緒論

1.植物生物技術(shù)的概述：指生物技術(shù)在植物上的應用，包括植物組織培養(yǎng)技術(shù)、人工種子、細胞工

程、基因工程等多個生物技術(shù)，主要是指植物基因工程和與之相關(guān)的植物組織細胞培養(yǎng)技術(shù)、分

子標記育種技術(shù)等。

2.生物技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展：現(xiàn)代生物技術(shù)是以20世紀70年代DNA重組技術(shù)的建立為標志的。發(fā)展

迅速

3.植物生物技術(shù)的展望：植物生物技術(shù)被普遍認為是未來人類解決資源短缺不可或缺的技術(shù)，也是

爭取農(nóng)產(chǎn)品高附加值的重要技術(shù)手段。

4.WhatisBiotechnology什么是生物技術(shù)：應用該技術(shù)通過添加來自另一生物的基因來修飾生物

的生物功能

第一章組織培養(yǎng)實驗室建設與操作技術(shù)

1.標準的組織培養(yǎng)實驗室包括:洗滌室（準備室）、配置室、滅菌室、接種室、培養(yǎng)室、觀察室等。

2.組織培養(yǎng)所用到的器具:鑲子類、剪刀類、組培瓶、各類器皿、量筒、移液管、試劑瓶、容量瓶、

試管以及移液管架、酒精、玻璃棒、

3.培養(yǎng)基的配制：無機營養(yǎng)成分、有機營養(yǎng)成分、碳源、激素、瓊脂、水。其中無機營養(yǎng)包括大

量元素、微量元素。有機營養(yǎng)包括氨基酸和維生素。碳源有蔗糖、葡萄糖、果糖，以蔗糖為主。

激素包括生長素和細胞激動素

4.植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì):生長素：。引喋乙酸、NAA、2,4-D；細胞分裂素：控制植物細胞分化（比例高

時——產(chǎn)生芽,比例低時——產(chǎn)生根）、赤霉素、脫落酸

作用：促進細胞生長和細胞分裂；

?誘導受傷組織表面細胞恢復分裂能力；

?形成愈傷組織，促進生根；

?與一定量的細胞分裂素配合共同誘導不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長、胚狀沐的誘導。

5.根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程，培養(yǎng)基分為：初代培養(yǎng)基：用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基；繼代培養(yǎng)

基：用來接種繼初代培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。根據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為：誘導培養(yǎng)基；增殖培養(yǎng)

基；生根培養(yǎng)基。

6.基本培養(yǎng)基：主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heiler、Nitsh、SH、Miller等。

7.完全培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基的基礎上，根據(jù)試驗的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其

他復雜有機物質(zhì)等。

8.培養(yǎng)基的配制:計量、移液、取瓊脂蔗糖備用、融化、足合、調(diào)pH、分裝、包扎、培養(yǎng)基的滅菌

9.滅菌工作的重要性:預防感類雜菌的需要；消除生物污染的需要；防腐與保存的需要

10.滅菌的方法：a、物理方法：干熱、濕熱、過濾（0.25微米）紫外燈、超聲波等。

b、化學方法：使用滅菌劑或抗菌素，如酒精、次氯酸鈉、升汞、漂白粉、高鎰酸鉀、雙氧水、

福爾馬林等。

11.王熱火菌,：適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：150℃、40min或120℃、120min，

如果發(fā)現(xiàn)芽抱桿菌?160℃、90?120min。

12.濕熱滅菌:適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸儲水、棉塞、紙等。121℃維持20?30min。注

意點：加足水、排盡氣、氣壓降到0時，才能開蓋

13.過濾滅菌:培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些

生長調(diào)節(jié)劑GA3、玉米素等），就需要過濾滅菌。另外酶、血清等也需要過濾滅菌。滅菌方法：

將生長調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度，用注射器注入微孔濾膜慮，濾膜孔徑0.22?0.45微米。制培

養(yǎng)基時，現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌，待降至50℃左右時，加入適量的激素，然后分裝。

14.射線滅菌：主要是利用紫外燈進行照射，適合實驗室空氣、操作臺等，滅菌時間20?30min。

15.火焰灼燒滅菌:用火焰灼燒達到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。

16.消毒劑

消毒劑使用濃度（%）消毒時間效果殘液去除難易

(min.)

