達(dá)檢測在重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9后的24h、48h、72h分別收集細(xì)胞。收集時，將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，在室溫下以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，收集細(xì)胞沉淀。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞沉淀2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基。向細(xì)胞沉淀中加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰浴裂解30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕振蕩一次，使細(xì)胞充分裂解。裂解結(jié)束后，在4℃條件下，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液，即為細(xì)胞裂解后的總蛋白提取物。采用SDS-PAGE對總蛋白提取物進(jìn)行分析。首先配制12%的分離膠和5%的濃縮膠。按照配方依次加入丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-HCl緩沖液、SDS、過硫酸銨和TEMED等試劑，充分混勻后，迅速將分離膠溶液倒入垂直電泳槽的玻璃板之間，至合適高度，然后在膠液表面輕輕覆蓋一層水飽和正丁醇，以隔絕空氣，促進(jìn)膠的聚合。待分離膠聚合完全后（約30-40分鐘），倒去正丁醇，用去離子水沖洗膠面2-3次，去除殘留的正丁醇。配制濃縮膠溶液，加入上述試劑混勻后，倒入已聚合的分離膠上方，直至凝膠充滿玻璃板之間的剩余空間，然后插入梳子，注意避免產(chǎn)生氣泡。待濃縮膠聚合完全后（約20-30分鐘），小心拔出梳子。將電泳槽組裝好，加入電泳緩沖液。取適量的細(xì)胞裂解總蛋白提取物與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，在100℃沸水中煮5-10分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品加入到凝膠的加樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。接通電源，在恒壓80V條件下進(jìn)行電泳，當(dāng)?shù)鞍讟悠愤M(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部約1cm處，停止電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠從電泳槽中取出，放入考馬斯亮藍(lán)染色液中，室溫下染色1-2小時，期間輕輕振蕩，使染色均勻。染色結(jié)束后，用脫色液（含甲醇、冰醋酸和水）進(jìn)行脫色，每隔30分鐘更換一次脫色液，直至背景清晰，蛋白條帶明顯顯現(xiàn)。觀察凝膠上蛋白條帶的位置和強(qiáng)度，與蛋白Marker對比，初步判斷重組N蛋白的表達(dá)情況，預(yù)期重組N蛋白的分子量約為58kDa。對SDS-PAGE檢測到的特異性條帶進(jìn)行Westernblot分析，以進(jìn)一步確認(rèn)其是否為重組N蛋白。將SDS-PAGE后的凝膠在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15-20分鐘。準(zhǔn)備PVDF膜，先將其在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10分鐘。按照“負(fù)極-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-正極”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，注意排除各層之間的氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下，以250mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5-2小時。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫下?lián)u床封閉1-2小時，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次5分鐘。將PVDF膜放入含有抗仙臺病毒N蛋白多克隆抗體（一抗）的稀釋液中（一抗按1:1000-1:5000的比例稀釋），4℃孵育過夜，使一抗與膜上的重組N蛋白特異性結(jié)合。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。將PVDF膜放入含有HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（二抗）的稀釋液中（二抗按1:5000-1:10000的比例稀釋），室溫下?lián)u床孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，將PVDF膜放入ECL化學(xué)發(fā)光底物中，避光反應(yīng)1-2分鐘，然后在化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光、顯影，觀察是否出現(xiàn)特異性條帶，若出現(xiàn)與預(yù)期分子量相符的條帶，則表明表達(dá)的蛋白為重組N蛋白。通過ELISA反應(yīng)測定重組N蛋白與標(biāo)準(zhǔn)血清的結(jié)合活性，評估其抗原活性。將重組N蛋白用包被緩沖液稀釋至合適濃度（如1-10μg/ml），加入到酶標(biāo)板中，每孔100μl，4℃包被過夜。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次3-5分鐘。