X線反復(fù)照射人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150的生物效應(yīng)及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景食管癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重點關(guān)注的對象。根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，食管癌在全球癌癥發(fā)病率中位居前十，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量與生存期限。我國是食管癌的高發(fā)國家，每年新診斷病例數(shù)約占全世界的1/2，死亡率高達(dá)17.38/10萬，在全部惡性腫瘤死亡原因中位居第四。這一嚴(yán)峻的現(xiàn)狀給患者家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)與精神負(fù)擔(dān)，也對我國的醫(yī)療資源造成了巨大的壓力。在食管癌的治療手段中，放療占據(jù)著不可或缺的重要地位。對于臨床確診時約70%-80%已喪失手術(shù)機(jī)會的患者而言，放療成為了局部晚期食管癌的主要治療手段。早期食管癌患者若拒絕手術(shù)或因內(nèi)科疾病不宜手術(shù)，放療可作為有效的替代方案；上胸段和頸段食管癌，因鄰近器官限制及手術(shù)創(chuàng)面大，放療療效優(yōu)于手術(shù)；中胸段食管癌若腫瘤明顯外侵，與主動脈間隙完全消失，不宜手術(shù)時，放療也能發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，食管癌術(shù)前和術(shù)后新輔助及輔助放療，理論上可提高治愈率；晚期食管癌予以局部放療能減輕患者疼痛及梗阻不適癥狀，控制局部病情，提高患者生活質(zhì)量。然而，目前無論是單一放療還是標(biāo)準(zhǔn)的同步放化療，治療效果仍不盡人意。單一放療的2年存活率僅約10%，標(biāo)準(zhǔn)同步放化療的5年生存率也僅在20%左右，且50%以上的病例治療后會出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)。這表明食管癌治療過程中存在的放療抵抗問題，極大地阻礙了放療效果的進(jìn)一步提升，成為亟待解決的關(guān)鍵難題。深入探究食管癌放療抵抗的機(jī)制，對于提高放療效果、改善患者預(yù)后具有重要意義。腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為可能與放射抗拒性的形成密切相關(guān)，研究其在食管癌放療抵抗中的作用機(jī)制，有助于找到臨床可干預(yù)的新靶點。而在細(xì)胞實驗層面，通過X線反復(fù)照射人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150，觀察其生物效應(yīng)，如細(xì)胞形態(tài)、染色體、放射敏感性、細(xì)胞周期分布以及腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)等方面的變化，能夠為揭示食管癌放療抵抗機(jī)制提供重要的實驗依據(jù)。這不僅有助于從細(xì)胞和分子層面深入理解食管癌放療抵抗的本質(zhì)，還可能為開發(fā)新的治療策略、設(shè)計針對性的治療方案提供理論支持，從而為提高食管癌的治療效果帶來新的希望，具有重要的臨床價值和現(xiàn)實意義。1.2人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150概述人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150來源于一名49歲接受放療后從上（頸部）食管切除低分化食管鱗狀細(xì)胞癌患者的腫瘤組織，該腫瘤侵犯了鄰近結(jié)構(gòu)。因其源自食管鱗癌，故而保留了食管鱗癌的部分生物學(xué)特性，為研究食管鱗癌的發(fā)病機(jī)制、治療靶點及藥物篩選等提供了極具價值的體外研究模型。在細(xì)胞形態(tài)上，KYSE-150呈現(xiàn)上皮細(xì)胞樣特征，生長特性為貼壁生長，這一特性使得其在體外培養(yǎng)過程中能夠較為穩(wěn)定地生長與傳代，便于實驗操作與觀察。在培養(yǎng)條件方面，推薦使用含RPMI-1640、Ham'sF-12以及10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基，在5%CO?、37℃的環(huán)境下培養(yǎng)，細(xì)胞倍增時間約為13-25小時。由于其與食管鱗癌的高度相關(guān)性，KYSE-150細(xì)胞系在食管癌研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。在研究食管癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制時，科研人員通過對該細(xì)胞系進(jìn)行基因編輯、信號通路調(diào)控等實驗操作，深入探究相關(guān)基因和信號通路在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用；在評估新型抗癌藥物療效時，以KYSE-150細(xì)胞系為模型，觀察藥物對細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，從而為藥物研發(fā)提供重要的實驗依據(jù)。例如，在探索某一潛在抗癌藥物對食管鱗癌的作用時，將藥物作用于KYSE-150細(xì)胞，通過檢測細(xì)胞活力、凋亡率以及相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化，判斷藥物的抗癌效果及作用機(jī)制。正是由于其在食管癌研究中的廣泛應(yīng)用與重要價值，選擇KYSE-150細(xì)胞系進(jìn)行X線反復(fù)照射的生物效應(yīng)研究，對于揭示食管癌放療抵抗機(jī)制具有重要意義。1.3X線照射對細(xì)胞系影響的研究現(xiàn)狀X線作為一種電離輻射，在腫瘤放療中被廣泛應(yīng)用，其對不同細(xì)胞系的影響一直是科研領(lǐng)域的研究重點。在肺癌細(xì)胞系研究中，有學(xué)者對肺癌細(xì)胞系NCI-H226和A549進(jìn)行不同劑量（2、4、8和12Gy）的X射線照射，并在照射前和照射后6、12、24、36和48h分別提取RNA，采用RT-PCR技術(shù)檢測各時相p57^kip2mRNA的含量，結(jié)果顯示兩組肺癌細(xì)胞p57的轉(zhuǎn)錄表達(dá)在不同照射劑量和不同時間水平間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，A549經(jīng)過X射線照射后，p57^kip2的mRNA含量明顯升高，且與照射劑量呈線性依賴關(guān)系；NCI-H226雖然未見明顯規(guī)律，但在X射線照射后的峰值mRNA含量均明顯升高，這表明X射線照射后能夠上調(diào)肺癌細(xì)胞p57^kip2的mRNA的表達(dá)，預(yù)示著p57可能參與了放射線所致細(xì)胞周期重新分布和細(xì)胞凋亡的過程，并且可能預(yù)測肺癌細(xì)胞的放射敏感性。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的相關(guān)研究中，科研人員采用瓊脂糖培養(yǎng)法建立U87多細(xì)胞球體模型，用0、1、5、10Gy的X線分別照射多細(xì)胞球體，利用高氯酸提取細(xì)胞中水溶性代謝物［膽堿（Cho）、肌酸（Cr）、N-乙酰天門冬氨酸（NAA）］，采用14.7T高場強(qiáng)磁共振儀獲取水溶性代謝物波譜，并采用明膠酶譜法測量U87多細(xì)胞球體上清中基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）活性。結(jié)果表明，多細(xì)胞球體在1、5、10GyX線照射下的膽堿與肌酸比值（Cho/Cr）較對照組升高，且在0-10GyX線照射范圍內(nèi)，隨著照射劑量的增加，細(xì)胞MMP-2活性增加，這說明亞致死劑量的X線可導(dǎo)致U87膠質(zhì)瘤多細(xì)胞球體MMP-2活性增高，Cho/Cr升高。針對人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150，目前已有研究通過分次照射建立了人食管鱗癌放射抗拒性細(xì)胞系KYSE-150R。在細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面，與親代細(xì)胞KYSE-150相比，KYSE-150R細(xì)胞的群體倍增時間延長；染色體分析顯示，KYSE-150R細(xì)胞的染色體數(shù)目增加，并出現(xiàn)染色體畸變。放射敏感性實驗表明，KYSE-150R細(xì)胞SF2、D0、Dq及N值均高于KYSE-150細(xì)胞，D0值比為1.21，說明KYSE-150R細(xì)胞具有更強(qiáng)的放射抗拒性。細(xì)胞周期分布檢測發(fā)現(xiàn)，KYSE-150細(xì)胞照射后S期比例增加，G2+M期比例下降，而KYSE-150R則變化不大。在腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)上，通過WesternBlotting法檢測發(fā)現(xiàn)，KYSE-150R中的β-catenin和Integrin-β1的表達(dá)量約為KYSE-150細(xì)胞的2倍，提示新細(xì)胞系KYSE-150R含有的腫瘤干細(xì)胞比例較其親本高，證明腫瘤干細(xì)胞與放射抗拒性產(chǎn)生機(jī)制有關(guān)。