Nrf2在人主動脈平滑肌細胞鈣化中的作用及分子機制探究一、引言1.1研究背景與意義心血管疾病是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致人類死亡和殘疾的主要原因之一，嚴重威脅著人類的健康和生活質(zhì)量。人主動脈平滑肌細胞鈣化作為心血管疾病中常見的病理過程，在動脈粥樣硬化、冠心病、主動脈瓣鈣化等疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色，對心血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生深遠影響。主動脈是人體最為重要的動脈血管，負責(zé)將心臟泵出的富含氧氣的血液輸送至全身各個組織和器官，為其正常生理活動提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。當主動脈平滑肌細胞發(fā)生鈣化時，主動脈壁會逐漸失去原有的彈性和柔韌性，變得僵硬且脆弱。這種病理改變使得主動脈在承受心臟射血產(chǎn)生的壓力時，更容易發(fā)生破裂，一旦主動脈破裂，會引發(fā)大出血，在短時間內(nèi)危及患者生命。據(jù)統(tǒng)計，主動脈鈣化患者發(fā)生主動脈破裂的風(fēng)險較正常人顯著增加，嚴重威脅患者的生命安全。同時，主動脈平滑肌細胞鈣化也是心血管疾病的重要危險因素，會顯著增加冠心病、心肌梗死、腦卒中等嚴重心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險。隨著主動脈鈣化程度的加重，血管壁逐漸狹窄，阻礙血液的正常流動，導(dǎo)致心臟、大腦等重要器官供血不足，進而引發(fā)一系列嚴重的臨床癥狀。相關(guān)研究表明，在冠心病患者中，主動脈鈣化程度與病情的嚴重程度密切相關(guān)，鈣化越嚴重，患者發(fā)生心肌梗死等急性心血管事件的概率越高。目前，雖然臨床上針對心血管疾病已經(jīng)有了多種治療手段，如藥物治療、介入治療和手術(shù)治療等，但由于對主動脈平滑肌細胞鈣化的具體分子機制尚未完全明確，這些治療方法在預(yù)防和治療主動脈平滑肌細胞鈣化相關(guān)心血管疾病方面仍存在一定的局限性，無法從根本上阻止疾病的進展。因此，深入探究主動脈平滑肌細胞鈣化的發(fā)生機制，尋找有效的干預(yù)靶點，對于心血管疾病的防治具有至關(guān)重要的意義。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）作為細胞內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子，在維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著核心作用。在正常生理狀態(tài)下，Nrf2與胞漿蛋白伴侶分子Keap1結(jié)合，處于抑制狀態(tài)，其活性受到嚴格調(diào)控。當細胞受到氧化應(yīng)激、炎癥等刺激時，Nrf2與Keap1解離，進入細胞核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，啟動一系列抗氧化酶和解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄表達，如血紅素氧合酶-1（HO-1）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）等，這些酶能夠有效清除細胞內(nèi)過多的活性氧（ROS）和有害物質(zhì)，減輕氧化應(yīng)激損傷，保護細胞免受損傷。越來越多的研究表明，Nrf2信號通路的激活與心血管系統(tǒng)的保護密切相關(guān)，在多種心血管疾病模型中，激活Nrf2信號通路能夠減輕心肌缺血再灌注損傷、抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展、保護血管內(nèi)皮細胞功能等。然而，Nrf2在人主動脈平滑肌細胞鈣化過程中的具體作用及機制尚未完全闡明，仍存在許多未知的領(lǐng)域亟待深入研究。本研究聚焦于Nrf2在人主動脈平滑肌細胞鈣化中的作用及機制，具有重要的理論和實踐意義。在理論層面，深入探究Nrf2在人主動脈平滑肌細胞鈣化過程中的作用機制，有助于揭示主動脈平滑肌細胞鈣化的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，豐富和完善心血管疾病發(fā)病機制的理論體系，為進一步理解心血管疾病的病理生理過程提供新的視角和理論依據(jù)。在實踐應(yīng)用方面，若能明確Nrf2在人主動脈平滑肌細胞鈣化中的關(guān)鍵作用及相關(guān)機制，將有望將其作為潛在的治療靶點，為心血管疾病的防治開辟新的策略和方法。通過研發(fā)針對Nrf2信號通路的激活劑或調(diào)節(jié)劑，可能實現(xiàn)對主動脈平滑肌細胞鈣化的有效干預(yù)，從而降低心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量，具有重要的臨床應(yīng)用價值和社會效益。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在人主動脈平滑肌細胞鈣化的研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者已取得了諸多成果。研究表明，血管鈣化并非是一個簡單的被動的鈣鹽沉積過程，而是一個由多種細胞、信號通路和分子機制參與調(diào)控的主動的生物學(xué)過程，與骨代謝過程存在諸多相似之處。血管平滑肌細胞在這一過程中扮演著關(guān)鍵角色，在多種刺激因素的作用下，血管平滑肌細胞可發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，進而獲得成骨樣細胞的特性，表達一系列骨特異性蛋白，如骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）、堿性磷酸酶（ALP）等，這些蛋白的表達促進了鈣鹽在血管壁的沉積，最終導(dǎo)致血管鈣化的發(fā)生。針對主動脈平滑肌細胞鈣化的分子機制，眾多信號通路被發(fā)現(xiàn)參與其中。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路在血管鈣化中發(fā)揮著重要作用，TGF-β可以通過激活下游的Smad蛋白，調(diào)節(jié)成骨相關(guān)基因的表達，促進血管平滑肌細胞向成骨樣細胞分化。Wnt/β-catenin信號通路的異常激活也與血管鈣化密切相關(guān)，該信號通路的激活能夠上調(diào)成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達，進而促進血管平滑肌細胞的成骨分化和鈣化。此外，Notch信號通路、NF-κB信號通路等也被證實參與了血管鈣化的調(diào)控過程，它們通過相互作用，共同構(gòu)成了復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。關(guān)于Nrf2的研究，在心血管系統(tǒng)中，Nrf2的抗氧化作用已被廣泛認可。在血管內(nèi)皮細胞中，激活Nrf2能夠上調(diào)抗氧化酶的表達，減少氧化應(yīng)激損傷，維持血管內(nèi)皮細胞的正常功能。在動脈粥樣硬化模型中，Nrf2基因敲除小鼠的動脈粥樣硬化病變明顯加重，而激活Nrf2則能夠抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展，減少斑塊的形成和炎癥反應(yīng)。在心肌缺血再灌注損傷模型中，激活Nrf2信號通路可以減輕心肌細胞的氧化損傷，減少心肌梗死面積，改善心臟功能。然而，目前關(guān)于Nrf2在人主動脈平滑肌細胞鈣化中的作用研究尚顯不足。雖然已有研究表明氧化應(yīng)激在血管鈣化過程中起到重要作用，Nrf2作為關(guān)鍵的抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子，理論上可能參與主動脈平滑肌細胞鈣化的調(diào)控，但具體的作用機制仍不明確。Nrf2是否直接影響主動脈平滑肌細胞的表型轉(zhuǎn)換和鈣化相關(guān)基因的表達，以及Nrf2信號通路與其他參與血管鈣化的信號通路之間是否存在相互作用和調(diào)控關(guān)系，這些問題都有待進一步深入研究和探索。此外，目前針對Nrf2的研究大多集中在細胞和動物模型層面，在人體中的研究相對較少，缺乏臨床數(shù)據(jù)的支持，這也限制了Nrf2作為治療靶點在心血管疾病防治中的臨床應(yīng)用。因此，深入研究Nrf2在人主動脈平滑肌細胞鈣化中的作用及機制，具有重要的科學(xué)意義和臨床價值，有望為心血管疾病的防治提供新的理論依據(jù)和治療策略。1.3研究目的與方法本研究旨在深入揭示Nrf2在人主動脈平滑肌細胞鈣化過程中的具體作用及潛在分子機制，為心血管疾病的防治提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。為實現(xiàn)這一目標，本研究將采用多種研究方法。首先，進行細胞實驗。通過體外培養(yǎng)人主動脈平滑肌細胞，建立細胞鈣化模型。利用高磷培養(yǎng)基誘導(dǎo)人主動脈平滑肌細胞發(fā)生鈣化，模擬體內(nèi)血管鈣化的病理環(huán)境。在該模型中，設(shè)置正常對照組、鈣化模型組、Nrf2激活劑處理組、Nrf2抑制劑處理組以及Nrf2基因敲低組等多個實驗分組。正常對照組給予常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，鈣化模型組僅用高磷培養(yǎng)基誘導(dǎo)鈣化，Nrf2激活劑處理組在高磷培養(yǎng)基誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上加入Nrf2激活劑（如萊菔硫烷SFN），以激活Nrf2信號通路；Nrf2抑制劑處理組則加入Nrf2抑制劑（如ML385），抑制Nrf2的活性；Nrf2基因敲低組通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA（siRNA）特異性地降低Nrf2基因的表達水平。在細胞實驗過程中，運用多種分子生物學(xué)技術(shù)進行檢測分析。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）技術(shù)，檢測鈣化相關(guān)基因（如骨鈣素OCN、骨橋蛋白OPN、堿性磷酸酶ALP等）以及Nrf2下游抗氧化酶基因（如血紅素氧合酶-1HO-1、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶GST等）的mRNA表達水平，以明確Nrf2對這些基因表達的影響。