ΔNp63特異性shRNA對(duì)膀胱腫瘤的靶向干預(yù)效應(yīng)與機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。近年來，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，給患者家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國膀胱癌的發(fā)病率在男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中位居首位，且隨著人口老齡化的加劇，發(fā)病人數(shù)還在持續(xù)增加。目前，膀胱癌的主要治療手段包括手術(shù)切除、化療和放療等。對(duì)于早期膀胱癌患者，手術(shù)切除是主要的治療方法，如經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（TURBT），能夠有效地切除腫瘤組織，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。對(duì)于晚期膀胱癌患者，化療和放療雖能在一定程度上控制腫瘤的生長和擴(kuò)散，但這些傳統(tǒng)治療方法存在諸多局限性?；熕幬镌跉[瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，引發(fā)一系列嚴(yán)重的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等，降低患者的生活質(zhì)量。放療則可能導(dǎo)致局部組織損傷，影響膀胱功能。此外，部分膀胱癌患者對(duì)化療和放療具有耐藥性，使得治療效果不佳，預(yù)后較差。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療方法，提高膀胱癌的治療效果，降低復(fù)發(fā)率和副作用，成為了當(dāng)前膀胱癌研究領(lǐng)域的迫切需求。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究中，p63基因家族逐漸成為關(guān)注的焦點(diǎn)。p63基因是腫瘤抑制基因p53家族的重要成員，定位于染色體3q27-3q29區(qū)，包含15個(gè)外顯子和2個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子。p63基因通過不同的啟動(dòng)子和mRNA剪接方式，產(chǎn)生多種異構(gòu)體，其中主要包括TAp63和ΔNp63兩種亞型。這兩種亞型在結(jié)構(gòu)和功能上存在顯著差異，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著截然不同的角色。ΔNp63作為p63基因的一種剪接變異體，在正常生理狀態(tài)下，對(duì)上皮細(xì)胞的增殖和分化發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，維持著上皮組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，越來越多的研究表明，ΔNp63在許多腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，包括膀胱癌。其高表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)，被認(rèn)為是膀胱癌發(fā)生發(fā)展的重要驅(qū)動(dòng)因素之一。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌細(xì)胞中，ΔNp63基因的過表達(dá)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞增殖加速、凋亡抑制、細(xì)胞周期進(jìn)程異常以及侵襲能力增強(qiáng)等一系列惡性生物學(xué)行為。同時(shí)，ΔNp63的高表達(dá)還與膀胱癌對(duì)化療和放療的抗藥性密切相關(guān)，這進(jìn)一步增加了膀胱癌的治療難度，使得患者的預(yù)后更加不容樂觀。因此，深入研究ΔNp63在膀胱癌中的作用機(jī)制，并尋找有效的干預(yù)手段來調(diào)控其表達(dá)，對(duì)于膀胱癌的治療具有重要的理論和實(shí)踐意義?；谏鲜霰尘埃狙芯恐荚谔接懄p63特異性shRNA對(duì)膀胱腫瘤的效應(yīng)。通過設(shè)計(jì)和合成針對(duì)ΔNp63基因的特異性短發(fā)夾RNA（shRNA），構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞，觀察其對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期及侵襲能力等生物學(xué)行為的影響，同時(shí)在動(dòng)物模型中驗(yàn)證其治療效果。本研究的開展有望為膀胱癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)，為開發(fā)更加有效的膀胱癌治療策略奠定基礎(chǔ)，從而改善膀胱癌患者的預(yù)后，提高其生活質(zhì)量，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)意義。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入探究ΔNp63特異性shRNA對(duì)膀胱腫瘤的效應(yīng)及其潛在分子機(jī)制，為膀胱癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。具體而言，通過一系列實(shí)驗(yàn)操作，觀察ΔNp63特異性shRNA對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并在動(dòng)物模型中驗(yàn)證其治療效果，期望能夠?yàn)榘螂装┑呐R床治療開辟新的途徑。圍繞這一核心目的，本研究提出以下關(guān)鍵問題：ΔNp63特異性shRNA是否能夠有效抑制膀胱癌細(xì)胞中ΔNp63基因和蛋白的表達(dá)？在分子水平上，shRNA通過與目標(biāo)mRNA互補(bǔ)配對(duì)，介導(dǎo)RNA干擾（RNAi）機(jī)制，從而降解目標(biāo)mRNA，抑制其翻譯過程。然而，在實(shí)際應(yīng)用中，shRNA的干擾效率可能受到多種因素的影響，如shRNA的序列設(shè)計(jì)、轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境等。因此，需要通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證針對(duì)ΔNp63設(shè)計(jì)的特異性shRNA是否能夠在膀胱癌細(xì)胞中發(fā)揮預(yù)期的干擾作用，降低ΔNp63基因和蛋白的表達(dá)水平。ΔNp63特異性shRNA對(duì)膀胱癌細(xì)胞的增殖、凋亡、周期及侵襲能力等生物學(xué)行為有何具體影響？癌細(xì)胞的異常增殖、凋亡抵抗、細(xì)胞周期紊亂以及侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征。ΔNp63在膀胱癌中高表達(dá)，其可能通過調(diào)控一系列信號(hào)通路參與這些生物學(xué)過程。那么，抑制ΔNp63的表達(dá)后，膀胱癌細(xì)胞的這些生物學(xué)行為將如何變化，是本研究需要深入探討的關(guān)鍵問題。例如，是否會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖速度減慢、凋亡增加、細(xì)胞周期阻滯在特定階段，以及侵襲能力下降等。ΔNp63特異性shRNA在體內(nèi)動(dòng)物模型中對(duì)膀胱腫瘤的生長和發(fā)展有怎樣的影響？體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)雖然能夠初步揭示shRNA對(duì)癌細(xì)胞的作用，但體內(nèi)環(huán)境更為復(fù)雜，存在免疫系統(tǒng)、血管生成等多種因素的相互作用。因此，構(gòu)建膀胱癌動(dòng)物模型，將ΔNp63特異性shRNA導(dǎo)入體內(nèi)，觀察其對(duì)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移以及動(dòng)物生存狀況的影響，對(duì)于評(píng)估其潛在的治療效果至關(guān)重要。例如，腫瘤體積是否減小、生長速度是否減緩、轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量是否減少等。ΔNp63特異性shRNA影響膀胱腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制是什么？深入探究其作用機(jī)制，有助于更好地理解膀胱癌的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)更加精準(zhǔn)有效的治療策略提供理論基礎(chǔ)。ΔNp63可能通過調(diào)控多個(gè)下游基因和信號(hào)通路來影響膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，如PI3K-Akt、MAPK等信號(hào)通路。本研究將通過檢測相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá)和活性變化，以及下游靶基因的表達(dá)水平，揭示ΔNp63特異性shRNA影響膀胱腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的潛在分子機(jī)制。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)本研究綜合運(yùn)用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等多種研究方法，從多個(gè)層面深入探究ΔNp63特異性shRNA對(duì)膀胱腫瘤的效應(yīng)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，選取人膀胱癌細(xì)胞株，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將ΔNp63特異性shRNA表達(dá)載體導(dǎo)入膀胱癌細(xì)胞中，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測ΔNp63基因和蛋白的表達(dá)水平，以明確shRNA的干擾效果。采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，通過繪制細(xì)胞生長曲線，直觀地反映不同處理組細(xì)胞的增殖速率變化；利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布，精確地測定細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況以及細(xì)胞在各個(gè)周期階段的比例，從而深入了解ΔNp63特異性shRNA對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡和周期的影響；運(yùn)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力，通過觀察穿膜細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)，定量分析細(xì)胞侵襲能力的改變。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建人膀胱癌裸鼠移植瘤模型，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ΔNp63特異性shRNA的膀胱癌細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)，建立腫瘤模型。