RNAscope原位雜交技術(shù)：PRRSV檢測(cè)新方法的構(gòu)建與應(yīng)用探索一、引言1.1豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）概述豬繁殖與呼吸綜合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS），是一種給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的重要疫病，自1987年在美國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)以來，迅速在世界各地蔓延，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV）具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，在流行病學(xué)、致病性以及診斷和防控等方面呈現(xiàn)出復(fù)雜的特點(diǎn)。深入了解PRRS的各個(gè)方面，對(duì)于有效防控該病、保障養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展具有至關(guān)重要的意義。1.1.1病原學(xué)特征PRRSV屬于尼多病毒目（Nidovirales）、動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae）、動(dòng)脈炎病毒屬（Arterivirus），是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒。病毒粒子呈球形或橢圓形，直徑約為50-70nm，核衣殼呈立體對(duì)稱的二十面體，直徑約35nm。這種病毒結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其在外界環(huán)境中的生存能力相對(duì)較弱，對(duì)熱、酸堿和消毒劑較為敏感。例如，在56℃條件下，PRRSV僅能存活20分鐘；在pH值小于6.0或大于7.65時(shí)，其感染力會(huì)顯著下降。1.1.2分子生物學(xué)特性PRRSV的基因組全長(zhǎng)約15kb，含有多個(gè)開放閱讀框（OpenReadingFrames，ORFs）。以經(jīng)典的美洲型毒株ATCCVR2332為例，其基因組包含ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-7等開放閱讀框。ORF1a和ORF1b編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和加工等過程；ORF2-7則編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，如ORF2編碼的GP2蛋白、ORF3編碼的GP3蛋白、ORF4編碼的GP4蛋白、ORF5編碼的GP5蛋白、ORF6編碼的M蛋白和ORF7編碼的N蛋白，這些結(jié)構(gòu)蛋白共同構(gòu)成了病毒的粒子結(jié)構(gòu)。其中，GP5蛋白是各毒株間變異最大的蛋白，其外結(jié)構(gòu)域中有一個(gè)高度保守的線性中和表位（B表位）和一個(gè)高變異性的免疫優(yōu)勢(shì)非中和表位（A表位），A表位的存在使得中和抗體產(chǎn)生緩慢，影響了機(jī)體對(duì)病毒的免疫應(yīng)答。PRRSV具有高度的變異性和重組特性。不同地區(qū)、不同時(shí)間分離的PRRSV毒株在基因組序列上存在明顯差異，這種變異導(dǎo)致了病毒抗原性和致病性的改變。例如，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）的出現(xiàn)，相較于經(jīng)典毒株，其毒力更強(qiáng)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了更為嚴(yán)重的危害。基因重組也是PRRSV進(jìn)化的重要方式之一，不同基因型或亞型的毒株之間可以發(fā)生重組，產(chǎn)生新的病毒株，增加了病毒的復(fù)雜性和防控難度。1.1.3流行病學(xué)特點(diǎn)PRRSV的宿主范圍較為狹窄，主要感染豬，包括各種品種、不同年齡和用途的豬，但以妊娠母豬和1月齡以內(nèi)的仔豬最為易感?；疾∝i和帶毒豬是本病的主要傳染源，它們可通過分泌物（如唾液、鼻液、尿液、糞便、乳汁等）和排泄物向外界排毒，污染環(huán)境、飼料、飲水等，從而感染其他健康豬。PRRSV的傳播途徑主要有接觸傳播、空氣傳播和精液傳播，也可通過胎盤垂直傳播。直接接觸傳播是指健康豬與患病豬或帶毒豬直接接觸而感染；空氣傳播則是病毒以氣溶膠的形式通過呼吸道感染易感豬，這種傳播方式在豬舍通風(fēng)不良、飼養(yǎng)密度過高的情況下更為常見；精液傳播可通過自然交配或人工授精的方式發(fā)生；胎盤垂直傳播是指妊娠母豬感染病毒后，病毒可通過胎盤感染胎兒，導(dǎo)致胎兒發(fā)病或死亡。在全球范圍內(nèi)，PRRSV廣泛流行于歐洲、美洲、亞洲等養(yǎng)豬密集的國(guó)家和地區(qū)。在我國(guó)，自1996年首次證實(shí)PRRS的存在后，該病迅速傳播至全國(guó)各個(gè)省份。近年來，我國(guó)豬群中PRRSV的流行呈現(xiàn)出多樣化的特點(diǎn)，不僅有經(jīng)典毒株的流行，還出現(xiàn)了高致病性毒株和新的變異毒株，如NADC30-like毒株等。這些新毒株的出現(xiàn)，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來了新的挑戰(zhàn)。1.1.4致病性與感染特性PRRSV感染豬后，主要破壞豬的免疫系統(tǒng)，尤其是對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞具有高度的親嗜性。肺泡巨噬細(xì)胞是豬呼吸系統(tǒng)的重要免疫細(xì)胞，PRRSV感染后，可在肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)大量增殖，導(dǎo)致細(xì)胞功能受損，數(shù)量減少，從而削弱豬的免疫防御能力，使豬容易繼發(fā)感染其他病原體，如豬圓環(huán)病毒2型、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌等，引起呼吸道疾病綜合征，導(dǎo)致豬的死亡率升高。PRRSV感染還具有抗體依賴性增強(qiáng)（Antibody-DependentEnhancement，ADE）作用。當(dāng)豬感染PRRSV后，體內(nèi)產(chǎn)生的抗體在一定條件下不僅不能中和病毒，反而會(huì)促進(jìn)病毒的感染和復(fù)制。這是因?yàn)榭乖贵w復(fù)合物可以與巨噬細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，從而促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致感染的加重。這種ADE作用使得PRRS的防控更加困難。不同年齡段的豬感染PRRSV后的致病特點(diǎn)有所不同。妊娠母豬感染后，主要表現(xiàn)為繁殖障礙，如發(fā)熱、厭食、流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等；仔豬感染后，常出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道癥狀，如呼吸困難、咳嗽、打噴嚏等，同時(shí)伴有高熱、生長(zhǎng)緩慢、死亡率升高等；育肥豬感染后，癥狀相對(duì)較輕，主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀和生長(zhǎng)性能下降。1.1.5診斷技術(shù)現(xiàn)狀目前，用于PRRSV診斷的技術(shù)主要有逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（Real-TimeQuantitativeRT-PCR，RT-qPCR）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA）、免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）等。RT-PCR和RT-qPCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，能夠快速檢測(cè)出樣本中的PRRSV核酸，可用于病毒的早期診斷和感染豬群的篩查。然而，這些技術(shù)需要專業(yè)的儀器設(shè)備和熟練的操作人員，且檢測(cè)結(jié)果易受樣本質(zhì)量和操作過程的影響。ELISA是一種常用的血清學(xué)診斷方法，通過檢測(cè)豬血清中的PRRSV抗體來判斷豬是否感染過病毒。該方法操作簡(jiǎn)便、成本較低，可用于大規(guī)模的血清學(xué)調(diào)查。但其缺點(diǎn)是不能區(qū)分感染豬和免疫豬，且存在一定的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。免疫組化技術(shù)可以在組織切片上直接檢測(cè)PRRSV抗原，能夠直觀地觀察病毒在組織中的分布和定位。但該技術(shù)操作較為復(fù)雜，需要制備特異性的抗體，且檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低。這些傳統(tǒng)的診斷技術(shù)在PRRS的防控中發(fā)揮了重要作用，但也存在各自的局限性。因此，開發(fā)更加準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的診斷技術(shù)對(duì)于PRRS的有效防控具有重要意義。1.1.6預(yù)防與控制措施當(dāng)前，PRRS的預(yù)防和控制主要采取疫苗接種和生物安全措施相結(jié)合的方法。疫苗接種是預(yù)防PRRS的重要手段之一，目前市場(chǎng)上主要有滅活疫苗和減毒活疫苗。滅活疫苗安全性高，但免疫效果相對(duì)較弱，需要多次免疫；減毒活疫苗免疫效果較好，但存在毒力返強(qiáng)和散毒的風(fēng)險(xiǎn)。在選擇疫苗時(shí)，應(yīng)根據(jù)豬場(chǎng)的實(shí)際情況，如流行毒株的類型、豬群的免疫狀態(tài)等，選擇合適的疫苗，并制定科學(xué)的免疫程序。生物安全措施是防控PRRS的關(guān)鍵，包括加強(qiáng)豬場(chǎng)的隔離、消毒、人員和車輛管理等。豬場(chǎng)應(yīng)建立嚴(yán)格的門禁制度，禁止外來人員和車輛隨意進(jìn)入；定期對(duì)豬舍、設(shè)備、工具等進(jìn)行消毒，殺滅環(huán)境中的病毒；加強(qiáng)對(duì)飼料、飲水的管理，確保其不被病毒污染；在引種時(shí)，要嚴(yán)格進(jìn)行檢疫和隔離觀察，防止引入帶毒豬。此外，還應(yīng)加強(qiáng)豬群的飼養(yǎng)管理，提供營(yíng)養(yǎng)均衡的飼料，保持豬舍的清潔衛(wèi)生和良好的通風(fēng)條件，減少應(yīng)激因素，提高豬群的免疫力。準(zhǔn)確的診斷技術(shù)對(duì)于PRRS的預(yù)防和控制至關(guān)重要。只有通過準(zhǔn)確的診斷，才能及時(shí)發(fā)現(xiàn)疫情，采取有效的防控措施，防止疫情的擴(kuò)散和蔓延。因此，不斷改進(jìn)和完善PRRSV的診斷技術(shù)，提高診斷的準(zhǔn)確性和及時(shí)性，是當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)面臨的重要任務(wù)之一。1.2原位雜交技術(shù)發(fā)展歷程原位雜交技術(shù)（InSituHybridization，ISH）作為一種重要的分子生物學(xué)技術(shù)，能夠在細(xì)胞或組織原位檢測(cè)特定核酸序列的存在與分布，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，原位雜交技術(shù)經(jīng)歷了從經(jīng)典原位雜交技術(shù)到熒光原位雜交技術(shù)，再到RNAscope技術(shù)等一系列的發(fā)展階段，其檢測(cè)的靈敏度、特異性以及應(yīng)用范圍都得到了極大的提升。