盡管當(dāng)前關(guān)于X線照射對細(xì)胞系影響的研究取得了一定成果，但對于人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150在X線反復(fù)照射下的生物效應(yīng)研究仍存在不足。多數(shù)研究僅聚焦于單次或有限次數(shù)的照射，對于X線反復(fù)照射過程中細(xì)胞的動態(tài)變化、細(xì)胞內(nèi)信號通路的持續(xù)性改變以及腫瘤干細(xì)胞特性的動態(tài)演變等方面的研究尚顯匱乏。在細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制方面，雖然已知X線照射會引起細(xì)胞周期分布的改變，但對于KYSE-150細(xì)胞系在反復(fù)照射下細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的時序性變化，以及這些變化如何與放射抗拒性的逐漸形成相互關(guān)聯(lián)，目前還缺乏深入的探討。此外，關(guān)于腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物在X線反復(fù)照射下的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以及如何通過干預(yù)這一網(wǎng)絡(luò)來克服食管癌放療抵抗，也有待進(jìn)一步的研究探索。這些不足為后續(xù)對KYSE-150細(xì)胞系的深入研究指明了方向。1.4研究目的與意義本研究旨在通過X線反復(fù)照射人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150，深入探究其生物效應(yīng)及潛在機(jī)制。具體而言，在細(xì)胞形態(tài)學(xué)層面，通過高分辨率相差顯微鏡細(xì)致觀察細(xì)胞形態(tài)在照射過程中的動態(tài)變化，如細(xì)胞大小、形狀、表面結(jié)構(gòu)等方面的改變，以及細(xì)胞間連接的變化情況，分析這些形態(tài)變化與細(xì)胞生理功能改變之間的關(guān)聯(lián)。在染色體層面，運(yùn)用先進(jìn)的染色體顯帶技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)，精確檢測染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)的變化，以及基因位點的改變，明確染色體畸變在食管癌放療抵抗中的作用機(jī)制。在放射敏感性方面，采用克隆形成實驗、細(xì)胞存活曲線分析等方法，準(zhǔn)確測定不同照射劑量和照射次數(shù)下細(xì)胞的放射敏感性，建立放射敏感性與照射參數(shù)之間的量化關(guān)系，為臨床放療劑量的優(yōu)化提供理論依據(jù)。在細(xì)胞周期分布上，借助流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白檢測等技術(shù)，深入研究細(xì)胞周期各時相比例的變化，以及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白和基因表達(dá)的改變，揭示細(xì)胞周期調(diào)控與放射抗拒性形成之間的內(nèi)在聯(lián)系。在腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)方面，利用蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫熒光染色、實時定量PCR等技術(shù)，全面檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化，解析腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在食管癌放療抵抗中的作用機(jī)制。本研究具有重要的臨床意義。對于食管癌放療而言，深入了解X線反復(fù)照射下KYSE-150細(xì)胞的生物效應(yīng)，有助于為臨床放療方案的制定提供更為科學(xué)、精準(zhǔn)的依據(jù)。通過揭示食管癌放療抵抗的分子機(jī)制，可以針對性地開發(fā)新的治療策略，如設(shè)計特異性的分子靶向藥物，聯(lián)合放療以克服放療抵抗，從而顯著提高放療效果，為食管癌患者帶來更好的治療前景。在臨床實踐中，醫(yī)生可以根據(jù)本研究的成果，為不同患者制定個性化的放療方案，優(yōu)化放療劑量和照射次數(shù)，提高治療的有效性和安全性，降低放療相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險，改善患者的生活質(zhì)量和生存預(yù)后。此外，本研究還可能為食管癌的早期診斷和預(yù)后評估提供新的生物標(biāo)志物，有助于實現(xiàn)食管癌的精準(zhǔn)診療，推動食管癌治療領(lǐng)域的發(fā)展與進(jìn)步。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1細(xì)胞系人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。細(xì)胞復(fù)蘇時，從液氮罐中取出凍存管，迅速置于37℃水浴鍋中，輕輕晃動使其快速解凍。待凍存管內(nèi)液體完全融化后，用75%酒精擦拭凍存管表面進(jìn)行消毒，隨后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基的離心管中。在1000rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再將細(xì)胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)所用的完全培養(yǎng)基由RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含Ham'sF-12）、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素雙抗組成。每2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次，加入1-2mL0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時，迅速加入3-4mL含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:2-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。2.1.2主要試劑與儀器實驗所需的主要試劑包括：RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含Ham'sF-12），規(guī)格為500mL/瓶，購自Gibco公司，用于提供細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)；胎牛血清（FBS），規(guī)格為500mL/瓶，購自ThermoFisherScientific公司，富含多種生長因子和營養(yǎng)成分，能促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖；青霉素-鏈霉素雙抗，規(guī)格為100×，購自Solarbio公司，每瓶10mL，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染；0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，規(guī)格為100mL/瓶，購自Sigma公司，用于消化貼壁細(xì)胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫落，便于傳代操作；二甲基亞砜（DMSO），分析純，規(guī)格為500mL/瓶，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，在細(xì)胞凍存時作為凍存保護(hù)劑，可降低細(xì)胞在凍存過程中的損傷。主要儀器有：二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientificForma3111），溫度控制精度為±0.1℃，CO?濃度控制精度為±0.1%，用于提供細(xì)胞生長所需的穩(wěn)定環(huán)境，包括適宜的溫度、濕度和CO?濃度；倒置相差顯微鏡（OlympusCKX41），具有高分辨率和清晰的成像效果，可用于實時觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況；離心機(jī)（Eppendorf5810R），最大轉(zhuǎn)速可達(dá)14000rpm，用于細(xì)胞離心操作，如收集細(xì)胞、更換培養(yǎng)基時去除上清液等；X線照射儀（VarianClinaciX），可產(chǎn)生高能X射線，用于對細(xì)胞進(jìn)行照射處理，其照射劑量和時間可根據(jù)實驗需求進(jìn)行精確設(shè)置；流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur），能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，在本實驗中用于檢測細(xì)胞周期分布情況；蛋白質(zhì)免疫印跡相關(guān)設(shè)備，包括電泳儀（Bio-RadPowerPacBasic）、轉(zhuǎn)膜儀（Bio-RadTrans-BlotSDSemi-DryTransferCell）和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocXRS+），用于檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平。2.2實驗方法2.2.1X線照射方案設(shè)計將處于對數(shù)生長期的KYSE-150細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為5×10?