乙醇70-750.1-3好易

氯化汞0.1-12?15最好最難

過氧化氫10?125?15較好最易

抗菌素4?50噸廣30?60較好校難

次氯酸鈣/納9?105?30好易

/人為因親（工作人員本才）：工作服、帽.0.奉，酒精接手。

及培關(guān)皿：洗-?熱壓

SL玻痛恭皿：洗一干熱r干熱笥）或豚干

（和接種用具：用cci_4布擦―溫布擦一

污條來源

用

泡湎希->燒

其75%~95%

培養(yǎng)煎：覆熱

揚名因素《外都細彷：用水沖洗一化學箱制處理

.培

泰

材莖尖矮養(yǎng)

料內(nèi)和細黃

加抗生素：森等素.利福平

I操作的史克：沈用地板95%酒精擦超凈工作g

用化學成制茶葵

1.無菌操作技術(shù)

17.實驗器具和材料的準備

用75%的酒精擦拭超凈工作臺，然后室及超凈工作臺用紫外燈殺菌20min-30niin。注意：臺面上的用

品不要放置太多或重疊放置，以免降低滅菌效果。

關(guān)紫外燈、打開風機，過5-10min進入緩沖間，以75%洗手和手愣，更換無菌服、帽子和口罩。進入

接種室。（注：沒有特別情況，盡量不要下工作臺）

18.外植體和外質(zhì)體的滅菌：

取流水沖洗（至少30min）過的外植體，用一定的消毒劑浸泡消毒，用無菌水沖洗3~4次，放入無菌

培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無菌的接種器械進行分離、切割或其他處理。

打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰火旋轉(zhuǎn)灼燒，用鏡子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鐐子放回，灼燒瓶口，

蓋上瓶塞。

用酒耦擦洗工作臺和手。進行下一輪操作。

19.無菌操作的注意事項

(1)進行培養(yǎng)時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。

(2)不能用手觸及已消毒器皿，如匕接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。

(3)為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理的布局，原則上應是右手使用的東西放置在右側(cè)，左

手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。

(4)工作由始至終要保持一定順序性，組織或細胞在未做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，

培養(yǎng)液在未用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復使用，應立即封閉瓶口直立可漕加落菌機會。

(5)工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以免唾沫把細菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。

第二章胚胎培養(yǎng)

1.植物胚培養(yǎng)：是指在無菌條件下，對植物的胚及胚器官如子房、胚珠和胚乳進行離體培養(yǎng)的技術(shù)。

2.植物胚培養(yǎng)的類型:成熟胚培養(yǎng)：成熟胚為子葉期以后的胚，其在簡單的培養(yǎng)基上即可萌發(fā)生長

3.成熟胚培養(yǎng)過程：

種子一一95%酒精消毒一一選取完好種子一一70%酒精浸數(shù)S——0.1%升汞或10%次氯酸鈉浸泡一一無

菌水沖洗一一種子培養(yǎng)幾天一一到離種胚一一接種在培養(yǎng)基上(MS、White培養(yǎng)基)

4.成熟胚培養(yǎng)條件下：

(1)因成熟胚本身含有較多的營養(yǎng)條件，對培養(yǎng)基要求不高

(2)只含有大量元素和糖的培養(yǎng)基上，便可萌發(fā)成苗

(3)多數(shù)植物成熟胚的生長以12h/天光照為宜。

5.幼胚培養(yǎng)：(子葉形成之前)對發(fā)育早期的胚進行培養(yǎng)。培養(yǎng)技術(shù)和條件要求較高。需要通過培

養(yǎng)基向其提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)。

6.看護培養(yǎng)(nurseculture):將親本愈傷組織或高密度的懸浮細胞同低密度細胞一起培養(yǎng)，以促

進低密度細胞生長、分裂的培養(yǎng)方法。

7.影響胚培養(yǎng)的因素

培養(yǎng)基：無機鹽、碳水化合物、植物激素的作用、天然提取物及某些蛋白制品、氨基酸和維生素、活

性炭和PH

環(huán)境條件：溫度、光照、pH、培養(yǎng)基形態(tài)

