會(huì)計(jì)學(xué)1抗體(kàngtǐ)的制備與純化第一頁(yè)，共37頁(yè)。第一節(jié)常規(guī)抗血清的制備(zhìbèi)方法一、動(dòng)物的免疫(miǎnyì)二、抗血清的采集第1頁(yè)/共37頁(yè)第二頁(yè)，共37頁(yè)。1、免疫動(dòng)物的選擇2、抗原接種(jiēzhòng)3、佐劑的應(yīng)用動(dòng)物(dòngwù)的免疫第2頁(yè)/共37頁(yè)第三頁(yè)，共37頁(yè)。免疫(miǎnyì)動(dòng)物的選擇種屬與品系(pǐnxì)經(jīng)濟(jì)性“R”型與“H”型經(jīng)驗(yàn)性適配第3頁(yè)/共37頁(yè)第四頁(yè)，共37頁(yè)。抗原(kàngyuán)接種劑量：注射途徑(tújìng)：間隔與免疫時(shí)間：接種次數(shù)：第4頁(yè)/共37頁(yè)第五頁(yè)，共37頁(yè)。佐劑的概念(gàiniàn)與種類(lèi)概念：與抗原同時(shí)或先于抗原進(jìn)入機(jī)體，以提高(tígāo)抗原的免疫原性的物質(zhì)。種類(lèi)：非免疫原性物質(zhì)免疫原性物質(zhì)第5頁(yè)/共37頁(yè)第六頁(yè)，共37頁(yè)。佐劑的作用(zuòyòng)機(jī)理延長(zhǎng)抗原的作用時(shí)間增強(qiáng)(zēngqiáng)吞噬作用刺激抗原提呈促進(jìn)細(xì)胞因子分泌誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分裂、增殖影響T細(xì)胞“極化”第6頁(yè)/共37頁(yè)第七頁(yè)，共37頁(yè)。1、采集(cǎijí)方法2、血清的分離與滅活抗血清的采集(cǎijí)第7頁(yè)/共37頁(yè)第八頁(yè)，共37頁(yè)。采集(cǎijí)方法一次性采集(cǎijí)多次性采集(cǎijí)第8頁(yè)/共37頁(yè)第九頁(yè)，共37頁(yè)?？寡宓姆蛛x(fēnlí)與滅活血清析出(xīchū)的溫度血清的滅活第9頁(yè)/共37頁(yè)第十頁(yè)，共37頁(yè)。第二節(jié)單克隆抗體(kàngtǐ)的制備方法一、單克隆抗體與雜交瘤技術(shù)二、單克隆抗體的制備(zhìbèi)過(guò)程三、單克隆抗體的特性第10頁(yè)/共37頁(yè)第十一頁(yè)，共37頁(yè)。單克隆抗體(kàngtǐ)與雜交瘤技術(shù)1、單克隆抗體(kàngtǐ)2、雜交瘤技術(shù)第11頁(yè)/共37頁(yè)第十二頁(yè)，共37頁(yè)。表位A表位B表位C抗原(kàngyuán)克隆(kèlónɡ)A克隆(kèlónɡ)B克隆C多克隆抗體單克隆抗體第12頁(yè)/共37頁(yè)第十三頁(yè)，共37頁(yè)。單克隆抗體(kàngtǐ)由一個(gè)識(shí)別單一抗原決定簇（表位）的B細(xì)胞克隆(kèlónɡ)所產(chǎn)生的同源抗體。第13頁(yè)/共37頁(yè)第十四頁(yè)，共37頁(yè)。雜交瘤技術(shù)(jìshù)通過(guò)融合經(jīng)免疫的小鼠脾細(xì)胞和建系小鼠骨髓瘤細(xì)胞，以獲得同時(shí)具有抗體分泌功能(gōngnéng)和保持細(xì)胞永生性特征的雜交瘤細(xì)胞克隆。是獲取單克隆抗體的主要技術(shù)途徑。第14頁(yè)/共37頁(yè)第十五頁(yè)，共37頁(yè)。單克隆抗體(kàngtǐ)制備過(guò)程1、致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備(zhǔnbèi)2、骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備(zhǔnbèi)3、細(xì)胞融合4、選擇性培養(yǎng)5、抗體分泌細(xì)胞的篩選6、克隆化過(guò)程7、單克隆抗體的制取第15頁(yè)/共37頁(yè)第十六頁(yè)，共37頁(yè)?？乖?kàngyuán)致敏淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞(xìbāo)融合(rónghé)選擇性培養(yǎng)抗體分泌細(xì)胞篩選克隆化單抗制取單抗純化單抗鑒定第16頁(yè)/共37頁(yè)第十七頁(yè)，共37頁(yè)。致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備(zhǔnbèi)動(dòng)物選擇：品系、年齡、性別、健康狀態(tài)(zhuàngtài)抗原接種：方式——體內(nèi)、體外劑量——0.5-100g次數(shù)——視抗原而定間隔——視抗原而定佐劑——視抗原而定收集時(shí)間：末次接種后72h第17頁(yè)/共37頁(yè)第十八頁(yè)，共37頁(yè)。骨髓瘤細(xì)胞(xìbāo)的準(zhǔn)備細(xì)胞株處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)(zhuàngtài)細(xì)胞株保持HGPRT缺陷狀態(tài)(zhuàngtài)第18頁(yè)/共37頁(yè)第十九頁(yè)，共37頁(yè)。細(xì)胞融合方式(fāngshì)：物理、化學(xué)、生物PEG融合要點(diǎn)：（見(jiàn)圖）第19頁(yè)/共37頁(yè)第二十頁(yè)，共37頁(yè)。致敏淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞(xìbāo)離心(líxīn)1000rpm10min50%PEG1ml培養(yǎng)液