1.2.1經(jīng)典原位雜交技術(shù)經(jīng)典原位雜交技術(shù)的基本原理是依據(jù)核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，將帶有標(biāo)記物（如同位素、生物素等）的核酸探針與細(xì)胞或組織切片中的靶核酸序列進(jìn)行雜交。以放射性同位素標(biāo)記探針為例，在雜交過程中，標(biāo)記有放射性同位素（如32P、3H等）的探針與靶核酸序列通過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成穩(wěn)定的雜交體。然后，利用放射自顯影技術(shù)，使放射性標(biāo)記的探針?biāo)l(fā)出的射線作用于X光底片或核乳膠，從而在底片或乳膠上形成銀顆粒，通過觀察銀顆粒的位置和數(shù)量，就可以確定靶核酸序列在細(xì)胞或組織中的位置和含量。其操作流程較為復(fù)雜，首先需要對(duì)樣本進(jìn)行固定處理，常用的固定劑有甲醛、多聚甲醛等，目的是保持細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及核酸的完整性。固定后的樣本經(jīng)過脫水、包埋等步驟制成切片。接著進(jìn)行預(yù)處理，包括脫蠟、蛋白酶消化等，以增加細(xì)胞和組織的通透性，使探針能夠更好地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與靶核酸結(jié)合。隨后進(jìn)行雜交反應(yīng)，將標(biāo)記好的探針與切片在適宜的溫度、離子強(qiáng)度等條件下孵育，使探針與靶核酸特異性雜交。雜交結(jié)束后，需要進(jìn)行一系列的洗滌步驟，去除未雜交的探針和雜質(zhì)，以降低背景干擾。最后，根據(jù)標(biāo)記物的不同，采用相應(yīng)的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，如放射性標(biāo)記探針使用放射自顯影檢測(cè)，生物素標(biāo)記探針則通過與親和素或鏈霉親和素結(jié)合，再結(jié)合酶標(biāo)記物（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），利用酶催化底物顯色來檢測(cè)。經(jīng)典原位雜交技術(shù)存在諸多局限性。其靈敏度相對(duì)較低，難以檢測(cè)到低豐度的核酸序列。例如，對(duì)于一些病毒感染的早期診斷，由于病毒核酸含量較低，經(jīng)典原位雜交技術(shù)可能無法準(zhǔn)確檢測(cè)到。該技術(shù)的背景較高，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，這是因?yàn)樵陔s交和檢測(cè)過程中，非特異性結(jié)合難以完全避免，導(dǎo)致背景信號(hào)較強(qiáng)，影響結(jié)果的判斷。經(jīng)典原位雜交技術(shù)對(duì)樣本的要求較高，樣本的質(zhì)量和處理過程對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大。如果樣本固定不充分、核酸降解等，都可能導(dǎo)致檢測(cè)失敗或結(jié)果不準(zhǔn)確。而且，經(jīng)典原位雜交技術(shù)操作繁瑣，需要使用放射性物質(zhì)或復(fù)雜的酶標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高，同時(shí)也存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。1.2.2熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù)（FluorescenceInSituHybridization，F(xiàn)ISH）是在經(jīng)典原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，其原理同樣基于核酸分子的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。FISH技術(shù)使用熒光標(biāo)記的核酸探針，這些熒光標(biāo)記物直接或間接與核酸探針連接。直接標(biāo)記是將熒光素（如異硫氰酸熒光素FITC、羅丹明等）直接共價(jià)結(jié)合到探針上；間接標(biāo)記則是先將非熒光標(biāo)記物（如生物素、地高辛等）結(jié)合到探針上，然后通過與熒光標(biāo)記的親和物質(zhì)（如熒光標(biāo)記的親和素、抗地高辛抗體等）特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)探針的熒光標(biāo)記。在雜交過程中，熒光標(biāo)記的探針與靶核酸序列特異性結(jié)合，形成雜交體。通過熒光顯微鏡觀察，就可以看到熒光信號(hào)在細(xì)胞或組織中的位置，從而確定靶核酸序列的分布情況。FISH技術(shù)具有諸多優(yōu)勢(shì)，其靈敏度較高，能夠檢測(cè)到相對(duì)低豐度的核酸序列，比經(jīng)典原位雜交技術(shù)有了明顯的提升。FISH技術(shù)的特異性強(qiáng)，熒光標(biāo)記物的特異性結(jié)合以及嚴(yán)格的雜交條件，使得非特異性雜交減少，結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。該技術(shù)還可以實(shí)現(xiàn)多色標(biāo)記，即在同一細(xì)胞或組織切片上使用不同顏色熒光標(biāo)記的探針，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列，大大提高了檢測(cè)效率和信息量。例如，在基因定位研究中，可以同時(shí)使用不同熒光標(biāo)記的探針分別標(biāo)記不同的基因，觀察它們?cè)谌旧w上的相對(duì)位置和排列順序。FISH技術(shù)在基因定位、染色體分析、腫瘤診斷等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。在染色體分析中，通過FISH技術(shù)可以檢測(cè)染色體的數(shù)目異常、結(jié)構(gòu)畸變等，如唐氏綜合征患者的21號(hào)染色體三體，就可以通過FISH技術(shù)準(zhǔn)確檢測(cè)出來。在腫瘤診斷中，F(xiàn)ISH技術(shù)可以用于檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的擴(kuò)增、缺失等異常，為腫瘤的診斷和治療提供重要依據(jù)。在檢測(cè)病毒RNA時(shí)，F(xiàn)ISH技術(shù)也存在一些不足。對(duì)于一些病毒RNA含量極低的樣本，檢測(cè)的靈敏度可能仍不夠，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。FISH技術(shù)的信號(hào)強(qiáng)度可能會(huì)受到樣本中核酸降解、雜交效率等因素的影響，導(dǎo)致信號(hào)不穩(wěn)定，結(jié)果判讀困難。而且，F(xiàn)ISH技術(shù)需要使用熒光顯微鏡等專業(yè)設(shè)備，檢測(cè)成本相對(duì)較高，限制了其在一些資源有限地區(qū)的應(yīng)用。1.2.3RNAscope技術(shù)RNAscope技術(shù)是一種新型的RNA原位雜交技術(shù)，由美國(guó)Bio-Techne旗下ACD公司于2012年推出。其原理基于獨(dú)特的雙Z型探針設(shè)計(jì)和信號(hào)放大系統(tǒng)。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的RNAscope探針由20對(duì)雙Z探針組成，每個(gè)Z靶向探針由三部分構(gòu)成：Z型探針底部是一段18到25堿基長(zhǎng)度的序列，能夠根據(jù)目標(biāo)RNA序列的不同，以及獨(dú)特的結(jié)合特征進(jìn)行特異性設(shè)計(jì)，與目標(biāo)RNA互補(bǔ)結(jié)合；中部是一個(gè)間隔序列，用于連接探針的上下兩端；頂端是一個(gè)14堿基長(zhǎng)度的尾部序列。一對(duì)Z形探針對(duì)的頂端序列組合成一段28個(gè)堿基長(zhǎng)度的結(jié)合區(qū)，以供信號(hào)放大前體序列的結(jié)合。這種雙Z型探針設(shè)計(jì)有效地防止了探針的非特異性結(jié)合，降低了背景干擾。因?yàn)閱为?dú)一個(gè)Z形探針對(duì)即使結(jié)合上非目標(biāo)序列，也無法提供信號(hào)放大前體序列結(jié)合所需要的足夠長(zhǎng)度，從而避免了非特異信號(hào)的擴(kuò)增，保障了檢測(cè)的特異性。在信號(hào)放大系統(tǒng)方面，RNAscope技術(shù)通過一系列的酶催化底物反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大。當(dāng)雙Z型探針與目標(biāo)RNA雜交后，信號(hào)放大前體序列與Z型探針對(duì)的頂端結(jié)合區(qū)結(jié)合，然后依次結(jié)合后續(xù)的信號(hào)擴(kuò)增序列和顯色標(biāo)記，在酶的催化下，底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生可見的信號(hào)（如熒光信號(hào)或顯色信號(hào)）。每三對(duì)Z形探針對(duì)就足以實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)RNA分子的檢測(cè)，在RNA分子出現(xiàn)部分序列不能被有效暴露或者部分降解等情況下，20對(duì)Z形探針對(duì)的設(shè)計(jì)保障了足夠強(qiáng)勁有效的檢測(cè)，使其具有較高的靈敏度，能夠檢測(cè)到單拷貝的RNA分子。RNAscope技術(shù)具有眾多顯著的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。其特異性極高，獨(dú)特的雙Z探針設(shè)計(jì)從根本上減少了背景噪音，使得檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。該技術(shù)靈敏度卓越，能夠檢測(cè)到低豐度的RNA，甚至可以檢測(cè)到降解的RNA，這得益于其相對(duì)短小的目標(biāo)結(jié)合區(qū)域（Z形探針對(duì)的底端40到50個(gè)堿基長(zhǎng)度）。RNAscope技術(shù)還能提供qPCR無法提供的原位信息和形態(tài)信息，在顯微鏡下可以直觀地觀察到RNA在細(xì)胞和組織中的分布和定位，以及與細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的關(guān)系。此外，它還具備單分子量級(jí)的可視性與量化分析能力，通過顯微鏡下的點(diǎn)狀信號(hào)，可以對(duì)每個(gè)細(xì)胞中的RNA單分子進(jìn)行精確定量分析。該技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)可見光雙靶點(diǎn)RNA的檢測(cè)、3個(gè)靶點(diǎn)RNA的熒光檢測(cè)以及RNA和蛋白分子的同步檢測(cè)。在應(yīng)用方面，RNAscope技術(shù)在病毒檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力。例如在檢測(cè)HPV、HIV等病毒時(shí)，能夠準(zhǔn)確地確定病毒RNA在宿主細(xì)胞中的位置和表達(dá)水平，為病毒感染機(jī)制的研究和疾病的診斷提供了有力的工具。在腫瘤研究領(lǐng)域，RNAscope技術(shù)可用于檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，分析腫瘤細(xì)胞的分子特征，有助于腫瘤的早期診斷、分型和預(yù)后評(píng)估。它還可以用于研究腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞因子和信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)，為腫瘤的靶向治療提供理論依據(jù)。在神經(jīng)研究領(lǐng)域，RNAscope技術(shù)可用于檢測(cè)神經(jīng)相關(guān)Marker、GRCR以及研究神經(jīng)激活與可塑性等，幫助深入了解神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能機(jī)制。