個，待細(xì)胞貼壁生長至80%-90%融合度時進(jìn)行X線照射處理。使用X線照射儀（VarianClinaciX），設(shè)定照射條件為：管電壓6MV，劑量率300MU/min。采用分次照射方式，總照射劑量為60Gy，分30次完成，每次照射劑量為2Gy，照射時間為40秒，每周照射5次，持續(xù)照射6周。在每次照射前，將6孔板從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出，置于X線照射儀的照射平臺上，確保細(xì)胞均勻接受照射。照射結(jié)束后，迅速將6孔板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，以維持細(xì)胞的正常生長環(huán)境。2.2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察在X線照射前及每次照射后24小時，采用相差顯微鏡（OlympusCKX41）對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察與記錄。具體操作如下：將6孔板輕輕放置于相差顯微鏡的載物臺上，避免震動對細(xì)胞造成影響。首先在低倍鏡（100×）下對細(xì)胞進(jìn)行整體觀察，觀察細(xì)胞的分布情況、細(xì)胞密度以及細(xì)胞群體的整體形態(tài)。然后轉(zhuǎn)換至高倍鏡（400×），仔細(xì)觀察單個細(xì)胞的形態(tài)特征，包括細(xì)胞的形狀、大小、細(xì)胞膜的完整性、細(xì)胞質(zhì)的均勻度以及細(xì)胞核的形態(tài)和大小。對于形態(tài)發(fā)生明顯變化的細(xì)胞，如細(xì)胞變圓、皺縮、出現(xiàn)突起或偽足等，使用顯微鏡自帶的攝像系統(tǒng)進(jìn)行拍照記錄，并標(biāo)注拍攝時間和照射次數(shù)。在整個觀察過程中，保持顯微鏡的光源強(qiáng)度、對比度和焦距穩(wěn)定，以確保觀察結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。2.2.3染色體分析在完成總劑量照射后，收集細(xì)胞進(jìn)行染色體分析。具體步驟為：向培養(yǎng)瓶中加入終濃度為0.05μg/mL的秋水仙素，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育4小時，以阻止細(xì)胞有絲分裂于中期，使染色體停留在較為分散的狀態(tài)。孵育結(jié)束后，棄去含秋水仙素的培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞2次，然后加入0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，消化1-2分鐘，待細(xì)胞變圓脫落后，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。向細(xì)胞沉淀中緩慢加入預(yù)溫至37℃的0.075MKCl低滲液8mL，輕輕吹打混勻，置于37℃水浴鍋中低滲處理30分鐘，使細(xì)胞膨脹，染色體分散。低滲處理結(jié)束后，加入2mL預(yù)冷的固定液（甲醇：冰醋酸=3:1），輕輕混勻，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。重復(fù)固定步驟2-3次，每次固定15-20分鐘，以確保細(xì)胞充分固定。最后，將固定好的細(xì)胞懸液滴于預(yù)冷的載玻片上，每片滴加2-3滴，輕輕吹散，自然干燥。采用G顯帶法進(jìn)行顯帶處理，將載玻片放入37℃的0.025%胰蛋白酶溶液中消化30-60秒，然后迅速放入Giemsa染液中染色10-15分鐘。染色結(jié)束后，用蒸餾水沖洗載玻片，自然干燥。在顯微鏡下（1000×）觀察染色體形態(tài)，選取50個以上分散良好的中期分裂相，分析染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)變化，包括染色體缺失、易位、倒位、雙著絲粒染色體等畸變情況。2.2.4放射敏感性檢測采用成克隆實驗檢測細(xì)胞放射敏感性。在X線照射前，將KYSE-150細(xì)胞以每皿50、100、200、400、800個的密度接種于直徑60mm的培養(yǎng)皿中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。接種后將培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細(xì)胞貼壁。然后對細(xì)胞進(jìn)行不同劑量（0、2、4、6、8Gy）的X線照射。照射結(jié)束后，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天，期間每3-4天更換一次培養(yǎng)基。待肉眼可見明顯的細(xì)胞克隆形成時，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕潤洗細(xì)胞2次，然后加入4%多聚甲醛固定15-20分鐘。固定結(jié)束后，棄去多聚甲醛，用蒸餾水沖洗培養(yǎng)皿2-3次。加入適量的結(jié)晶紫染液，染色10-15分鐘，使細(xì)胞克隆染色。染色結(jié)束后，用蒸餾水沖洗培養(yǎng)皿，去除多余的染液，自然干燥。在顯微鏡下計數(shù)含有50個細(xì)胞以上的克隆數(shù)。根據(jù)公式計算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（SurvivingFraction，SF）：SF=實際克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×接種效率。其中，接種效率=對照組克隆數(shù)/對照組接種細(xì)胞數(shù)。以照射劑量為橫坐標(biāo)，存活分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞存活曲線。采用線性二次模型（Linear-Quadraticmodel，LQ模型）擬合存活曲線，計算放射敏感性相關(guān)參數(shù)，包括D0（平均致死劑量，使細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)為37%所需的照射劑量）、Dq（準(zhǔn)閾劑量，反映細(xì)胞亞致死損傷修復(fù)能力的參數(shù)）、N（外推值，反映細(xì)胞內(nèi)所含的放射敏感區(qū)域數(shù)）和SF2（2Gy照射劑量下的存活分?jǐn)?shù)）。2.2.5細(xì)胞周期分布檢測在X線照射后24小時，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布。收集照射后的細(xì)胞，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗2次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。向細(xì)胞沉淀中加入0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，消化1-2分鐘，待細(xì)胞變圓脫落后，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL。取1mL細(xì)胞懸液，緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇，邊加邊輕輕混勻，置于4℃冰箱固定過夜。固定結(jié)束后，1000rpm離心5分鐘，棄去乙醇。用PBS潤洗細(xì)胞2次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。向細(xì)胞沉淀中加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PropidiumIodide，PI）和100μg/mLRNaseA的染色緩沖液，輕輕混勻，37℃避光孵育30分鐘，使PI與細(xì)胞內(nèi)的DNA充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，使用流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur）進(jìn)行檢測。采用CellQuest軟件獲取至少10000個細(xì)胞的檢測數(shù)據(jù)，用ModFit軟件分析細(xì)胞周期各時相（G0/G1期、S期、G2/M期）的比例。2.2.6腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物檢測采用WesternBlotting法檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物β-catenin和Integrin-β1的表達(dá)。在X線照射后48小時，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS潤洗2次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。向細(xì)胞沉淀中加入適量的RIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30分鐘，期間每隔5-10分鐘輕輕振蕩一次，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液至新的離心管中，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)測定的蛋白濃度，將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5-10分鐘，使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：300mA恒流轉(zhuǎn)膜90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1-2小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液（β-catenin抗體和Integrin-β1抗體均按1:1000稀釋，內(nèi)參GAPDH抗體按1:5000稀釋）中，4℃孵育過夜。