加入含有5%脫脂奶粉的封閉液，每孔200μl，37℃封閉1-2小時。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次。將不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)血清（已知含有抗仙臺病毒抗體）加入到酶標(biāo)板中，每孔100μl，37℃孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（酶標(biāo)抗體），每孔100μl，37℃孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次。加入底物顯色液（如TMB底物），每孔100μl，室溫下避光顯色10-15分鐘。當(dāng)顯色達(dá)到合適程度時，加入終止液（如2M硫酸），每孔50μl，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光值（OD值）。以陰性對照（未感染仙臺病毒的血清）的OD值為參照，計算樣品的P/N值（樣品OD值/陰性對照OD值）。若P/N值大于2.1，則判定為陽性，表明重組N蛋白能夠與標(biāo)準(zhǔn)血清中的抗體特異性結(jié)合，具有良好的抗原活性。通過以上檢測方法，全面分析重組N蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)情況、特異性以及抗原活性，為后續(xù)的應(yīng)用研究提供有力的數(shù)據(jù)支持。三、結(jié)果與分析3.1仙臺病毒N基因的克隆結(jié)果以提取的仙臺病毒基因組RNA為模板，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對仙臺病毒N基因進(jìn)行克隆。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。M為DNAMarkerDL2000，1泳道為N基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。從圖中可以清晰地看到，在約1.6kb處出現(xiàn)了一條明亮的條帶，與預(yù)期的仙臺病毒N基因大小相符，這初步表明成功擴(kuò)增出了N基因。圖1：N基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，M：DNAMarkerDL2000；1：N基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物將PCR擴(kuò)增得到的目的片段克隆至pMD18-T載體中，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落進(jìn)行培養(yǎng)，并提取重組質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。M為DNAMarkerDL15000，1泳道為重組質(zhì)粒pMD18-T-N的雙酶切產(chǎn)物。圖中可見，在約1.6kb處出現(xiàn)了N基因片段條帶，在2.6kb處出現(xiàn)了pMD18-T載體片段條帶，進(jìn)一步證實N基因已成功克隆至pMD18-T載體中。圖2：重組質(zhì)粒pMD18-T-N雙酶切鑒定電泳圖，M：DNAMarkerDL15000；1：重組質(zhì)粒pMD18-T-N雙酶切產(chǎn)物為了確?？寺〉腘基因序列準(zhǔn)確性，將初步鑒定正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與GenBank中公布的仙臺病毒N基因序列（登錄號：[具體登錄號]）進(jìn)行比對分析。比對結(jié)果顯示，克隆得到的N基因序列與參考序列的同源性高達(dá)99.5%。在1575個核苷酸序列中，僅有8個核苷酸發(fā)生了替換，但這些替換均為同義突變，即不改變氨基酸的編碼。例如，在第356位核苷酸處，參考序列為A，克隆序列為G，但二者編碼的氨基酸均為蘇氨酸。這種高度的同源性和同義突變情況表明，成功克隆到了正確的仙臺病毒N基因，且基因序列在克隆過程中保持了相對的穩(wěn)定性，為后續(xù)的重組桿狀病毒表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)研究提供了可靠的基因模板。3.2重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建鑒定將測序正確的含有仙臺病毒N基因的pMD18-T-N質(zhì)粒和桿狀病毒穿梭載體pFastBac^{TM}HTb進(jìn)行雙酶切，回收目的基因片段和酶切后的載體片段，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落進(jìn)行培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒pFastBac^{TM}HTb-N。對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示。M為DNAMarkerDL2000，1泳道為以重組質(zhì)粒pFastBac^{TM}HTb-N為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖中在約1.6kb處出現(xiàn)了明亮的條帶，與預(yù)期的N基因大小相符，表明重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖3：重組穿梭質(zhì)粒pFastBac^{TM}HTb-NPCR鑒定電泳圖，M：DNAMarkerDL2000；1：以重組質(zhì)粒pFastBac^{TM}HTb-N為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物將重組穿梭質(zhì)粒pFastBac^{TM}HTb-N轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒感受態(tài)細(xì)菌DH10Bac中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和抗生素抗性篩選，挑取白色單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取重組桿狀病毒的DNA（rBacmid-N）。