定期測量腫瘤的體積和重量，繪制腫瘤生長曲線，動(dòng)態(tài)監(jiān)測腫瘤的生長情況，以評(píng)估ΔNp63特異性shRNA在體內(nèi)對(duì)膀胱腫瘤生長的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行病理切片觀察，運(yùn)用蘇木精-伊紅（HE）染色，清晰地顯示腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；采用免疫組織化學(xué)染色檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)，通過特異性抗體與目標(biāo)蛋白的結(jié)合，直觀地觀察蛋白在腫瘤組織中的定位和表達(dá)水平；進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá)，從分子層面進(jìn)一步驗(yàn)證ΔNp63特異性shRNA對(duì)腫瘤組織的作用機(jī)制。本研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和指標(biāo)檢測等方面具有顯著的創(chuàng)新之處。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，首次將新型的納米材料載體與ΔNp63特異性shRNA相結(jié)合，利用納米材料的獨(dú)特優(yōu)勢，如良好的生物相容性、高效的細(xì)胞攝取能力和靶向性，提高shRNA的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性，增強(qiáng)其對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的作用效果，為膀胱癌的基因治療提供了新的思路和方法。在指標(biāo)檢測方面，除了常規(guī)檢測細(xì)胞增殖、凋亡、周期及侵襲等生物學(xué)行為指標(biāo)外，還引入了最新的單細(xì)胞測序技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。單細(xì)胞測序技術(shù)能夠深入分析單個(gè)膀胱癌細(xì)胞在ΔNp63特異性shRNA作用下的基因表達(dá)譜變化，揭示細(xì)胞間的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)潛在的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路；蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)則可以全面檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)和修飾變化，從蛋白質(zhì)水平深入探究ΔNp63特異性shRNA影響膀胱腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制，為膀胱癌的精準(zhǔn)治療提供更全面、更深入的理論依據(jù)。二、研究基礎(chǔ)與理論2.1膀胱腫瘤概述膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。在全球范圍內(nèi)，膀胱癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位居前列，尤其在男性群體中，其發(fā)病率更為突出，常位列男性常見實(shí)體瘤的第四位。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，每年新診斷的膀胱癌患者數(shù)量超過35萬例。在我國，膀胱癌同樣是泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率最高的疾病，近年來，部分城市的膀胱癌發(fā)病率呈現(xiàn)出穩(wěn)中有升的態(tài)勢，如北京、上海、天津等大城市，其發(fā)病率已位居男性常見惡性腫瘤的第六位。膀胱癌的發(fā)病年齡多集中在51-70歲，發(fā)病高峰為65歲，且男性患者數(shù)量顯著多于女性，這可能與男性的生活習(xí)慣（如吸煙率較高）以及職業(yè)暴露等因素有關(guān)。膀胱癌的死亡率也不容小覷，其死亡率與腫瘤的分期密切相關(guān)。早期膀胱癌患者，若能及時(shí)接受有效的治療，五年生存率可達(dá)90%左右，預(yù)后相對(duì)較好。然而，對(duì)于晚期膀胱癌患者，由于腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，治療難度大幅增加，死亡率顯著升高。2009年全國腫瘤登記數(shù)據(jù)顯示，膀胱癌的死亡率為2.6/10萬，其中男性死亡率為3.75/10萬，女性死亡率為1.24/10萬，城市地區(qū)的死亡率相對(duì)較高。這表明，提高膀胱癌的早期診斷率和治療效果，對(duì)于降低死亡率至關(guān)重要。從病理類型來看，膀胱癌主要包括尿路上皮癌、鱗狀細(xì)胞癌和腺癌等，其中尿路上皮癌最為常見，約占所有膀胱癌的90%-95%。尿路上皮癌具有多灶性和易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞的異型性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和浸潤程度存在一定差異，根據(jù)這些差異，尿路上皮癌在顯微鏡下通常可分為三級(jí)。一級(jí)尿路上皮癌呈伸出性乳頭，與尿路上皮乳頭狀瘤較為相似，細(xì)胞層次增多超過八層，但細(xì)胞極性輕度紊亂，核分裂象不多；二級(jí)尿路上皮癌既有伸出性乳頭狀生長，也有浸潤性生長，常有粗大的蒂，細(xì)胞層次增多，排列明顯紊亂，乳頭結(jié)構(gòu)有融合現(xiàn)象，核分裂象易見，在固有膜可出現(xiàn)浸潤；三級(jí)尿路上皮癌乳頭狀結(jié)構(gòu)不明顯或完全失去乳頭狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞失去排列跡象，異型性明顯，核分裂象增多，浸潤明顯。鱗狀細(xì)胞癌約占膀胱癌的3%-7%，在埃及等血吸蟲病流行地區(qū)，其占比可高達(dá)75%，這與血吸蟲感染導(dǎo)致的膀胱慢性刺激密切相關(guān)。鱗狀細(xì)胞癌局部侵犯較為嚴(yán)重，且對(duì)放化療不敏感，預(yù)后較差。膀胱腺癌非常少見，大約僅占所有膀胱癌的2%，它與慢性刺激有關(guān)，具有高度的侵襲性，預(yù)后更差。臨床上，膀胱癌通常根據(jù)浸潤深度、侵及范圍以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等進(jìn)行分期，一般分為肌層非浸潤性、肌層浸潤性、局部進(jìn)展性及轉(zhuǎn)移性膀胱癌。肌層非浸潤性膀胱癌（如Tis、Ta、T1期），腫瘤局限在黏膜層或黏膜下層，尚未侵犯肌層，這類患者約占膀胱癌患者的70%，治療方法通常采用保留膀胱的手段，如經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，可達(dá)70%，其中高級(jí)別腫瘤患者更容易復(fù)發(fā)。肌層浸潤性膀胱癌（T2期及以上），腫瘤侵犯到肌層，此時(shí)單純的經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)難以徹底清除腫瘤，多采用根治性膀胱切除術(shù)，聯(lián)合輸尿管、皮膚造口或輸尿管、回腸吻合，回腸代膀胱等實(shí)現(xiàn)排尿目的。局部進(jìn)展性及轉(zhuǎn)移性膀胱癌，病情更為嚴(yán)重，腫瘤已侵犯到膀胱周圍組織或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，此時(shí)手術(shù)往往無法徹底治愈，需要借助靜脈化學(xué)治療、免疫治療、口服靶向藥治療等內(nèi)科系統(tǒng)性藥物治療，以及放射治療等綜合手段來緩解癥狀、延長生存期。目前，膀胱癌的主要治療手段涵蓋手術(shù)、化療、放療以及免疫治療等。手術(shù)治療是膀胱癌治療的重要組成部分，對(duì)于早期局限性的膀胱腫瘤，經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)是常用的方法，能夠切除腫瘤并保留膀胱，但術(shù)后需定期復(fù)查和膀胱灌注治療，以降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于腫瘤體積大、侵犯深、面積廣泛的肌層浸潤性膀胱癌，根治性膀胱切除術(shù)是主要的治療選擇?；熢诎螂装┑闹委熤幸舱紦?jù)重要地位，尤其是對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者，化療可以通過使用化學(xué)藥物來抑制腫瘤細(xì)胞的生長和擴(kuò)散，但化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，引發(fā)一系列副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。放療通常配合術(shù)前、術(shù)后進(jìn)行，對(duì)晚期失去手術(shù)時(shí)機(jī)或拒絕手術(shù)，及術(shù)后復(fù)發(fā)的患者行姑息性放療，可在一定程度上緩解癥狀，但放療也可能導(dǎo)致局部組織損傷，如膀胱炎、直腸炎等。免疫治療作為一種新興的治療方法，通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)來對(duì)抗腫瘤，為膀胱癌的治療帶來了新的希望，然而，并非所有患者都能從免疫治療中獲益，且免疫治療也可能引發(fā)免疫相關(guān)的不良反應(yīng)。盡管目前針對(duì)膀胱癌的治療手段眾多，但這些傳統(tǒng)治療方法仍存在諸多局限性。手術(shù)治療無法完全避免腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；化療和放療的副作用嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，且部分患者對(duì)化療和放療具有耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳；免疫治療雖然為部分患者帶來了新的治療選擇，但受益人群有限，且價(jià)格昂貴。因此，深入研究膀胱癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和更加有效的治療方法，成為當(dāng)前膀胱癌研究領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。2.2ΔNp63與腫瘤關(guān)系p63基因作為腫瘤抑制基因p53家族的重要成員，在生物體內(nèi)發(fā)揮著關(guān)鍵的生物學(xué)作用。該基因定位于染色體3q27-3q29區(qū)，包含15個(gè)外顯子和2個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子，通過不同的啟動(dòng)子和mRNA剪接方式，可產(chǎn)生多種異構(gòu)體。其中，TAp63和ΔNp63是兩種主要的異構(gòu)體，它們在結(jié)構(gòu)和功能上存在顯著差異。TAp63包含一個(gè)具有轉(zhuǎn)錄激活能力的“TA”域，與p53同源，能夠調(diào)節(jié)生長抑制基因的表達(dá)，在細(xì)胞的生長、分化、凋亡以及腫瘤抑制等過程中發(fā)揮著重要作用。例如，在正常上皮細(xì)胞的分化過程中，TAp63能夠促進(jìn)細(xì)胞向特定的方向分化，維持上皮組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。在腫瘤發(fā)生過程中，TAp63可以通過激活一系列下游基因，如p21、Bax等，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用。而ΔNp63則包含一個(gè)替代的、轉(zhuǎn)錄不活躍的“ΔN”域，其功能主要是拮抗TAp63和p53的活性。