DNA測序技術(shù)及發(fā)展文檔ppt第1頁，共56頁。人類基因組計劃（Humangenomeproject,HGP）用了大約10年的時間，各國政府相繼投入了幾十億美元，才完成了人類個體全基因組序列的測序工作。而2005年以來，出現(xiàn)的新一代測序技術(shù)，卻可在1個月內(nèi)，花費十幾萬美元就可完成一個人類個體全基因組序列的測序工作?，F(xiàn)在，美國、歐洲等各大生物技術(shù)公司、大型生物醫(yī)藥研究機構(gòu)等投入大量的人力物力開始了新一輪的下一代測序技術(shù)的技術(shù)競賽，力爭實現(xiàn)1000美元完成一個人的全基因組序列的測序，加速個人基因組時代的到來。第2頁，共56頁。一、DNA測序技術(shù)概述DNA測序——核酸DNA分子一級結(jié)構(gòu)的測定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)一項重要的技術(shù)。核苷酸的排列順序堿基的排列順序第3頁，共56頁。1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰島素51個氨基酸的序列測定。70年代后期，Sanger和MaxamGilbert等人又建立了核酸序列測定的方法，Sanger雙脫氧末端終止法和MaxamGilbert化學(xué)裂解法將核酸序列測定技術(shù)推進到“直讀”階段，使核酸序列測定變得遠比蛋白質(zhì)氨基酸序列測定容易，這樣人們可以通過核酸序列和遺傳密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基酸的序列。第4頁，共56頁。測序技術(shù)的發(fā)展歷史雙脫氧末端終止法(Sanger測序法)1970s同位素標記，手工1980s熒光標記，自動1990s毛細管電泳合成測序法（第二代測序）焦磷酸測序（Pyrosequencing,Roche/454）合成測序（Sequencing-By-Synthesis,Illumina/Solexa）連接測序（Sequencing-By-Ligation,ABI/SOLiD）單分子測序技術(shù)（第三代測序）HelicosPacificBiosciencesOxfordNanopore第5頁，共56頁。代數(shù)測序技術(shù)特點代表儀器第一代Sanger測序法低通量，高成本ABI3730XL第二代循環(huán)芯片技術(shù)高通量高效率成本底IlluminaGAROCH-454ABI-SOLID第三代單分子測序試劑用量少，成本更低HeliScope第6頁，共56頁。第7頁，共56頁。二、第一代測序方法1、末端終止法2、化學(xué)裂解法3、DNA測序自動化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長度僅相差1個核苷酸的ssDNA，從而完成測序的方法。用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標記，計算機自動讀出。優(yōu)點簡便、迅速、應(yīng)用廣泛。不需酶促反應(yīng)，可以對寡核苷酸測序。1、高負荷，1塊膠可測16個樣品；2、機讀不需放射自顯影；3、安全不用同位素；4、簡單迅速8-10h。第8頁，共56頁。測序的基本過程制備待測DNA序列模板；酶促或化學(xué)反應(yīng)將其轉(zhuǎn)變“等差數(shù)列”（n=1）；電泳PAGE；讀序。第9頁，共56頁。第一代測序computeranalysis凝膠中DNA移動方向樣品槽激光器輸入光學(xué)系統(tǒng)成象透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機旋光鏡/棱鏡組件第10頁，共56頁。Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法化學(xué)裂解是Maxam和Gilbert等人1977年創(chuàng)建的，用來測定DNA序列?；瘜W(xué)法是用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定地裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈（等差數(shù)列n=1），經(jīng)過PAGE和放射自顯影后，可以直接讀出DNA的順序。某些試劑能修飾或破壞DNA鏈上特定核苷酸的堿基進而使N-糖苷鍵斷裂，暴露出的糖環(huán)以β-消除反應(yīng)，在3’和5’位上斷裂磷酸二酯鍵。使戊糖脫落，用于嘌呤環(huán)的試劑是硫酸二甲酯，而聯(lián)氨可用于肼解嘧啶環(huán)。4種核苷酸的特異裂解和鑒別方法如下：第11頁，共56頁。反應(yīng)體系堿基修飾試劑堿基修飾反應(yīng)主鏈斷裂試劑斷裂點GDMSG甲基化六氫吡啶GG+A甲酸脫嘌呤六氫吡啶GorAC+T肼嘧啶開環(huán)六氫吡啶CorTC肼（加鹽）胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶C第12頁，共56頁。原理用放射性核素標記待測DNA一側(cè)末端將標記DNA分為G、A+G、C+T、C4個反應(yīng)體系用不同的化學(xué)試劑處理不同反應(yīng)體系，隨機斷裂DNA片段某種堿基中的任何一個，產(chǎn)生一組一端為放射線標記的末端，另一端為不同大小的DNA片段的混合物電泳分離，放射自顯影得到互相錯落的梯形圖譜，即可讀出DNA序列第13頁，共56頁。反應(yīng)產(chǎn)物電泳放射自顯影閱讀第14頁，共56頁。Sanger雙脫氧末端終止法原理DNA鏈的合成反應(yīng)，只不過反應(yīng)體系中加入了四種雙脫氧核糖核苷酸（ddNTP）中的一種。在DNA鏈合成過程中ddNTP會代替部分dNTP作為底物進行DNA合成反應(yīng)。一旦ddNTP摻入到合成DNA鏈中，正在延伸的DNA鏈將終止。經(jīng)電泳分離，放射自顯影，直接讀出DNA的核苷酸序列第15頁，共56頁。反應(yīng)體系引物模板：純單鏈DNA和經(jīng)過熱變性或堿變性的雙鏈DNADNA聚合酶：Klenow大片段放射性同位素標記的dNTP：32P-dNTP、α-32S-dNTPddNTP用于測序的變性凝膠電泳：膠長40cm第16頁，共56頁。ddNTP第17頁，共56頁。第18頁，共56頁。