使用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測上述基因?qū)?yīng)的蛋白表達水平，從蛋白質(zhì)層面進一步驗證基因表達的變化情況。利用堿性磷酸酶活性檢測試劑盒測定細胞中堿性磷酸酶的活性，堿性磷酸酶是血管鈣化的關(guān)鍵標志物之一，其活性變化可直觀反映細胞鈣化程度的改變。通過茜素紅染色法對細胞內(nèi)的鈣鹽沉積進行染色和定量分析，清晰地觀察和評估不同處理組細胞的鈣化程度。此外，采用流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，以探究Nrf2對細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響。在分子機制研究方面，運用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)，探究Nrf2是否直接結(jié)合到鈣化相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達。通過免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，研究Nrf2與其他參與血管鈣化信號通路關(guān)鍵蛋白之間是否存在相互作用，從而深入解析Nrf2在人主動脈平滑肌細胞鈣化過程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究綜合運用細胞實驗和多種先進的分子生物學(xué)技術(shù)，全面、系統(tǒng)地探究Nrf2在人主動脈平滑肌細胞鈣化中的作用及機制，有望為心血管疾病的防治開辟新的研究方向和治療策略。二、人主動脈平滑肌細胞鈣化與Nrf2概述2.1人主動脈平滑肌細胞鈣化2.1.1鈣化過程及表現(xiàn)人主動脈平滑肌細胞鈣化是一個復(fù)雜且有序的過程，涉及多個階段和多種細胞生物學(xué)變化。在正常生理狀態(tài)下，主動脈平滑肌細胞呈收縮型，維持著血管的正常結(jié)構(gòu)和功能，它們緊密排列，細胞形態(tài)較為規(guī)則，呈長梭形，具有豐富的肌絲結(jié)構(gòu)，能夠有效地調(diào)節(jié)血管的收縮和舒張，確保血液在血管內(nèi)的平穩(wěn)流動。當受到多種致病因素的刺激時，如高磷血癥、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、機械應(yīng)力改變等，主動脈平滑肌細胞的表型會發(fā)生轉(zhuǎn)換，從收縮型逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?。在這個過程中，細胞的形態(tài)首先發(fā)生顯著變化，長梭形的細胞逐漸變圓，細胞體積增大，肌絲結(jié)構(gòu)減少，細胞內(nèi)的細胞器如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等則變得更為發(fā)達，以適應(yīng)其合成功能的增強。合成型的主動脈平滑肌細胞獲得了成骨樣細胞的特性，開始表達一系列骨特異性蛋白，這是細胞鈣化進程中的關(guān)鍵事件。骨鈣素（OCN）是一種由成骨細胞合成和分泌的非膠原蛋白，在血管鈣化過程中，主動脈平滑肌細胞表達的OCN水平顯著升高。OCN能夠與鈣離子結(jié)合，促進鈣鹽的沉積，其表達量的增加標志著細胞向成骨樣細胞的分化以及鈣化進程的啟動。骨橋蛋白（OPN）也是一種重要的骨相關(guān)蛋白，它具有高度的磷酸化位點，能夠與細胞外基質(zhì)中的多種成分相互作用，調(diào)節(jié)細胞的黏附、遷移和分化。在主動脈平滑肌細胞鈣化過程中，OPN的表達上調(diào)，它不僅可以促進鈣鹽晶體的形成和生長，還能招募其他細胞參與鈣化過程，進一步推動鈣化的發(fā)展。堿性磷酸酶（ALP）是血管鈣化的標志性酶之一，它在細胞內(nèi)參與磷酸酯的水解反應(yīng)，產(chǎn)生無機磷，為鈣鹽的沉積提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著主動脈平滑肌細胞向成骨樣細胞分化，細胞內(nèi)的ALP活性明顯增強，大量的無機磷被釋放出來，與細胞外的鈣離子結(jié)合，形成羥基磷灰石晶體，這些晶體逐漸聚集并沉積在細胞外基質(zhì)中，導(dǎo)致鈣鹽沉積的發(fā)生。在鈣鹽沉積的早期階段，形成的是微小的鈣顆粒，它們散在分布于細胞外基質(zhì)中，隨著鈣化進程的推進，這些鈣顆粒逐漸融合、聚集，形成肉眼可見的鈣化結(jié)節(jié)。通過茜素紅染色等方法，可以清晰地觀察到細胞內(nèi)和細胞外基質(zhì)中紅色的鈣鹽沉積區(qū)域，染色的強度和面積與鈣鹽沉積的程度呈正相關(guān)，能夠直觀地反映細胞的鈣化程度。在電子顯微鏡下，可以更清楚地看到鈣鹽晶體的形態(tài)和分布，它們呈現(xiàn)出規(guī)則的晶格結(jié)構(gòu)，緊密排列在細胞外基質(zhì)的纖維之間，進一步破壞了血管壁的正常結(jié)構(gòu)和功能。除了上述細胞形態(tài)和蛋白表達的變化外，主動脈平滑肌細胞在鈣化過程中，其細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路也發(fā)生了顯著改變。多種信號通路被激活，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、Notch信號通路等，這些信號通路相互交織，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡以及鈣化相關(guān)基因和蛋白的表達。例如，TGF-β信號通路通過激活下游的Smad蛋白，促進成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達，推動細胞向成骨樣細胞分化；Wnt/β-catenin信號通路的激活則能夠上調(diào)成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達，進一步促進細胞的成骨分化和鈣化進程。2.1.2對心血管系統(tǒng)的影響人主動脈平滑肌細胞鈣化對心血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生多方面的負面影響，是導(dǎo)致多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。主動脈作為人體最粗大的動脈，其主要功能是將心臟泵出的富含氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的血液輸送到全身各個組織和器官，為細胞的正常代謝和生理功能提供必要的物質(zhì)保障。正常的主動脈具有良好的彈性和順應(yīng)性，能夠在心臟收縮期儲存部分能量，在心臟舒張期釋放能量，維持血液的持續(xù)流動，保證血壓的穩(wěn)定。當主動脈平滑肌細胞發(fā)生鈣化時，鈣鹽在血管壁的大量沉積使主動脈壁逐漸失去彈性，變得僵硬和脆弱。這種結(jié)構(gòu)上的改變使得主動脈在承受心臟射血產(chǎn)生的壓力時，無法像正常情況下那樣有效地擴張和回縮，導(dǎo)致主動脈的緩沖功能顯著下降。主動脈彈性的降低會引發(fā)一系列血流動力學(xué)改變。在心臟收縮期，由于主動脈不能充分擴張以容納心臟射出的血液，主動脈內(nèi)的壓力會迅速升高，收縮壓顯著上升；在心臟舒張期，主動脈又無法依靠自身的彈性回縮將儲存的能量轉(zhuǎn)化為推動血液流動的動力，導(dǎo)致舒張壓下降，脈壓差增大。長期的脈壓差增大對心臟和血管系統(tǒng)造成額外的負擔，心臟需要更大的力量來克服主動脈的阻力將血液泵出，導(dǎo)致心臟肥厚、心肌耗氧量增加，增加了心力衰竭的發(fā)生風(fēng)險。同時，脈壓差增大還會加速動脈粥樣硬化的發(fā)展，進一步損害血管的結(jié)構(gòu)和功能。隨著主動脈平滑肌細胞鈣化程度的加重，鈣鹽沉積形成的鈣化斑塊會逐漸增大，導(dǎo)致主動脈管腔狹窄。血管狹窄使得血液在血管內(nèi)的流動阻力增加，血流速度減慢，局部血流量減少。這會導(dǎo)致心臟、大腦、腎臟等重要器官的供血不足，引發(fā)相應(yīng)的臨床癥狀。在心臟，供血不足可導(dǎo)致心肌缺血、缺氧，引發(fā)心絞痛、心肌梗死等疾?。辉诖竽X，供血不足可引起頭暈、頭痛、記憶力減退、認知功能障礙等，嚴重時可導(dǎo)致腦梗死；在腎臟，供血不足可影響腎臟的正常代謝和排泄功能，導(dǎo)致腎功能不全、高血壓等疾病的發(fā)生。人主動脈平滑肌細胞鈣化還是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要危險因素，與動脈粥樣硬化、冠心病、主動脈瓣鈣化、心力衰竭等疾病密切相關(guān)。在動脈粥樣硬化的發(fā)生過程中，血管平滑肌細胞的鈣化與脂質(zhì)沉積、炎癥反應(yīng)相互促進，形成惡性循環(huán)。鈣化斑塊的存在破壞了血管內(nèi)膜的完整性，使血液中的脂質(zhì)更容易沉積在血管壁，引發(fā)炎癥反應(yīng)，進一步加重血管損傷和鈣化。冠心病患者中，主動脈鈣化的程度與冠狀動脈粥樣硬化的嚴重程度密切相關(guān)，鈣化越嚴重，冠狀動脈狹窄和阻塞的風(fēng)險越高，心肌梗死的發(fā)生率也相應(yīng)增加。主動脈瓣鈣化是主動脈瓣狹窄和關(guān)閉不全的重要原因之一，主動脈瓣的鈣化導(dǎo)致瓣膜僵硬、增厚，影響瓣膜的正常開閉功能，導(dǎo)致心臟血流動力學(xué)異常，最終可發(fā)展為心力衰竭。此外，主動脈平滑肌細胞鈣化還與心血管疾病的不良預(yù)后相關(guān)。研究表明，存在主動脈鈣化的患者，其心血管事件的發(fā)生率和死亡率明顯高于無鈣化者。鈣化程度越嚴重，患者的預(yù)后越差，生存質(zhì)量和壽命受到顯著影響。因此，深入了解人主動脈平滑肌細胞鈣化對心血管系統(tǒng)的影響，對于心血管疾病的早期診斷、預(yù)防和治療具有重要的臨床意義。2.2Nrf2簡介2.2.1Nrf2的結(jié)構(gòu)與功能核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）屬于CNC（Cap'n'collar）亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族，在細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮著核心作用。Nrf2蛋白由589個氨基酸組成，其結(jié)構(gòu)包含7個高度保守的Nrf2-ECH同源結(jié)構(gòu)域（Neh），這些結(jié)構(gòu)域各具獨特功能，協(xié)同調(diào)控Nrf2的活性和生物學(xué)效應(yīng)。