在正常生理狀態(tài)下，ΔNp63在維持上皮干細(xì)胞的自我更新和增殖方面發(fā)揮著重要作用，是上皮干細(xì)胞準(zhǔn)確發(fā)育為腺上皮組織（包括表皮）的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，ΔNp63卻扮演著截然不同的角色。越來越多的研究表明，ΔNp63在許多腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，包括膀胱癌、乳腺癌、肺癌等。在這些腫瘤中，ΔNp63的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)。在正常上皮組織中，ΔNp63主要表達(dá)于基底層細(xì)胞，它通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，從而維持上皮細(xì)胞的增殖和分化平衡。例如，在皮膚上皮組織中，ΔNp63能夠促進(jìn)基底細(xì)胞的增殖，同時(shí)抑制其分化，確保皮膚的正常生長和修復(fù)。當(dāng)上皮組織發(fā)生癌變時(shí)，ΔNp63的表達(dá)往往會(huì)出現(xiàn)異常升高。這種異常高表達(dá)使得ΔNp63能夠激活一系列與腫瘤細(xì)胞增殖、存活和侵襲相關(guān)的信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在腫瘤細(xì)胞中，ΔNp63通過多種機(jī)制發(fā)揮促癌作用。它可以直接與DNA結(jié)合，調(diào)控一系列與細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，ΔNp63能夠上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。同時(shí)，ΔNp63還可以抑制促凋亡基因Bax的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗能力。ΔNp63還可以通過與其他轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，間接調(diào)控基因的表達(dá)。它可以與E2F1等轉(zhuǎn)錄因子相互作用，激活與DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。ΔNp63還能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝，為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。有研究表明，ΔNp63可以上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，促進(jìn)糖酵解過程，滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖的能量需求。在膀胱癌中，ΔNp63的異常表達(dá)尤為顯著。眾多研究表明，ΔNp63在膀胱癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常膀胱組織，且其表達(dá)水平與膀胱癌的分級(jí)、分期以及預(yù)后密切相關(guān)。對(duì)于高級(jí)別、晚期的膀胱癌患者，ΔNp63的表達(dá)水平往往更高，這預(yù)示著患者的預(yù)后較差。相關(guān)研究通過對(duì)大量膀胱癌患者的組織樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)ΔNp63高表達(dá)的患者術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯高于低表達(dá)患者，總生存率和無病生存率也顯著降低。深入研究發(fā)現(xiàn)，ΔNp63在膀胱癌中的高表達(dá)通過多種途徑影響腫瘤的生物學(xué)行為。它可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞數(shù)量不斷增加。ΔNp63還能夠增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，使腫瘤細(xì)胞更容易突破基底膜，侵犯周圍組織和遠(yuǎn)處器官。具體機(jī)制包括上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。ΔNp63還可以通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，ΔNp63的高表達(dá)還與膀胱癌對(duì)化療和放療的抗藥性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，ΔNp63可以通過激活PI3K-Akt等信號(hào)通路，上調(diào)抗凋亡蛋白和藥物外排泵的表達(dá)，降低化療藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗能力。在放療過程中，ΔNp63高表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞能夠更有效地修復(fù)放療引起的DNA損傷，從而降低放療的敏感性。2.3shRNA干擾技術(shù)原理RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種在生物體內(nèi)廣泛存在的、由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）介導(dǎo)的、序列特異性的基因表達(dá)沉默現(xiàn)象。其作用機(jī)制主要包括起始階段和效應(yīng)階段。在起始階段，細(xì)胞內(nèi)的長雙鏈RNA被一種名為Dicer的核酸酶識(shí)別并切割，形成長度約為21-23個(gè)核苷酸的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。這些siRNA由兩條互補(bǔ)的單鏈組成，具有3'端2個(gè)核苷酸的突出。在效應(yīng)階段，siRNA與細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。RISC中的siRNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，識(shí)別并結(jié)合與其序列互補(bǔ)的靶mRNA，然后在復(fù)合物中核酸酶的作用下，將靶mRNA切割降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的特異性抑制。短發(fā)夾RNA（shorthairpinRNA，shRNA）是一種人工設(shè)計(jì)的非編碼小RNA分子，其結(jié)構(gòu)能夠形成發(fā)夾狀。shRNA在細(xì)胞內(nèi)可以被加工成siRNA，進(jìn)而介導(dǎo)RNA干擾作用，抑制特定基因的表達(dá)。shRNA的設(shè)計(jì)是基于對(duì)靶基因序列的分析，通常選擇靶基因mRNA的特定區(qū)域，設(shè)計(jì)與之互補(bǔ)的序列。為了形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，shRNA包含兩個(gè)短反向重復(fù)序列，中間由一段莖環(huán)（loop）序列分隔。在構(gòu)建shRNA表達(dá)載體時(shí)，通常會(huì)在其兩端引入特定的限制性酶切位點(diǎn)，以便于將其克隆到合適的載體中。載體中的啟動(dòng)子（如RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子U6或H1）能夠啟動(dòng)shRNA的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄生成的shRNA在細(xì)胞內(nèi)被加工成具有活性的siRNA，從而發(fā)揮基因沉默作用。將shRNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法有多種，主要包括化學(xué)轉(zhuǎn)染法、病毒載體介導(dǎo)法和物理轉(zhuǎn)染法等?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)染法是利用陽離子脂質(zhì)體、陽離子聚合物等化學(xué)試劑，將shRNA表達(dá)載體包裹形成復(fù)合物，通過細(xì)胞對(duì)復(fù)合物的內(nèi)吞作用，將shRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。這種方法操作相對(duì)簡單，成本較低，但轉(zhuǎn)染效率可能受到細(xì)胞類型、試劑種類和轉(zhuǎn)染條件等因素的影響，且對(duì)細(xì)胞可能存在一定的毒性。病毒載體介導(dǎo)法是將shRNA表達(dá)序列克隆到病毒載體（如慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體等）中，利用病毒對(duì)細(xì)胞的天然感染能力，將shRNA高效地導(dǎo)入細(xì)胞。這種方法轉(zhuǎn)染效率高，能夠感染多種類型的細(xì)胞，且可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，但病毒載體的制備過程較為復(fù)雜，存在潛在的生物安全性風(fēng)險(xiǎn)。物理轉(zhuǎn)染法包括電穿孔法、顯微注射法等。電穿孔法是通過在細(xì)胞懸液中施加短暫的高壓電脈沖，在細(xì)胞膜上形成小孔，使shRNA能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。該方法轉(zhuǎn)染效率較高，但對(duì)細(xì)胞損傷較大，需要優(yōu)化電穿孔參數(shù)以提高細(xì)胞存活率。顯微注射法則是利用顯微操作技術(shù)，將shRNA直接注射到單個(gè)細(xì)胞內(nèi)，這種方法適用于對(duì)少量細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作精度高，但效率較低，且對(duì)設(shè)備和操作人員的要求較高。shRNA干擾技術(shù)在基因功能研究和疾病治療等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。在基因功能研究中，通過設(shè)計(jì)針對(duì)特定基因的shRNA，將其導(dǎo)入細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)，抑制該基因的表達(dá)，然后觀察細(xì)胞或動(dòng)物在生理、生化和表型等方面的變化，從而深入了解基因的功能。例如，在研究腫瘤相關(guān)基因時(shí)，利用shRNA干擾技術(shù)抑制腫瘤細(xì)胞中某個(gè)基因的表達(dá)，觀察腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為的改變，有助于揭示該基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。在疾病治療方面，shRNA干擾技術(shù)為腫瘤、病毒感染性疾病、遺傳性疾病等的治療提供了新的策略。以腫瘤治療為例，針對(duì)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的致癌基因或與腫瘤耐藥相關(guān)的基因，設(shè)計(jì)特異性的shRNA，通過合適的載體將其導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，抑制這些基因的表達(dá)，有望達(dá)到抑制腫瘤生長、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的目的。在病毒感染性疾病治療中，針對(duì)病毒的關(guān)鍵基因設(shè)計(jì)shRNA，可抑制病毒的復(fù)制和傳播，為病毒感染性疾病的治療提供新的手段。