大單元八生物技術(shù)與工程——基因工程【知識回顧】【資料】2019年底，新冠病毒在武漢被首次發(fā)現(xiàn)。2020年，疫情迅速蔓延至全球，成為世界性大流行疾病?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)病毒表面S刺突蛋白可以作為疫苗的抗原，使人體獲得相應(yīng)的免疫能力。如何利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)大量的S蛋白？通過哪些途徑獲取S蛋白的相關(guān)基因？一、目的基因的篩選和獲取建立基因組文庫建立cDNA文庫序列未知序列已知獲取目的基因化學(xué)合成PCR擴(kuò)增依據(jù)基因工程生產(chǎn)S蛋白用

切割

與載體，再用

連接，形成重組DNA分子。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建限制性內(nèi)切核酸酶S蛋白基因DNA連接酶【任務(wù)一】選擇合適的限制酶S蛋白基因依據(jù)基因工程生產(chǎn)S蛋白【歸納拓展】1.限制酶的選擇技巧(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點選擇限制酶①應(yīng)選擇切點位于目的基因兩端的限制酶,不能選擇切點位于目的基因內(nèi)部的限制酶；②為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和反向連接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒。(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點選擇限制酶(如圖)二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建依據(jù)基因工程生產(chǎn)S蛋白繪制產(chǎn)S蛋白的大腸桿菌流程圖；繪制產(chǎn)S蛋白的煙草流程圖；繪制產(chǎn)S蛋白的動物細(xì)胞流程圖?！救蝿?wù)二】按照基因工程步驟，選擇性合適的詞條，繪制產(chǎn)S蛋白的流程圖質(zhì)粒、S蛋白基因、重組質(zhì)粒、中國倉鼠卵巢細(xì)胞、Ti質(zhì)粒（含T-DNA）、動物細(xì)胞培養(yǎng)、重組Ti質(zhì)粒、農(nóng)桿菌、脫分化、愈傷組織、再分化、煙草細(xì)胞、CaCl2、大腸桿菌、S蛋白前體、S蛋白、煙草植株依據(jù)基因工程生產(chǎn)S蛋白繪制產(chǎn)S蛋白的大腸桿菌流程圖CaCl2處理質(zhì)粒胰島素基因重組質(zhì)粒大腸桿菌S蛋白前體思考2.為什么通過大腸桿菌生產(chǎn)的S蛋白的生物活性較低？大腸桿菌中沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體，無法對S蛋白進(jìn)一步加工修飾。思考1.使用CaCl2處理大腸桿菌的目的是什么？使大腸桿菌處于易于吸收周圍DNA分子的生理狀態(tài)。依據(jù)基因工程生產(chǎn)S蛋白重組Ti質(zhì)粒S蛋白基因Ti質(zhì)粒（含T-DNA）農(nóng)桿菌煙草細(xì)胞CaCl2侵染愈傷組織脫分化再分化煙草植株S蛋白繪制產(chǎn)S蛋白的煙草流程圖依據(jù)基因工程生產(chǎn)S蛋白繪制產(chǎn)S蛋白的動物細(xì)胞流程圖。思考：動物細(xì)胞培養(yǎng)需要提供哪些條件？①營養(yǎng)物質(zhì)：②適宜的生長環(huán)境細(xì)胞生存的營養(yǎng)物質(zhì)，還要添加一些天然成分，如動物血清等無菌、無毒環(huán)境；適宜的溫度和PH、滲透壓；95%的空氣和5%CO2氣體環(huán)境。中國倉鼠卵巢細(xì)胞S蛋白基因質(zhì)粒重組質(zhì)粒動物細(xì)胞培養(yǎng)S蛋白顯微注射依據(jù)基因工程生產(chǎn)S蛋白四、目的基因的檢測與鑒定依據(jù)基因工程生產(chǎn)S蛋白四、目的基因的檢測與鑒定如何對S蛋白的各個水平進(jìn)行檢測與鑒定PCR技術(shù)檢測S蛋白基因是否導(dǎo)入PCR技術(shù)檢測S蛋白基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA設(shè)計引物PCR擴(kuò)增S蛋白基因瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶有無及大小判斷提取S蛋白基因依據(jù)基因工程生產(chǎn)S蛋白逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA設(shè)計引物PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶有無及大小判斷提取S蛋白的mRNA四、目的基因的檢測與鑒定如何對S蛋白的各個水平進(jìn)行檢測與鑒定抗原-抗體雜交技術(shù)檢測S蛋白是否成功表達(dá)在S蛋白特異性抗體酶標(biāo)板中加入待測的S蛋白樣品，如果出現(xiàn)陽性，則S蛋白成功表達(dá)。動物模擬實驗檢測S蛋白是否具有抗原效應(yīng)將提取的S蛋白注射到實驗動物體內(nèi)，培養(yǎng)一段時間后，檢測實驗動物體內(nèi)的抗體水平。依據(jù)基因工程生產(chǎn)S蛋白1.(2023·湖北卷)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒,構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒),并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯誤的是(