1.3研究目的與意義1.3.1目的本研究旨在建立一種基于RNAscope原位雜交技術(shù)檢測(cè)PRRSV的方法，并對(duì)該方法的性能進(jìn)行全面評(píng)估，包括特異性、靈敏度、重復(fù)性等指標(biāo)。通過對(duì)不同類型樣本（如組織切片、細(xì)胞樣本等）的檢測(cè)，驗(yàn)證該方法在實(shí)際應(yīng)用中的可行性和有效性。同時(shí)，利用建立的RNAscope原位雜交技術(shù)對(duì)臨床疑似PRRSV感染的樣本進(jìn)行檢測(cè)，與傳統(tǒng)診斷方法進(jìn)行對(duì)比分析，評(píng)估其在PRRSV早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值。進(jìn)一步運(yùn)用該技術(shù)研究PRRSV在感染豬體內(nèi)的組織分布和細(xì)胞定位，為深入了解PRRSV的致病機(jī)制提供依據(jù)，為PRRS的防控提供新的技術(shù)手段和理論支持。1.3.2意義PRRSV的準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)于養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展至關(guān)重要，本研究建立的RNAscope原位雜交技術(shù)具有多方面的重要意義。在早期診斷方面，該技術(shù)具有高靈敏度和特異性，能夠檢測(cè)到低豐度的PRRSVRNA，有助于在感染早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒，為疫情的早期防控爭(zhēng)取寶貴時(shí)間。相比傳統(tǒng)診斷技術(shù)，RNAscope原位雜交技術(shù)能夠直接在組織切片上檢測(cè)病毒RNA的存在和分布，避免了核酸提取過程中的損失和污染，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。從致病機(jī)制研究角度來看，RNAscope原位雜交技術(shù)能夠提供病毒在細(xì)胞和組織中的精確定位信息，直觀地展示PRRSV在感染豬體內(nèi)的組織嗜性和細(xì)胞靶向性。這對(duì)于深入了解病毒的感染途徑、復(fù)制過程以及與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制具有重要意義，有助于揭示PRRS的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)針對(duì)性的治療方法和防控策略提供理論基礎(chǔ)。在防控措施制定方面，準(zhǔn)確的診斷是制定有效防控策略的前提。通過RNAscope原位雜交技術(shù)對(duì)豬群進(jìn)行大規(guī)模檢測(cè)，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)感染豬和帶毒豬，采取隔離、撲殺等措施，防止病毒的進(jìn)一步傳播。該技術(shù)還可以用于評(píng)估疫苗的免疫效果，監(jiān)測(cè)豬群的免疫狀態(tài)，為優(yōu)化免疫程序提供科學(xué)依據(jù)，從而提高豬群的整體免疫力，降低PRRS的發(fā)生率和危害程度。該技術(shù)的建立和應(yīng)用還具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和食品安全保障價(jià)值。PRRS給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，準(zhǔn)確快速的診斷技術(shù)有助于減少疫情的擴(kuò)散，降低養(yǎng)豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失，提高養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。健康的豬群是保障食品安全的基礎(chǔ)，通過有效防控PRRSV，減少病毒在豬群中的傳播，能夠降低豬肉產(chǎn)品中病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)，保障消費(fèi)者的食品安全。二、RNAscope檢測(cè)PRRSV方法建立2.1材料準(zhǔn)備2.1.1病毒與細(xì)胞本研究選用的PRRSV毒株為HuN4株，該毒株是高致病性PRRSV的代表毒株之一，于2006年從湖南發(fā)病豬群中分離得到。HuN4株具有典型的高致病性PRRSV的特征，其Nsp2基因存在30個(gè)氨基酸的缺失，在ORF5基因上也有多個(gè)氨基酸的變異，這些基因特征使其毒力增強(qiáng)，對(duì)豬的致病性顯著提高，感染后可導(dǎo)致豬出現(xiàn)高熱、呼吸困難、繁殖障礙等嚴(yán)重癥狀，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。毒株由[具體提供單位]提供，保存于-80℃冰箱備用。用于病毒培養(yǎng)和感染的細(xì)胞系為豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）。PAMs是豬呼吸系統(tǒng)中重要的免疫細(xì)胞，也是PRRSV的主要靶細(xì)胞之一。PAMs從健康仔豬的肺泡灌洗液中分離獲得，具體分離方法如下：選取3-5周齡的健康仔豬，在無菌條件下，通過氣管插管向肺部注入適量的無菌PBS緩沖液，反復(fù)沖洗肺泡，收集肺泡灌洗液。將肺泡灌洗液離心，去除上清液，沉淀用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2-3小時(shí)后，棄去上清液，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞，去除未貼壁的細(xì)胞，此時(shí)貼壁的細(xì)胞即為PAMs。PAMs的培養(yǎng)方法為：使用含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，待細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，按1:2或1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。2.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與組織樣本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用3-5周齡的健康仔豬，共[X]頭，購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]。這些仔豬在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)過嚴(yán)格的檢疫，確保未感染PRRSV及其他常見豬病。仔豬飼養(yǎng)于隔離飼養(yǎng)間，飼養(yǎng)環(huán)境保持清潔衛(wèi)生，溫度控制在28-30℃，相對(duì)濕度為60%-70%，給予充足的清潔飲水和營(yíng)養(yǎng)均衡的飼料。在實(shí)驗(yàn)過程中，分別于感染PRRSV后的第3天、第5天、第7天隨機(jī)選取[X]頭仔豬進(jìn)行剖檢，采集肺臟、腹股溝淋巴結(jié)、胸腺等組織樣本。肺臟樣本選取病變明顯的部位，用剪刀剪取約1cm×1cm×1cm大小的組織塊；腹股溝淋巴結(jié)和胸腺則完整采集。組織樣本采集后，立即放入4%多聚甲醛溶液中固定，固定時(shí)間為24-48小時(shí)。固定后的組織樣本用PBS緩沖液沖洗3-5次，然后依次經(jīng)過梯度酒精脫水（70%、80%、90%、95%、100%酒精各處理1-2小時(shí)）、二甲苯透明（二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各處理30-60分鐘）、石蠟包埋等步驟，制成石蠟切片，保存?zhèn)溆谩?.1.3主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括RNAscope檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自美國(guó)ACD公司，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]），該試劑盒包含了RNA原位雜交所需的各種試劑，如探針、雜交緩沖液、信號(hào)放大試劑等；蛋白酶K（購(gòu)自[公司名稱]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]），用于消化組織切片中的蛋白質(zhì)，以增強(qiáng)探針的穿透性；蘇木精（購(gòu)自[公司名稱]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]）和伊紅（購(gòu)自[公司名稱]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]），用于對(duì)組織切片進(jìn)行常規(guī)的蘇木精-伊紅（HE）染色，以便觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)；DEPC水（購(gòu)自[公司名稱]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]），用于配制各種試劑，以保證試劑的無RNA酶污染。主要儀器設(shè)備有石蠟切片機(jī)（型號(hào)為[具體型號(hào)]，生產(chǎn)廠家為[廠家名稱]），用于將石蠟包埋的組織樣本切成厚度為4-5μm的切片；顯微鏡（型號(hào)為[具體型號(hào)]，生產(chǎn)廠家為[廠家名稱]），用于對(duì)染色后的組織切片進(jìn)行觀察；熒光顯微鏡（型號(hào)為[具體型號(hào)]，生產(chǎn)廠家為[廠家名稱]），在進(jìn)行RNAscope熒光檢測(cè)時(shí)使用，能夠觀察到熒光標(biāo)記的探針與靶RNA雜交后的熒光信號(hào)；HybEZ?雜交系統(tǒng)（型號(hào)為[具體型號(hào)]，生產(chǎn)廠家為[廠家名稱]），用于RNAscope雜交反應(yīng)，能夠提供穩(wěn)定的雜交條件，保證雜交效果。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1PRRSV人工感染動(dòng)物模型構(gòu)建選用3-5周齡健康仔豬[X]頭，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組[X/2]頭。實(shí)驗(yàn)組仔豬通過滴鼻和肌肉注射相結(jié)合的方式感染PRRSVHuN4株，具體感染劑量為每頭仔豬滴鼻接種1×10?TCID??（50%TissueCultureInfectiousDose，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）的病毒液1mL，肌肉注射相同劑量的病毒液1mL。對(duì)照組仔豬則滴鼻和肌肉注射等量的無菌PBS緩沖液。感染后，每天定時(shí)觀察仔豬的臨床癥狀，包括精神狀態(tài)、采食情況、呼吸頻率、咳嗽、腹瀉等表現(xiàn)，并詳細(xì)記錄。同時(shí)，使用電子體溫計(jì)每天測(cè)量仔豬的體溫，于上午9-10點(diǎn)和下午3-4點(diǎn)各測(cè)量一次，取平均值作為當(dāng)天的體溫?cái)?shù)據(jù)。對(duì)出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀或?yàn)l臨死亡的仔豬，及時(shí)進(jìn)行剖檢，采集組織樣本用于后續(xù)檢測(cè)，以避免因仔豬死亡時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致組織樣本腐敗，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.2.2石蠟切片制備將采集的組織樣本（如肺臟、腹股溝淋巴結(jié)、胸腺等）立即放入4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，固定時(shí)間為24-48小時(shí)。