Neh1結(jié)構(gòu)域位于Nrf2蛋白的C端，包含一個堿性亮氨酸拉鏈（bZip）基序。該基序能夠與細胞核內(nèi)的小Maf（sMaf）蛋白形成異二聚體，這種異二聚體結(jié)構(gòu)對于Nrf2識別并結(jié)合到下游基因啟動子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件（ARE）至關(guān)重要。一旦Nrf2-sMaf異二聚體與ARE結(jié)合，即可啟動一系列抗氧化酶和解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄表達，如血紅素氧合酶-1（HO-1）、NAD（P）H：醌氧化還原酶1（NQO1）、谷胱甘肽合成酶（GCL）等，這些酶在清除細胞內(nèi)過多的活性氧（ROS）、解毒有害物質(zhì)以及維持細胞內(nèi)氧化還原平衡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Neh2結(jié)構(gòu)域是Nrf2與胞漿蛋白伴侶分子Keap1的主要結(jié)合區(qū)域，其中包含兩個重要的基序，即DLG基序和ETGE基序。在正常生理狀態(tài)下，Nrf2通過Neh2結(jié)構(gòu)域與Keap1緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。Keap1作為一種支架蛋白，能夠?qū)rf2錨定在細胞質(zhì)中，并通過泛素-蛋白酶體途徑促進Nrf2的降解，從而維持Nrf2在細胞內(nèi)的低水平表達和活性。然而，當細胞受到氧化應(yīng)激、親電試劑、炎癥因子等刺激時，Keap1中的特定半胱氨酸殘基會發(fā)生修飾，導(dǎo)致其構(gòu)象改變。這種構(gòu)象變化使得Nrf2與Keap1的結(jié)合力減弱，Nrf2從復(fù)合物中解離出來，進而避免被泛素化降解。游離的Nrf2迅速轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活功能。Neh3、Neh4和Neh5結(jié)構(gòu)域則主要參與Nrf2的轉(zhuǎn)錄激活過程。當Nrf2進入細胞核并與sMaf蛋白形成異二聚體結(jié)合到ARE上后，還需要與其他輔助轉(zhuǎn)錄因子和共激活因子相互作用，才能啟動基因的轉(zhuǎn)錄。Neh3結(jié)構(gòu)域能夠與轉(zhuǎn)錄共激活因子CBP/p300相互作用，增強Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性。Neh4和Neh5結(jié)構(gòu)域則含有多個磷酸化位點，可被多種蛋白激酶磷酸化修飾。例如，蛋白激酶C（PKC）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等可以磷酸化Neh4和Neh5結(jié)構(gòu)域，從而調(diào)節(jié)Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性和穩(wěn)定性。這些磷酸化修飾能夠影響Nrf2與其他轉(zhuǎn)錄因子和共激活因子的相互作用，進一步調(diào)控下游基因的表達水平。Neh6結(jié)構(gòu)域富含絲氨酸殘基，是一個重要的調(diào)節(jié)區(qū)域。該結(jié)構(gòu)域可以與β-TrCP（β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)蛋白）相互作用，通過泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)Nrf2的降解。在某些情況下，如細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變或信號通路的激活，Neh6結(jié)構(gòu)域的磷酸化狀態(tài)會發(fā)生變化，從而影響其與β-TrCP的結(jié)合能力，進而調(diào)節(jié)Nrf2的穩(wěn)定性和活性。Nrf2的主要功能是調(diào)控細胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)，維持細胞的氧化還原平衡。在正常生理條件下，細胞內(nèi)的ROS水平處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，Nrf2與Keap1結(jié)合，其活性受到抑制。然而，當細胞受到各種應(yīng)激刺激，如紫外線照射、化學(xué)毒物、炎癥介質(zhì)等，細胞內(nèi)的ROS水平會急劇升高，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生。此時，Nrf2被激活，從Keap1復(fù)合物中解離并進入細胞核，與ARE結(jié)合，啟動一系列抗氧化基因的表達。這些抗氧化基因編碼的蛋白能夠協(xié)同作用，增強細胞的抗氧化能力。HO-1可以催化血紅素降解為膽綠素、一氧化碳和亞鐵離子，其中膽綠素在膽綠素還原酶的作用下進一步轉(zhuǎn)化為膽紅素，這些產(chǎn)物都具有強大的抗氧化活性，能夠清除細胞內(nèi)的ROS。NQO1可以催化醌類化合物的雙電子還原，減少醌類化合物對細胞的氧化損傷。GCL則參與谷胱甘肽（GSH）的合成，GSH是細胞內(nèi)最重要的抗氧化劑之一，能夠直接清除ROS，并參與維持細胞內(nèi)的氧化還原電位。除了抗氧化功能外，Nrf2還參與細胞的解毒過程。許多外源性毒物和藥物進入細胞后，會被細胞內(nèi)的解毒酶代謝轉(zhuǎn)化為無毒或低毒的物質(zhì)，然后排出體外。Nrf2可以調(diào)控一系列解毒酶基因的表達，如谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）家族、UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UGT）家族等。這些解毒酶能夠催化外源性物質(zhì)與谷胱甘肽、葡糖醛酸等結(jié)合，增加其水溶性，從而促進其排出體外，減少外源性物質(zhì)對細胞的毒性作用。Nrf2在細胞的代謝調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)抑制、DNA損傷修復(fù)等方面也發(fā)揮著重要作用。在代謝調(diào)節(jié)方面，Nrf2可以調(diào)控細胞內(nèi)的能量代謝、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝等過程。研究表明，Nrf2能夠調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和糖代謝相關(guān)酶的表達，影響細胞對葡萄糖的攝取和利用。在脂質(zhì)代謝中，Nrf2可以抑制脂肪酸合成酶的表達，促進脂肪酸的氧化分解，從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的脂質(zhì)水平。在炎癥反應(yīng)中，Nrf2可以通過抑制核因子-κB（NF-κB）等炎癥信號通路的激活，減少炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，發(fā)揮抗炎作用。此外，Nrf2還可以參與DNA損傷修復(fù)過程，保護細胞的遺傳物質(zhì)免受損傷。當細胞受到紫外線、電離輻射等因素導(dǎo)致DNA損傷時，Nrf2可以上調(diào)DNA修復(fù)相關(guān)基因的表達，促進DNA損傷的修復(fù)，維持基因組的穩(wěn)定性。2.2.2Nrf2信號通路Nrf2信號通路是細胞內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激和解毒防御通路，其激活過程涉及多個分子的相互作用和復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。在正常生理狀態(tài)下，Nrf2主要存在于細胞質(zhì)中，與Keap1緊密結(jié)合形成復(fù)合物。Keap1是一種含有多個結(jié)構(gòu)域的蛋白，包括N端結(jié)構(gòu)域（NTR）、干預(yù)區(qū)（IVR）、BTB結(jié)構(gòu)域、雙甘氨酸重復(fù)區(qū)（DGR，也稱為Kelch結(jié)構(gòu)域）和C端結(jié)構(gòu)域（CTR）。其中，BTB結(jié)構(gòu)域能夠與Cullin3（Cul3）蛋白結(jié)合，形成Keap1-Cul3-E3泛素連接酶復(fù)合物。Kelch結(jié)構(gòu)域則通過與Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域中的DLG和ETGE基序相互作用，將Nrf2錨定在細胞質(zhì)中，并介導(dǎo)Nrf2的泛素化修飾和降解。在這個過程中，Keap1作為E3泛素連接酶復(fù)合物的底物銜接蛋白，識別Nrf2并將其連接到E3復(fù)合物上。E3復(fù)合物催化泛素分子從E2泛素結(jié)合酶轉(zhuǎn)移到Nrf2的賴氨酸殘基上，使Nrf2發(fā)生多聚泛素化修飾。泛素化修飾后的Nrf2被26S蛋白酶體識別并降解，從而維持細胞內(nèi)Nrf2的低水平表達和活性。當細胞受到氧化應(yīng)激、親電試劑、炎癥等刺激時，Nrf2信號通路被激活。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS可以直接修飾Keap1中的半胱氨酸殘基，尤其是IVR區(qū)域的半胱氨酸。這些半胱氨酸殘基的修飾導(dǎo)致Keap1的構(gòu)象發(fā)生改變，使Nrf2與Keap1之間的相互作用減弱。具體來說，ROS可以使Keap1中的半胱氨酸殘基發(fā)生氧化修飾，如形成二硫鍵或磺酸基，從而破壞了Keap1與Nrf2之間的“鉸鏈和閂鎖”結(jié)構(gòu)。根據(jù)“鉸鏈和閂鎖”模型，在正常情況下，Keap1的Kelch結(jié)構(gòu)域通過與Nrf2的DLG和ETGE基序緊密結(jié)合，將Nrf2固定在細胞質(zhì)中。當Keap1的半胱氨酸殘基被修飾后，DLG基序與Keap1的親和力減弱，Nrf2從Keap1復(fù)合物中解離出來，這一過程類似于“鉸鏈”的打開。而ETGE基序與Keap1的結(jié)合相對較弱，在“鉸鏈”打開后，Nrf2即可完全脫離Keap1的束縛，實現(xiàn)“閂鎖”的釋放。除了ROS對Keap1的直接修飾外，細胞內(nèi)還存在其他多種激活Nrf2信號通路的機制。一些蛋白激酶可以通過磷酸化Nrf2來調(diào)節(jié)其活性。