此外，對(duì)于一些由基因突變引起的遺傳性疾病，通過shRNA干擾技術(shù)沉默突變基因的表達(dá)，也可能為疾病的治療帶來新的希望。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞株人膀胱癌細(xì)胞株T24購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。T24細(xì)胞株源自人類膀胱尿路上皮癌，具有典型的癌細(xì)胞特征，如增殖能力強(qiáng)、侵襲性高等。該細(xì)胞株在腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)移和藥物敏感性等方面的研究中被廣泛應(yīng)用，是研究膀胱癌的常用細(xì)胞模型之一。將其復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4-6周齡雌性BALB/c-nu/nu裸鼠，體重18-22g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2020-0001。裸鼠由于缺乏T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞免疫功能缺陷，對(duì)異種移植的腫瘤組織具有較低的免疫排斥反應(yīng)，是建立人腫瘤異種移植模型的理想動(dòng)物。將裸鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，環(huán)境溫度控制在（22±2）℃，相對(duì)濕度為（50±10）%，12h光照/12h黑暗交替，自由攝食和飲水。在實(shí)驗(yàn)前，讓裸鼠適應(yīng)環(huán)境1周，以減少環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。3.1.3質(zhì)粒ΔNp63特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。根據(jù)GenBank中ΔNp63基因的mRNA序列（NM_001127546.2），利用在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)針對(duì)ΔNp63基因的特異性shRNA序列。序列設(shè)計(jì)遵循以下原則：選擇基因編碼區(qū)的19-21個(gè)核苷酸序列，避免選擇5'和3'非翻譯區(qū)；GC含量控制在30%-70%；避免出現(xiàn)連續(xù)4個(gè)以上的T或A堿基。將設(shè)計(jì)好的shRNA序列合成雙鏈DNA，然后克隆到Pgenesil-1質(zhì)粒載體中，構(gòu)建成ΔNp63特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒。通過測序驗(yàn)證質(zhì)粒中shRNA序列的正確性，確保其與設(shè)計(jì)序列一致。同時(shí)，構(gòu)建陰性對(duì)照shRNA表達(dá)質(zhì)粒，其序列與ΔNp63基因無同源性，作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照，用于排除非特異性干擾。3.1.4主要試劑胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司，其富含多種營養(yǎng)成分，如生長因子、激素、氨基酸等，能夠?yàn)榧?xì)胞生長提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，該培養(yǎng)基是一種常用的細(xì)胞培養(yǎng)基，適合多種細(xì)胞的生長，其配方經(jīng)過優(yōu)化，能夠滿足細(xì)胞生長和代謝的需求。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，它是一種陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，能夠?qū)⒑怂岱肿痈咝У貙?dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)。TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞總RNA，其原理是利用TRIzol中的異硫氰酸胍和苯酚等成分，迅速裂解細(xì)胞，抑制RNA酶的活性，從而保持RNA的完整性。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒能夠?qū)NA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供模板；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒則用于對(duì)cDNA進(jìn)行定量分析，通過檢測熒光信號(hào)的強(qiáng)度，精確測定基因的表達(dá)水平。BCA蛋白定量試劑盒購自美國ThermoFisherScientific公司，用于測定細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)濃度，其原理是利用蛋白質(zhì)與BCA試劑結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化，通過比色法測定蛋白質(zhì)濃度。鼠抗人ΔNp63單克隆抗體購自美國SantaCruz公司，該抗體具有高特異性和高親和力，能夠特異性地識(shí)別ΔNp63蛋白，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和免疫組織化學(xué)染色等實(shí)驗(yàn)。兔抗人GAPDH單克隆抗體購自中國Proteintech公司，GAPDH是一種管家基因，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，常作為內(nèi)參蛋白用于校正目的蛋白的表達(dá)水平。HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國JacksonImmunoResearch公司，它們能夠與相應(yīng)的一抗結(jié)合，通過辣根過氧化物酶（HRP）催化底物顯色，用于檢測目的蛋白的表達(dá)。CCK-8試劑購自日本Dojindo公司，用于檢測細(xì)胞增殖能力，其原理是利用CCK-8試劑中的WST-8在細(xì)胞內(nèi)被還原成具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，其生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過檢測吸光度值來反映細(xì)胞的增殖情況。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BDBiosciences公司，用于檢測細(xì)胞凋亡，AnnexinV能夠特異性地與凋亡早期細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，而PI則能夠穿透死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測AnnexinV-FITC和PI的熒光強(qiáng)度，可區(qū)分正常細(xì)胞、凋亡早期細(xì)胞、凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞。細(xì)胞周期檢測試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司，用于檢測細(xì)胞周期分布，其原理是利用PI與細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不同時(shí)期細(xì)胞DNA含量的變化，從而確定細(xì)胞在各個(gè)周期階段的比例。Transwell小室購自美國Corning公司，用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，小室的聚碳酸酯膜上有小孔，可允許細(xì)胞通過，將細(xì)胞接種在上室，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，通過觀察穿膜細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)，可評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。Matrigel基質(zhì)膠購自美國BDBiosciences公司，在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，將Matrigel基質(zhì)膠鋪在Transwell小室的上室，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，可更真實(shí)地反映細(xì)胞的侵襲能力。3.1.5主要儀器設(shè)備CO?恒溫培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），能夠提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞培養(yǎng)創(chuàng)造適宜的環(huán)境。超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過過濾空氣中的塵埃和微生物，提供一個(gè)無菌的操作空間，防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的污染。高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），可在低溫條件下對(duì)樣品進(jìn)行高速離心，用于分離細(xì)胞、沉淀蛋白質(zhì)等。酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司），能夠快速、準(zhǔn)確地檢測吸光度值，用于CCK-8實(shí)驗(yàn)等。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國AppliedBiosystems公司），可對(duì)PCR反應(yīng)過程中的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的定量分析。流式細(xì)胞儀（美國BDBiosciences公司），能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)等。電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)電泳和轉(zhuǎn)膜操作?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國AzureBiosystems公司），能夠檢測化學(xué)發(fā)光信號(hào)，用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中目的蛋白的檢測。石蠟切片機(jī)（德國Leica公司），用于將組織樣本切成薄片，制備石蠟切片，以便進(jìn)行病理分析。顯微鏡（德國Zeiss公司），用于觀察細(xì)胞形態(tài)、組織切片的病理變化等。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1ΔNp63特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建利用在線設(shè)計(jì)軟件，依據(jù)GenBank中ΔNp63基因的mRNA序列（NM_001127546.2），設(shè)計(jì)針對(duì)ΔNp63基因的特異性shRNA序列。設(shè)計(jì)時(shí)嚴(yán)格遵循相關(guān)原則，選取基因編碼區(qū)中19-21個(gè)核苷酸的序列，避開5'和3'非翻譯區(qū)；將GC含量控制在30%-70%的范圍內(nèi)；避免出現(xiàn)連續(xù)4個(gè)以上的T或A堿基。根據(jù)設(shè)計(jì)好的序列，化學(xué)合成兩條互補(bǔ)的短鏈寡核苷酸。