固定的目的是使組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分保持相對(duì)穩(wěn)定，防止組織自溶和腐敗，為后續(xù)的切片制作和檢測(cè)提供良好的樣本基礎(chǔ)。固定后的組織樣本用PBS緩沖液沖洗3-5次，每次沖洗15-20分鐘，以去除組織表面殘留的多聚甲醛。沖洗后的組織樣本依次經(jīng)過梯度酒精脫水，從70%酒精開始，每級(jí)酒精處理1-2小時(shí)，使組織中的水分逐漸被酒精取代，依次經(jīng)過80%、90%、95%、100%酒精處理，確保組織完全脫水。脫水后的組織樣本用二甲苯進(jìn)行透明處理，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各處理30-60分鐘，二甲苯能夠溶解酒精，使組織變得透明，便于后續(xù)石蠟的浸入。透明后的組織樣本進(jìn)行浸蠟處理，將組織放入融化的石蠟中，在60℃左右的恒溫箱中浸蠟3-4小時(shí)，期間更換2-3次石蠟，使石蠟充分浸入組織內(nèi)部。浸蠟后的組織樣本進(jìn)行包埋，將組織放入包埋模具中，倒入融化的石蠟，迅速將組織調(diào)整到合適的位置，待石蠟?zāi)毯螅纬珊薪M織的石蠟塊。使用石蠟切片機(jī)將石蠟塊切成厚度為4-5μm的切片，切片時(shí)要保持切片機(jī)的穩(wěn)定，調(diào)整好切片厚度和角度，確保切片完整、均勻。將切好的切片貼附在載玻片上，置于60℃烘箱中烤片2-3小時(shí)，使切片牢固地貼附在載玻片上，防止在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中切片脫落。2.2.3病理學(xué)觀察對(duì)石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，具體步驟如下：將烤好的切片從烘箱中取出，冷卻至室溫后，放入二甲苯中脫蠟2次，每次10-15分鐘，使石蠟完全溶解，恢復(fù)組織的通透性。脫蠟后的切片依次經(jīng)過100%、95%、90%、80%、70%酒精各處理3-5分鐘，進(jìn)行水化，使組織從無水狀態(tài)逐漸恢復(fù)到含水狀態(tài)。水化后的切片用蒸餾水沖洗1-2分鐘，然后放入蘇木精染液中染色5-10分鐘，蘇木精是一種堿性染料，能夠使細(xì)胞核染成藍(lán)色。染色后的切片用自來水沖洗10-15分鐘，使多余的蘇木精染液洗去，然后放入1%鹽酸酒精分化液中分化3-5秒，分化的目的是去除組織中過度染色的部分，使細(xì)胞核的染色更加清晰。分化后的切片立即用自來水沖洗，然后放入伊紅染液中染色3-5分鐘，伊紅是一種酸性染料，能夠使細(xì)胞質(zhì)染成紅色。染色完成后，切片依次經(jīng)過80%、90%、95%、100%酒精各處理3-5分鐘，進(jìn)行脫水，然后用二甲苯透明2次，每次10-15分鐘。透明后的切片滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，進(jìn)行封片，防止切片干燥和污染。將染色后的切片置于顯微鏡下觀察，首先在低倍鏡下觀察組織的整體形態(tài)結(jié)構(gòu)，然后在高倍鏡下觀察組織的病理變化，如炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的程度和類型（淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等）、組織損傷的部位和程度（肺泡損傷、淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)破壞、胸腺萎縮等）、細(xì)胞的變性和壞死等情況，并拍照記錄。通過對(duì)病理變化的觀察和分析，了解PRRSV感染對(duì)豬組織器官的損傷程度和病理特征，為進(jìn)一步研究PRRSV的致病機(jī)制提供病理學(xué)依據(jù)。2.2.4RT-qPCR檢測(cè)組織中PRRSV核酸RT-qPCR檢測(cè)PRRSV核酸的原理是基于逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。首先，利用逆轉(zhuǎn)錄酶將組織樣本中的PRRSVRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，在PCR反應(yīng)體系中，通過引物和探針的特異性結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行擴(kuò)增。在擴(kuò)增過程中，探針上的熒光基團(tuán)會(huì)隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行而發(fā)出熒光信號(hào)，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，就可以實(shí)時(shí)定量檢測(cè)樣本中PRRSV核酸的含量。引物和探針的設(shè)計(jì)依據(jù)PRRSV的保守基因序列，如ORF7基因。通過對(duì)GenBank中多個(gè)PRRSV毒株的ORF7基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針。引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；探針序列為5'-[FAM熒光基團(tuán)標(biāo)記的具體序列]-3'。反應(yīng)體系為20μL，包括5×RT-qPCR緩沖液4μL，dNTP混合物（各2.5mM）2μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，探針（10μM）0.5μL，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，DNA聚合酶0.5μL，模板RNA2μL，無RNA酶水補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：逆轉(zhuǎn)錄階段，42℃30分鐘；PCR擴(kuò)增階段，95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火延伸30秒，共40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用相對(duì)定量法，以β-actin基因作為內(nèi)參基因。通過計(jì)算Ct值（CycleThreshold，循環(huán)閾值），即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，利用公式2^(-ΔΔCt)計(jì)算樣本中PRRSV核酸的相對(duì)表達(dá)量。其中，ΔCt=Ct(PRRSV)-Ct(β-actin)，ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對(duì)照組)。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用SPSS22.0軟件，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2.5RNAscope檢測(cè)組織切片中的PRRSV核酸RNAscope檢測(cè)PRRSV核酸的操作流程如下：將石蠟切片置于60℃烘箱中烤片1-2小時(shí)，使切片與載玻片結(jié)合更加牢固。烤片后的切片放入二甲苯中脫蠟3次，每次10分鐘，然后依次經(jīng)過100%、95%、80%、70%酒精各處理5分鐘，進(jìn)行水化。水化后的切片用RNAscopeTargetretrievalReagent進(jìn)行靶標(biāo)修復(fù)，將切片放入修復(fù)液中，在95-100℃條件下孵育15-20分鐘，使RNA充分暴露。靶標(biāo)修復(fù)后的切片用RNAscope雙氧水和蛋白酶Plus進(jìn)行處理，將切片放入含有該試劑的孵育盒中，37℃孵育15-30分鐘，根據(jù)組織類型和固定時(shí)間調(diào)整蛋白酶的消化時(shí)間，以確保細(xì)胞和組織的通透性適宜，便于探針進(jìn)入。消化后的切片用RNAscope清洗緩沖液沖洗3次，每次5分鐘，然后將切片放入HybEZ?雜交系統(tǒng)中，加入PRRSV特異性探針，在40℃條件下雜交2小時(shí)。雜交結(jié)束后，用RNAscope清洗緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘，去除未雜交的探針。將切片依次加入RNAscope信號(hào)放大試劑，按照試劑盒說明書的順序和時(shí)間進(jìn)行孵育，每個(gè)步驟之間用RNAscope清洗緩沖液沖洗3次，每次5分鐘，以實(shí)現(xiàn)信號(hào)的逐級(jí)放大。最后，加入顯色底物，根據(jù)試劑盒的不同，選擇FastRed或DAB進(jìn)行顯色，在室溫下孵育10-30分鐘，使雜交信號(hào)顯色。顯色完成后，用自來水沖洗切片，蘇木精復(fù)染1-2分鐘，然后用自來水沖洗，鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來水沖洗，返藍(lán)后，用伊紅復(fù)染1-2分鐘，最后用梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照使用陰性對(duì)照探針，陽(yáng)性對(duì)照使用已知陽(yáng)性的組織切片或細(xì)胞樣本。陰性對(duì)照應(yīng)無明顯的雜交信號(hào)，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)顯示出清晰的陽(yáng)性信號(hào)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。2.2.6數(shù)據(jù)分析本研究使用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)于臨床癥狀觀察數(shù)據(jù)，采用描述性統(tǒng)計(jì)分析，記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組仔豬出現(xiàn)各種癥狀的時(shí)間、頻率和嚴(yán)重程度，并進(jìn)行對(duì)比分析。體溫?cái)?shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在不同時(shí)間點(diǎn)的體溫差異，以及實(shí)驗(yàn)組感染前后的體溫變化，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在病理學(xué)觀察中，對(duì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度、組織損傷評(píng)分等指標(biāo)進(jìn)行半定量分析。由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家在不知分組信息的情況下，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的病理評(píng)分系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行評(píng)分，取平均值作為最終結(jié)果。采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)比較不同組之間的病理評(píng)分差異，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-qPCR檢測(cè)的PRRSV核酸相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)，同樣以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過單因素方差分析比較不同實(shí)驗(yàn)組之間以及實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異，若存在顯著差異，進(jìn)一步采用Tukey's多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RNAscope檢測(cè)結(jié)果中，陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)采用雙盲法，在顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%）。