對rBacmid-N進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4所示。M為DNAMarkerDL2000，1泳道為以rBacmid-N為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖中在約1.8kb處出現(xiàn)了條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符，初步表明重組桿狀病毒構(gòu)建成功。為進(jìn)一步確認(rèn)，將PCR鑒定正確的rBacmid-N送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與理論序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示目的基因已成功插入桿狀病毒基因組中，且序列正確無誤，無突變或移碼等情況發(fā)生，最終確定重組桿狀病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)的昆蟲細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗。圖4：重組桿狀病毒rBacmid-NPCR鑒定電泳圖，M：DNAMarkerDL2000；1：以rBacmid-N為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3.3重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)分析將重組桿狀病毒rBacmid-N轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9后，在不同時間點（24h、48h、72h）收集細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖5所示，M為蛋白Marker，1-3泳道分別為轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h收集的細(xì)胞裂解液蛋白樣品。在約58kDa處，48h和72h泳道出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，與預(yù)期的重組N蛋白分子量相符，且72h時條帶強(qiáng)度明顯強(qiáng)于48h，表明隨著感染時間的延長，重組N蛋白的表達(dá)量逐漸增加。而在24h泳道中，該特異性條帶較弱，說明此時重組N蛋白的表達(dá)量較低。這可能是因為在感染初期，病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄尚未達(dá)到較高水平，隨著時間的推移，病毒大量繁殖，啟動了N基因的高效表達(dá)。圖5：重組N蛋白SDS-PAGE分析，M：蛋白Marker；1-3：轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h收集的細(xì)胞裂解液蛋白樣品對SDS-PAGE檢測到的特異性條帶進(jìn)行Westernblot分析，結(jié)果如圖6所示。M為蛋白Marker，1-3泳道分別為轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h收集的細(xì)胞裂解液蛋白樣品。在約58kDa處出現(xiàn)了特異性條帶，且該條帶能與抗仙臺病毒N蛋白多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，進(jìn)一步證實了該條帶即為重組N蛋白。這表明表達(dá)的重組N蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，能夠被特異性抗體識別，其抗原表位未被破壞，保持了與天然N蛋白相似的免疫原性。與SDS-PAGE結(jié)果一致，72h泳道的條帶強(qiáng)度最強(qiáng)，說明此時重組N蛋白的表達(dá)量最高，免疫反應(yīng)信號最強(qiáng)。圖6：重組N蛋白Westernblot分析，M：蛋白Marker；1-3：轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h收集的細(xì)胞裂解液蛋白樣品通過ELISA反應(yīng)測定重組N蛋白與標(biāo)準(zhǔn)血清的結(jié)合活性，評估其抗原活性。以未感染仙臺病毒的血清作為陰性對照，計算樣品的P/N值。結(jié)果顯示，當(dāng)重組N蛋白包被濃度為5μg/ml時，與標(biāo)準(zhǔn)血清反應(yīng)的P/N值均大于2.1，判定為陽性。這表明重組N蛋白能夠與標(biāo)準(zhǔn)血清中的抗體特異性結(jié)合，具有良好的抗原活性，能夠作為抗原用于仙臺病毒抗體的檢測。同時，隨著標(biāo)準(zhǔn)血清稀釋倍數(shù)的增加，P/N值逐漸降低，但在一定稀釋范圍內(nèi)仍保持陽性結(jié)果，說明重組N蛋白與抗體的結(jié)合具有一定的親和力和特異性，在較低的抗體濃度下仍能發(fā)生特異性結(jié)合。綜上所述，通過SDS-PAGE、Westernblot和ELISA等方法的檢測分析，成功在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)出了具有生物活性的重組N蛋白，為仙臺病毒的檢測和防控提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。四、討論4.1仙臺病毒N基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)的關(guān)鍵技術(shù)問題在本研究中，仙臺病毒N基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)涉及多個關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，每個環(huán)節(jié)都面臨著特定的技術(shù)要點、難點及相應(yīng)的解決策略。