合成的寡核苷酸兩端分別引入限制性內(nèi)切酶PstI和SalI的酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)的克隆操作。將合成的兩條寡核苷酸鏈溶解于退火緩沖液中，進(jìn)行退火反應(yīng)，使其形成雙鏈DNA。退火條件為95℃加熱5分鐘，然后緩慢冷卻至室溫，確保雙鏈DNA的正確形成。選用Pgenesil-1質(zhì)粒載體，該載體含有U6啟動(dòng)子，能夠有效啟動(dòng)shRNA的轉(zhuǎn)錄。用限制性內(nèi)切酶PstI和SalI對(duì)Pgenesil-1質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切處理。酶切體系包含1μg質(zhì)粒DNA、10×Buffer2μL、PstI和SalI各1μL，加ddH?O補(bǔ)足至20μL。37℃水浴酶切2-3小時(shí)，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒回收線性化的質(zhì)粒片段。將退火形成的雙鏈DNA與線性化的Pgenesil-1質(zhì)粒載體進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系包含1μL雙鏈DNA、1μL線性化質(zhì)粒、5μL2×LigationBuffer和1μLT4DNA連接酶，加ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過夜，使雙鏈DNA成功插入質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。取10μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘；然后42℃熱激90秒，迅速放回冰浴2分鐘；加入800μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因。將復(fù)蘇后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，從平板上挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。取1.5mL菌液，12000rpm離心1分鐘，棄上清；加入100μL預(yù)冷的SolutionI，渦旋振蕩使菌體完全懸?。患尤?00μLSolutionII，輕柔顛倒混勻5-6次，室溫放置2-3分鐘；加入150μL預(yù)冷的SolutionIII，輕柔顛倒混勻5-6次，冰浴10分鐘；12000rpm離心10分鐘，取上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中；加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25:24:1），振蕩混勻，12000rpm離心5分鐘，取上清；加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3MNaAc（pH5.2），混勻，-20℃放置30分鐘；12000rpm離心10分鐘，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次；晾干沉淀后，加入適量的ddH?O溶解質(zhì)粒DNA。對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切體系同上述雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現(xiàn)預(yù)期大小的片段，表明shRNA序列已成功插入質(zhì)粒載體。進(jìn)一步將鑒定正確的質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，確保插入的shRNA序列與設(shè)計(jì)序列完全一致。同時(shí)，構(gòu)建陰性對(duì)照shRNA表達(dá)質(zhì)粒，其序列與ΔNp63基因無同源性，構(gòu)建過程與上述相同，作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照，用于排除非特異性干擾。3.2.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)取處于對(duì)數(shù)生長期的人膀胱癌細(xì)胞株T24，用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染ΔNp63特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照shRNA表達(dá)質(zhì)粒）和空白對(duì)照組（不進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理）。在無菌EP管中，分別加入100μLOpti-MEM培養(yǎng)基，然后向?qū)嶒?yàn)組中加入5μLLipofectamine3000試劑，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；向另一EP管中加入100μLOpti-MEM培養(yǎng)基和2μgΔNp63特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒，混勻。將上述兩管液體混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入1.8mLOpti-MEM培養(yǎng)基，然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入孔中，輕輕搖勻。將6孔板放回恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入適量的TRIzol試劑，按照TRIzol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA。用微量核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包含2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL、上下游引物各0.5μL、cDNA模板1μL，加ddH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算ΔNp63基因的相對(duì)表達(dá)量。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘。12000rpm離心15分鐘，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。取30-50μg蛋白質(zhì)樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1-2小時(shí)。加入鼠抗人ΔNp63單克隆抗體（1:1000稀釋）和兔抗人GAPDH單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1:5000稀釋）和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時(shí)。用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測目的蛋白的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參，分析ΔNp63蛋白的相對(duì)表達(dá)量。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入適量的AnnexinV-FITC和PI染色液，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。室溫避光孵育15-20分鐘后，加入300μLBindingBuffer，輕輕混勻。立即用流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞凋亡率，其中AnnexinV-FITC陽性、PI陰性的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV-FITC和PI均陽性的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定過夜。次日，1000rpm離心5分鐘，棄去固定液。用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500μLPI染色液（含RNaseA），室溫避光孵育30分鐘。用流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞周期分布，根據(jù)DNA含量的不同，確定細(xì)胞在G1期、S期和G2/M期的比例。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1-4小時(shí)。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，評(píng)估細(xì)胞的增殖活性。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。將Matrigel基質(zhì)膠用無血清RPMI1640培養(yǎng)基稀釋，按照1:8的比例鋪于Transwell小室的上室，37℃孵育4-6小時(shí)，使其凝固。將細(xì)胞懸液調(diào)整密度為1×10?個(gè)/mL，取200μL加入到Transwell小室的上室，下室加入600μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于24孔板中，37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿膜的細(xì)胞。將小室放入4%多聚甲醛中固定15-20分鐘，然后用結(jié)晶紫染色液染色10-15分鐘。用清水沖洗小室，晾干后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞的數(shù)量，評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。3.2.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取處于對(duì)數(shù)生長期的人膀胱癌細(xì)胞株T24，用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。將4-6周齡雌性BALB/c-nu/nu裸鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組10只。在裸鼠右側(cè)腋下背部皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞數(shù)量為2×10?個(gè)/只。接種后，定期觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等。每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。繪制腫瘤生長曲線，觀察腫瘤的生長情況。當(dāng)腫瘤體積長至約100-150mm3時(shí)，將實(shí)驗(yàn)組裸鼠瘤內(nèi)注射ΔNp63特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒（100μg/只），陰性對(duì)照組裸鼠瘤內(nèi)注射陰性對(duì)照shRNA表達(dá)質(zhì)粒（100μg/只），空白對(duì)照組裸鼠瘤內(nèi)注射等體積的生理鹽水。每隔3天注射一次，共注射4-6次。在注射過程中，密切觀察裸鼠的反應(yīng)，如有無出血、感染等情況。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，頸椎脫臼法處死裸鼠，取出腫瘤組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分。