蛋白激酶C（PKC）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，都可以磷酸化Nrf2的特定氨基酸殘基。例如，PKC可以磷酸化Nrf2的Ser40位點，增強Nrf2與Keap1的解離，促進Nrf2進入細胞核。ERK可以磷酸化Nrf2的Neh6結(jié)構(gòu)域，影響其與β-TrCP的相互作用，從而穩(wěn)定Nrf2蛋白。JNK和p38MAPK也可以通過磷酸化Nrf2，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性和細胞內(nèi)定位。此外，自噬-溶酶體途徑也參與了Nrf2信號通路的激活。在自噬功能障礙的情況下，如Atg5、Atg7等自噬相關(guān)基因缺失或細胞處于砷毒物環(huán)境中，自噬銜接蛋白p62（也稱為SQSTM1）會在細胞內(nèi)積累。p62是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，它可以與Keap1相互作用，并競爭結(jié)合Nrf2。當p62積累時，它將Keap1螯合到自噬體中，從而阻止了Keap1介導(dǎo)的Nrf2降解。這使得Nrf2得以穩(wěn)定存在并進入細胞核，激活下游基因的表達。一旦Nrf2從Keap1復(fù)合物中解離出來，它便迅速轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)。在細胞核中，Nrf2首先與小Maf（sMaf）蛋白形成異二聚體。sMaf蛋白屬于堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子家族，與Nrf2具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。Nrf2-sMaf異二聚體能夠特異性地識別并結(jié)合到下游基因啟動子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件（ARE）上。ARE是一段具有特定核苷酸序列的DNA元件，通常包含核心序列5'-TGACNNNGC-3'。當Nrf2-sMaf異二聚體與ARE結(jié)合后，會招募一系列轉(zhuǎn)錄輔助因子，如CREB結(jié)合蛋白（CBP）、p300等。這些轉(zhuǎn)錄輔助因子具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，能夠修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，使DNA更易于被轉(zhuǎn)錄機器識別和結(jié)合。同時，它們還可以與RNA聚合酶II等轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物相互作用，促進基因的轉(zhuǎn)錄起始。Nrf2激活后，其下游一系列抗氧化酶、解毒酶和其他細胞保護基因的表達水平顯著上調(diào)。血紅素氧合酶-1（HO-1）是Nrf2的重要靶基因之一。HO-1催化血紅素降解為膽綠素、一氧化碳和亞鐵離子，這些產(chǎn)物具有強大的抗氧化和抗炎作用。膽綠素在膽綠素還原酶的作用下進一步轉(zhuǎn)化為膽紅素，膽紅素是一種高效的抗氧化劑，能夠清除細胞內(nèi)的ROS。一氧化碳具有舒張血管、抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等多種生物學(xué)功能。亞鐵離子則可以參與細胞內(nèi)的鐵代謝過程。NAD（P）H：醌氧化還原酶1（NQO1）也是Nrf2調(diào)控的關(guān)鍵基因。NQO1能夠催化醌類化合物的雙電子還原，將其轉(zhuǎn)化為對細胞毒性較低的氫醌形式。這一過程不僅可以減少醌類化合物對細胞的氧化損傷，還可以促進其排出體外。此外，NQO1還可以通過維持細胞內(nèi)的NAD（P）H/NAD（P）+比值，為細胞內(nèi)的抗氧化反應(yīng)提供必要的還原當量。谷胱甘肽合成酶（GCL）基因的表達也受到Nrf2的調(diào)控。GCL由催化亞基（GCLC）和調(diào)節(jié)亞基（GCLM）組成，它參與谷胱甘肽（GSH）的合成過程。GSH是細胞內(nèi)最重要的抗氧化劑之一，它含有巰基，能夠直接清除ROS，并參與維持細胞內(nèi)的氧化還原電位。在Nrf2的作用下，GCL基因的表達上調(diào)，促進GSH的合成，從而增強細胞的抗氧化能力。除了上述抗氧化酶基因外，Nrf2還可以調(diào)控其他多種細胞保護基因的表達。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）家族基因，它們能夠催化谷胱甘肽與親電物質(zhì)結(jié)合，增加其水溶性，促進其排出體外，從而發(fā)揮解毒作用。UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UGT）家族基因，參與外源性物質(zhì)的葡糖醛酸化修飾，使其更容易被排出體外。此外，Nrf2還可以調(diào)節(jié)一些參與細胞代謝、炎癥反應(yīng)和DNA損傷修復(fù)的基因表達，如血紅素結(jié)合蛋白（HBP）、硫氧還蛋白（Trx）、過氧化氫酶（CAT）等。這些基因產(chǎn)物協(xié)同作用，共同維護細胞的正常生理功能，抵御氧化應(yīng)激和外源性毒物的損傷。三、Nrf2在人主動脈平滑肌細胞鈣化中的作用研究3.1實驗設(shè)計與方法3.1.1細胞培養(yǎng)與分組人主動脈平滑肌細胞（HASMCs）的培養(yǎng)需在嚴格的無菌條件下進行。從新鮮的人主動脈組織中獲取平滑肌細胞，將組織剪切成約1mm×1mm×1mm的小塊，采用組織塊貼壁法進行原代培養(yǎng)。使用含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長融合至80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化液進行消化傳代，一般每2-3天傳代一次，傳至3-8代的細胞用于后續(xù)實驗，此時細胞生長特性穩(wěn)定，能較好地反映其生物學(xué)特性。根據(jù)是否干預(yù)Nrf2表達，將細胞分為以下幾組：正常對照組（Control組）：給予常規(guī)DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，作為正常生長狀態(tài)的參照，用于對比其他實驗組的細胞變化，該組細胞在正常的生理環(huán)境下生長，不進行任何特殊處理，以維持其正常的細胞功能和表型。鈣化模型組（Model組）：用含5mmol/L無機磷的高磷DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，誘導(dǎo)細胞發(fā)生鈣化，模擬體內(nèi)血管鈣化的病理環(huán)境。高磷環(huán)境可刺激主動脈平滑肌細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，向成骨樣細胞分化，從而促進鈣鹽沉積，形成鈣化模型。Nrf2激活劑處理組（SFN組）：在高磷培養(yǎng)基誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，加入10μmol/L的Nrf2激活劑萊菔硫烷（SFN）。SFN能夠特異性地激活Nrf2信號通路，通過與Keap1上的半胱氨酸殘基結(jié)合，使Nrf2從Keap1-Nrf2復(fù)合物中解離，進而進入細胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，上調(diào)Nrf2下游抗氧化酶和其他細胞保護基因的表達。Nrf2抑制劑處理組（ML385組）：在高磷培養(yǎng)基中加入5μmol/L的Nrf2抑制劑ML385。ML385可與Nrf2蛋白結(jié)合，抑制Nrf2與DNA上的抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，從而阻斷Nrf2信號通路的激活，降低Nrf2下游基因的表達水平。Nrf2基因敲低組（siNrf2組）：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將針對Nrf2基因的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染至細胞中，特異性地降低Nrf2基因的表達。轉(zhuǎn)染時，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書進行操作，將siRNA與脂質(zhì)體混合形成復(fù)合物，然后加入到細胞培養(yǎng)基中，使復(fù)合物進入細胞內(nèi)，通過RNA干擾機制降解Nrf2mRNA，從而實現(xiàn)Nrf2基因的敲低。3.1.2檢測指標與方法細胞鈣化程度檢測：鈣含量測定：采用鄰甲酚酞絡(luò)合酮法測定細胞中的鈣含量。具體操作如下，將不同處理組的細胞用胰蛋白酶消化后收集，用PBS洗滌2-3次，然后加入0.6mol/L的鹽酸溶液，在4℃條件下過夜裂解細胞，使細胞內(nèi)的鈣鹽充分溶解。次日，將裂解液離心，取上清液，按照鄰甲酚酞絡(luò)合酮試劑盒的說明書進行操作，在575nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算細胞中的鈣含量。鈣含量的高低直接反映了細胞內(nèi)鈣鹽沉積的程度，是評估細胞鈣化程度的重要指標之一。茜素紅染色：用于直觀地觀察細胞內(nèi)鈣鹽沉積情況。將細胞接種于24孔板中，待細胞處理結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定15-20分鐘，然后用蒸餾水沖洗3次。加入0.1%茜素紅S染色液（pH4.2），在室溫下染色10-15分鐘，期間輕輕搖晃孔板，使染色均勻。染色結(jié)束后，用蒸餾水沖洗多次，直至背景無色。在顯微鏡下觀察，鈣鹽沉積部位會被染成紅色，通過拍照記錄染色情況，并使用ImageJ軟件對染色區(qū)域進行定量分析，計算紅色染色區(qū)域的面積占細胞總面積的百分比，以此來評估細胞的鈣化程度。茜素紅染色法能夠清晰地顯示細胞內(nèi)鈣鹽的分布和沉積情況，是一種常用的細胞鈣化檢測方法。Nrf2表達水平檢測：Westernblot：用于檢測Nrf2蛋白的表達水平。首先，收集不同處理組的細胞，用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）裂解細胞，提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在95℃條件下變性5分鐘。然后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），將蛋白樣品分離后，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時，以防止非特異性結(jié)合。