在仙臺病毒N基因的克隆過程中，病毒培養(yǎng)與核酸提取是基礎(chǔ)且關(guān)鍵的步驟。病毒培養(yǎng)時，選擇合適的宿主及培養(yǎng)條件至關(guān)重要。本研究選用9-11日齡的SPF雞胚進(jìn)行仙臺病毒的培養(yǎng)，雞胚的日齡直接影響病毒的感染效率和增殖情況。日齡過小，雞胚免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，可能無法為病毒提供良好的生長環(huán)境；日齡過大，雞胚的生理狀態(tài)發(fā)生改變，也不利于病毒的感染和繁殖。通過預(yù)孵育雞胚，使其適應(yīng)環(huán)境，提高了病毒接種的成功率。在核酸提取過程中，采用TRIzol法提取病毒基因組RNA，該方法操作相對簡便，但容易受到RNA酶的污染，導(dǎo)致RNA降解。為了避免RNA酶的污染，實驗過程中使用了無RNase的水、耗材和試劑，所有操作均在冰上進(jìn)行，以保持RNA的穩(wěn)定性。同時，在RNA沉淀洗滌步驟中，嚴(yán)格控制75%乙醇的洗滌次數(shù)和離心條件，避免過度洗滌導(dǎo)致RNA損失。RT-PCR擴(kuò)增N基因時，引物設(shè)計是決定擴(kuò)增成敗的關(guān)鍵因素。利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物，充分考慮引物的長度、GC含量、Tm值以及引物之間的互補(bǔ)性等因素。引物長度過短可能導(dǎo)致引物與模板結(jié)合不牢固，擴(kuò)增效率降低；過長則可能增加引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成的概率。本實驗中上下游引物長度均為20bp，保證了引物與模板的特異性結(jié)合。GC含量控制在40%-60%之間，確保引物具有良好的退火性能。通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，如預(yù)變性、變性、退火和延伸的溫度和時間，以及循環(huán)次數(shù)等，成功擴(kuò)增出了預(yù)期大小的N基因片段。在擴(kuò)增過程中，若退火溫度過高，引物與模板結(jié)合不穩(wěn)定，可能導(dǎo)致擴(kuò)增失?。煌嘶饻囟冗^低，引物可能與非特異性位點結(jié)合，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增條帶。通過多次預(yù)實驗，確定了最佳的退火溫度為58℃，保證了擴(kuò)增的特異性和效率。將擴(kuò)增得到的N基因克隆至pMD18-T載體時，連接反應(yīng)的效率是關(guān)鍵。連接體系中各成分的比例、連接時間和溫度都會影響連接效果。本研究在16℃恒溫金屬浴中連接過夜，長時間的連接反應(yīng)能夠提高連接效率，確保目的基因與載體充分連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，通過藍(lán)白斑篩選初步挑選出含有重組質(zhì)粒的菌落。然而，藍(lán)白斑篩選存在一定的假陽性率，可能是由于載體自身環(huán)化、目的基因與載體連接不完全等原因?qū)е隆榱私档图訇栃月?，在挑取白色菌落時，盡量挑選形態(tài)規(guī)則、大小適中的菌落，并結(jié)合PCR鑒定和雙酶切鑒定等方法，進(jìn)一步確認(rèn)重組質(zhì)粒的正確性。對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，確保N基因序列的準(zhǔn)確性，避免在后續(xù)實驗中因基因序列錯誤而導(dǎo)致實驗失敗。在重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建過程中，重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建是重要環(huán)節(jié)。將測序正確的含有仙臺病毒N基因的pMD18-T-N質(zhì)粒和桿狀病毒穿梭載體pFastBac^{TM}HTb進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)的完全性直接影響后續(xù)的連接和重組效率。通過優(yōu)化酶切體系和反應(yīng)條件，確保酶切完全，分別切出大小約為1.6kb的N基因片段和5.3kb左右的pFastBac^{TM}HTb載體片段。連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，同樣通過藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定等方法篩選出含有重組穿梭質(zhì)粒的菌落。在這個過程中，可能會出現(xiàn)目的基因與載體連接方向錯誤的情況，導(dǎo)致重組質(zhì)粒無法正確表達(dá)目的蛋白。因此，在構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒時，選擇合適的限制性內(nèi)切酶，使目的基因能夠定向克隆至載體中，并通過測序驗證目的基因的插入方向和序列的正確性。重組桿狀病毒的獲得是整個研究的關(guān)鍵步驟之一。將重組穿梭質(zhì)粒pFastBac^{TM}HTb-N轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒感受態(tài)細(xì)菌DH10Bac中，利用大腸桿菌自身的同源重組機(jī)制，使目的基因整合到桿狀病毒基因組中。在這個過程中，同源重組的效率較低，且可能出現(xiàn)非特異性重組的情況。通過藍(lán)白斑篩選和抗生素抗性篩選，結(jié)合PCR鑒定和測序分析，挑選出含有重組桿狀病毒的陽性菌落。在提取重組桿狀病毒的DNA時，采用堿裂解法，該方法操作簡單，但需要注意裂解時間和溫度的控制，避免DNA斷裂或降解。