讀出模板互補序列dNTP

凝膠電泳

較大片段

較小片段ddGTPddATPddCTPddTTP

反應(yīng)混合物Klenow酶

未知序列的單鏈DNA

讀出待測序列CTGACTTCGACAAAGAA5′3′ACTGddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3′5′CTGACTTCGACAA5′3′Sanger雙脫氧末端終止法第19頁，共56頁?；瘜W(xué)降解法程序復(fù)雜后來逐漸被Sanger法代替這２種方法都需要放射性同位素標記操作繁瑣不能自動化不能滿足大規(guī)模測序的要求。到了20世紀80年代末研究人員逐漸利用熒光標記代替同位素標記測序產(chǎn)物，經(jīng)過平板電泳分離熒光分子在激光的激發(fā)下可以發(fā)射出不同波長的熒光，根據(jù)熒光信號可以確定DNA序列。第20頁，共56頁。目前所用自動測序技術(shù)的改進

同位素標記到熒光標記,平板電泳到毛細管電泳

多色熒光標記毛細管電泳單色熒光標記平板電泳同位素標記平板電泳ACGTACGT測序圖譜TATTGCATTGTCTGCATTGTCT第21頁，共56頁。毛細管電泳基本原理：與鏈終止法測序原理相同，只是用不同的熒光色彩標記ddNTP，如ddATP標記紅色熒光,，ddTTP標記綠色熒光，ddCTP標記藍色熒光,ddGTP標記黃色熒光，由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色，而簡化為由1個泳道同時判讀4種堿基。第22頁，共56頁。第23頁，共56頁。DNA自動測序結(jié)果舉例目前商品化生產(chǎn)的測序儀ABI3730測序儀，最長可以測1200個堿基第24頁，共56頁。DNA測序技術(shù)的應(yīng)用分析基因組核苷酸排列序列尋找致病基因基因定點誘變的基礎(chǔ)基礎(chǔ)研究（基因表達、突變）臨床應(yīng)用（基因診斷、基因治療）第25頁，共56頁。目前所用測序技術(shù)的缺點測序的原理是DNA鏈終止法，這注定了一個反應(yīng)所測序列不可能太長，目前為1000個核苷酸左右。測序反應(yīng)費時費力科學(xué)家們完成第一個人類基因組測序整整花了13年的時間，耗費了30億美元的費用。測序準確度不高DNA聚合酶造成的堿基錯配，DNA序列判讀錯誤。測序基于PCR反應(yīng)，需要引物，并且有些些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的難于進行PCR反應(yīng)的片段不能測序。第26頁，共56頁。三、第二代測序技術(shù)第二代測序技術(shù)——循環(huán)陣列合成測序法新一代測序技術(shù)（NextGenerationGequencing，NGS）代表技術(shù)為羅氏公司(Roche)的454測序儀(RocheGSFLXsequencer)（2005）Illumina公司的Solexa基因組分析儀(IlluminaGenomeAnalyzer)ABI的SOLiD測序儀(ABISOLiDsequencer)（2007）第27頁，共56頁。Next-generationsequencingtechnology200520062007BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-Ligation第28頁，共56頁。1.ROCH-454的優(yōu)勢454平臺的突出優(yōu)勢是讀長。目前454系統(tǒng)的序列讀長已超過400bp。雖然454平臺的測序成本比其他平臺要高很多，不過對于那些需要長讀長的應(yīng)用，如從頭拼接和環(huán)境微生物組學(xué)，它仍是最理想的選擇。第29頁，共56頁。2.IlluminaGA的特性可擴展的超高通量