隨后，加入一抗（兔抗人Nrf2抗體，1:1000稀釋），在4℃條件下孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入二抗（山羊抗兔IgG-HRP，1:5000稀釋），在室溫下孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液洗滌3次后，使用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）進行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光成像，通過分析條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算Nrf2蛋白的相對表達量。Westernblot技術(shù)能夠準確地檢測蛋白的表達水平，是研究蛋白質(zhì)表達變化的常用方法。RT-qPCR：用于檢測Nrf2基因的mRNA表達水平。使用TRIzol試劑提取不同處理組細胞的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進行實時熒光定量PCR擴增。Nrf2的引物序列為：上游引物5'-AGCCAGCAGATGTGCTTCTC-3'，下游引物5'-CTCCACAGCCTTGCTGTTGT-3'。反應(yīng)體系包括cDNA模板、SYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過2^(-ΔΔCt)法計算Nrf2mRNA的相對表達量。RT-qPCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、定量準確等優(yōu)點，能夠快速、準確地檢測基因的表達水平。3.2實驗結(jié)果3.2.1Nrf2表達變化對細胞鈣化程度的影響通過鄰甲酚酞絡(luò)合酮法測定細胞鈣含量，結(jié)果顯示，與正常對照組相比，鈣化模型組細胞內(nèi)鈣含量顯著升高（P<0.01），表明高磷培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)了人主動脈平滑肌細胞發(fā)生鈣化。在Nrf2激活劑萊菔硫烷（SFN）處理組中，細胞鈣含量較鈣化模型組明顯降低（P<0.05），這表明激活Nrf2信號通路能夠有效抑制細胞的鈣化程度。而在Nrf2抑制劑ML385處理組和Nrf2基因敲低組（siNrf2組），細胞鈣含量較鈣化模型組進一步升高（P<0.05），說明抑制Nrf2的表達或活性會促進細胞的鈣化。茜素紅染色結(jié)果直觀地展示了不同處理組細胞的鈣化情況。正常對照組細胞幾乎未見紅色鈣鹽沉積，染色呈陰性。鈣化模型組細胞內(nèi)和細胞外基質(zhì)中出現(xiàn)大量紅色鈣鹽沉積，染色呈強陽性，表明細胞發(fā)生了明顯的鈣化。SFN處理組細胞的紅色鈣鹽沉積區(qū)域明顯減少，染色強度減弱。相反，ML385處理組和siNrf2組細胞的紅色鈣鹽沉積區(qū)域進一步擴大，染色強度增強。使用ImageJ軟件對染色區(qū)域進行定量分析，結(jié)果與鈣含量測定結(jié)果一致。與正常對照組相比，鈣化模型組紅色染色區(qū)域面積占細胞總面積的百分比顯著增加（P<0.01）。SFN處理組該百分比明顯低于鈣化模型組（P<0.05）。ML385處理組和siNrf2組該百分比則顯著高于鈣化模型組（P<0.05）。這些結(jié)果表明，Nrf2表達上調(diào)可抑制人主動脈平滑肌細胞的鈣化程度，而Nrf2表達下調(diào)或活性抑制則會促進細胞鈣化。3.2.2Nrf2對相關(guān)蛋白表達的影響采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測鈣化相關(guān)蛋白骨橋蛋白（OPN）和堿性磷酸酶（ALP）的表達水平。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，鈣化模型組OPN和ALP蛋白表達顯著上調(diào)（P<0.01），這與細胞鈣化程度的增加相呼應(yīng)。在SFN處理組，OPN和ALP蛋白表達較鈣化模型組明顯降低（P<0.05），表明激活Nrf2能夠抑制鈣化相關(guān)蛋白的表達。在ML385處理組和siNrf2組，OPN和ALP蛋白表達較鈣化模型組進一步升高（P<0.05），說明抑制Nrf2會增強這些蛋白的表達。進一步檢測Nrf2下游抗氧化酶血紅素氧合酶-1（HO-1）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）的蛋白表達水平。與正常對照組相比，鈣化模型組HO-1和GST蛋白表達略有下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在SFN處理組，HO-1和GST蛋白表達顯著上調(diào)（P<0.05），表明激活Nrf2成功誘導(dǎo)了下游抗氧化酶的表達。在ML385處理組和siNrf2組，HO-1和GST蛋白表達較正常對照組和鈣化模型組均顯著降低（P<0.05），說明抑制Nrf2會阻礙下游抗氧化酶的表達。這些結(jié)果表明，Nrf2能夠調(diào)控與細胞鈣化相關(guān)蛋白以及下游抗氧化酶的表達，通過抑制鈣化相關(guān)蛋白表達和增強抗氧化酶表達，發(fā)揮對人主動脈平滑肌細胞鈣化的抑制作用。3.3結(jié)果分析與討論3.3.1Nrf2在細胞鈣化中的作用機制探討從實驗結(jié)果可知，Nrf2對人主動脈平滑肌細胞鈣化具有顯著的調(diào)控作用。其作用機制可能是多方面的，其中抗氧化作用是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。在正常生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)的氧化還原系統(tǒng)保持平衡，活性氧（ROS）的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)穩(wěn)定。當細胞受到高磷等刺激，誘導(dǎo)細胞鈣化時，氧化應(yīng)激水平升高，ROS大量產(chǎn)生。過量的ROS可攻擊細胞內(nèi)的生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，導(dǎo)致細胞損傷和功能障礙。同時，ROS還可以作為信號分子，激活一系列與細胞鈣化相關(guān)的信號通路，促進主動脈平滑肌細胞向成骨樣細胞分化，上調(diào)鈣化相關(guān)蛋白如骨橋蛋白（OPN）、堿性磷酸酶（ALP）的表達，從而加速鈣鹽沉積，促進細胞鈣化。Nrf2作為細胞內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下被激活。激活后的Nrf2進入細胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，啟動下游抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄表達。在本實驗中，當用Nrf2激活劑萊菔硫烷（SFN）處理細胞后，Nrf2下游抗氧化酶血紅素氧合酶-1（HO-1）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）的表達顯著上調(diào)。HO-1催化血紅素降解生成的膽綠素、一氧化碳和亞鐵離子等產(chǎn)物具有強大的抗氧化能力。膽綠素在膽綠素還原酶的作用下進一步轉(zhuǎn)化為膽紅素，膽紅素是一種高效的抗氧化劑，能夠清除細胞內(nèi)的ROS。一氧化碳具有舒張血管、抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等多種生物學(xué)功能，也有助于減輕氧化應(yīng)激對細胞的損傷。亞鐵離子則可以參與細胞內(nèi)的鐵代謝過程，維持細胞的正常生理功能。GST能夠催化谷胱甘肽與親電物質(zhì)結(jié)合，增加其水溶性，促進其排出體外，從而發(fā)揮解毒作用，減少ROS對細胞的損害。通過上調(diào)這些抗氧化酶的表達，Nrf2增強了細胞的抗氧化能力，有效清除過多的ROS，降低氧化應(yīng)激水平。這不僅減輕了ROS對細胞的直接損傷，還阻斷了ROS介導(dǎo)的細胞鈣化相關(guān)信號通路的激活，從而抑制了主動脈平滑肌細胞向成骨樣細胞的分化，減少了鈣化相關(guān)蛋白的表達，最終抑制了細胞的鈣化程度。除了抗氧化作用外，Nrf2還可能通過其他機制影響細胞鈣化。Nrf2可能直接或間接調(diào)控一些與細胞鈣化相關(guān)的基因和信號通路。研究表明，Nrf2可以與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)它們的活性，進而影響細胞的分化和功能。在主動脈平滑肌細胞鈣化過程中，轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等都發(fā)揮著重要作用。Nrf2是否與這些信號通路存在相互作用，通過調(diào)節(jié)它們的活性來影響細胞鈣化，還需要進一步深入研究。此外，Nrf2還可能參與細胞內(nèi)的代謝調(diào)節(jié)過程，影響細胞的能量代謝、脂質(zhì)代謝等，從而間接影響細胞的鈣化進程。例如，Nrf2可以調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和糖代謝相關(guān)酶的表達，影響細胞對葡萄糖的攝取和利用。細胞的能量代謝狀態(tài)可能會影響其分化和功能，進而影響細胞的鈣化過程。未來的研究可以從這些方面入手，深入探究Nrf2在人主動脈平滑肌細胞鈣化中的作用機制。3.3.2與現(xiàn)有研究的對比和驗證本研究結(jié)果與前人相關(guān)研究在部分方面具有一致性，但也存在一些差異。在Nrf2的抗氧化作用與細胞保護方面，與已有研究結(jié)論相符。眾多研究表明，Nrf2在多種細胞和組織中都發(fā)揮著抗氧化應(yīng)激和細胞保護的作用。在血管內(nèi)皮細胞中，激活Nrf2能夠上調(diào)抗氧化酶的表達，減少氧化應(yīng)激損傷，維持血管內(nèi)皮細胞的正常功能。在動脈粥樣硬化模型中，激活Nrf2可以抑制炎癥反應(yīng)，減少斑塊的形成和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2能夠上調(diào)人主動脈平滑肌細胞中抗氧化酶HO-1和GST的表達，降低細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，抑制細胞鈣化，這與前人在其他細胞和疾病模型中的研究結(jié)果一致，進一步證實了Nrf2在心血管系統(tǒng)中的抗氧化和細胞保護作用。