)【鏈真題

明方向】A.若用HindⅢ酶切,目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落,不一定含有目的基因?qū)蛹壎黄?聚焦11.(2023·湖北卷)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒,構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒),并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯誤的是(

)【鏈真題

明方向】C.若用SphⅠ酶切,可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D.若用SphⅠ酶切,攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落D突破點1突破點2突破點33.(2024·黑龍江齊齊哈爾三模)人乳鐵蛋白廣泛分布于乳汁等外分泌液中,在初乳中含量較高,對細(xì)菌、真菌和病毒等有抑制作用。下圖表示利用基因工程技術(shù)構(gòu)建人乳鐵蛋白基因重組質(zhì)粒的過程(圖中Tetr表示四環(huán)素抗性基因,Ampr表示氨芐青霉素抗性基因),五種限制酶的識別序列及切割位點如下表所示?；卮鹣铝袉栴}。突破點1突破點2突破點3突破點1突破點2突破點3(1)要將人乳鐵蛋白基因插入載體中,若只允許使用一種限制酶,應(yīng)選擇的限制酶是

?；蚬こ碳夹g(shù)中通常選擇

種限制酶進(jìn)行酶切。(2)人乳鐵蛋白基因可利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增需要引物_________(在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”中選擇),連續(xù)擴(kuò)增5次后至少需要引物

個。(3)據(jù)圖分析,成功獲得含有人乳鐵蛋白基因的重組質(zhì)粒需要在含有

(填“四環(huán)素”或“氨芐青霉素”)的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,然后將需要的重組質(zhì)粒導(dǎo)入牛的受精卵,再利用

工程技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因小牛。Sau3AⅠ2Ⅱ、Ⅲ62氨芐青霉素胚胎大單元八生物技術(shù)與工程突破3聚焦2基因編輯技術(shù)及其應(yīng)用P133CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)①構(gòu)建CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒②導(dǎo)入受體細(xì)胞③轉(zhuǎn)錄出sgRNA與Cas9蛋白形成復(fù)合體④復(fù)合體中的sgRNA引導(dǎo)識別目標(biāo)DNA序列，Cas9蛋白將雙鏈剪切。復(fù)合體作用類似于限制酶，切割磷酸二酯鍵，一般產(chǎn)生平末端。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)⑤激活細(xì)胞自身修復(fù)機(jī)制相應(yīng)的酶會將切口連接起來，由于Cas9蛋白剪切時會導(dǎo)致堿基的損傷或修飾，相應(yīng)的酶會將損傷的堿基切除，最終可能發(fā)生移碼突變或終止密碼子提前，導(dǎo)致基因的功能缺失達(dá)到敲除基因的目的。......AGCTCCGATCGA............TCGAGGCTAGCT......CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)⑥檢測基因敲除是否成功DNA分子雜交技術(shù)：利用堿基互補(bǔ)配對原理，通過標(biāo)記的探針（一小段單鏈DNA或RNA）與目標(biāo)DNA結(jié)合，從而檢測或定位特定基因序列的技術(shù)。探針只與完全或高度相同的序列結(jié)合，才能出現(xiàn)雜交帶。突破點1突破點2突破點3【命題設(shè)計】(2)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)有時存在編輯對象出錯而“脫靶”的現(xiàn)象,sgRNA的識別序列越短,基因編輯的脫靶率就越高。請分析原因。_____________________________________________________________。sgRNA的識別序列短,特異性差,容易與其他DNA片段結(jié)合造成編輯出錯突破點1突破點2突破點3【練模擬