GenomeAnalyzer系統(tǒng)目前每次運行后可獲得超過20GB的高品質(zhì)過濾數(shù)據(jù)。經(jīng)優(yōu)化后通量還有望上升到95GB，相當(dāng)于人類基因組的30倍覆蓋度。需要樣品量少

GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng，能應(yīng)用在很多樣品有限的實驗（比如免疫沉淀、顯微切割等）中。簡單、快速、自動化

GenomeAnalyzer系統(tǒng)提供了最簡單和簡潔的工作流程。制備樣品文庫可以在幾小時內(nèi)完成，一個星期內(nèi)就能得到高精確度的數(shù)據(jù)。自動化的流程不減少了手工操作誤差和污染可能性，也不需要機器人操作或潔凈室。第30頁，共56頁。3.ABISOLID的特性無以倫比的通量目前SOLiD3系統(tǒng)單次運行能產(chǎn)生50GB的人基因組序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于基因組的17倍覆蓋度，這顯然是其他任一臺新一代測序系統(tǒng)都無法達到的準確性新的超精確檢測模塊（ECC模塊）將提供高達99.99%的精確性；多達98%的可定位堿基的質(zhì)量值高于45；更多標簽以提高靈敏度和動態(tài)范圍；高準確性的原始讀序，支持無參考序列的數(shù)據(jù)分析。第31頁，共56頁。第二代測序技術(shù)最顯著的特征是高通量,一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測序,使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組測序或基因組深度測序變得方便易行。第32頁，共56頁。共同特點：成了生物醫(yī)學(xué)、計算機、微電子學(xué)、光學(xué)、材料科學(xué)和精密加工等多學(xué)科技術(shù)。例如，RocheGSFLXsequencer的圖像采集技術(shù)就借鑒現(xiàn)代天文望遠鏡的光學(xué)系統(tǒng)技術(shù)，即超高分辨率的CCD集成光纖束技術(shù)。測序策略主要基于循環(huán)芯片測序法（Cyclic-arraysequencing），即制備DNA文庫，單分子擴增，在固相載體上形成DNA簇陣列，并行地利用DNA聚合酶或者連接酶進行酶促反應(yīng)（模板變性、引物退火雜交、延伸或連接），同時讀取反應(yīng)產(chǎn)生的特異性熒光信號，最終得到超大量的DNA序列信息。第33頁，共56頁。高通量并行測序。例如，RocheGSFLXsequencer一次就可對上百萬條DNA分子同時進行序列測定，一次運行通量達到400Mb以上，而傳統(tǒng)測序（一代測序）一輪測序的通量僅為80Kb左右。第34頁，共56頁。第二代測序技術(shù)的應(yīng)用從頭測序(de-novosequencing)對于基因組未被測序過的生物,其基因組測序需要從頭測序。重測序SNP（SingleNucleotidePolymorphism）研究轉(zhuǎn)錄組及表達譜分析RNA測序(miRNA)轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究（ChIP-Seq）第35頁，共56頁。廠商RocheIlluminaABI技術(shù)454SolexaGASOLiD測序儀GS20FLXTiIIIIIx123序列數(shù)目（百萬）0.50.51.252810025040115320單末端測序（Single-end）讀長（bp）1002004003550100253550運行時間（天）0.250.30.4335658通量（Gb）0.050.10.515251416配對末端測序（Paired-end）讀長（bp）

2004002×352×502×1002×252×352×50庫序列長度（kb）

3.53.50.20.20.2332運行時間（天）

0.30.461010121016通量（Gb）

0.10.529502832Solexa和SOLiD配對末端測序所需時間和產(chǎn)出是單末端的兩倍，454的配對末端和單末端差異在于建庫方法，所需時間和測序量不變。ABISOLiD包含兩張芯片，這里的數(shù)據(jù)是一張芯片的量。