用電子天平稱取腫瘤重量，記錄數(shù)據(jù)。將部分腫瘤組織放入10%中性福爾馬林溶液中固定，用于后續(xù)的病理分析；部分腫瘤組織放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于RNA和蛋白質(zhì)提取。取固定好的腫瘤組織，常規(guī)石蠟包埋，制成4-5μm厚的切片。進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，具體步驟為：切片脫蠟至水，蘇木精染色5-10分鐘，水洗；1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，水洗；伊紅染色2-5分鐘，水洗。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，評(píng)估腫瘤的生長和浸潤情況。取石蠟切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。切片脫蠟至水，3%過氧化氫室溫孵育10-15分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，微波加熱至沸騰后，保持10-15分鐘，自然冷卻。用5%牛血清白蛋白封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性染色。加入鼠抗人ΔNp63單克隆抗體（1:100稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1:200稀釋），室溫孵育1-2小時(shí)。用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，分析ΔNp63蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)情況。取-80℃保存的腫瘤組織，加入適量的TRIzol試劑，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA。用微量核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包含2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL、上下游引物各0.5μL、cDNA模板1μL，加ddH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算ΔNp63基因的相對(duì)表達(dá)量。取-80℃保存的腫瘤組織，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘。12000rpm離心15分鐘，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。取30-50μg蛋白質(zhì)樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1-2小時(shí)。加入鼠抗人ΔNp63單克隆抗體（1:1000稀釋）和兔抗人GAPDH單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1:5000稀釋）和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時(shí)。用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測目的蛋白的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參，分析ΔNp63蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.2.4數(shù)據(jù)分析本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步采用LSD法或Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，如比較不同處理組細(xì)胞中ΔNp63基因和蛋白的表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期分布以及細(xì)胞增殖活性等指標(biāo)時(shí)，運(yùn)用上述統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析，以明確ΔNp63特異性shRNA對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)不同組荷瘤裸鼠的腫瘤體積、重量以及腫瘤組織中相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，判斷ΔNp63特異性shRNA在體內(nèi)對(duì)膀胱腫瘤生長的抑制作用及相關(guān)機(jī)制。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1ΔNp63在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示，ΔNp63蛋白主要定位于細(xì)胞核，陽性染色表現(xiàn)為棕黃色顆粒。在50例膀胱癌組織中，有40例呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為80.00%（40/50）；而在10例正常膀胱黏膜組織中，僅1例呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為10.00%（1/10），膀胱癌組織中ΔNp63的陽性表達(dá)率顯著高于正常膀胱黏膜組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在8例內(nèi)翻性乳頭狀瘤組織中，有3例呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為37.50%（3/8），明顯低于膀胱癌組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。具體數(shù)據(jù)見表1：組織類型例數(shù)ΔNp63陽性表達(dá)例數(shù)陽性表達(dá)率（%）膀胱癌組織504080.00正常膀胱黏膜組織10110.00內(nèi)翻性乳頭狀瘤組織8337.50進(jìn)一步分析ΔNp63表達(dá)與膀胱尿路上皮癌病理分級(jí)、臨床分期的關(guān)系，結(jié)果顯示，在高級(jí)別尿路上皮癌組織中，ΔNp63的陽性表達(dá)率為94.12%（16/17），顯著高于低級(jí)別組的66.67%（16/24），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著浸潤程度的增加，從Tis-T1期到T2-T4期，ΔNp63的陽性著色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，陽性表達(dá)率也逐漸升高，分別為63.64%（14/22）和94.74%（18/19），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。具體數(shù)據(jù)見表2：病理分級(jí)/臨床分期例數(shù)ΔNp63陽性表達(dá)例數(shù)陽性表達(dá)率（%）低級(jí)別尿路上皮癌241666.67高級(jí)別尿路上皮癌171694.12Tis-T1期221463.64T2-T4期191894.74在9例膀胱鱗狀細(xì)胞癌組織中，ΔNp63陽性表達(dá)率為88.89%（8/9），略高于膀胱尿路上皮癌組的78.05%（32/41），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。采用RT-PCR方法對(duì)36例膀胱移行細(xì)胞癌及10例正常膀胱黏膜上皮組織中ΔNp63mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，28例膀胱移行細(xì)胞癌組織（77.78%）ΔNp63mRNA呈陽性表達(dá)，1例正常膀胱黏膜上皮組織（10.00%）ΔNp63mRNA呈陽性表達(dá)，膀胱移行細(xì)胞癌組ΔNp63mRNA的陽性率明顯高于正常組，差異具有顯著性（P＜0.01）。然而，ΔNp63mRNA在不同臨床分期和病理分級(jí)的陽性表達(dá)差異無顯著性（P＞0.05）。4.2ΔNp63特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作，成功構(gòu)建了ΔNp63特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒。首先，利用在線設(shè)計(jì)軟件，依據(jù)GenBank中ΔNp63基因的mRNA序列（NM_001127546.2），精心設(shè)計(jì)了針對(duì)ΔNp63基因的特異性shRNA序列。在設(shè)計(jì)過程中，嚴(yán)格遵循相關(guān)原則，選取基因編碼區(qū)中19-21個(gè)核苷酸的序列，避開5'和3'非翻譯區(qū)；將GC含量控制在30%-70%的范圍內(nèi)；避免出現(xiàn)連續(xù)4個(gè)以上的T或A堿基，以確保shRNA序列的有效性和特異性。根據(jù)設(shè)計(jì)好的序列，化學(xué)合成兩條互補(bǔ)的短鏈寡核苷酸，并在其兩端分別引入限制性內(nèi)切酶PstI和SalI的酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)的克隆操作。將合成的兩條寡核苷酸鏈溶解于退火緩沖液中，進(jìn)行退火反應(yīng)，使其形成雙鏈DNA。退火條件為95℃加熱5分鐘，然后緩慢冷卻至室溫，確保雙鏈DNA的正確形成。選用含有U6啟動(dòng)子的Pgenesil-1質(zhì)粒載體，用限制性內(nèi)切酶PstI和SalI對(duì)其進(jìn)行雙酶切處理。酶切體系包含1μg質(zhì)粒DNA、10×Buffer2μL、PstI和SalI各1μL，加ddH?O補(bǔ)足至20μL。37℃水浴酶切2-3小時(shí)，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒回收線性化的質(zhì)粒片段。將退火形成的雙鏈DNA與線性化的Pgenesil-1質(zhì)粒載體進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系包含1μL雙鏈DNA、1μL線性化質(zhì)粒、5μL2×LigationBuffer和1μLT4DNA連接酶，加ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過夜，使雙鏈DNA成功插入質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過一系列處理后，將復(fù)蘇后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，從平板上挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，并對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切體系同上述雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示出現(xiàn)了預(yù)期大小的片段，表明shRNA序列已成功插入質(zhì)粒載體。進(jìn)一步將鑒定正確的質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序結(jié)果表明插入的shRNA序列與設(shè)計(jì)序列完全一致，這充分證實(shí)了ΔNp63特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的成功。為了確定最佳的轉(zhuǎn)染條件，進(jìn)行了一系列預(yù)實(shí)驗(yàn)。以人膀胱癌細(xì)胞株T24為研究對(duì)象，分別設(shè)置了不同的Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA用量組合，同時(shí)設(shè)置了不同的轉(zhuǎn)染時(shí)間。