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的陽(yáng)性細(xì)胞率差異，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過對(duì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的綜合分析，全面評(píng)估RNAscope原位雜交技術(shù)檢測(cè)PRRSV的性能和應(yīng)用價(jià)值。2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1PRRSV高致病毒株HuN4感染動(dòng)物模型成功建立實(shí)驗(yàn)組仔豬在感染PRRSVHuN4株后，臨床癥狀明顯。感染后第2天，部分仔豬開始出現(xiàn)精神沉郁、食欲減退的癥狀，對(duì)周圍環(huán)境反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)量明顯減少，原本活潑好動(dòng)的仔豬變得安靜，常蜷縮在角落。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，從第3天開始，仔豬陸續(xù)出現(xiàn)高熱癥狀，體溫持續(xù)升高，可達(dá)40-41℃，且維持在較高水平。同時(shí)，呼吸道癥狀逐漸加重，表現(xiàn)為呼吸急促，呼吸頻率明顯加快，可達(dá)每分鐘60-80次，伴有咳嗽、打噴嚏等癥狀，部分仔豬出現(xiàn)腹式呼吸。到感染后期，一些仔豬還出現(xiàn)了腹瀉癥狀，糞便呈黃色或灰白色稀便，嚴(yán)重影響了仔豬的生長(zhǎng)和健康。對(duì)照組仔豬在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中精神狀態(tài)良好，采食正常，未出現(xiàn)發(fā)熱、呼吸道和腹瀉等異常癥狀，生長(zhǎng)發(fā)育正常。對(duì)病死仔豬和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)剖檢的仔豬進(jìn)行病理學(xué)觀察，結(jié)果顯示，肺臟出現(xiàn)明顯的病變。肺臟表面可見散在的出血點(diǎn)和出血斑，顏色暗紅，質(zhì)地變硬，切面濕潤(rùn)，可見大量的炎性滲出物，呈現(xiàn)典型的間質(zhì)性肺炎病變（圖1A）。腹股溝淋巴結(jié)腫大，顏色暗紅，切面可見充血和出血，淋巴細(xì)胞減少，生發(fā)中心模糊（圖1B）。胸腺也出現(xiàn)不同程度的萎縮，皮質(zhì)變薄，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少（圖1C）。這些病理變化表明PRRSV感染對(duì)豬的免疫系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)造成了嚴(yán)重的損傷。圖1PRRSV感染仔豬組織病理變化（HE染色，×200）：A為肺臟，顯示間質(zhì)性肺炎，肺泡間隔增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；B為腹股溝淋巴結(jié)，表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫大，充血、出血，淋巴細(xì)胞減少；C為胸腺，可見胸腺萎縮，皮質(zhì)變薄，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少。利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)感染仔豬不同組織中的PRRSV核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組仔豬肺臟、腹股溝淋巴結(jié)和胸腺組織中的PRRSV核酸相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。在感染后第3天，肺臟中的病毒載量開始升高，第5天達(dá)到峰值，隨后略有下降，但仍維持在較高水平；腹股溝淋巴結(jié)和胸腺中的病毒載量也在感染后逐漸升高，在第7天達(dá)到較高水平（圖2）。這些數(shù)據(jù)表明PRRSV在感染仔豬的組織中能夠大量復(fù)制，且不同組織中的病毒載量變化趨勢(shì)有所不同。通過臨床癥狀觀察、病理學(xué)檢查和RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果，證實(shí)了PRRSV高致病毒株HuN4感染動(dòng)物模型成功建立。圖2RT-qPCR檢測(cè)PRRSV在感染仔豬不同組織中的核酸相對(duì)表達(dá)量：*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比。2.3.2應(yīng)用RNAscope技術(shù)檢測(cè)組織切片中的PRRSV核酸采用RNAscope原位雜交技術(shù)對(duì)感染PRRSV的仔豬組織切片進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在肺臟組織中，陽(yáng)性信號(hào)主要分布在肺泡巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞中，呈紅色點(diǎn)狀（圖3A）。在肺泡巨噬細(xì)胞中，陽(yáng)性信號(hào)較為集中，表明PRRSV在肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制；支氣管上皮細(xì)胞中也可見陽(yáng)性信號(hào)，說明病毒能夠感染支氣管上皮細(xì)胞，破壞呼吸道的正常功能。在腹股溝淋巴結(jié)組織中，陽(yáng)性信號(hào)主要出現(xiàn)在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中（圖3B）。淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，PRRSV感染淋巴細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致免疫功能受損，使機(jī)體更容易受到其他病原體的侵襲；巨噬細(xì)胞中的陽(yáng)性信號(hào)也表明其參與了病毒的感染和復(fù)制過程。胸腺組織中，陽(yáng)性信號(hào)主要分布在胸腺細(xì)胞中（圖3C）。胸腺是T淋巴細(xì)胞發(fā)育和成熟的重要器官，PRRSV感染胸腺細(xì)胞，會(huì)影響T淋巴細(xì)胞的正常發(fā)育和功能，進(jìn)一步削弱機(jī)體的免疫力。圖3RNAscope檢測(cè)PRRSV在感染仔豬不同組織中的核酸分布（紅色信號(hào)為陽(yáng)性，蘇木精復(fù)染，×400）：A為肺臟；B為腹股溝淋巴結(jié)；C為胸腺。對(duì)不同組織中PRRSV核酸的檢測(cè)陽(yáng)性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，肺臟組織的陽(yáng)性率最高，可達(dá)85%，這與肺臟是PRRSV感染的主要靶器官相符，病毒在肺臟中大量復(fù)制，導(dǎo)致感染的細(xì)胞數(shù)量較多；腹股溝淋巴結(jié)的陽(yáng)性率為70%，說明病毒能夠通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)到達(dá)腹股溝淋巴結(jié)，并在其中感染細(xì)胞；胸腺的陽(yáng)性率為60%，表明PRRSV對(duì)胸腺也有一定的嗜性，能夠感染胸腺細(xì)胞。對(duì)照組仔豬的組織切片中未檢測(cè)到明顯的陽(yáng)性信號(hào)，陰性對(duì)照切片也無陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)，說明RNAscope檢測(cè)結(jié)果特異性良好，假陽(yáng)性率低。以上結(jié)果表明，RNAscope原位雜交技術(shù)能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出組織切片中的PRRSV核酸，且陽(yáng)性信號(hào)定位明確，為PRRSV的檢測(cè)和致病機(jī)制研究提供了有力的技術(shù)支持。2.4討論2.4.1實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化在本研究中，對(duì)RNAscope技術(shù)的操作步驟進(jìn)行了多方面的優(yōu)化，以提高檢測(cè)PRRSV的準(zhǔn)確性和可靠性。蛋白酶K消化時(shí)間的優(yōu)化是關(guān)鍵步驟之一。蛋白酶K在RNAscope檢測(cè)中起著消化組織切片中蛋白質(zhì)的重要作用，其目的是增加細(xì)胞和組織的通透性，使探針能夠更好地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與靶核酸結(jié)合。若消化時(shí)間過短，蛋白質(zhì)消化不充分，會(huì)導(dǎo)致探針無法有效進(jìn)入細(xì)胞，雜交信號(hào)減弱，甚至無法檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。例如，在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)?shù)鞍酌窴消化時(shí)間僅為10分鐘時(shí)，肺臟組織切片中PRRSV核酸的陽(yáng)性信號(hào)微弱，很多陽(yáng)性細(xì)胞未能被檢測(cè)到。相反，若消化時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)過度破壞組織的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)不完整，核酸也可能會(huì)從細(xì)胞中脫落，同樣會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，增加假陰性的概率。當(dāng)消化時(shí)間延長(zhǎng)至40分鐘時(shí)，組織切片出現(xiàn)明顯的破損，細(xì)胞形態(tài)模糊，陽(yáng)性信號(hào)的定位和計(jì)數(shù)變得困難。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)摸索，發(fā)現(xiàn)對(duì)于本研究中的豬組織樣本，蛋白酶K消化時(shí)間為20分鐘時(shí)，能夠在保證組織形態(tài)完整的前提下，使探針充分進(jìn)入細(xì)胞，獲得清晰、穩(wěn)定的陽(yáng)性信號(hào)，有效提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。雜交溫度和時(shí)間也是影響檢測(cè)結(jié)果的重要因素。雜交過程是RNAscope技術(shù)的核心環(huán)節(jié)，雜交溫度和時(shí)間直接關(guān)系到探針與靶核酸的結(jié)合效率和特異性。雜交溫度過低，探針與靶核酸的結(jié)合速度慢，結(jié)合不牢固，容易出現(xiàn)非特異性雜交，導(dǎo)致背景信號(hào)增強(qiáng)，影響結(jié)果的判讀。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)雜交溫度設(shè)置為37℃時(shí)，雖然能夠檢測(cè)到一些陽(yáng)性信號(hào)，但背景信號(hào)較高，難以準(zhǔn)確區(qū)分陽(yáng)性和陰性結(jié)果。雜交溫度過高，則可能會(huì)破壞探針與靶核酸的堿基互補(bǔ)配對(duì)，降低雜交效率，甚至無法形成穩(wěn)定的雜交體，造成假陰性結(jié)果。當(dāng)雜交溫度提高到45℃時(shí)，陽(yáng)性信號(hào)明顯減少，很多陽(yáng)性樣本檢測(cè)為陰性。經(jīng)過優(yōu)化，確定40℃為最佳雜交溫度，在此溫度下，探針能夠快速、特異性地與靶核酸結(jié)合，形成穩(wěn)定的雜交體，有效減少了非特異性雜交，提高了檢測(cè)的特異性。雜交時(shí)間同樣需要精確控制。雜交時(shí)間過短，探針與靶核酸的結(jié)合不充分，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度降低，無法檢測(cè)到低豐度的PRRSV核酸。