胚齡：胚的發(fā)育程度與萌發(fā)成活率呈正相關(guān)，胚的剝離以受精35天左右為宜；心形胚和魚雷胚較好

8.胚珠培養(yǎng)：是指將胚珠從母體上分離出來，在無菌的人工環(huán)境條件下培養(yǎng)，使其生長發(fā)育形成幼

苗的過程。

9.胚珠培養(yǎng)類型:未受精胚珠的培養(yǎng)和受精胚珠的培養(yǎng)

10.胚珠培養(yǎng)的基本過程：胚珠的獲?。慌囵B(yǎng)條件；受精胚珠的發(fā)育

11.子房培養(yǎng)：將子房從母株上摘下，放在無菌的人工環(huán)境條件下，讓其進一步生長發(fā)育，以至形成

幼苗的過程。根據(jù)培養(yǎng)的子房是否授粉分為：授粉子房培養(yǎng)；未授粉子房培養(yǎng)

12.子房培養(yǎng)的過程:子房的獲??；子房的培養(yǎng)

子房性細胞——愈傷組織或胚狀洋——單倍體植株

子房體細胞---愈傷組織或胚狀洋----二倍體植株

13.胚珠和子房培養(yǎng)的應用

(1)受精胚珠培養(yǎng)目的：一是打破種子的休眠；二是挽救胚的發(fā)育，以獲得雜交種。

(2)未受精胚珠培養(yǎng)目的：獲得單倍體植株。

(1)授粉子房培養(yǎng)目的：挽救子房雜種胚的發(fā)育

(2)未授粉子房培養(yǎng)目的：獲得單倍體植株；試管受精解決雜交育種中不親和問題。

14.影響胚珠和子房培養(yǎng)的因素

a)基因型

b)發(fā)育時期：越早培養(yǎng)基越復雜

c)附帶組織：花的其它器官。

d)附加成分：外源激素等

15.胚乳培養(yǎng)：是指將從母體上分離出來，在無菌的環(huán)境條件下培養(yǎng)，使其生長發(fā)育形成幼苗的過程。

16.胚乳培養(yǎng)過程

胚乳外植體制備：種子消毒-一取出胚乳

培養(yǎng):White或MS誘導培養(yǎng)基一-25-27℃一暗或弱光

發(fā)育：誘導形成愈傷組織----再分化形成胚狀體或不定芽—生根培養(yǎng)----植株。

17.胚乳培養(yǎng)的應用

獲得三倍體植株，用于育種利用。三倍體植株具有營養(yǎng)體大，無籽等特點。如無籽西瓜。

胚乳培養(yǎng)也會產(chǎn)生較多的混倍體，影響育種利用。但可用于染色體工程研究。

/穩(wěn)定型：三倍體

/畸變型：除少數(shù)是三倍體，多數(shù)是由多種倍性細胞組成的嵌合體

18.植物離體授粉：將未授粉的胚珠或子房從母體上分離下來，進行無菌培養(yǎng)，并以一定的方式授以

無菌花粉，使之在試管實現(xiàn)受精的技術(shù)。

19.離體授粉的類型

(1).離體柱頭授粉(授于離體雌蕊的位置)

(2).離體子房授粉

(3).離體胚珠授粉

第三章植物愈傷組織的誘導與分化培養(yǎng)