拓角度】5.(2024·廣東佛山二模)為解決跨物種器官移植出現(xiàn)的免疫排斥反應(yīng),研究者提出了如下思路:剔除豬的某些基因,用豬的器官作為供體。借助CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以剔除豬的相關(guān)基因,下圖為Cas9蛋白依據(jù)sgRNA片段切割DNA的示意圖(設(shè)計特定的sgRNA可以識別需剔除的DNA序列)。下列相關(guān)敘述錯誤的是(

)突破點1突破點2突破點3A.上述需要剔除的基因可能是標(biāo)明豬細(xì)胞身份的標(biāo)簽蛋白基因B.上述基因編輯過程還需細(xì)胞內(nèi)的限制酶及DNA連接酶參與C.上述基因編輯技術(shù)能定點切除的目標(biāo)基因取決于sgRNAD.可以利用顯微注射技術(shù)將Cas9-sgRNA復(fù)合體導(dǎo)入豬的受精卵答案

B大單元八生物技術(shù)與工程層級三PCR技術(shù)及應(yīng)用P137【知識回顧】PCR擴(kuò)增DNA的過程變性復(fù)性延伸50°C左右72°C左右、耐高溫DNA聚合酶2種引物設(shè)計的原則：①能與目標(biāo)序列的3'端堿基互補(bǔ)配對；②引物不能自身環(huán)化或相互配對；③引物長度適中，過短特異性差。1.重疊延伸PCR技術(shù)（定點突變，如堿基對A-T突變?yōu)镃-G）1.重疊延伸PCR技術(shù)（基因拼接）引物2與引物3可以堿基互補(bǔ)配對。3'3'5'5'3'5'5'3'5'3'3'5'【歸納總結(jié)】(1)基因定點突變,該技術(shù)要使用四種引物?？疾閮?nèi)容可涉及與突變位點配對的引物設(shè)計情況、兩個階段引物的選擇、擴(kuò)增體系及產(chǎn)物等。解答此技術(shù)相關(guān)問題時可結(jié)合題圖依據(jù)以下原則:引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點,而這兩條引物有部分堿基(包括突變位點)是可以互補(bǔ)的。因此,分別利用引物1和2、引物3和4進(jìn)行PCR后,得到的DNA片段可以通過引物2和3互補(bǔ)的堿基雜交在一起,再在DNA聚合酶的作用下延伸,就能成為一條完整的DNA片段。最后,用引物1和4進(jìn)行擴(kuò)增得到含有突變位點的DNA片段。通過測序可以檢驗定點突變是否成功。(2)構(gòu)建融合基因,重疊延伸PCR還可以用于兩個或兩個以上異源基因DNA片段的拼接。引物上含有末端互補(bǔ)序列,通過PCR產(chǎn)生的兩個DNA片段可通過引物延伸進(jìn)行剪接和擴(kuò)增,從而獲得重組體,與定點突變不同的是待融合基因的PCR產(chǎn)物來自兩個不同的基因,通過引物在兩種PCR產(chǎn)物中產(chǎn)生互相重疊的鏈而獲得融合基因?！練w納總結(jié)】2.反向PCR技術(shù)原理是:用限制性內(nèi)切核酸酶切割該DNA,隨后使用DNA連接酶將獲得的酶切產(chǎn)物環(huán)化,這樣就獲得了已知序列兩側(cè)攜帶有未知序列的環(huán)狀DNA分子。以該已知序列為模板設(shè)計一對相反方向的特異性引物,該引物對已知序列反向,但對未知序列卻是相向的,從而得以擴(kuò)增出未知序列。已知序列【例2】反向PCR是一種通過已知序列設(shè)計引物對未知序列進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù),其過程如下圖所示。下列敘述正確的是(

)注:引物分別與臨近的DNA鏈互補(bǔ)配對。

A.應(yīng)選擇引物1和引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增B.設(shè)計的引物中G、C堿基含量越高,復(fù)性的溫度越低C