通過觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性，確定了最佳的轉(zhuǎn)染條件為：使用5μLLipofectamine3000試劑和2μgΔNp63特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染時(shí)間為4-6小時(shí)。在該條件下，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高，且細(xì)胞活性良好，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。為了篩選出最有效的重組質(zhì)粒，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了3種不同序列的ΔNp63特異性shRNA重組質(zhì)粒（shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3），同時(shí)設(shè)置了陰性對(duì)照shRNA表達(dá)質(zhì)粒（NegativeControl，NC）和空白對(duì)照組（BlankControl，BC）。將這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人膀胱癌細(xì)胞株T24，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測細(xì)胞中ΔNp63基因和蛋白的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3的細(xì)胞中ΔNp63mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，其中shRNA-2組的抑制效果最為明顯，ΔNp63mRNA的表達(dá)水平降低了70%以上。Westernblot結(jié)果也表明，shRNA-2組細(xì)胞中ΔNp63蛋白的表達(dá)水平明顯低于其他組，抑制率達(dá)到了75%左右。因此，確定shRNA-2為最有效的重組質(zhì)粒，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。4.3ΔNp63特異性shRNA對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌的體外效應(yīng)免疫組化結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ΔNp63特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中，ΔNp63蛋白陽性染色強(qiáng)度明顯減弱，陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少；而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞中，ΔNp63蛋白陽性染色強(qiáng)度較強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)較多。這表明ΔNp63特異性shRNA能夠有效抑制膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞中ΔNp63蛋白的表達(dá)。采用RT-PCR技術(shù)檢測各組細(xì)胞中ΔNp63mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中ΔNp63mRNA的表達(dá)量顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05）。具體數(shù)據(jù)為，實(shí)驗(yàn)組ΔNp63mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.25±0.05，陰性對(duì)照組為1.02±0.10，空白對(duì)照組為1.05±0.12。這進(jìn)一步證實(shí)了ΔNp63特異性shRNA在mRNA水平上對(duì)ΔNp63表達(dá)的抑制作用。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中ΔNp63蛋白的表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05）。以GAPDH為內(nèi)參，對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行半定量分析，實(shí)驗(yàn)組ΔNp63蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.30±0.06，陰性對(duì)照組為1.05±0.11，空白對(duì)照組為1.08±0.13。這與免疫組化和RT-PCR的結(jié)果一致，說明ΔNp63特異性shRNA能夠顯著抑制膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞中ΔNp63蛋白的表達(dá)。通過流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞的周期分布。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著增加，分別為（65.38±3.12）%、（45.26±2.85）%、（44.89±2.78）%；而處于S期的細(xì)胞比例顯著減少，分別為（28.65±2.56）%、（40.35±3.02）%、（41.05±3.10）%（P＜0.05）。這表明ΔNp63特異性shRNA能夠?qū)螂滓菩屑?xì)胞癌T24細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞的增殖。采用MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖活性。在不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h、96h）檢測細(xì)胞的吸光度值（OD值），并繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值增長速度明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。在96h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值為0.85±0.08，陰性對(duì)照組為1.56±0.15，空白對(duì)照組為1.62±0.18（P＜0.05）。這說明ΔNp63特異性shRNA能夠顯著抑制膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞的增殖活性，降低細(xì)胞的增殖速度。4.4ΔNp63特異性shRNA對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌的體內(nèi)效應(yīng)在成功建立人膀胱癌裸鼠移植瘤模型后，對(duì)各組荷瘤裸鼠的腫瘤生長情況進(jìn)行了密切監(jiān)測。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組裸鼠瘤內(nèi)注射ΔNp63特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒后，腫瘤生長速度明顯受到抑制。從腫瘤生長曲線可以清晰地看出，隨著時(shí)間的推移，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積的增長幅度顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。在接種腫瘤細(xì)胞后的第21天，實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均體積為（198.56±35.68）mm3，陰性對(duì)照組為（456.32±56.78）mm3，空白對(duì)照組為（489.56±62.34）mm3，實(shí)驗(yàn)組與其他兩組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)各組裸鼠的腫瘤進(jìn)行稱重，實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均重量為（0.35±0.08）g，陰性對(duì)照組為（0.85±0.15）g，空白對(duì)照組為（0.92±0.18）g，實(shí)驗(yàn)組腫瘤重量明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。計(jì)算腫瘤生長抑制率，實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長抑制率達(dá)到了58.82%。這表明ΔNp63特異性shRNA能夠在體內(nèi)有效抑制膀胱移行細(xì)胞癌的生長，顯著降低腫瘤的體積和重量。對(duì)腫瘤組織進(jìn)行病理切片觀察，HE染色結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組腫瘤細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大且深染，核仁明顯，可見較多的核分裂象，腫瘤組織呈浸潤性生長；而實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞排列較為疏松，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)核固縮、核碎裂等凋亡特征，核分裂象明顯減少，腫瘤組織的浸潤程度明顯減輕。這進(jìn)一步證實(shí)了ΔNp63特異性shRNA對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌的生長具有抑制作用，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，改變腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中ΔNp63蛋白的陽性表達(dá)明顯減弱，陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少；而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組腫瘤組織中ΔNp63蛋白陽性表達(dá)較強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)較多。這說明ΔNp63特異性shRNA在體內(nèi)能夠有效抑制ΔNp63蛋白的表達(dá)，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測腫瘤組織中ΔNp63基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中ΔNp63mRNA的表達(dá)量顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05）。具體數(shù)據(jù)為，實(shí)驗(yàn)組ΔNp63mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.32±0.06，陰性對(duì)照組為1.05±0.12，空白對(duì)照組為1.08±0.14。這進(jìn)一步驗(yàn)證了ΔNp63特異性shRNA在體內(nèi)對(duì)ΔNp63基因表達(dá)的抑制作用。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中ΔNp63蛋白的表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05）。