1.植物的全能性：植物體的任何一個細胞都具有生長分化成為一個完整植株的能力

2.植物組織培養(yǎng)：就是利用植物的全能性進行離體無菌植物培養(yǎng)的一門技術(shù)。

3.愈傷組織二植物外植體脫分化、經(jīng)過細胞分裂形成的一團無序生長的薄壁細胞。

4.愈傷組織培養(yǎng)：是指將外植體接種到人工培養(yǎng)基上，在激素作用下，進行愈傷組織誘導、生長和

分化的培養(yǎng)過程。

5.愈傷組織培養(yǎng)的調(diào)控因素:外植體、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境。

6.從外植體脫分化形成典型的愈傷組織大致可分為三個時期:誘導期、分裂期和分化期。

7.形態(tài)建成：外植體細胞在適宜的培養(yǎng)條件下發(fā)生脫分化、再分化，產(chǎn)生芽和根，或者形成胚狀體，

發(fā)宵成苗或完整植株。

8.愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式：不定芽方式和胚狀體方式。

9.愈傷組織的形態(tài)發(fā)生：外植體細胞在適宜的培養(yǎng)條件下發(fā)生脫分化、再分化，產(chǎn)生芽和根，或者

形成胚狀體，發(fā)育成苗或完整植株。

10.胚狀體(emtryoid)：指在組織培養(yǎng)中，由一個非合子細胞(體細胞)，經(jīng)胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過

程(經(jīng)過原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚5個時期)，形成具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)。

11.愈傷組織的培養(yǎng)條件：溫度、光照、濕度、培養(yǎng)基組成、PH值、滲透壓。

12.試管苗移栽時注意事項

(1).試管苗馴化和煉苗：瓶馴化；瓶外馴化一定值到育苗容器和苗床，經(jīng)過一段時間的保濕和遮

光處理。

(2).根級理：蘸生長素(50n】g/LNAA)和生根粉處理。

(3).選無風陰濕天氣移苗。

(4).基質(zhì)濕度不宜太高，基質(zhì)水分過多，通氣不良影響生根。

根培養(yǎng)

營養(yǎng)器官莖培養(yǎng)（包括莖尖、莖段）

后養(yǎng)葉培養(yǎng)（包括葉原基、葉柄、

植物器葉鞘、葉片、亍葉）

官培養(yǎng)

I花培養(yǎng)（包括花托、花瓣、花絲、

生殖器官花柄、子房、花藥）

培養(yǎng)種子培養(yǎng)（包括成熟與未成熟）

胚胎培養(yǎng)（包拈幼胚、成熟胚、胚珠、

亍房、胚乳培養(yǎng)）

13.植物器官的培養(yǎng)的分類

14.植物組織培養(yǎng)的應用

1）如利用莖、葉和花器培養(yǎng)建立的試管苗，可在短期提高繁殖速率，進行名貴品種的快速繁殖；

2）利用基尖培養(yǎng)可得到脫毒試管苗，解決品種的退化問題，提高產(chǎn)量和質(zhì)量；

3）將植物器官作誘變處理，用器官培養(yǎng)可得到突變株，進行細胞突變育種

第四章莖尖培養(yǎng)和離體快繁

1.類型及意義：類型:

1）微莖尖（莖尖分生組織）培養(yǎng)：指帶有1?2個葉原基的生長錐，其長度不超過0.5imn。目的是

獲得無病毒植株

2）普通莖尖培養(yǎng)：指對幾毫米至幾十亳米長的莖尖、芽尖及側(cè)芽的培養(yǎng)。目的是快速繁殖。技

術(shù)簡單，操作方便，易成活和分化，成苗時間短。

意義：無性系快速繁殖；培養(yǎng)無病毒苗，品種改良；理論基礎研究。

2.莖尖培養(yǎng)方法

1）制備外植體：取l-2cm的枝條頂梢，去小葉--消毒--解剖鏡下用解剖刀除去幼葉和葉原基，露

出生長點，切下0.1-0.2mni長的莖尖（含1-2個葉原基）

2）組織分離：用消毒的鏡子將材料轉(zhuǎn)到解剖鏡下，一手用鑲子將其按住，一手用滅菌后的解剖針將

葉片葉原基去掉，露出生長點，切下頂端0.1-0.2nun長的莖尖來培養(yǎng)；若為快速繁殖，也可取

0.5-1cm長的莖尖?