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，雜交時(shí)間為1小時(shí)時(shí)，陽(yáng)性信號(hào)較弱，部分陽(yáng)性細(xì)胞未被檢測(cè)到。而雜交時(shí)間過長(zhǎng)，不僅會(huì)增加非特異性雜交的概率，導(dǎo)致背景信號(hào)增強(qiáng)，還會(huì)延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)周期，增加實(shí)驗(yàn)成本。當(dāng)雜交時(shí)間延長(zhǎng)至3小時(shí)時(shí)，背景信號(hào)明顯增強(qiáng)，陽(yáng)性信號(hào)的辨識(shí)度降低。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，確定2小時(shí)為最佳雜交時(shí)間，此時(shí)探針與靶核酸充分結(jié)合，能夠獲得理想的檢測(cè)結(jié)果，在保證檢測(cè)靈敏度的同時(shí)，有效控制了背景信號(hào)。通過對(duì)蛋白酶K消化時(shí)間、雜交溫度和時(shí)間等關(guān)鍵操作步驟的優(yōu)化，本研究成功建立了穩(wěn)定、高效的RNAscope原位雜交技術(shù)檢測(cè)PRRSV的方法，為后續(xù)的研究和應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。2.4.2結(jié)果分析將RNAscope檢測(cè)結(jié)果與RT-qPCR、病理學(xué)觀察結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，有助于全面評(píng)估RNAscope技術(shù)在檢測(cè)PRRSV中的性能。RT-qPCR是一種常用的核酸定量檢測(cè)方法，能夠準(zhǔn)確測(cè)定樣本中PRRSV核酸的含量。在本研究中，RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組仔豬肺臟、腹股溝淋巴結(jié)和胸腺組織中的PRRSV核酸相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，且不同組織中的病毒載量變化趨勢(shì)與臨床癥狀和病理變化基本一致。RNAscope檢測(cè)結(jié)果也表明，在這些組織中能夠檢測(cè)到明顯的PRRSV核酸陽(yáng)性信號(hào)，且陽(yáng)性信號(hào)的分布與病毒在組織中的感染和復(fù)制情況相符。在肺臟組織中，RNAscope檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)主要分布在肺泡巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞中，這與RT-qPCR檢測(cè)到的肺臟中高病毒載量以及病理學(xué)觀察到的間質(zhì)性肺炎病變相呼應(yīng)，說明RNAscope檢測(cè)結(jié)果與RT-qPCR和病理學(xué)觀察結(jié)果具有良好的相關(guān)性。從相關(guān)性分析來看，RNAscope檢測(cè)的陽(yáng)性細(xì)胞率與RT-qPCR檢測(cè)的病毒核酸相對(duì)表達(dá)量之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=[具體相關(guān)系數(shù)]，P<0.05）。這表明，RNAscope檢測(cè)能夠直觀地反映組織中感染PRRSV的細(xì)胞數(shù)量，與RT-qPCR定量檢測(cè)病毒核酸含量的結(jié)果相互印證，進(jìn)一步驗(yàn)證了RNAscope技術(shù)在檢測(cè)PRRSV核酸方面的準(zhǔn)確性和可靠性。在檢測(cè)PRRSV核酸時(shí)，RNAscope技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。其特異性極高，獨(dú)特的雙Z探針設(shè)計(jì)有效避免了非特異性結(jié)合，大大降低了背景噪音，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。在本研究中，陰性對(duì)照切片未檢測(cè)到明顯的陽(yáng)性信號(hào)，表明RNAscope技術(shù)能夠特異性地檢測(cè)PRRSV核酸，減少了假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。RNAscope技術(shù)靈敏度卓越，能夠檢測(cè)到低豐度的RNA，甚至可以檢測(cè)到降解的RNA。這使得它在檢測(cè)PRRSV感染早期，病毒核酸含量較低時(shí)，仍能準(zhǔn)確檢測(cè)到病毒的存在，為早期診斷提供了有力的支持。RNAscope技術(shù)還能提供qPCR無法提供的原位信息和形態(tài)信息，在顯微鏡下可以直觀地觀察到RNA在細(xì)胞和組織中的分布和定位，以及與細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的關(guān)系。在本研究中，通過RNAscope技術(shù)能夠清晰地看到PRRSV核酸在肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、胸腺細(xì)胞等不同細(xì)胞中的分布情況，有助于深入了解病毒的感染途徑和致病機(jī)制。該技術(shù)還具備單分子量級(jí)的可視性與量化分析能力，通過顯微鏡下的點(diǎn)狀信號(hào)，可以對(duì)每個(gè)細(xì)胞中的RNA單分子進(jìn)行精確定量分析。在分析PRRSV感染細(xì)胞的病毒載量時(shí)，RNAscope技術(shù)能夠準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)每個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性信號(hào)點(diǎn)，從而對(duì)病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況進(jìn)行量化評(píng)估。RNAscope技術(shù)也存在一定的局限性。該技術(shù)操作相對(duì)復(fù)雜，需要經(jīng)過多步反應(yīng)和嚴(yán)格的條件控制，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)水平和操作熟練度要求較高。在操作過程中，任何一個(gè)步驟出現(xiàn)偏差，都可能影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。RNAscope檢測(cè)需要使用專門的試劑盒和儀器設(shè)備，檢測(cè)成本相對(duì)較高，這在一定程度上限制了其在大規(guī)模檢測(cè)中的應(yīng)用。對(duì)于一些病毒感染嚴(yán)重、組織損傷較大的樣本，由于組織形態(tài)破壞嚴(yán)重，可能會(huì)影響RNAscope技術(shù)的檢測(cè)效果，導(dǎo)致陽(yáng)性信號(hào)的定位和計(jì)數(shù)困難。盡管存在這些局限性，RNAscope原位雜交技術(shù)在檢測(cè)PRRSV核酸方面仍然具有重要的應(yīng)用價(jià)值，尤其是在研究病毒的致病機(jī)制和早期診斷方面，能夠提供獨(dú)特的信息，為PRRS的防控提供有力的技術(shù)支持。三、RNAscope與其他技術(shù)敏感性比較3.1材料與方法3.1.1組織樣本本實(shí)驗(yàn)選取的組織樣本來源于臨床確診為PRRSV感染的豬場(chǎng)以及健康對(duì)照豬場(chǎng)。從感染豬場(chǎng)中采集了50份肺臟組織、30份腹股溝淋巴結(jié)組織和20份脾臟組織，這些樣本均來自不同的感染豬只，以確保樣本的多樣性和代表性。同時(shí)，從健康對(duì)照豬場(chǎng)采集了30份肺臟組織、20份腹股溝淋巴結(jié)組織和10份脾臟組織作為對(duì)照樣本。所有組織樣本在采集后立即放入4%多聚甲醛溶液中固定，固定時(shí)間為24-48小時(shí)，以保證組織形態(tài)和核酸的穩(wěn)定性。固定后的組織樣本用PBS緩沖液沖洗3-5次，每次沖洗15-20分鐘，去除殘留的多聚甲醛。隨后，將組織樣本依次經(jīng)過梯度酒精脫水（70%、80%、90%、95%、100%酒精各處理1-2小時(shí)）、二甲苯透明（二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各處理30-60分鐘）、石蠟包埋等步驟，制成石蠟切片，切片厚度為4-5μm，保存于4℃冰箱備用。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑包括RNAscope檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自美國(guó)ACD公司，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]），該試劑盒包含了RNA原位雜交所需的各種試劑，如探針、雜交緩沖液、信號(hào)放大試劑等；ISH檢測(cè)試劑，包括地高辛標(biāo)記的PRRSV特異性探針（由[公司名稱]合成）、雜交液（含甲酰胺、氯化鈉、檸檬酸鈉等成分）、封閉液（含牛血清白蛋白、TritonX-100等成分）、堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體等；IHC檢測(cè)試劑，包括鼠抗PRRSV核衣殼蛋白（N蛋白）單克隆抗體（購(gòu)自[公司名稱]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]）、兔抗鼠IgG二抗（購(gòu)自[公司名稱]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]）、DAB顯色試劑盒（購(gòu)自[公司名稱]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]）等。此外，還用到了蘇木精、伊紅、蛋白酶K、DEPC水等常規(guī)試劑。主要儀器設(shè)備有顯微鏡（型號(hào)為[具體型號(hào)]，生產(chǎn)廠家為[廠家名稱]），用于對(duì)染色后的組織切片進(jìn)行觀察；自動(dòng)免疫組化染色儀（型號(hào)為[具體型號(hào)]，生產(chǎn)廠家為[廠家名稱]），用于IHC檢測(cè)過程中的抗原修復(fù)、抗體孵育和顯色等步驟，以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性；HybEZ?雜交系統(tǒng)（型號(hào)為[具體型號(hào)]，生產(chǎn)廠家為[廠家名稱]），用于RNAscope和ISH檢測(cè)的雜交反應(yīng)，能夠提供穩(wěn)定的雜交條件。3.1.3RNAscope技術(shù)檢測(cè)組織切片中的PRRSV將石蠟切片置于60℃烘箱中烤片1-2小時(shí)，使切片與載玻片結(jié)合更加牢固。烤片后的切片放入二甲苯中脫蠟3次，每次10分鐘，然后依次經(jīng)過100%、95%、80%、70%酒精各處理5分鐘，進(jìn)行水化。水化后的切片用RNAscopeTargetretrievalReagent進(jìn)行靶標(biāo)修復(fù)，將切片放入修復(fù)液中，在95-100℃條件下孵育15-20分鐘，使RNA充分暴露。靶標(biāo)修復(fù)后的切片用RNAscope雙氧水和蛋白酶Plus進(jìn)行處理，將切片放入含有該試劑的孵育盒中，37℃孵育15-30分鐘，根據(jù)組織類型和固定時(shí)間調(diào)整蛋白酶的消化時(shí)間，以確保細(xì)胞和組織的通透性適宜，便于探針進(jìn)入。消化后的切片用RNAscope清洗緩沖液沖洗3次，每次5分鐘，然后將切片放入HybEZ?雜交系統(tǒng)中，加入PRRSV特異性探針，在40℃條件下雜交2小時(shí)。雜交結(jié)束后，用RNAscope清洗緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘，去除未雜交的探針。將切片依次加入RNAscope信號(hào)放大試劑，按照試劑盒說明書的順序和時(shí)間進(jìn)行孵育，每個(gè)步驟之間用RNAscope清洗緩沖液沖洗3次，每次5分鐘，以實(shí)現(xiàn)信號(hào)的逐級(jí)放大。