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次洗滌10-15分鐘。將PVDF膜放入二抗稀釋液（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體按1:5000稀釋）中，室溫孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次洗滌10-15分鐘。采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）進(jìn)行顯色，將PVDF膜與ECL發(fā)光液充分接觸，曝光于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocXRS+）中，獲取蛋白條帶圖像。使用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算β-catenin和Integrin-β1的相對表達(dá)量。2.3數(shù)據(jù)分析方法本實驗采用SPSS26.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。所有實驗均獨立重復(fù)至少3次，確保數(shù)據(jù)的可靠性和重復(fù)性。對于計量資料，如細(xì)胞周期各時相比例、腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物相對表達(dá)量等，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，用于比較照射前與照射后的細(xì)胞周期分布差異、照射組與對照組的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)差異等。多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若方差齊性，進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較，例如在分析不同照射劑量下細(xì)胞放射敏感性參數(shù)（D0、Dq、N、SF2）的差異時，采用此方法。對于細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、染色體分析等定性資料，采用描述性統(tǒng)計分析，詳細(xì)記錄和描述觀察到的細(xì)胞形態(tài)變化特征、染色體畸變類型及數(shù)量等。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，此時認(rèn)為實驗結(jié)果具有顯著性差異，能夠為研究結(jié)論提供有力支持；以P<0.01為差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義，表明結(jié)果差異更為顯著，在數(shù)據(jù)分析中嚴(yán)格把控差異顯著性水平，確保研究結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。三、X線反復(fù)照射對KYSE-150細(xì)胞的生物效應(yīng)結(jié)果3.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化在X線照射前，通過相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，KYSE-150細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞呈多邊形或短梭形，邊界清晰，細(xì)胞間連接緊密，貼壁生長且分布較為均勻，細(xì)胞核大而圓，位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)豐富且均勻，無明顯顆?；蚩张?。在細(xì)胞群體層面，細(xì)胞排列較為規(guī)則，呈單層緊密排列，無明顯的細(xì)胞重疊現(xiàn)象。隨著X線照射次數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生顯著變化。在照射5次后，部分細(xì)胞開始出現(xiàn)形態(tài)改變，細(xì)胞體積增大，形狀變得不規(guī)則，部分細(xì)胞呈現(xiàn)出拉長或變圓的趨勢。細(xì)胞邊界變得模糊，細(xì)胞間連接也開始變得松散，出現(xiàn)了一些細(xì)胞脫離貼壁層的現(xiàn)象。此時，細(xì)胞群體的排列也開始變得紊亂，出現(xiàn)了局部細(xì)胞聚集和稀疏區(qū)域相間的情況。當(dāng)照射次數(shù)達(dá)到10次時，細(xì)胞形態(tài)變化更為明顯。大部分細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，部分細(xì)胞呈現(xiàn)出巨大化，細(xì)胞形狀多樣，出現(xiàn)了不規(guī)則的多邊形、長梭形以及不規(guī)則分支狀等。細(xì)胞邊界變得極為模糊，細(xì)胞間連接明顯減少，大量細(xì)胞脫離貼壁層，懸浮于培養(yǎng)液中。在細(xì)胞群體層面，細(xì)胞排列雜亂無章，細(xì)胞聚集現(xiàn)象更為顯著，形成了大小不一的細(xì)胞團(tuán)塊。同時，細(xì)胞的運(yùn)動性增強(qiáng)，在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞在培養(yǎng)皿中緩慢移動。照射15次后，細(xì)胞形態(tài)進(jìn)一步惡化。細(xì)胞體積繼續(xù)增大，部分細(xì)胞出現(xiàn)明顯的皺縮和變形，細(xì)胞膜表面出現(xiàn)許多突起和偽足。細(xì)胞核形態(tài)也發(fā)生改變，出現(xiàn)核固縮、核碎裂等現(xiàn)象，部分細(xì)胞核偏離細(xì)胞中央位置。細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量空泡，細(xì)胞器分布紊亂。細(xì)胞間連接幾乎消失，細(xì)胞大量死亡，培養(yǎng)液中出現(xiàn)較多的細(xì)胞碎片。細(xì)胞群體呈現(xiàn)出離散狀態(tài)，細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)一步解體，存活細(xì)胞數(shù)量明顯減少。照射20次后，細(xì)胞形態(tài)變化達(dá)到較為嚴(yán)重的程度。大部分細(xì)胞呈現(xiàn)出異常的形態(tài)，如極度拉長、扭曲，甚至出現(xiàn)多核細(xì)胞。細(xì)胞膜完整性受損，出現(xiàn)破裂和滲漏現(xiàn)象。細(xì)胞核嚴(yán)重變形，染色質(zhì)凝集，部分細(xì)胞核消失。細(xì)胞質(zhì)中的空泡融合成大的液泡，細(xì)胞器幾乎無法辨認(rèn)。細(xì)胞間幾乎不存在連接，細(xì)胞大量死亡，僅少數(shù)細(xì)胞仍保持相對完整的形態(tài)，但也呈現(xiàn)出明顯的衰老特征，如細(xì)胞扁平、體積增大、色素沉著等。照射30次完成總劑量照射后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了根本性的改變。存活的細(xì)胞數(shù)量極少，且形態(tài)嚴(yán)重異常。細(xì)胞體積大小不一，形狀極不規(guī)則，呈現(xiàn)出各種奇異的形態(tài)。細(xì)胞膜嚴(yán)重受損，幾乎無法維持完整的結(jié)構(gòu)。細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完全破壞，無法辨認(rèn)核膜、核仁等結(jié)構(gòu)，染色質(zhì)分散于細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞質(zhì)中充滿了大小不一的空泡和碎片，細(xì)胞器完全消失。細(xì)胞間不存在任何連接，完全處于離散狀態(tài)，漂浮于培養(yǎng)液中。3.2染色體異常完成60Gy總劑量照射后，對KYSE-150細(xì)胞進(jìn)行染色體分析。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與照射前正常的KYSE-150細(xì)胞染色體相比，照射后的細(xì)胞染色體發(fā)生了顯著變化。正常KYSE-150細(xì)胞的染色體數(shù)目為46條，核型正常，染色體形態(tài)規(guī)則，著絲粒清晰，各條染色體的長短、形態(tài)特征與正常人類染色體標(biāo)準(zhǔn)核型一致。然而，照射后的細(xì)胞染色體數(shù)目出現(xiàn)了明顯增加。對50個以上分散良好的中期分裂相進(jìn)行分析統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目分布范圍廣泛，多數(shù)細(xì)胞的染色體數(shù)目在60-80條之間，部分細(xì)胞的染色體數(shù)目甚至超過100條，呈現(xiàn)出非整倍體的特征。染色體結(jié)構(gòu)也發(fā)生了多種畸變。其中，染色體缺失現(xiàn)象較為常見，表現(xiàn)為染色體部分片段的丟失，導(dǎo)致染色體形態(tài)殘缺不全。例如，在部分細(xì)胞中觀察到1號染色體長臂末端缺失，5號染色體短臂部分缺失等情況。染色體易位也頻繁出現(xiàn)，即兩條非同源染色體之間發(fā)生片段交換，形成異常的染色體結(jié)構(gòu)。如觀察到9號染色體與22號染色體之間發(fā)生相互易位，產(chǎn)生了兩條衍生染色體，其形態(tài)和帶型與正常染色體明顯不同。