蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

一、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達(dá)1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。*蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜二、蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)和等電點(diǎn)

蛋白質(zhì)的兩性電離蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。幾種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)每種蛋白質(zhì)都有其特有的等電點(diǎn)——分離、鑒定等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)分子中所含氨基酸的種類有關(guān)三、蛋白質(zhì)的變性作用和復(fù)性

蛋白質(zhì)的變性(denaturation)

在某些物理和化學(xué)因素作用下，蛋白質(zhì)三維構(gòu)象被破壞，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。變性的本質(zhì)是次級(jí)鍵的破壞（包括二硫鍵），不改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的因素

物理因素：加熱、高壓、劇烈攪拌、超聲波、紫外照射等化學(xué)因素：酸、堿、有機(jī)溶劑（苯酚、乙醚等）、變性劑（尿素、鹽酸胍等）、去垢劑（SDS：十二烷基硫酸鈉）蛋白質(zhì)溶解度下降或易于沉淀。變性使得埋藏在分子內(nèi)部的側(cè)鏈基團(tuán)暴露出來，易被蛋白酶水解。變性使得蛋白質(zhì)的生物活性喪失。

變性蛋白質(zhì)的特性蛋白質(zhì)復(fù)性(renaturation)

變性蛋白在去除變性因素后可重新恢復(fù)到天然構(gòu)象，恢復(fù)其生物活性，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。

復(fù)性的條件：變形的條件不劇烈或者變性的時(shí)間不長(zhǎng)四、蛋白質(zhì)的沉淀（protein

precipitation）

蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定性受到破壞，蛋白質(zhì)從溶液中析出的特點(diǎn)。分為可逆沉淀作用和不可逆沉淀作用?？赡娉恋碜饔玫鞍踪|(zhì)沉淀后→除去蛋白沉淀因素（透析）→恢復(fù)溶解狀態(tài)鹽溶作用：多數(shù)蛋白質(zhì)在稀鹽中溶解度增加鹽析作用：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量鹽（硫酸銨）→蛋白質(zhì)溶解度逐漸下降不可逆沉淀作用

重金屬沉淀：堿性條件下：氨基酸-——重金屬離子+生物堿試劑（可引起生物堿沉淀的試劑）沉淀：酸性條件下：氨基酸+——酸根-有機(jī)溶劑沉淀：脫水；降低介電常數(shù)加熱變性沉淀：變性、凝固五、蛋白質(zhì)的紫外吸收

由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長(zhǎng)處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測(cè)定。第六節(jié)

蛋白質(zhì)的分離純化

和測(cè)定一、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則材料的選擇（新鮮、目的蛋白含量高）分離過程中避免一切可能引起變性的條件蛋白質(zhì)的純化一般在低溫下進(jìn)行（4oC）分離前建立有效的檢測(cè)方法了解目的蛋白的特性（穩(wěn)定性）蛋白的儲(chǔ)存：--20oC或4oC，冷凍干燥，避免反復(fù)凍融二、蛋白質(zhì)分離純化的基本步驟1.細(xì)胞破碎

機(jī)械破碎（勻漿、研磨、組織搗碎等）；滲透壓法；凍融法；超聲波法；酶解法等2.蛋白質(zhì)的抽提分離蛋白質(zhì)與細(xì)胞其他組分選擇合適的抽提液，包括：pH、離子強(qiáng)度、及其它組分（還原劑、酶抑制劑、SDS、Triton）避免蛋白質(zhì)變性

3.蛋白質(zhì)的分離——分離目的蛋白與雜蛋白等電點(diǎn)沉淀法：蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最??；不同蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同鹽析法：不同蛋白質(zhì)對(duì)中性鹽濃度變化的反應(yīng)不同；常用中性鹽為(NH4)2SO4、NH4Cl等有機(jī)溶劑沉淀法：降低介電常數(shù)；破壞水化層；常用乙醇、丙酮4.蛋白質(zhì)的純化

蛋白質(zhì)分離純化主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)、電荷情況、等電點(diǎn)、分子的大小、形狀、溶解度、穩(wěn)定性、吸附性質(zhì)（包括與其它小分子的親合力等）以及蛋白質(zhì)的光吸收性質(zhì)（280nm）等。（1）凝膠過濾(gelfiltration)

凝膠過濾色譜亦稱凝膠色譜、排阻色譜或分子篩，是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法。凝膠色譜的機(jī)理是分子篩效應(yīng)。常用凝膠葡聚糖凝膠（商品名Sephadex）聚丙烯酰胺凝膠(商品名Bio-GelP)

瓊脂糖凝膠(商品名因生產(chǎn)廠家而不同)凝膠過濾的作用機(jī)制

凝膠過濾的過程（2）離子交換層析（ionexchangechromatography）離子交換層析法是利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。電荷不同的蛋白質(zhì)，對(duì)離子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強(qiáng)度和pH值，物質(zhì)就能依次從層析柱中分離出來。

支持介質(zhì)（纖維素、凝膠等）交換劑類型：陰離子交換劑、陽離子交換劑常用陽離子交換劑羧甲基纖維素（CM-C）；陰離子交換劑二乙氨基乙基纖維素（DEAE-C）。（3）親和層析

利用目的蛋白跟它的固相化的配基之間的特異親和力來跟其他蛋白分開的配基（ligand）選擇抗原――抗體，酶――抑制劑，酶――底物，激素――受體，金屬結(jié)合蛋白――螯和劑，含巰基蛋白――Hg或含巰基分子，凝集素――糖蛋白改變pH或鹽濃度，使目的蛋白與配體的結(jié)合力下降而被洗脫。離子交換層析凝膠過濾交換層析親和層析三、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定1.凝膠過濾法

外用幾種已知分子量的蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行凝膠過濾，以每種蛋白質(zhì)的洗脫體積對(duì)它們的分子量對(duì)數(shù)作圖，繪制出標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線。未知蛋白根據(jù)其所用的洗脫體積，從標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線上課求出未知蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的分子量。2.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS）

電泳:蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)。聚丙烯酰胺凝膠主要根據(jù)蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)的不同進(jìn)行分離大小形狀：小的、近球形的遷移速度快

SDS的作用

SDS存在下，蛋白質(zhì)變性，肽鏈伸展，SDS與蛋白分子成比例結(jié)合→帶負(fù)電荷復(fù)合物，消除不同蛋白間原有電荷差。3.超速離心

超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。高速：25000rpm超速：50000-120000rpmm’:微粒有效質(zhì)量ω:角速度r:微粒界面與旋轉(zhuǎn)中心的距離ρ:離心介質(zhì)密度f:微粒摩擦系數(shù)S:沉降系數(shù),單位:S沉降速度質(zhì)量、形狀、密度密度梯度離心四、蛋白質(zhì)的純度鑒定

1.電泳等電聚焦電泳（isoelectricfocusing，IEF）

通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。在分離膠中加入具有一定pH梯度的兩性電解質(zhì)，每種蛋白質(zhì)將移向并聚集在其等電點(diǎn)的pH梯度處。

雙向凝膠電泳two-dimensionalelectrophoresis

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)五、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

紫外吸收法280nm吸收值染料結(jié)合法（Brad