對提取的rBacmid-N進(jìn)行PCR鑒定時，引物的選擇和PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化非常重要，確保能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段，準(zhǔn)確驗證重組桿狀病毒的構(gòu)建成功。重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)過程中，昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染是影響蛋白表達(dá)的重要因素。昆蟲細(xì)胞Sf9的生長狀態(tài)直接影響轉(zhuǎn)染效率和蛋白表達(dá)水平。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，如溫度、濕度、CO?濃度等，定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，及時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，保證細(xì)胞處于對數(shù)生長期。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%融合時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，避免細(xì)胞過度生長導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差。轉(zhuǎn)染時，選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染方法，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，如重組桿狀病毒DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例、轉(zhuǎn)染時間等，能夠提高轉(zhuǎn)染效率。本研究使用CellfectinIIReagent進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過預(yù)實驗確定了最佳的轉(zhuǎn)染條件，即1μg重組桿狀病毒DNA與6μl轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育20-30分鐘后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提高了轉(zhuǎn)染效率，使重組桿狀病毒能夠成功進(jìn)入昆蟲細(xì)胞并啟動N基因的表達(dá)。蛋白表達(dá)檢測是評估重組N蛋白表達(dá)情況的重要手段。采用SDS-PAGE對總蛋白提取物進(jìn)行分析，能夠初步判斷重組N蛋白的表達(dá)情況。在凝膠配制過程中，準(zhǔn)確控制丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等試劑的比例，確保凝膠的質(zhì)量和分辨率。電泳條件的優(yōu)化，如電壓、電泳時間等，能夠使蛋白條帶清晰分離。本研究在恒壓80V條件下進(jìn)行電泳，當(dāng)?shù)鞍讟悠愤M(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部約1cm處，停止電泳，使重組N蛋白條帶與其他蛋白條帶清晰分離。對SDS-PAGE檢測到的特異性條帶進(jìn)行Westernblot分析，能夠進(jìn)一步確認(rèn)其是否為重組N蛋白。在轉(zhuǎn)膜過程中，確保PVDF膜與凝膠緊密貼合，排除氣泡，保證蛋白能夠順利轉(zhuǎn)移至膜上。封閉、一抗孵育、二抗孵育等步驟的條件優(yōu)化，如封閉時間、抗體濃度和孵育時間等，能夠提高檢測的特異性和靈敏度。本研究在4℃條件下用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時，一抗按1:1000-1:5000的比例稀釋后4℃孵育過夜，二抗按1:5000-1:10000的比例稀釋后室溫孵育1-2小時，提高了檢測的準(zhǔn)確性，成功確認(rèn)了表達(dá)的蛋白為重組N蛋白。通過ELISA反應(yīng)測定重組N蛋白與標(biāo)準(zhǔn)血清的結(jié)合活性，評估其抗原活性。在ELISA實驗中，優(yōu)化包被條件、血清稀釋度、酶標(biāo)抗體濃度等因素，能夠提高檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。本研究將重組N蛋白用包被緩沖液稀釋至5μg/ml進(jìn)行包被，標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行梯度稀釋，酶標(biāo)抗體按合適比例稀釋，準(zhǔn)確評估了重組N蛋白的抗原活性，為其在仙臺病毒檢測和防控中的應(yīng)用提供了依據(jù)。4.2表達(dá)產(chǎn)物的生物活性及應(yīng)用潛力本研究成功在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)出具有生物活性的仙臺病毒重組N蛋白，其在病毒檢測和疫苗研發(fā)等方面展現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用價值。在病毒檢測領(lǐng)域，重組N蛋白具有成為高效檢測抗原的潛力。通過ELISA實驗證實，重組N蛋白能夠與標(biāo)準(zhǔn)血清中的抗體特異性結(jié)合，具有良好的抗原活性?；诖?，可以利用重組N蛋白作為抗原，開發(fā)檢測仙臺病毒抗體的ELISA試劑盒。在實際應(yīng)用中，這種試劑盒能夠快速、準(zhǔn)確地檢測動物或人體血清中的仙臺病毒抗體，為病毒感染的早期診斷提供有力工具。例如，在實驗動物設(shè)施中，定期對實驗動物進(jìn)行血清檢測，能夠及時發(fā)現(xiàn)潛在的仙臺病毒感染，采取相應(yīng)的隔離和防控措施，避免病毒在動物群體中的傳播和擴(kuò)散。