此外，還發(fā)現(xiàn)了染色體倒位現(xiàn)象，即染色體某一片段發(fā)生180°倒轉(zhuǎn)，導(dǎo)致基因排列順序發(fā)生改變。如在一些細(xì)胞中，檢測到4號染色體上的某一片段發(fā)生倒位，其正常的基因排列順序被打亂。雙著絲粒染色體也有出現(xiàn)，這類染色體具有兩個著絲粒，在細(xì)胞分裂過程中可能會導(dǎo)致染色體分離異常。在分析的細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了15號染色體與17號染色體融合形成的雙著絲粒染色體，其在中期分裂相中呈現(xiàn)出特殊的形態(tài)。這些染色體數(shù)目增加和結(jié)構(gòu)畸變的現(xiàn)象，表明X線反復(fù)照射對KYSE-150細(xì)胞的染色體造成了嚴(yán)重?fù)p傷，可能導(dǎo)致基因的丟失、重排和表達(dá)異常，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常生理功能，與食管癌放療抵抗機(jī)制可能存在密切關(guān)聯(lián)。3.3放射敏感性改變通過成克隆實驗檢測細(xì)胞放射敏感性，并繪制細(xì)胞存活曲線，采用線性二次模型擬合存活曲線，計算得到放射敏感性相關(guān)參數(shù)。結(jié)果顯示，與照射前的KYSE-150細(xì)胞相比，經(jīng)過X線反復(fù)照射后的細(xì)胞SF2值從照射前的0.35±0.03升高至0.48±0.04，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明在2Gy照射劑量下，照射后的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯增加，細(xì)胞對射線的抵抗能力增強(qiáng)。D0值從照射前的1.52±0.08Gy升高至1.85±0.10Gy，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），平均致死劑量的升高意味著需要更高的照射劑量才能使細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)降低至37%，進(jìn)一步說明細(xì)胞的放射抗拒性增強(qiáng)。Dq值從照射前的1.05±0.06Gy升高至1.38±0.09Gy，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），準(zhǔn)閾劑量的增加反映出細(xì)胞亞致死損傷修復(fù)能力增強(qiáng)，使得細(xì)胞在受到照射后更易修復(fù)損傷，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的放射抗拒性。N值從照射前的2.10±0.15升高至2.85±0.20，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），外推值的增大表明細(xì)胞內(nèi)所含的放射敏感區(qū)域數(shù)增加，細(xì)胞對射線的耐受性增強(qiáng)。這些放射敏感性參數(shù)的變化一致表明，X線反復(fù)照射后人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150的放射抗拒性顯著增強(qiáng)，對射線的敏感性明顯降低。3.4細(xì)胞周期分布改變利用流式細(xì)胞術(shù)對X線照射后24小時的KYSE-150細(xì)胞周期分布進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示出明顯的變化。照射前，細(xì)胞周期各時相比例分別為：G0/G1期60.23%±3.15%，S期25.46%±2.08%，G2/M期14.31%±1.85%。在X線反復(fù)照射后，S期細(xì)胞比例顯著增加，從照射前的25.46%±2.08%升高至45.78%±3.52%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明照射后進(jìn)入DNA合成期的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞DNA合成活動增強(qiáng)，可能是細(xì)胞為了應(yīng)對輻射損傷，試圖通過增加DNA合成來修復(fù)受損的遺傳物質(zhì)。同時，G2/M期細(xì)胞比例則明顯下降，從照射前的14.31%±1.85%降低至5.12%±0.98%，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。G2/M期是細(xì)胞分裂的準(zhǔn)備階段和分裂期，該時期細(xì)胞比例的大幅下降，說明細(xì)胞分裂過程受到了抑制，可能是由于輻射導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制紊亂，使得細(xì)胞難以順利進(jìn)入分裂期，或者在G2期進(jìn)行DNA損傷檢測時，發(fā)現(xiàn)損傷嚴(yán)重?zé)o法修復(fù)，從而阻滯在G2期，無法進(jìn)入M期進(jìn)行分裂。而G0/G1期細(xì)胞比例變化相對較小，為50.10%±3.02%，與照射前相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明X線反復(fù)照射對細(xì)胞進(jìn)入靜止期或DNA合成前期的影響相對不明顯。3.5腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)變化采用WesternBlotting法檢測X線照射后腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物β-catenin和Integrin-β1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與照射前相比，照射后β-catenin和Integrin-β1的表達(dá)量均顯著增加。β-catenin的相對表達(dá)量從照射前的1.00±0.08升高至2.15±0.15，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。Integrin-β1的相對表達(dá)量從照射前的1.05±0.09升高至2.30±0.18，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。從蛋白條帶圖像上可以清晰地看到，照射后β-catenin和Integrin-β1對應(yīng)的條帶亮度明顯增強(qiáng)，表明這兩種腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著上調(diào)。利用ImageJ軟件對蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，結(jié)果與上述趨勢一致，進(jìn)一步驗證了照射后β-catenin和Integrin-β1表達(dá)量的增加。這一結(jié)果提示，X線反復(fù)照射可能誘導(dǎo)人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)上調(diào)，使得細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞的比例增加，進(jìn)而可能與細(xì)胞放射抗拒性的增強(qiáng)存在密切關(guān)聯(lián)。四、生物效應(yīng)結(jié)果的分析與討論4.1細(xì)胞形態(tài)與染色體變化的意義細(xì)胞形態(tài)作為細(xì)胞生理狀態(tài)和功能的外在表現(xiàn)，在X線反復(fù)照射人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150的過程中，發(fā)生了顯著且復(fù)雜的變化，這些變化蘊(yùn)含著重要的生物學(xué)信息。正常情況下，KYSE-150細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、邊界清晰且細(xì)胞間連接緊密。隨著X線照射次數(shù)的逐步增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變，從細(xì)胞體積增大、形狀不規(guī)則，到細(xì)胞邊界模糊、細(xì)胞間連接松散，直至細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變形、多核等嚴(yán)重異常形態(tài)。這些變化并非孤立發(fā)生，而是與細(xì)胞的生理功能改變密切相關(guān)。細(xì)胞形態(tài)的改變往往伴隨著細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的破壞，細(xì)胞骨架作為維持細(xì)胞形態(tài)和功能的重要結(jié)構(gòu)，其受損會影響細(xì)胞的運(yùn)動、物質(zhì)運(yùn)輸和信號傳遞等生理過程。細(xì)胞形態(tài)的變化還可能影響細(xì)胞的代謝活動，例如細(xì)胞表面積與體積比值的改變會影響細(xì)胞與外界環(huán)境的物質(zhì)交換效率，進(jìn)而影響細(xì)胞的能量代謝和物質(zhì)合成。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，細(xì)胞形態(tài)的變化可能與細(xì)胞周期進(jìn)程的異常有關(guān)。有研究表明，細(xì)胞在不同的細(xì)胞周期階段具有不同的形態(tài)特征，當(dāng)細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制受到干擾時，細(xì)胞形態(tài)也會相應(yīng)發(fā)生改變。