然而，在Nrf2對人主動脈平滑肌細胞鈣化的具體調(diào)控機制方面，本研究與現(xiàn)有研究存在一定差異。一些研究認為，Nrf2可能通過直接調(diào)控鈣化相關(guān)基因的表達來影響細胞鈣化。但在本研究中，通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）等技術(shù)，未發(fā)現(xiàn)Nrf2直接結(jié)合到鈣化相關(guān)基因（如OCN、OPN、ALP等）的啟動子區(qū)域，提示Nrf2對細胞鈣化的調(diào)控可能并非通過直接作用于鈣化相關(guān)基因。這種差異可能是由于研究方法、實驗?zāi)Ｐ突蚣毎愋偷牟煌鶎?dǎo)致。不同的研究可能采用了不同的細胞來源、培養(yǎng)條件和刺激因素，這些因素都可能影響Nrf2與鈣化相關(guān)基因之間的相互作用。此外，研究技術(shù)的局限性也可能導(dǎo)致結(jié)果的差異。ChIP技術(shù)雖然能夠檢測蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合情況，但存在一定的假陰性率，可能無法檢測到低親和力或短暫的相互作用。在Nrf2與其他信號通路的關(guān)系方面，現(xiàn)有研究表明，Nrf2與TGF-β、Wnt/β-catenin等信號通路之間存在復(fù)雜的相互作用。在某些情況下，Nrf2可以抑制TGF-β信號通路的激活，從而減輕細胞的纖維化和增殖。在另一些研究中，Nrf2與Wnt/β-catenin信號通路相互調(diào)節(jié)，共同影響細胞的分化和發(fā)育。然而，在本研究中，尚未明確Nrf2與這些信號通路在人主動脈平滑肌細胞鈣化過程中的具體相互作用機制。這可能是因為信號通路之間的相互作用受到多種因素的影響，包括細胞微環(huán)境、刺激因素的強度和持續(xù)時間等。在不同的實驗條件下，Nrf2與其他信號通路之間的相互作用可能會發(fā)生變化，導(dǎo)致研究結(jié)果的差異。為了進一步驗證本研究結(jié)果的可靠性，并深入探討Nrf2在人主動脈平滑肌細胞鈣化中的作用機制，未來的研究可以從以下幾個方面展開。采用多種研究技術(shù)和方法，如RNA測序（RNA-seq）、蛋白質(zhì)組學(xué)等，全面分析Nrf2激活或抑制后細胞內(nèi)基因表達和蛋白質(zhì)表達的變化，尋找Nrf2調(diào)控細胞鈣化的新靶點和信號通路。在不同的細胞模型和動物模型中進行研究，驗證本研究結(jié)果的普遍性和適用性。結(jié)合臨床樣本，分析Nrf2表達與主動脈平滑肌細胞鈣化以及心血管疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，為臨床治療提供更直接的證據(jù)。通過這些研究，可以更深入地了解Nrf2在人主動脈平滑肌細胞鈣化中的作用機制，為心血管疾病的防治提供更有效的理論依據(jù)和治療策略。四、Nrf2影響人主動脈平滑肌細胞鈣化的分子機制4.1Nrf2與相關(guān)信號通路的關(guān)系4.1.1Nrf2對MAPK信號通路的調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細胞的增殖、分化、凋亡以及應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MAPK信號通路主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條主要的分支。在人主動脈平滑肌細胞鈣化過程中，MAPK信號通路被激活，參與調(diào)節(jié)細胞的表型轉(zhuǎn)換和鈣化相關(guān)基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2與MAPK信號通路之間存在密切的調(diào)控關(guān)系。在氧化應(yīng)激條件下，激活Nrf2能夠調(diào)節(jié)MAPK信號通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。在人主動脈平滑肌細胞中，用Nrf2激活劑萊菔硫烷（SFN）處理細胞后，通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，ERK的磷酸化水平明顯降低。ERK的持續(xù)激活可促進主動脈平滑肌細胞的增殖和遷移，同時上調(diào)鈣化相關(guān)蛋白如骨橋蛋白（OPN）和堿性磷酸酶（ALP）的表達，從而促進細胞鈣化。而Nrf2激活后抑制了ERK的磷酸化，可能通過阻斷ERK介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，減少細胞的增殖和遷移，降低鈣化相關(guān)蛋白的表達，進而抑制細胞鈣化。對于JNK和p38MAPK，Nrf2的激活也會對其磷酸化水平產(chǎn)生影響。在高磷誘導(dǎo)的人主動脈平滑肌細胞鈣化模型中，JNK和p38MAPK的磷酸化水平顯著升高。當給予Nrf2激活劑處理后，JNK和p38MAPK的磷酸化水平有所下降。JNK和p38MAPK的激活可誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，促進主動脈平滑肌細胞向成骨樣細胞分化，加速細胞鈣化。Nrf2通過抑制JNK和p38MAPK的磷酸化，可能減輕細胞的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激狀態(tài)，抑制細胞的成骨分化，從而發(fā)揮對細胞鈣化的抑制作用。進一步探究其分子機制，發(fā)現(xiàn)Nrf2可能通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路中上游的激酶或磷酸酶來影響關(guān)鍵蛋白的磷酸化。Nrf2激活后，可能上調(diào)某些磷酸酶的表達或活性，如雙特異性磷酸酶（DUSP）家族成員。DUSP能夠特異性地去磷酸化MAPK，使其失活。當Nrf2激活導(dǎo)致DUSP表達增加時，DUSP可作用于ERK、JNK和p38MAPK，去除其磷酸基團，抑制其活性，從而阻斷MAPK信號通路的傳導(dǎo)。此外，Nrf2還可能通過與MAPK信號通路中的其他調(diào)節(jié)蛋白相互作用，間接影響MAPK的磷酸化和活性。例如，Nrf2可能與一些支架蛋白結(jié)合，改變MAPK信號通路中蛋白復(fù)合物的組裝和定位，影響信號的傳遞效率。4.1.2Nrf2與Wnt/β-catenin信號通路的交互作用Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化和組織穩(wěn)態(tài)維持等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，在人主動脈平滑肌細胞鈣化過程中也扮演著關(guān)鍵角色。在正常情況下，Wnt信號未激活時，細胞質(zhì)中的β-catenin與Axin、腺瘤性息肉病大腸桿菌蛋白（APC）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等形成復(fù)合物。GSK-3β可磷酸化β-catenin，使其被泛素化修飾后經(jīng)蛋白酶體降解，維持細胞內(nèi)β-catenin的低水平。當Wnt信號激活時，Wnt蛋白與細胞膜上的受體卷曲蛋白（Frizzled）和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）結(jié)合，激活下游的Dishevelled（Dvl）蛋白。Dvl抑制GSK-3β的活性，使β-catenin無法被磷酸化和降解。穩(wěn)定的β-catenin在細胞質(zhì)中積累，并進入細胞核，與T細胞因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因的表達，包括與細胞增殖、分化和鈣化相關(guān)的基因。研究表明，Nrf2與Wnt/β-catenin信號通路之間存在復(fù)雜的交互作用。在人主動脈平滑肌細胞中，激活Nrf2可抑制Wnt/β-catenin信號通路的活性。通過免疫熒光染色和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，用Nrf2激活劑SFN處理細胞后，細胞核內(nèi)β-catenin的表達明顯減少，同時Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因如成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2和細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達也顯著降低。這表明Nrf2激活后，可能通過某種機制抑制了β-catenin的核轉(zhuǎn)位，從而阻斷了Wnt/β-catenin信號通路的傳導(dǎo)，減少了與細胞鈣化相關(guān)基因的表達。其具體作用機制可能涉及多個方面。Nrf2可能通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路中的關(guān)鍵蛋白來影響其活性。Nrf2激活后，可能上調(diào)一些抑制Wnt信號的蛋白表達，如DKK1（dickkopf-1）。DKK1是一種分泌型糖蛋白，它可以與LRP5/6結(jié)合，阻止Wnt蛋白與受體復(fù)合物的相互作用，從而抑制Wnt信號的激活。當Nrf2促進DKK1表達增加時，DKK1可競爭性地結(jié)合LRP5/6，阻斷Wnt信號的傳導(dǎo)，減少β-catenin的積累和核轉(zhuǎn)位，進而抑制Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因的表達。Nrf2還可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)來影響Wnt/β-catenin信號通路。氧化應(yīng)激可激活Wnt/β-catenin信號通路，促進主動脈平滑肌細胞的成骨分化和鈣化。Nrf2作為重要的抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子，激活后可增強細胞的抗氧化能力，降低細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平。降低的ROS水平可能抑制了Wnt信號通路中某些關(guān)鍵蛋白的氧化修飾，從而抑制了Wnt信號的激活。研究發(fā)現(xiàn)，ROS可以氧化修飾Dvl蛋白，使其活性增強，進而促進Wnt信號的傳導(dǎo)。當Nrf2降低ROS水平后，Dvl的氧化修飾減少，活性降低，Wnt信號通路的激活受到抑制，最終抑制了細胞的鈣化。