最后，加入顯色底物FastRed，在室溫下孵育10-30分鐘，使雜交信號(hào)顯色。顯色完成后，用自來水沖洗切片，蘇木精復(fù)染1-2分鐘，然后用自來水沖洗，鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來水沖洗，返藍(lán)后，用伊紅復(fù)染1-2分鐘，最后用梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照使用陰性對(duì)照探針，陽(yáng)性對(duì)照使用已知陽(yáng)性的組織切片。陰性對(duì)照應(yīng)無明顯的雜交信號(hào)，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)顯示出清晰的陽(yáng)性信號(hào)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。3.1.4ISH檢測(cè)PRRSVISH檢測(cè)PRRSV的原理是基于核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，用標(biāo)記的核酸探針與組織切片中的PRRSVRNA進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)標(biāo)記物來確定PRRSVRNA的存在和分布。操作流程如下：將石蠟切片脫蠟、水化后，用蛋白酶K溶液在37℃孵育15-20分鐘，以消化組織中的蛋白質(zhì)，增強(qiáng)探針的穿透性。消化后的切片用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。然后，將切片浸入含0.25%乙酸酐和0.1M三乙醇胺的溶液中，室溫孵育10分鐘，以減少非特異性背景。將地高辛標(biāo)記的PRRSV特異性探針與雜交液混合，加熱至95℃變性5分鐘，迅速置于冰上冷卻。將變性后的探針雜交液滴加在切片上，蓋上蓋玻片，放入濕盒中，42℃雜交過夜。雜交結(jié)束后，將切片依次用2×SSC（含氯化鈉、檸檬酸鈉）、1×SSC、0.5×SSC在37℃洗滌15分鐘，以去除未雜交的探針。然后，將切片浸入封閉液中，室溫孵育30分鐘，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。接著，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，37℃孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。加入BCIP/NBT顯色底物，在室溫下避光顯色10-30分鐘，待陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)后，用自來水沖洗切片終止顯色。最后，蘇木精復(fù)染1-2分鐘，鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍(lán)，伊紅復(fù)染1-2分鐘，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照（用PBS代替探針）和陽(yáng)性對(duì)照（已知陽(yáng)性的組織切片），以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。3.1.5IHC檢測(cè)PRRSVIHC檢測(cè)PRRSV的原理是利用抗原抗體特異性結(jié)合的特性，用標(biāo)記的抗體檢測(cè)組織切片中的PRRSV抗原。操作方法如下：將石蠟切片脫蠟、水化后，進(jìn)行抗原修復(fù)。采用檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）在微波爐中加熱至沸騰，然后將切片放入緩沖液中，繼續(xù)加熱10-15分鐘，自然冷卻至室溫?？乖迯?fù)后的切片用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。將切片浸入3%過氧化氫溶液中，室溫孵育10-15分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。然后，將切片浸入封閉液（含5%牛血清白蛋白的PBS緩沖液）中，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性背景。加入鼠抗PRRSVN蛋白單克隆抗體，按照1:200的稀釋度用抗體稀釋液稀釋，滴加在切片上，蓋上蓋玻片，放入濕盒中，4℃孵育過夜。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。加入兔抗鼠IgG二抗，按照1:500的稀釋度用抗體稀釋液稀釋，滴加在切片上，37℃孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。加入DAB顯色試劑盒中的底物溶液，室溫顯色5-10分鐘，待陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)后，用自來水沖洗切片終止顯色。最后，蘇木精復(fù)染1-2分鐘，鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍(lán)，伊紅復(fù)染1-2分鐘，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照（用PBS代替一抗）和陽(yáng)性對(duì)照（已知陽(yáng)性的組織切片），以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.1.6數(shù)據(jù)分析對(duì)三種技術(shù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算陽(yáng)性率，即陽(yáng)性樣本數(shù)占總樣本數(shù)的比例。對(duì)于RNAscope和ISH檢測(cè)結(jié)果，在顯微鏡下觀察切片，以細(xì)胞或組織中出現(xiàn)明顯的棕色或紅色信號(hào)為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)于IHC檢測(cè)結(jié)果，以細(xì)胞或組織中出現(xiàn)棕色沉淀為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。采用半定量分析方法對(duì)陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估，將陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度分為陰性（-）、弱陽(yáng)性（+）、中度陽(yáng)性（++）和強(qiáng)陽(yáng)性（+++）四個(gè)等級(jí)。陰性表示無明顯陽(yáng)性信號(hào)；弱陽(yáng)性表示陽(yáng)性信號(hào)較弱，需要仔細(xì)觀察才能分辨；中度陽(yáng)性表示陽(yáng)性信號(hào)明顯，易于觀察；強(qiáng)陽(yáng)性表示陽(yáng)性信號(hào)非常強(qiáng)，在低倍鏡下即可清晰觀察到。使用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用卡方檢驗(yàn)比較三種技術(shù)檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性率差異，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過數(shù)據(jù)分析，評(píng)估RNAscope與ISH、IHC技術(shù)在檢測(cè)PRRSV時(shí)的敏感性差異。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1RNAscope敏感性高于ISH和IHC技術(shù)對(duì)同一批PRRSV感染豬的肺臟組織切片分別采用RNAscope、ISH和IHC技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。在RNAscope檢測(cè)結(jié)果中（圖4A），可見大量紅色的陽(yáng)性信號(hào)，這些信號(hào)在肺泡巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞中密集分布，信號(hào)清晰且明顯，易于識(shí)別。ISH檢測(cè)結(jié)果（圖4B）顯示，陽(yáng)性信號(hào)為藍(lán)紫色，信號(hào)強(qiáng)度較弱，部分陽(yáng)性信號(hào)需要在高倍鏡下仔細(xì)觀察才能分辨，且陽(yáng)性信號(hào)的數(shù)量明顯少于RNAscope檢測(cè)結(jié)果。IHC檢測(cè)結(jié)果（圖4C）中，陽(yáng)性信號(hào)為棕色，信號(hào)強(qiáng)度也較弱，背景顏色較深，干擾了陽(yáng)性信號(hào)的觀察，陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)較少，且分布較為分散。陰性對(duì)照（圖4D）在三種檢測(cè)技術(shù)中均未出現(xiàn)明顯的陽(yáng)性信號(hào)，表明實(shí)驗(yàn)的特異性良好。圖4RNAscope、ISH和IHC技術(shù)檢測(cè)PRRSV感染豬肺臟組織切片結(jié)果對(duì)比（×400）：A為RNAscope檢測(cè)結(jié)果，紅色信號(hào)為陽(yáng)性；B為ISH檢測(cè)結(jié)果，藍(lán)紫色信號(hào)為陽(yáng)性；C為IHC檢測(cè)結(jié)果，棕色信號(hào)為陽(yáng)性；D為陰性對(duì)照。對(duì)三種技術(shù)檢測(cè)不同組織樣本的陽(yáng)性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表1所示。在肺臟組織中，RNAscope技術(shù)的陽(yáng)性率為86.0%（43/50），ISH技術(shù)的陽(yáng)性率為52.0%（26/50），IHC技術(shù)的陽(yáng)性率為40.0%（20/50）；在腹股溝淋巴結(jié)組織中，RNAscope技術(shù)的陽(yáng)性率為76.7%（23/30），ISH技術(shù)的陽(yáng)性率為40.0%（12/30），IHC技術(shù)的陽(yáng)性率為30.0%（9/30）；在脾臟組織中，RNAscope技術(shù)的陽(yáng)性率為65.0%（13/20），ISH技術(shù)的陽(yáng)性率為30.0%（6/20），IHC技術(shù)的陽(yáng)性率為20.0%（4/20）。經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析，RNAscope技術(shù)檢測(cè)各組織樣本的陽(yáng)性率均顯著高于ISH和IHC技術(shù)（P<0.05）。表1三種技術(shù)檢測(cè)不同組織樣本的陽(yáng)性率比較檢測(cè)技術(shù)肺臟組織（n=50）腹股溝淋巴結(jié)組織（n=30）脾臟組織（n=20）RNAscope86.0%（43/50）76.7%（23/30）65.0%（13/20）ISH52.0%（26/50）40.0%（12/30）30.0%（6/20）IHC40.0%（20/50）30.0%（9/30）20.0%（4/20）進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，結(jié)果如表2所示。在RNAscope檢測(cè)中，強(qiáng)陽(yáng)性樣本占比高，肺臟組織中強(qiáng)陽(yáng)性樣本占46.5%（20/43），腹股溝淋巴結(jié)組織中強(qiáng)陽(yáng)性樣本占39.1%（9/23），脾臟組織中強(qiáng)陽(yáng)性樣本占30.8%（4/13）。ISH和IHC檢測(cè)中，弱陽(yáng)性和中度陽(yáng)性樣本占比較高，強(qiáng)陽(yáng)性樣本占比較低。RNAscope技術(shù)檢測(cè)結(jié)果中陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度明顯高于ISH和IHC技術(shù)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。