在本實驗中，X線照射可能導(dǎo)致細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性改變，進(jìn)而影響細(xì)胞周期的正常進(jìn)程，使得細(xì)胞在形態(tài)上表現(xiàn)出異常。細(xì)胞形態(tài)的變化還可能與細(xì)胞的分化狀態(tài)改變有關(guān)。正常上皮細(xì)胞具有特定的分化特征，而在X線照射后，細(xì)胞形態(tài)的改變可能暗示著細(xì)胞分化方向的改變，這種改變可能導(dǎo)致細(xì)胞失去正常的分化功能，進(jìn)而影響組織和器官的正常生理功能。細(xì)胞形態(tài)的變化在食管癌放療抵抗機(jī)制中可能扮演著重要角色，它不僅反映了細(xì)胞內(nèi)部生理功能的改變，還可能通過影響細(xì)胞間的相互作用和信號傳導(dǎo)，進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞的放射敏感性和增殖能力。染色體作為遺傳物質(zhì)的載體，其數(shù)目和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定對于細(xì)胞的正常生理功能和遺傳信息傳遞至關(guān)重要。在本研究中，X線反復(fù)照射導(dǎo)致KYSE-150細(xì)胞染色體數(shù)目增加且出現(xiàn)多種結(jié)構(gòu)畸變，這對細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性和生理功能產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。染色體數(shù)目增加會導(dǎo)致基因劑量失衡，使得細(xì)胞內(nèi)某些基因的表達(dá)水平發(fā)生改變。某些原癌基因的表達(dá)可能因染色體數(shù)目增加而增強(qiáng)，從而促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖；而一些抑癌基因的表達(dá)可能受到抑制，無法有效發(fā)揮抑制腫瘤的作用。染色體結(jié)構(gòu)畸變，如缺失、易位、倒位和雙著絲粒染色體的出現(xiàn)，會導(dǎo)致基因的排列順序和位置發(fā)生改變。基因位置的改變可能影響其與調(diào)控元件的相互作用，從而影響基因的表達(dá)調(diào)控。染色體易位可能導(dǎo)致原本不相鄰的基因融合在一起，產(chǎn)生新的融合基因，這些融合基因可能具有異常的生物學(xué)功能，進(jìn)一步推動細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。染色體畸變還會影響細(xì)胞在有絲分裂過程中的染色體分離，導(dǎo)致子細(xì)胞中染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的異常。這不僅會進(jìn)一步加劇細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性，還可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡。如果細(xì)胞能夠在染色體異常的情況下繼續(xù)存活和增殖，那么這些細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的適應(yīng)性和生存能力，從而表現(xiàn)出對放療的抵抗性。有研究表明，染色體畸變與腫瘤細(xì)胞的放射抗拒性密切相關(guān)，染色體畸變可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)機(jī)制的改變，使得腫瘤細(xì)胞能夠更好地應(yīng)對放療引起的DNA損傷，從而提高其放射抗拒性。染色體的變化在食管癌放療抵抗機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，它通過影響細(xì)胞的遺傳信息傳遞和基因表達(dá)調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞生理功能的改變，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的放射敏感性和生物學(xué)行為。4.2放射敏感性改變的機(jī)制探討細(xì)胞放射敏感性的改變是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及多個層面的調(diào)控機(jī)制。在本研究中，X線反復(fù)照射人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150后，細(xì)胞放射抗拒性顯著增強(qiáng)，這一現(xiàn)象與DNA損傷修復(fù)以及細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)。DNA作為細(xì)胞遺傳信息的載體，在受到X線照射后極易受到損傷。X線照射會導(dǎo)致DNA分子中的化學(xué)鍵斷裂，產(chǎn)生多種類型的損傷，如單鏈斷裂（SSB）和雙鏈斷裂（DSB）。單鏈斷裂若未能及時修復(fù)，可能會在DNA復(fù)制過程中轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈斷裂，而雙鏈斷裂是一種極為嚴(yán)重的DNA損傷形式。正常情況下，細(xì)胞擁有一套復(fù)雜而精密的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，以確?；蚪M的穩(wěn)定性。這一機(jī)制主要包括堿基切除修復(fù)（BER）、核苷酸切除修復(fù)（NER）、錯配修復(fù)（MMR）、同源重組（HR）和非同源末端連接（NHEJ）等。堿基切除修復(fù)主要負(fù)責(zé)修復(fù)DNA堿基的損傷，通過切除受損堿基并重新合成正確的堿基來恢復(fù)DNA的正常結(jié)構(gòu)。核苷酸切除修復(fù)則針對DNA雙鏈上較大的損傷，如嘧啶二聚體等，通過切除含有損傷的核苷酸片段并重新合成來修復(fù)DNA。錯配修復(fù)用于糾正DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)的堿基錯配，保證遺傳信息的準(zhǔn)確傳遞。同源重組是一種高度保守的修復(fù)機(jī)制，主要發(fā)生在細(xì)胞周期的S期和G2期，通過利用同源DNA序列作為模板來修復(fù)雙鏈斷裂，具有高度的準(zhǔn)確性。非同源末端連接則是在細(xì)胞周期的各個時期都能發(fā)揮作用，它直接將斷裂的DNA末端連接起來，雖然操作簡單快速，但可能會導(dǎo)致堿基的丟失或插入，從而引起基因突變。當(dāng)細(xì)胞受到X線反復(fù)照射后，DNA損傷頻繁發(fā)生。在這一過程中，細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)基因和蛋白表達(dá)上調(diào)，使得DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)。有研究表明，在X線照射后的細(xì)胞中，參與同源重組修復(fù)的關(guān)鍵蛋白BRCA1和BRCA2的表達(dá)水平顯著升高，這些蛋白能夠與其他修復(fù)蛋白協(xié)同作用，促進(jìn)DNA雙鏈斷裂的修復(fù)。參與非同源末端連接的DNA連接酶IV等蛋白的表達(dá)也會增加，進(jìn)一步提高了細(xì)胞對DNA損傷的修復(fù)能力。這種DNA損傷修復(fù)能力的增強(qiáng)使得腫瘤細(xì)胞能夠更好地應(yīng)對X線照射引起的DNA損傷，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的放射抗拒性。若DNA損傷過于嚴(yán)重，超出了細(xì)胞的修復(fù)能力，細(xì)胞可能會啟動凋亡程序，以避免受損DNA的傳遞。在本研究中，雖然細(xì)胞放射抗拒性增強(qiáng)，但仍有部分細(xì)胞因DNA損傷無法修復(fù)而發(fā)生凋亡，這也從側(cè)面反映了DNA損傷修復(fù)與細(xì)胞放射敏感性之間的復(fù)雜關(guān)系。細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的重要過程，它受到一系列嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制的控制。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞周期的各個時相之間存在著精確的調(diào)控機(jī)制，以確保細(xì)胞的正常生長、分裂和分化。細(xì)胞周期主要包括G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（有絲分裂期）。在細(xì)胞周期的進(jìn)程中，存在多個關(guān)鍵的調(diào)控點，如G1/S檢查點、S期檢查點和G2/M檢查點。這些檢查點能夠監(jiān)測細(xì)胞的DNA損傷情況、DNA復(fù)制的完整性以及染色體的穩(wěn)定性等，當(dāng)檢測到異常情況時，細(xì)胞周期會被阻滯，以便細(xì)胞有足夠的時間進(jìn)行修復(fù)。在G1/S檢查點，細(xì)胞會檢查DNA是否存在損傷，若發(fā)現(xiàn)損傷，細(xì)胞會激活相關(guān)的信號通路，如p53信號通路，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，防止受損DNA進(jìn)入S期進(jìn)行復(fù)制。只有當(dāng)DNA損傷得到修復(fù)后，細(xì)胞才能通過G1/S檢查點，進(jìn)入S期繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞周期。在S期檢查點，細(xì)胞會監(jiān)測DNA復(fù)制的進(jìn)程和準(zhǔn)確性，若發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制異常，如復(fù)制叉停滯等，細(xì)胞會啟動相應(yīng)的修復(fù)機(jī)制，并阻滯細(xì)胞周期。