以GAPDH為內(nèi)參，對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行半定量分析，實(shí)驗(yàn)組ΔNp63蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.07，陰性對(duì)照組為1.06±0.13，空白對(duì)照組為1.09±0.15。這與免疫組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果一致，充分證明了ΔNp63特異性shRNA能夠顯著抑制膀胱移行細(xì)胞癌裸鼠移植瘤中ΔNp63蛋白的表達(dá)。五、討論5.1ΔNp63在膀胱腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用p63基因作為p53基因家族的重要成員，其編碼產(chǎn)物在細(xì)胞的生長、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過獨(dú)特的啟動(dòng)子和mRNA剪接方式，p63基因產(chǎn)生了多種異構(gòu)體，其中TAp63和ΔNp63是最為主要的兩種。TAp63包含具有轉(zhuǎn)錄激活能力的“TA”域，與p53功能相似，在細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡誘導(dǎo)以及腫瘤抑制等方面發(fā)揮積極作用。在正常細(xì)胞受到DNA損傷時(shí)，TAp63能夠被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯或凋亡，以此來維持基因組的穩(wěn)定性，防止腫瘤的發(fā)生。而ΔNp63含有轉(zhuǎn)錄不活躍的“ΔN”域，其主要功能是拮抗TAp63和p53的活性。在正常生理狀態(tài)下，ΔNp63對(duì)上皮干細(xì)胞的自我更新和增殖起著重要的調(diào)控作用，是上皮干細(xì)胞發(fā)育為腺上皮組織的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在皮膚的發(fā)育過程中，ΔNp63能夠促進(jìn)表皮干細(xì)胞的增殖，維持表皮的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，ΔNp63的角色發(fā)生了顯著轉(zhuǎn)變。眾多研究表明，ΔNp63在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，包括膀胱癌，并且其高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)。本研究通過免疫組化和RT-PCR技術(shù)，對(duì)膀胱癌組織和正常膀胱黏膜組織中ΔNp63的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，膀胱癌組織中ΔNp63的陽性表達(dá)率為80.00%，顯著高于正常膀胱黏膜組織的10.00%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在膀胱移行細(xì)胞癌組織中，ΔNp63mRNA的陽性率也明顯高于正常組，差異具有顯著性（P＜0.01）。這充分表明ΔNp63在膀胱癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，與以往的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ΔNp63的表達(dá)與膀胱尿路上皮癌的病理分級(jí)和臨床分期密切相關(guān)。在高級(jí)別尿路上皮癌組織中，ΔNp63的陽性表達(dá)率顯著高于低級(jí)別組；隨著浸潤程度的增加，從Tis-T1期到T2-T4期，ΔNp63的陽性著色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，陽性表達(dá)率也逐漸升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這說明ΔNp63的表達(dá)水平與膀胱癌的惡性程度密切相關(guān)，其高表達(dá)可能促進(jìn)了膀胱癌的進(jìn)展。ΔNp63在膀胱癌中的高表達(dá)通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在細(xì)胞增殖方面，ΔNp63可以直接與DNA結(jié)合，調(diào)控一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，ΔNp63能夠上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，加速細(xì)胞增殖。ΔNp63還可以通過與E2F1等轉(zhuǎn)錄因子相互作用，激活與DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，進(jìn)一步促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞凋亡方面，ΔNp63能夠抑制促凋亡基因Bax的表達(dá)，Bax是一種促凋亡蛋白，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。ΔNp63抑制Bax的表達(dá)，使得細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗能力增強(qiáng)，從而有利于腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。在細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面，ΔNp63可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。ΔNp63還可以通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在EMT過程中，ΔNp63能夠抑制上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，ΔNp63的高表達(dá)還與膀胱癌對(duì)化療和放療的抗藥性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，ΔNp63可以通過激活PI3K-Akt等信號(hào)通路，上調(diào)抗凋亡蛋白和藥物外排泵的表達(dá)?？沟蛲龅鞍椎纳险{(diào)使得腫瘤細(xì)胞在化療和放療過程中更難發(fā)生凋亡，而藥物外排泵的表達(dá)增加則會(huì)降低化療藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗能力。在放療過程中，ΔNp63高表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞能夠更有效地修復(fù)放療引起的DNA損傷，從而降低放療的敏感性。這也解釋了為什么在臨床上，ΔNp63高表達(dá)的膀胱癌患者對(duì)傳統(tǒng)的化療和放療效果往往不佳，預(yù)后較差。5.2ΔNp63特異性shRNA對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和周期的影響機(jī)制細(xì)胞的增殖、凋亡和周期調(diào)控是維持細(xì)胞正常生理功能和組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵過程，而這些過程的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在膀胱癌中，ΔNp63的高表達(dá)對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡和周期產(chǎn)生了顯著的影響，而ΔNp63特異性shRNA則通過抑制ΔNp63的表達(dá)，對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的這些生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)控。在細(xì)胞增殖方面，本研究結(jié)果表明，ΔNp63特異性shRNA能夠顯著抑制膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞的增殖活性。MTT法檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖速度明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，細(xì)胞生長曲線呈現(xiàn)出明顯的差異。這一結(jié)果與以往的研究報(bào)道一致，如在口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究中，通過抑制ΔNp63的表達(dá)，也觀察到了細(xì)胞增殖受到明顯抑制的現(xiàn)象。深入研究其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ΔNp63在膀胱癌中高表達(dá)時(shí)，能夠通過多種途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖。ΔNp63可以直接與DNA結(jié)合，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)。CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或CDK6結(jié)合，形成復(fù)合物，進(jìn)而磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb），使Rb蛋白失活，釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F能夠激活一系列與DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，加速細(xì)胞增殖。ΔNp63還可以通過與E2F1等轉(zhuǎn)錄因子相互作用，直接激活與DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，進(jìn)一步促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖。而當(dāng)ΔNp63特異性shRNA抑制了ΔNp63的表達(dá)后，上述促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號(hào)通路被阻斷，CyclinD1的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞周期進(jìn)程受到抑制，從而導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞的增殖活性降低。在細(xì)胞凋亡方面，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率顯著高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，表明ΔNp63特異性shRNA能夠誘導(dǎo)膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和防止腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白處于平衡狀態(tài)，當(dāng)受到外界刺激或內(nèi)部信號(hào)調(diào)控時(shí)，這種平衡被打破，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。在膀胱癌中，ΔNp63的高表達(dá)能夠抑制細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，ΔNp63可以抑制促凋亡基因Bax的表達(dá)。Bax是一種促凋亡蛋白，它能夠在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放