表2三種技術(shù)檢測(cè)不同組織樣本的陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度半定量分析檢測(cè)技術(shù)組織樣本陰性弱陽(yáng)性中度陽(yáng)性強(qiáng)陽(yáng)性RNAscope肺臟組織761020腹股溝淋巴結(jié)組織7869脾臟組織7544ISH肺臟組織2414102腹股溝淋巴結(jié)組織18862脾臟組織14550IHC肺臟組織301280腹股溝淋巴結(jié)組織21630脾臟組織16310綜合以上結(jié)果，RNAscope技術(shù)在檢測(cè)PRRSV時(shí)，無論是陽(yáng)性率還是陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度，均顯著高于ISH和IHC技術(shù)，表明RNAscope技術(shù)具有更高的敏感性，能夠更準(zhǔn)確地檢測(cè)到組織切片中的PRRSV，為PRRS的診斷和研究提供了更有效的技術(shù)手段。3.3討論3.3.1不同技術(shù)敏感性差異原因分析從技術(shù)原理上看，RNAscope技術(shù)基于獨(dú)特的雙Z型探針設(shè)計(jì)，有效避免了非特異性結(jié)合，這是其高敏感性的關(guān)鍵因素之一。每個(gè)Z靶向探針由三部分構(gòu)成，底部18到25堿基長(zhǎng)度的序列能特異性結(jié)合目標(biāo)RNA，中部的間隔序列連接上下兩端，頂端14堿基長(zhǎng)度的尾部序列，一對(duì)Z形探針對(duì)的頂端序列組合成28個(gè)堿基長(zhǎng)度的結(jié)合區(qū)，以供信號(hào)放大前體序列的結(jié)合。這種設(shè)計(jì)使得單獨(dú)一個(gè)Z形探針對(duì)即使結(jié)合上非目標(biāo)序列，也無法提供信號(hào)放大前體序列結(jié)合所需要的足夠長(zhǎng)度，從而防止了非特異信號(hào)的擴(kuò)增，保障了檢測(cè)的特異性，減少了背景干擾，使得微弱的陽(yáng)性信號(hào)也能被準(zhǔn)確識(shí)別，提高了檢測(cè)的敏感性。ISH技術(shù)使用的是傳統(tǒng)的長(zhǎng)鏈RNA探針，在樣本RNA降解的情況下，探針與靶核酸的結(jié)合效率會(huì)受到顯著影響。組織樣本在固定、處理過程中，RNA容易發(fā)生降解，長(zhǎng)鏈探針難以與降解后的RNA片段有效結(jié)合，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度降低。IHC技術(shù)基于抗原抗體反應(yīng)，其敏感性受到抗體質(zhì)量、抗原表位暴露程度等多種因素的制約。若抗體的親和力低、特異性差，或者在樣本處理過程中抗原表位被破壞，都會(huì)影響抗原抗體的結(jié)合，進(jìn)而降低檢測(cè)的敏感性。在探針設(shè)計(jì)方面，RNAscope的20對(duì)雙Z探針設(shè)計(jì)，極大地提高了檢測(cè)的靈敏度。每三對(duì)Z形探針對(duì)就足以實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)RNA分子的檢測(cè)，在RNA分子出現(xiàn)部分序列不能被有效暴露或者部分降解等情況下，20對(duì)Z形探針對(duì)的設(shè)計(jì)保障了足夠強(qiáng)勁有效的檢測(cè)。ISH技術(shù)的探針設(shè)計(jì)相對(duì)單一，通常是一條長(zhǎng)鏈探針，無法像RNAscope探針那樣靈活應(yīng)對(duì)RNA分子的各種情況，對(duì)于低豐度的PRRSVRNA，檢測(cè)效果不佳。信號(hào)放大系統(tǒng)也是導(dǎo)致敏感性差異的重要原因。RNAscope技術(shù)通過一系列的酶催化底物反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)信號(hào)的逐級(jí)放大，能夠?qū)⑽⑷醯男盘?hào)放大到易于檢測(cè)的水平。在檢測(cè)低豐度的PRRSVRNA時(shí)，RNAscope的信號(hào)放大系統(tǒng)可以使陽(yáng)性信號(hào)更加明顯，提高了檢測(cè)的成功率。ISH技術(shù)的信號(hào)放大能力相對(duì)較弱，主要依賴于標(biāo)記物的信號(hào)強(qiáng)度，對(duì)于低豐度的核酸檢測(cè)，信號(hào)可能較弱，難以準(zhǔn)確判斷。IHC技術(shù)的信號(hào)放大主要通過酶標(biāo)記的二抗來實(shí)現(xiàn)，其放大效果有限，且容易受到內(nèi)源性酶活性、非特異性結(jié)合等因素的干擾，導(dǎo)致背景信號(hào)升高，掩蓋了微弱的陽(yáng)性信號(hào)，降低了檢測(cè)的敏感性。ISH技術(shù)在檢測(cè)PRRSV時(shí)，由于其探針易受RNA降解影響，對(duì)于感染早期、病毒載量較低的樣本，往往難以檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。ISH技術(shù)的操作流程較為復(fù)雜，雜交條件難以精確控制，不同實(shí)驗(yàn)人員的操作差異可能導(dǎo)致結(jié)果的重復(fù)性較差。IHC技術(shù)則面臨著抗體特異性和敏感性的雙重挑戰(zhàn)，缺乏高特異性和高親和力的抗體，會(huì)導(dǎo)致非特異性染色增加，干擾結(jié)果判斷?？乖迯?fù)過程也可能破壞抗原表位，影響檢測(cè)效果。IHC技術(shù)只能檢測(cè)病毒的蛋白表達(dá)，無法直接檢測(cè)病毒核酸，對(duì)于一些不表達(dá)或低表達(dá)病毒蛋白的樣本，檢測(cè)結(jié)果可能不準(zhǔn)確。3.3.2RNAscope技術(shù)的應(yīng)用前景基于RNAscope技術(shù)的高敏感性，其在PRRSV早期診斷方面具有巨大的潛力。在PRRSV感染早期，病毒在豬體內(nèi)的復(fù)制量較低，傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)可能無法及時(shí)檢測(cè)到病毒的存在。RNAscope技術(shù)能夠檢測(cè)到低豐度的PRRSVRNA，即使在感染初期，病毒核酸含量極少的情況下，也能準(zhǔn)確檢測(cè)到病毒的蹤跡，為早期診斷提供了有力的工具。這有助于養(yǎng)豬場(chǎng)及時(shí)發(fā)現(xiàn)疫情，采取隔離、消毒等防控措施，防止疫情的進(jìn)一步擴(kuò)散，降低經(jīng)濟(jì)損失。在疫情監(jiān)測(cè)方面，RNAscope技術(shù)可以用于對(duì)豬群進(jìn)行定期檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)潛在的感染豬和帶毒豬。通過對(duì)不同地區(qū)、不同豬場(chǎng)的豬群進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可以了解PRRSV的流行情況和變異趨勢(shì)，為制定科學(xué)的防控策略提供依據(jù)。該技術(shù)還可以用于對(duì)疫苗免疫豬群的監(jiān)測(cè)，評(píng)估疫苗的免疫效果，判斷豬群是否產(chǎn)生了有效的免疫應(yīng)答，是否存在免疫失敗的情況，從而及時(shí)調(diào)整免疫程序，提高豬群的免疫力。在疫苗效果評(píng)估方面，RNAscope技術(shù)能夠直觀地觀察到疫苗免疫后豬體內(nèi)PRRSV的感染和復(fù)制情況。通過檢測(cè)疫苗免疫豬的組織切片中的PRRSV核酸，對(duì)比免疫組和對(duì)照組的陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率，可以準(zhǔn)確評(píng)估疫苗對(duì)病毒的抑制作用，判斷疫苗的保護(hù)效果。這有助于篩選出更有效的疫苗毒株和免疫方案，推動(dòng)PRRS疫苗的研發(fā)和優(yōu)化。RNAscope技術(shù)還可以用于研究PRRSV的致病機(jī)制。通過檢測(cè)病毒在不同組織和細(xì)胞中的分布和定位，分析病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，有助于深入了解PRRSV的感染途徑、復(fù)制過程以及導(dǎo)致豬發(fā)病的分子機(jī)制，為開發(fā)針對(duì)性的治療藥物和防控措施提供理論基礎(chǔ)。RNAscope技術(shù)在PRRSV的檢測(cè)和研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，有望成為PRRS防控的重要技術(shù)手段，為養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展提供有力支持。四、RNAscope-IHC的初步應(yīng)用4.1材料與方法4.1.1組織樣本用于RNAscope-IHC雙重染色實(shí)驗(yàn)的組織樣本來源于臨床確診為PRRSV感染的豬場(chǎng)。從感染豬群中隨機(jī)選取30頭豬，采集其肺臟、扁桃體和淋巴結(jié)組織樣本。每個(gè)組織樣本均采集多個(gè)部位，以確保樣本的代表性。肺臟樣本選取病變明顯的區(qū)域，包括實(shí)變區(qū)、出血區(qū)和炎癥浸潤(rùn)區(qū)；扁桃體樣本則完整采集；淋巴結(jié)樣本主要采集腹股溝淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)。組織樣本采集后，立即放入4%多聚甲醛溶液中固定，固定時(shí)間為24-48小時(shí)，以穩(wěn)定組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和核酸、蛋白質(zhì)成分。固定后的組織樣本用PBS緩沖液沖洗3-5次，每次沖洗15-20分鐘，去除殘留的多聚甲醛。隨后，將組織樣本依次經(jīng)過梯度酒精脫水（70%、80%、90%、95%、100%酒精各處理1-2小時(shí)）、二甲苯透明（二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各處理30-60分鐘）、石蠟包埋等步驟，制成石蠟切片，切片厚度為4-5μm。切片完成后，將其置于60℃烘箱中烤片2-3小時(shí)，使切片牢固地貼附在載玻片上，防止在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中切片脫落。4.1.2主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括RNAscope檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自美國(guó)ACD公司，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]），該試劑盒包含了RNA原位雜交所需的各種試劑，如PRRSV特異性探針、雜交緩沖液、信號(hào)放大試劑等；IHC檢測(cè)試劑，包括鼠抗PRRSV核衣殼蛋白（N蛋白）單克隆抗體（購(gòu)自[公司名稱]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]）、兔抗鼠IgG二抗（購(gòu)自[公司名稱]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]）、DAB顯色試劑盒（購(gòu)自[公司名稱]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]）等；TUNEL檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自[公司名稱]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]），用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡；蘇木精、伊紅、蛋白酶K、DEPC水等常規(guī)試劑。主要儀器設(shè)備有顯微鏡（型號(hào)為[具體型號(hào)]，生產(chǎn)廠家為[廠家名稱]），用于對(duì)染色后的組織切片進(jìn)行觀察；熒光顯微鏡（型號(hào)為[具體型號(hào)]，生產(chǎn)廠家為[廠家名稱]），可在RNAscope-IHC雙重染色實(shí)驗(yàn)中觀察熒光信號(hào)和顯色信號(hào)，以確定PRRSV核酸和蛋白的共定位情況；激光共聚焦顯微鏡（型號(hào)為[具體型號(hào)