G2/M檢查點則主要檢查DNA是否完全復(fù)制以及染色體是否正確組裝，確保細(xì)胞在進(jìn)入有絲分裂期之前，遺傳物質(zhì)已經(jīng)準(zhǔn)確復(fù)制且染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。X線照射會對細(xì)胞周期產(chǎn)生顯著影響。在本研究中，X線反復(fù)照射后，KYSE-150細(xì)胞的S期比例顯著增加，G2/M期比例明顯下降。這表明細(xì)胞在受到照射后，DNA合成活動增強(qiáng)，可能是細(xì)胞試圖通過增加DNA合成來修復(fù)受損的遺傳物質(zhì)。而G2/M期比例的下降則說明細(xì)胞分裂過程受到抑制，可能是由于輻射導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制紊亂，使得細(xì)胞難以順利進(jìn)入分裂期。細(xì)胞周期分布的改變與放射敏感性密切相關(guān)。不同細(xì)胞周期時相的細(xì)胞對射線的敏感性存在差異，一般來說，M期細(xì)胞對射線最為敏感，G2期細(xì)胞對射線的敏感性接近M期，S期細(xì)胞對射線敏感性最差，G1期的細(xì)胞中，G1早期對射線的敏感性差，但G1晚期則較敏感。當(dāng)細(xì)胞受到X線照射后，敏感時相的細(xì)胞被射線殺傷，導(dǎo)致細(xì)胞周期分布發(fā)生改變。若細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制異常，使得細(xì)胞無法正常阻滯在檢查點進(jìn)行DNA損傷修復(fù)，或者細(xì)胞能夠快速通過檢查點，即使DNA損傷未修復(fù)也繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞周期，那么這些細(xì)胞就可能表現(xiàn)出更強(qiáng)的放射抗拒性。在某些腫瘤細(xì)胞中，由于細(xì)胞周期調(diào)控基因的突變，導(dǎo)致細(xì)胞周期檢查點功能異常，細(xì)胞能夠在DNA損傷的情況下繼續(xù)分裂，從而對放療產(chǎn)生抵抗。4.3細(xì)胞周期分布改變的影響細(xì)胞周期分布的改變對細(xì)胞增殖和放療效果產(chǎn)生了多方面的影響。在細(xì)胞增殖方面，S期細(xì)胞比例的顯著增加表明細(xì)胞DNA合成活動增強(qiáng)。DNA合成是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵步驟，更多細(xì)胞進(jìn)入S期意味著細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力。細(xì)胞通過增加DNA合成，可能是為了補(bǔ)充受損的DNA或為細(xì)胞分裂做更充分的準(zhǔn)備。然而，這種增殖能力的增強(qiáng)在腫瘤細(xì)胞中往往是不受控制的，可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的快速生長和擴(kuò)散。G2/M期細(xì)胞比例的明顯下降，使得細(xì)胞分裂過程受到抑制。細(xì)胞在G2期主要進(jìn)行DNA損傷檢測和修復(fù)，以及為有絲分裂做準(zhǔn)備。當(dāng)G2/M期細(xì)胞比例降低時，說明細(xì)胞可能無法順利通過G2期的檢查點，或者在G2期檢測到DNA損傷嚴(yán)重?zé)o法修復(fù)，從而無法進(jìn)入M期進(jìn)行分裂。這在一定程度上限制了細(xì)胞的增殖速度，但同時也可能導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，使得細(xì)胞處于一種不穩(wěn)定的狀態(tài)。如果細(xì)胞在G2期長期阻滯，可能會啟動凋亡程序，以避免受損DNA的傳遞；但如果細(xì)胞能夠繞過檢查點繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞周期，那么這些細(xì)胞可能會攜帶錯誤的遺傳信息進(jìn)行分裂，增加細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。對于放療效果而言，細(xì)胞周期分布的改變與細(xì)胞對射線的敏感性密切相關(guān)。不同細(xì)胞周期時相的細(xì)胞對射線的敏感性存在顯著差異。M期細(xì)胞由于其染色體處于高度濃縮和分離的狀態(tài)，對射線最為敏感，射線照射容易導(dǎo)致染色體斷裂和分離異常，從而使細(xì)胞死亡。G2期細(xì)胞對射線的敏感性接近M期，因為在G2期細(xì)胞已經(jīng)完成了DNA復(fù)制，細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)相對較多，射線照射更容易引起DNA損傷。S期細(xì)胞對射線敏感性最差，這是因為S期細(xì)胞正在進(jìn)行DNA合成，細(xì)胞內(nèi)存在多種DNA修復(fù)機(jī)制，能夠及時修復(fù)射線引起的DNA損傷。G1期的細(xì)胞中，G1早期對射線的敏感性差，但G1晚期則較敏感。在本研究中，X線反復(fù)照射后，S期細(xì)胞比例增加，G2/M期細(xì)胞比例下降，這使得細(xì)胞群體對射線的整體敏感性降低。更多的細(xì)胞處于對射線敏感性較差的S期，而對射線敏感的G2/M期細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在放療過程中更難被射線殺傷，從而降低了放療效果。細(xì)胞周期分布的改變還可能影響放療后細(xì)胞的修復(fù)和再增殖能力。放療后，處于S期的細(xì)胞可能利用其較強(qiáng)的DNA修復(fù)能力，迅速修復(fù)射線引起的DNA損傷，從而恢復(fù)增殖能力；而處于G2/M期的細(xì)胞由于比例下降，可能無法及時補(bǔ)充受損或死亡的細(xì)胞，進(jìn)一步影響放療效果。4.4腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)變化的作用腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物β-catenin和Integrin-β1在X線反復(fù)照射后表達(dá)顯著增加，這一現(xiàn)象在食管癌放療抵抗及腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中具有重要作用。β-catenin作為Wnt信號通路的關(guān)鍵蛋白，在腫瘤干細(xì)胞的自我更新和分化調(diào)控中發(fā)揮著核心作用。正常情況下，β-catenin在細(xì)胞內(nèi)受到嚴(yán)格的調(diào)控，大部分與E-cadherin結(jié)合，位于細(xì)胞膜上，參與細(xì)胞間的黏附作用。當(dāng)Wnt信號通路激活時，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，啟動一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1等。這些靶基因參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程，從而促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的自我更新和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在本研究中，X線反復(fù)照射導(dǎo)致β-catenin表達(dá)增加，可能激活了Wnt信號通路，使得腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力增強(qiáng)，從而增加了腫瘤細(xì)胞的放射抗拒性。有研究表明，抑制β-catenin的表達(dá)或阻斷Wnt信號通路，可以降低腫瘤干細(xì)胞的比例，提高腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性。Integrin-β1是整合素家族的重要成員，其主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）之間的黏附作用。Integrin-β1通過與ECM中的配體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，如FAK-Src信號通路、PI3K-AKT信號通路等。這些信號通路參與細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程。在腫瘤干細(xì)胞中，Integrin-β1的高表達(dá)使其能夠與ECM緊密結(jié)合，從而獲得更好的生存環(huán)境和營養(yǎng)支持。Integrin-β1還可以通過激活相關(guān)信號通路，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的自我更新和分化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射抗拒性。在本研究中，X線反復(fù)照射后Integrin-β1表達(dá)增加，可能增強(qiáng)了腫瘤干細(xì)胞與ECM的黏附能力，激活了相關(guān)信號通路，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤干細(xì)胞的存活和增殖，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的放射抗拒性增強(qiáng)。有研究報道，使用Integrin-β1抗體阻斷其功能，可以抑制腫瘤干細(xì)胞的增殖和遷移，提高腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性。腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)增加與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力，被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。當(dāng)腫瘤受到放療等治療手段的作用時，大部分腫瘤細(xì)胞可能被殺傷，但腫瘤干細(xì)胞由于其較強(qiáng)的放射抗拒性和自我更新能力，能夠存活下來。這些存活的腫瘤干細(xì)胞可以重新增殖和分化，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)。腫瘤干細(xì)胞還具有較強(qiáng)的遷移和侵襲能力，能夠突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在本研究中，X線反復(fù)照射后人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)增加，提示腫瘤干細(xì)胞比例增加，這可能增加了腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。有臨床研究表明，腫瘤組織中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的高表達(dá)與食管癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，患者更容易出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，生存率較低。4.5研究結(jié)果對食管癌放療的啟示本研究結(jié)果為食管癌放療提供了多方面的啟示，有助于優(yōu)化放療方案、提高放療療效。在放療方案優(yōu)化方面，基于細(xì)胞放射敏感性改變的結(jié)果，臨床放療時應(yīng)更加注重個體化劑量的制定。由于X線反復(fù)照射后KYSE-150細(xì)胞放射抗拒性增強(qiáng)，對于不同患者，尤其是那些可能存在放射抗拒風(fēng)險的患者，不能一概而論地采用標(biāo)準(zhǔn)放療劑量。應(yīng)根據(jù)患者腫瘤細(xì)胞的放射敏感性檢測結(jié)果，如通過檢測腫瘤組織中相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平，評估細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力和細(xì)胞周期調(diào)控狀態(tài)，來精準(zhǔn)調(diào)整放療劑量。對于放射抗拒性較強(qiáng)的患者，可適當(dāng)增加放療劑量，以克服腫瘤細(xì)胞的放射抵抗，提高放療效果；而對于放射敏感性較高的患者，則可適當(dāng)降低放療劑量，減少正常組織的放射性損傷。還可考慮調(diào)整放療的分次劑量和照射次數(shù)。傳統(tǒng)的放療方案通常采用固定的分次劑量和照射次數(shù)，但根據(jù)本研究中細(xì)胞周期分布改變的結(jié)果，不同細(xì)胞周期時相的細(xì)胞對射線敏感性存在差異，可嘗試采用適應(yīng)性放療策略。在放療過程中，根據(jù)腫瘤細(xì)胞周期分布的動態(tài)變化，適時調(diào)整分次劑量和照射時間間隔，使更多的腫瘤細(xì)胞處于對射線敏感的時相，從而提高放療療效。為提高放療療效，可聯(lián)合靶向治療。鑒于腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)增加與放射抗拒性增強(qiáng)密切相關(guān)，針對腫瘤干細(xì)胞的靶向治療可作為聯(lián)合放療的有效策略。開發(fā)針對β-catenin和Integrin-β1等腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的靶向藥物，抑制腫瘤干細(xì)胞的自我更新和增殖能力。使用β-catenin抑制劑，阻斷Wnt信號通路，抑制腫瘤干細(xì)胞的增殖；或使用Integrin-β1抗體，阻斷其與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附作用，抑制腫瘤干細(xì)胞的遷移和侵襲。將這些靶向藥物與放療聯(lián)合應(yīng)用，可提高腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性，增強(qiáng)放療療效。還可利用DNA損傷修復(fù)抑制劑來提高放療療效。由于X線照射后細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)是導(dǎo)致放射抗拒性的重要原因之一，使用DNA損傷修復(fù)抑制劑，如PARP抑制劑，抑制腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力。PARP抑制劑能夠特異性地抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的活性，該酶在DNA單鏈斷裂修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)PARP被抑制后，DNA單鏈斷裂無法及時修復(fù)，在DNA復(fù)制過程中會轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈斷裂，而腫瘤細(xì)胞在放療后原本就存在DNA雙鏈斷裂，此時細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷進(jìn)一步加重，超出其修復(fù)能力，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。將PARP抑制劑與放療聯(lián)合使用，可增加腫瘤細(xì)胞的DNA損傷，克服腫瘤細(xì)胞的放射抗拒性，提高放療療效。五、結(jié)論與展望5.1研究主要結(jié)論本研究通過X線反復(fù)照射人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150，系統(tǒng)地探究了其生物效應(yīng)及潛在機(jī)制，取得了以下主要結(jié)論：細(xì)胞形態(tài)與染色體變化：X線反復(fù)照射導(dǎo)致KYSE-150細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，從典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轶w積增大、形狀不規(guī)則、邊界模糊、細(xì)胞間連接松散，最終出現(xiàn)皺縮、變形、多核等嚴(yán)重異常形態(tài)。染色體分析顯示，照射后的細(xì)胞染色體數(shù)目明顯增加，呈現(xiàn)非整倍體特征，同時出現(xiàn)多種結(jié)構(gòu)畸變，如染色體缺失、易位、倒位和雙著絲粒染色體等。這些細(xì)胞形態(tài)和染色體的變化表明X線照射對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和遺傳物質(zhì)造成了嚴(yán)重?fù)p傷，可能導(dǎo)致細(xì)胞生理功能的改變和遺傳信息傳遞的異常，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程。放射敏感性改變：通過成克隆實驗檢測發(fā)現(xiàn)，X線反復(fù)照射后人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150的放射抗拒性顯著增強(qiáng)。具體表現(xiàn)為SF2值升高，說明在2Gy照射劑量下細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)增加，對射線的抵抗能力增強(qiáng)；D0值升高，表明需要更高的照射劑量才能使細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)降低至37%，細(xì)胞的放射抗拒性增強(qiáng)；Dq值升高，反映出細(xì)胞亞致死損傷修復(fù)能力增強(qiáng)，更易修復(fù)射線造成的損傷；N值升高，意味著細(xì)胞內(nèi)所含的放射敏感區(qū)域數(shù)增加，細(xì)胞對射線的耐受性增強(qiáng)。這些放射敏感性參數(shù)的變化一致表明，X線反復(fù)照射使得細(xì)胞對射線的敏感性降低，放射抗拒性增強(qiáng)。細(xì)胞周期分布改變：利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布發(fā)現(xiàn)，X線反復(fù)照射后，KYSE-150細(xì)胞的S期比例顯著增加，從照射前的25.46%±2.08%升高至45.78%±3.52%，表明細(xì)胞DNA合成活動增強(qiáng)，可能是細(xì)胞為應(yīng)對輻射損傷而增加DNA合成以修復(fù)受損遺傳物質(zhì)。G2/M期細(xì)胞比例明顯下降，從照射前的14.31%±1.85%降低至5.12%±0.98%，說明細(xì)胞分裂過程受到抑制，可能是由于輻射導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制紊亂，細(xì)胞難以順利進(jìn)入分裂期。而G0/G1期細(xì)胞比例變化相對較小，與照射前相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)變化：采用WesternBlotting法檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物β-catenin和Integrin-β1的表達(dá)，結(jié)果顯示照射后二者的表達(dá)量均顯著增加。β-catenin的相對表達(dá)量從照射前的1.00±0.08升高至2.15±0.15，Integrin-β1的相對表達(dá)量從照射前的1.05±0.09升高至2.30±0.18