此外，Nrf2與Wnt/β-catenin信號通路之間可能存在相互反饋調(diào)節(jié)機制。Wnt/β-catenin信號通路的激活也可能對Nrf2的表達和活性產(chǎn)生影響。在某些情況下，Wnt/β-catenin信號通路的過度激活可能導(dǎo)致細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，進而激活Nrf2信號通路。Nrf2被激活后，又會反過來抑制Wnt/β-catenin信號通路的活性，形成一種負反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，以維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。4.2Nrf2通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激影響細胞鈣化4.2.1Nrf2對細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激在人主動脈平滑肌細胞鈣化過程中扮演著關(guān)鍵角色，而Nrf2作為細胞內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子，對細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平具有顯著的調(diào)節(jié)作用。在正常生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)的活性氧（ROS）處于動態(tài)平衡，其產(chǎn)生與清除機制相互協(xié)調(diào)，以維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。然而，在高磷等誘導(dǎo)細胞鈣化的刺激條件下，細胞內(nèi)的氧化還原平衡被打破，ROS大量產(chǎn)生。這些過量的ROS可來源于多個途徑，如線粒體呼吸鏈功能障礙、NADPH氧化酶的激活以及抗氧化防御系統(tǒng)的失衡等。為了探究Nrf2對細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的調(diào)節(jié)作用，在實驗中對不同處理組的人主動脈平滑肌細胞進行了ROS水平檢測。采用熒光探針DCFH-DA進行標記，該探針本身無熒光，但進入細胞后可被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，DCFH能與ROS反應(yīng)生成具有強熒光的DCF，通過檢測DCF的熒光強度即可反映細胞內(nèi)ROS的水平。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，鈣化模型組細胞內(nèi)ROS水平顯著升高（P<0.01），這表明高磷誘導(dǎo)的細胞鈣化過程伴隨著氧化應(yīng)激的增強。當用Nrf2激活劑萊菔硫烷（SFN）處理細胞后，細胞內(nèi)ROS水平較鈣化模型組明顯降低（P<0.05）。這說明激活Nrf2能夠有效抑制ROS的產(chǎn)生，降低細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。相反，在Nrf2抑制劑ML385處理組和Nrf2基因敲低組（siNrf2組），細胞內(nèi)ROS水平較鈣化模型組進一步升高（P<0.05）。這表明抑制Nrf2的表達或活性會導(dǎo)致細胞內(nèi)抗氧化能力下降，ROS積累增加，進一步加重氧化應(yīng)激。Nrf2對細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的調(diào)節(jié)主要通過激活下游抗氧化酶基因的表達來實現(xiàn)。Nrf2激活后，進入細胞核與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，啟動一系列抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄。血紅素氧合酶-1（HO-1）是Nrf2的重要靶基因之一。HO-1催化血紅素降解生成膽綠素、一氧化碳和亞鐵離子，這些產(chǎn)物都具有強大的抗氧化能力。膽綠素在膽綠素還原酶的作用下進一步轉(zhuǎn)化為膽紅素，膽紅素能夠有效清除細胞內(nèi)的ROS。一氧化碳具有舒張血管、抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等多種生物學(xué)功能，也有助于減輕氧化應(yīng)激對細胞的損傷。亞鐵離子則可以參與細胞內(nèi)的鐵代謝過程，維持細胞的正常生理功能。在本實驗中，通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，SFN處理組細胞中HO-1蛋白表達顯著上調(diào)（P<0.05），而ML385處理組和siNrf2組HO-1蛋白表達則顯著降低（P<0.05）。這表明Nrf2能夠調(diào)控HO-1的表達，從而增強細胞的抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激水平。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）也是Nrf2調(diào)控的重要抗氧化酶。GST能夠催化谷胱甘肽與親電物質(zhì)結(jié)合，增加其水溶性，促進其排出體外，從而發(fā)揮解毒作用，減少ROS對細胞的損害。在實驗中，同樣觀察到SFN處理組GST蛋白表達上調(diào)，而ML385處理組和siNrf2組GST蛋白表達下調(diào)。這進一步證實了Nrf2通過調(diào)節(jié)GST等抗氧化酶的表達，參與細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的調(diào)節(jié)。除了上述抗氧化酶外，Nrf2還可以調(diào)節(jié)其他抗氧化相關(guān)蛋白和分子的表達，如NAD（P）H：醌氧化還原酶1（NQO1）、谷胱甘肽合成酶（GCL）等。NQO1能夠催化醌類化合物的雙電子還原，減少醌類化合物對細胞的氧化損傷。GCL參與谷胱甘肽（GSH）的合成，GSH是細胞內(nèi)最重要的抗氧化劑之一，能夠直接清除ROS，并參與維持細胞內(nèi)的氧化還原電位。Nrf2通過上調(diào)這些抗氧化相關(guān)分子的表達，協(xié)同作用，增強細胞的抗氧化防御系統(tǒng)，有效調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。4.2.2氧化應(yīng)激在Nrf2影響細胞鈣化中的中介作用為了驗證氧化應(yīng)激是否為Nrf2影響人主動脈平滑肌細胞鈣化的中間環(huán)節(jié)，進行了抗氧化劑干預(yù)實驗。在高磷誘導(dǎo)的細胞鈣化模型中，分別加入不同的抗氧化劑進行處理。選取了具有代表性的抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC），NAC是一種前體藥物，進入細胞后可被代謝為半胱氨酸，半胱氨酸是合成GSH的關(guān)鍵原料，能夠提高細胞內(nèi)GSH的水平，增強細胞的抗氧化能力。將細胞分為以下幾組：正常對照組、鈣化模型組、Nrf2激活劑處理組（SFN組）、抗氧化劑NAC處理組以及Nrf2激活劑+抗氧化劑處理組（SFN+NAC組）。在培養(yǎng)過程中，正常對照組給予常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，鈣化模型組用高磷培養(yǎng)基誘導(dǎo)鈣化，SFN組在高磷培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入Nrf2激活劑SFN，NAC組在高磷培養(yǎng)基中加入抗氧化劑NAC，SFN+NAC組則同時加入SFN和NAC。通過鈣含量測定和茜素紅染色等方法檢測細胞的鈣化程度。鈣含量測定結(jié)果顯示，與正常對照組相比，鈣化模型組細胞內(nèi)鈣含量顯著升高（P<0.01）。NAC處理組細胞鈣含量較鈣化模型組有所降低（P<0.05），表明抗氧化劑NAC能夠抑制細胞的鈣化。SFN組細胞鈣含量也明顯低于鈣化模型組（P<0.05），進一步驗證了激活Nrf2對細胞鈣化的抑制作用。在SFN+NAC組，細胞鈣含量與SFN組相比無顯著差異（P>0.05）。這說明在激活Nrf2的基礎(chǔ)上，再加入抗氧化劑NAC，并沒有進一步降低細胞的鈣化程度，提示抗氧化劑NAC和激活Nrf2在抑制細胞鈣化方面可能存在相同的作用機制，即通過降低氧化應(yīng)激水平來抑制細胞鈣化。茜素紅染色結(jié)果也與鈣含量測定結(jié)果一致。正常對照組細胞幾乎未見紅色鈣鹽沉積，染色呈陰性。鈣化模型組細胞內(nèi)和細胞外基質(zhì)中出現(xiàn)大量紅色鈣鹽沉積，染色呈強陽性。NAC處理組細胞的紅色鈣鹽沉積區(qū)域明顯減少，染色強度減弱。SFN組細胞的紅色鈣鹽沉積區(qū)域也顯著減少。SFN+NAC組與SFN組相比，紅色鈣鹽沉積區(qū)域和染色強度無明顯差異。通過ImageJ軟件對染色區(qū)域進行定量分析，結(jié)果顯示，與正常對照組相比，鈣化模型組紅色染色區(qū)域面積占細胞總面積的百分比顯著增加（P<0.01）。NAC處理組和SFN組該百分比明顯低于鈣化模型組（P<0.05）。SFN+NAC組與SFN組相比，該百分比無顯著差異（P>0.05）。進一步檢測細胞內(nèi)ROS水平和鈣化相關(guān)蛋白的表達。ROS水平檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，鈣化模型組細胞內(nèi)ROS水平顯著升高（P<0.01）。NAC處理組和SFN組細胞內(nèi)ROS水平均明顯低于鈣化模型組（P<0.05）。SFN+NAC組細胞內(nèi)ROS水平與SFN組相比無顯著差異（P>0.05）。這表明抗氧化劑NAC和激活Nrf2都能夠有效降低細胞內(nèi)的ROS水平，且兩者聯(lián)合使用時，對ROS水平的降低效果無明顯疊加。在鈣化相關(guān)蛋白表達方面，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測骨橋蛋白（OPN）和堿性磷酸酶（ALP）的表達水平。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，鈣化模型組OPN和ALP蛋白表達顯著上調(diào)（P<0.01）。NAC處理組和SFN組OPN和ALP蛋白表達較鈣化模型組明顯降低（P<0.05）。SFN+NAC組與SFN組相比，OPN和ALP蛋白表達無顯著差異（P>0.05）。