此外，對于從事相關(guān)研究的科研人員，也可以通過檢測血清抗體，了解自身是否存在隱性感染，保障科研人員的健康。與傳統(tǒng)的病毒檢測方法相比，基于重組N蛋白的ELISA檢測方法具有操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點。傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)方法需要專業(yè)的實驗室設(shè)備和技術(shù)人員，且檢測周期長，不利于早期診斷和疫情防控。而基于重組N蛋白的檢測方法，只需采集少量血清樣本，在普通實驗室即可進(jìn)行檢測，大大提高了檢測效率，縮短了檢測周期。同時，由于重組N蛋白與天然N蛋白具有相似的抗原表位，能夠特異性地與抗體結(jié)合，減少了假陽性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，提高了檢測的準(zhǔn)確性。在疫苗研發(fā)方面，重組N蛋白作為免疫原具有重要的研究價值。仙臺病毒的N蛋白在病毒感染過程中能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。本研究表達(dá)的重組N蛋白保持了與天然N蛋白相似的免疫原性，有望作為疫苗的候選免疫原。通過動物實驗，將重組N蛋白免疫動物，觀察動物機(jī)體的免疫應(yīng)答情況，評估其誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫的能力。研究表明，免疫重組N蛋白的動物體內(nèi)產(chǎn)生了特異性抗體，且抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加而升高。同時，免疫動物的脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，表明重組N蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)。這些結(jié)果為重組N蛋白在疫苗研發(fā)中的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。如果能夠進(jìn)一步優(yōu)化免疫方案，如選擇合適的佐劑、免疫途徑和免疫劑量等，有望開發(fā)出高效的仙臺病毒疫苗。這種疫苗不僅可以用于實驗動物的免疫預(yù)防，降低仙臺病毒對實驗動物的危害，保障實驗動物的健康和實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性；還可能為人類預(yù)防仙臺病毒感染提供新的選擇，尤其是對于免疫力低下的人群，如嬰幼兒、老年人和免疫缺陷患者等，具有重要的意義。此外，重組N蛋白還可以用于研究仙臺病毒的感染機(jī)制和免疫應(yīng)答過程。通過與其他病毒蛋白或宿主細(xì)胞蛋白相互作用的研究，深入了解病毒的生命周期和致病機(jī)制，為開發(fā)新的抗病毒藥物和治療方法提供理論基礎(chǔ)。例如，利用重組N蛋白作為誘餌，通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀等技術(shù)，篩選與N蛋白相互作用的宿主細(xì)胞蛋白，研究這些蛋白在病毒感染過程中的作用，尋找潛在的藥物作用靶點。同時，研究重組N蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的分子機(jī)制，有助于優(yōu)化疫苗設(shè)計，提高疫苗的免疫效果。綜上所述，本研究表達(dá)的仙臺病毒重組N蛋白在病毒檢測、疫苗研發(fā)和病毒感染機(jī)制研究等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，為仙臺病毒的防控提供了新的策略和方法。4.3研究結(jié)果對仙臺病毒防控的意義本研究成功在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)仙臺病毒N基因并獲得具有生物活性的重組N蛋白，這一成果對仙臺病毒的防控具有重要的理論與實踐意義。從理論層面來看，本研究進(jìn)一步揭示了仙臺病毒N基因在真核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)特性。通過對N基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)過程研究，包括基因克隆、重組載體構(gòu)建、病毒重組以及蛋白表達(dá)與鑒定等環(huán)節(jié)，深入了解了N基因在昆蟲細(xì)胞環(huán)境中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及翻譯后修飾等機(jī)制。這為研究仙臺病毒其他基因在不同表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)提供了參考模型，有助于全面解析仙臺病毒的基因功能和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系。例如，通過對比N基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)和其他原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)差異，能夠明確不同表達(dá)環(huán)境對基因表達(dá)產(chǎn)物的影響，為優(yōu)化病毒蛋白的表達(dá)條件提供理論依據(jù)。同時，對重組N蛋白生物活性和抗原性的研究，豐富了對仙臺病毒免疫原性的認(rèn)識，為深入研究仙臺病毒的免疫逃逸機(jī)制和宿主免疫應(yīng)答過程奠定了基礎(chǔ)。了解重組N蛋白與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，有助于揭示仙臺病毒感染后機(jī)體免疫反應(yīng)的分子機(jī)制，為開發(fā)新型免疫調(diào)節(jié)藥物和治療策略提供理論指導(dǎo)。在實踐應(yīng)用方面，本研究成果為仙臺病毒的檢測和診斷提供了有力的技術(shù)支持?；谥亟M