10ml離心(líxīn)1000rpm7min37。C搖動(dòng)、由慢漸快1min、靜止1.5min加入HAT培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，置于培養(yǎng)孔內(nèi)第20頁(yè)/共37頁(yè)第二十一頁(yè)，共37頁(yè)。選擇性培養(yǎng)(péiyǎng)隨機(jī)融合(rónghé)后的細(xì)胞類(lèi)型HAT選擇培養(yǎng)原理第21頁(yè)/共37頁(yè)第二十二頁(yè)，共37頁(yè)。隨機(jī)融合后的細(xì)胞(xìbāo)類(lèi)型細(xì)胞組合HGPRT生長(zhǎng)狀態(tài)淋巴細(xì)胞+骨髓瘤+長(zhǎng)期生長(zhǎng)淋巴細(xì)胞+淋巴細(xì)胞+短期(duǎnqī)生長(zhǎng)骨髓瘤+骨髓瘤—不能生長(zhǎng)未融合淋巴細(xì)胞+短期(duǎnqī)生長(zhǎng)未融合骨髓瘤—不能生長(zhǎng)第22頁(yè)/共37頁(yè)第二十三頁(yè)，共37頁(yè)。HAT選擇(xuǎnzé)培養(yǎng)原理核苷酸從頭合成途徑(tújìng)（denovosynthesis）核苷酸補(bǔ)救(bǔjiù)合成途徑（salvagesynthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黃嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）第23頁(yè)/共37頁(yè)第二十四頁(yè)，共37頁(yè)?？贵w分泌細(xì)胞(xìbāo)的篩選對(duì)篩選方法(fāngfǎ)的要求：多——大量樣品一次檢測(cè)快——迅速取得檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)——檢測(cè)結(jié)果可靠性高靈——檢測(cè)方法(fāngfǎ)靈敏度高常用篩選方法(fāngfǎ)：ELISA、RIA、CDC、IFA等第24頁(yè)/共37頁(yè)第二十五頁(yè)，共37頁(yè)?？寺?kèlónɡ)化過(guò)程概念：建立單一細(xì)胞克隆方法：有限稀釋(xīshì)法克隆建立的標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)兩次以上100%陽(yáng)性孔飼養(yǎng)細(xì)胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾細(xì)胞第25頁(yè)/共37頁(yè)第二十六頁(yè)，共37頁(yè)。有限(yǒuxiàn)稀釋法計(jì)數(shù)(jìshù)103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔第26頁(yè)/共37頁(yè)第二十七頁(yè)，共37頁(yè)。單克隆抗體(kàngtǐ)的制取制取方式：體外——培養(yǎng)罐法體內(nèi)——腹腔接種純化：鹽析、層析、制備型HPLC鑒定：特征鑒定——Ig類(lèi)型、親和力、效價(jià)、特異性決定簇鑒定——是否針對(duì)(zhēnduì)同一決定簇第27頁(yè)/共37頁(yè)第二十八頁(yè)，共37頁(yè)。多抗與單抗制劑(zhìjì)的比較多抗單抗單抗（血清）（腹水）（培養(yǎng)上清）特異性抗體含量（mg/ml）0.1-10.5-50.005-0.025無(wú)關(guān)(wúguān)Ig含量（mg/ml）100.5-1—其他血清蛋白大量極少—均一性—++特異性多決定簇單決定簇單決定簇穩(wěn)定性較好略差略差重復(fù)性差好好第28頁(yè)/共37頁(yè)第二十九頁(yè)，共37頁(yè)。單克隆抗體(kàngtǐ)的特性1、理化性狀高度均一2、抗原結(jié)合(jiéhé)性高度特異3、生物活性高度單一第29頁(yè)/共37頁(yè)第三十頁(yè)，共37頁(yè)。第三節(jié)抗體的純化(chúnhuà)與鑒定一、抗體純化的目的與方法(fāngfǎ)二、純化抗體的鑒定與保存第30頁(yè)/共37頁(yè)第三十一頁(yè)，共37頁(yè)?？贵w(kàngtǐ)純化的目的1、去除雜蛋白2、去除雜抗體3、去除非(chúfēi)同類(lèi)抗體第31頁(yè)/共37頁(yè)第三十二頁(yè)，共37頁(yè)。抗體純化(chúnhuà)的方法1、鹽析、層析技術(shù)2、抗原(kàngyuán)吸附第32頁(yè)/共37頁(yè)第三十三頁(yè)，共37頁(yè)。純化抗體(kàngtǐ)的鑒定1、多克隆(kèlónɡ)抗體的鑒定2、單克隆(kèlónɡ)抗體的鑒定第33頁(yè)/共3