目前使用最廣泛的三大第二代測序平臺測序能力統(tǒng)計信息（2010年年初數(shù)據(jù)）3個水稻基因組/天12個水稻基因組/天10個水稻基因組/天第36頁，共56頁。第二代測序技術(shù)采用了高通量測序技術(shù)，使測序通量大大提高，從Sanger測序法一次讀取一條序列到毛細管測序的一次讀取96條序列再到現(xiàn)在的一次讀取幾百萬條序列的實現(xiàn)，不得不說這是對第一代測序技術(shù)的一次革命性的變革。然而第二代測序技術(shù)并不完美，由于其在測序前要通過PCR手段對待測片段進行擴增，因此增加了測序的錯誤率。并且其測序結(jié)果比較短，更適合重測序，而不太適用于沒有基因組序列的全新測序。第37頁，共56頁。四、第三代測序技術(shù)雖然第二代測序技術(shù)已經(jīng)取得廣泛應(yīng)用，但是其必須基于PCR擴增，成本、準確性等關(guān)鍵問題仍然存在，科學(xué)家正在致力于新的測序解決方案。目前，以單分子測序為主要特征的第三代測序技術(shù)，也稱為next-next-generationsequencing已經(jīng)初現(xiàn)端倪。第38頁，共56頁。生物科學(xué)公司BioScienceCorporation的HeliScope單分子測序技術(shù)（2008）斯坦福大學(xué)的科學(xué)家最近利用Heliscope單分子測序儀,用了48000美元的試劑和4個星期的時間,對一名白人男子的基因組進行了測序。太平洋生物科學(xué)公司PacBio的SMRT（singlecellrealtime）技術(shù)目標：1000美元測定一個人類基因組牛津納米孔技術(shù)公司OxfordNanoporetechnologies的蛋白納米孔測序技術(shù)（流行趨勢）第39頁，共56頁。PacificBiosciences公司發(fā)明了一種直徑只有幾十納米的納米孔[zero-modewaveguides(ZMWs)]，單分子的DNA聚合酶被固定在這個孔內(nèi)。在這么小的孔內(nèi)，DNA鏈周圍的熒光標記的脫氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G這四種熒光標記的脫氧核苷酸非?？焖俚貜耐饷孢M入到孔內(nèi)又出去，它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號。而當(dāng)某一種熒光標記的脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時，這種特定顏色的熒光會持續(xù)一小段時間，直到新的化學(xué)鍵形成，熒光基團被DNA聚合酶切除為止。第40頁，共56頁。第41頁，共56頁。新型納米孔測序法（nanoporesequencing）是采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動單個分子逐一通過納米孔來實現(xiàn)測序的。由于納米孔的直徑非常細小，僅允許單個核酸聚合物通過，因而可以在此基礎(chǔ)上使用多種方法來進行高通量檢測。第42頁，共56頁。納米孔測序技術(shù)—鏈測序(strandsequencing)第43頁，共56頁。OxfordNanoporeTechnologies與牛津大學(xué)合作,已設(shè)計另外一種基因工程蛋白質(zhì)納米孔.通過遺傳工程改造,他們已經(jīng)可以構(gòu)建一種將氨基化環(huán)糊精(Aminocyclodextrin)配體共價連接到位于脂雙層膜中的α-溶血蛋白內(nèi)生物納米孔。驅(qū)動4種核苷酸單磷酸(dNMPs)通過生物孔,通過納米孔的電流將分別減少到4種不同的狀態(tài),每種狀態(tài)都與一種核苷酸單磷酸相對應(yīng)。核酸外切酶將DNA鏈切成單個核苷酸。GridION（2011）MinION（2012）即插即用、一次性第44頁，共56頁。英國OxfordNanoporeTechnologies公司2012年2月的發(fā)布了一款便攜式的基因組測序儀MinION，約摸只有U盤大小，價格低于900美元，立即引發(fā)市場轟動。/technology/the-minion-device-a-miniaturised-sensing-system/the-minion-device-a-miniaturised-sensing-system第45頁，共56頁。HiSeqXTen測序儀HiSeqXTen是Illumina于2014年推出的最新測序系統(tǒng)，其功能定位為工廠規(guī)模的測序系統(tǒng)。HiSeqXTen系統(tǒng)，全球首臺也是唯一一臺可以1000美元完成人類基因組30X測序深度的系統(tǒng)。HiSeqXTen系統(tǒng)由10臺以上的HiSeqX組成。第46頁，共56頁。HiSeqXTen測序儀功能強大價格昂貴第47頁，共56頁。新一代基因組測序技術(shù)成本下降走勢圖第48頁，共56頁。第三代測序技術(shù)優(yōu)點它實現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測10個堿基，測序速度是化學(xué)法測序的2萬倍。它實現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長的片段），一個反應(yīng)就可以測非常長的序列。這為基因組的重復(fù)序列的拼接提供了非常好的條件。它的精度非常高，達到99.9999%。第49頁，共56頁。直接測RNA的序列（類似RT-PC