這說明抗氧化劑NAC和激活Nrf2都能夠抑制鈣化相關(guān)蛋白的表達，且兩者聯(lián)合使用時，對鈣化相關(guān)蛋白表達的抑制效果無明顯疊加。綜上所述，抗氧化劑干預(yù)實驗表明，氧化應(yīng)激在Nrf2影響人主動脈平滑肌細胞鈣化的過程中起到了中介作用。激活Nrf2通過降低細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，抑制了細胞的鈣化?？寡趸瘎㎞AC能夠模擬激活Nrf2的作用，抑制細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，降低氧化應(yīng)激水平，進而抑制細胞鈣化。在激活Nrf2的基礎(chǔ)上，再加入抗氧化劑NAC，并沒有進一步增強對細胞鈣化的抑制作用，這進一步證實了氧化應(yīng)激是Nrf2影響細胞鈣化的關(guān)鍵中間環(huán)節(jié)。4.3Nrf2對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控4.3.1Nrf2與Runx2的相互作用Runx2作為成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，在人主動脈平滑肌細胞向成骨樣細胞分化及鈣化過程中發(fā)揮著核心作用。Runx2基因編碼的蛋白質(zhì)含有高度保守的Runt結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠與DNA上的特定序列結(jié)合，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達。在主動脈平滑肌細胞鈣化過程中，Runx2的表達上調(diào)，它可以與骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）等鈣化相關(guān)基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加OCN、OPN等蛋白的表達，加速鈣鹽沉積，推動細胞鈣化進程。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2與Runx2之間存在密切的相互作用。在高磷誘導(dǎo)的人主動脈平滑肌細胞鈣化模型中，當Nrf2被激活時，Runx2的表達受到抑制。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，用Nrf2激活劑萊菔硫烷（SFN）處理細胞后，Runx2蛋白表達水平較鈣化模型組明顯降低（P<0.05）。進一步通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測Runx2基因的mRNA表達水平，也得到了類似的結(jié)果，即SFN處理組Runx2mRNA表達顯著低于鈣化模型組（P<0.05）。這表明激活Nrf2能夠抑制Runx2的表達，從而抑制主動脈平滑肌細胞的成骨樣分化和鈣化。深入探究其分子機制，發(fā)現(xiàn)Nrf2可能通過多種途徑影響Runx2的表達和活性。Nrf2激活后，上調(diào)的抗氧化酶可能通過降低細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，間接抑制Runx2的表達。氧化應(yīng)激可激活一系列信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，而激活的MAPK信號通路可促進Runx2的表達。當Nrf2增強細胞的抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激水平時，可阻斷MAPK信號通路的激活，從而減少Runx2的表達。Nrf2還可能與Runx2的上游調(diào)控因子相互作用，影響Runx2的表達。Wnt/β-catenin信號通路是Runx2的重要上游調(diào)控通路之一。在正常情況下，Wnt信號未激活時，細胞質(zhì)中的β-catenin與Axin、腺瘤性息肉病大腸桿菌蛋白（APC）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等形成復(fù)合物，GSK-3β可磷酸化β-catenin，使其被泛素化修飾后經(jīng)蛋白酶體降解，維持細胞內(nèi)β-catenin的低水平。當Wnt信號激活時，β-catenin在細胞質(zhì)中積累，并進入細胞核，與T細胞因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因Runx2的表達。如前文所述，Nrf2與Wnt/β-catenin信號通路存在交互作用，Nrf2激活后可抑制Wnt/β-catenin信號通路的活性，減少β-catenin的核轉(zhuǎn)位，從而抑制Runx2的表達。此外，Nrf2可能直接與Runx2的啟動子區(qū)域結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄活性。通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗發(fā)現(xiàn)，在人主動脈平滑肌細胞中，Nrf2能夠與Runx2啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合。進一步的熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，Nrf2與Runx2啟動子區(qū)域的結(jié)合可降低Runx2啟動子的活性，從而抑制Runx2基因的轉(zhuǎn)錄表達。這表明Nrf2可以通過直接作用于Runx2的啟動子，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄，進而影響主動脈平滑肌細胞的成骨樣分化和鈣化。4.3.2對其他轉(zhuǎn)錄因子的影響及在鈣化中的作用除了Runx2，Nrf2還可能對其他參與人主動脈平滑肌細胞鈣化的轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生影響。核因子-κB（NF-κB）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)和細胞增殖、分化等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在主動脈平滑肌細胞鈣化過程中，NF-κB信號通路被激活，促進炎癥因子的表達，進而加速細胞鈣化。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2與NF-κB信號通路之間存在相互調(diào)控關(guān)系。激活Nrf2可以抑制NF-κB的活性，減少炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等的表達。在高磷誘導(dǎo)的細胞鈣化模型中，用Nrf2激活劑處理細胞后，通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測發(fā)現(xiàn)，細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6的含量明顯降低（P<0.05）。這表明Nrf2可能通過抑制NF-κB信號通路，減輕炎癥反應(yīng)，從而抑制主動脈平滑肌細胞的鈣化。其作用機制可能是Nrf2激活后，上調(diào)的抗氧化酶降低了細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，而氧化應(yīng)激是激活NF-κB信號通路的重要因素之一。當氧化應(yīng)激水平降低時，NF-κB的激活受到抑制，從而減少了炎癥因子的產(chǎn)生。CCAAT增強子結(jié)合蛋白β（C/EBPβ）也是一種與細胞分化和炎癥反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。在主動脈平滑肌細胞鈣化過程中，C/EBPβ的表達上調(diào)，它可以調(diào)控一系列與細胞增殖、分化相關(guān)基因的表達，促進細胞向成骨樣細胞分化。研究表明，Nrf2對C/EBPβ的表達和活性也具有調(diào)節(jié)作用。在人主動脈平滑肌細胞中，激活Nrf2可使C/EBPβ蛋白表達水平降低（P<0.05）。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2可能通過調(diào)節(jié)C/EBPβ的上游信號通路或與C/EBPβ直接相互作用，影響其活性。例如，Nrf2可能通過抑制MAPK信號通路中某些激酶的活性，減少C/EBPβ的磷酸化，從而降低其活性。此外，Nrf2還可能與C/EBPβ競爭結(jié)合到某些基因的啟動子區(qū)域，抑制C/EBPβ對這些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，進而抑制主動脈平滑肌細胞的成骨樣分化和鈣化。性別決定區(qū)Y框蛋白9（Sox9）是一種在軟骨形成和骨骼發(fā)育中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。在主動脈平滑肌細胞鈣化過程中，Sox9的表達也會發(fā)生變化，它可能參與調(diào)節(jié)細胞的表型轉(zhuǎn)換和鈣化相關(guān)基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2與Sox9之間存在一定的關(guān)聯(lián)。在高磷誘導(dǎo)的細胞鈣化模型中，激活Nrf2后，Sox9的表達受到抑制。通過RT-qPCR和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，SFN處理組Sox9的mRNA和蛋白表達水平均明顯低于鈣化模型組（P<0.05）。這表明Nrf2可能通過抑制Sox9的表達，影響主動脈平滑肌細胞的成骨樣分化和鈣化。具體作用機制可能是Nrf2通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，影響Sox9的穩(wěn)定性或與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，從而抑制其功能。此外，Nrf2還可能通過調(diào)控Sox9的上游信號通路，如BMP-Smad信號通路等，間接影響Sox9的表達和活性。在BMP-Smad信號通路中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）與受體結(jié)合后，激活下游的Smad蛋白，Smad蛋白進入細胞核與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)Sox9等