3）培養(yǎng)基：一般為MS培養(yǎng)方法：

固體培養(yǎng)法：試管培養(yǎng)

紙橋培養(yǎng)法：含義：用酒杯狀的濾紙代替瓊脂，使杯底朝上塞入試管中，與液體培養(yǎng)基接觸，將離體

荃尖置于濾紙上方進行培養(yǎng)。

優(yōu)點：培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基，營養(yǎng)物質(zhì)能通過濾紙均衡而持久地供給外植體，有利于外植體的健康成

長；缺點：操作工藝復雜。

3.組織分離：用消毒的鎰子將材料轉(zhuǎn)到解剖鏡下，一手用銀子將其按住，一手用滅菌后的解剖針將

葉片葉原基去掉，露出生長點，切下頂端0.l-0.2nun長的莖尖來培養(yǎng)；若為快速繁殖，也可取

0.5-1cm長的莖尖?

4.快速繁殖（微繁殖）：用組織培養(yǎng)的方法，使植物的部分器官、組織迅速擴大培養(yǎng)，并移植到溫室

或農(nóng)田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。

5.快速繁殖特點：

（1）.繁殖速度快；（3）.節(jié)約空間有利于植物的工廠化生產(chǎn)；

（2）.使用材料少，生產(chǎn)效率高，省時省工；（4）.在無菌條件下進行，不受病蟲害侵害。

5.莖尖微繁技術(shù)的過程

1）無菌培養(yǎng)體系的建立、4）誘導生根

2）芽的增殖5）試管苗的移植

3）中間繁殖體的增殖

第五章單倍體細胞培養(yǎng)

1.單倍體植物（haplobiont）:月離體培養(yǎng)花藥的方法使花粉發(fā)育成一個完整的植株。

2.花粉和花藥的培養(yǎng)（pollenandantherculture）?是指花粉在培養(yǎng)基上改變其正常發(fā)育和機能，

不經(jīng)受精而發(fā)生細胞分裂，白單個花粉粒發(fā)育成完整單倍體植株的技術(shù)。

3.花藥培養(yǎng)：其外植體為植物雄性生殖器官的一部分，就培養(yǎng)方法和技術(shù)來講，屬于器官培養(yǎng)的疇。

將花粉發(fā)育至一定階段的花藥接種到人工培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，以形成花粉脛或愈傷組織進而分化

成植株的技術(shù)。

4.花粉培養(yǎng)：將處于一定發(fā)育階段的花粉從花藥中分離，再加以離體培養(yǎng)。有時花粉培養(yǎng)也稱為小

匏子培養(yǎng)（microsporeculture）。從培養(yǎng)方法和技術(shù)方面來講，它屬于細胞培養(yǎng)的疇。將花粉從

花藥中分離出來進行離體培養(yǎng)的過程

5.離體培養(yǎng)小抱子發(fā)育的影響因素：

a）植株基因型：裸子植物難，被子植物簡單e）小抱子發(fā)育狀態(tài)：單核期（多）。

b）大白菜：早熟簡單，晚熟難；f）預火理：低溫處理。

c）培養(yǎng)基成分：MS.其次B5.N6培養(yǎng)基。g）培養(yǎng)條件：一般溫度25℃，光照無或正常光

d）植物生長條件和生理狀態(tài)：幼年、開花初期。照等。對不同物種，沒有固定的模式。

6.獲得花粉的方法

A、機械擠壓梯度離心法B、自然散粉法

花藥消毒消毒后的花藥接種在液體培養(yǎng)基中

用銀子或小玻璃杵子將花粉從花藥中擠壓出一定溫度下振蕩培養(yǎng)

用30%蔗糖離心收集懸浮上層的完整花粉?；ǚ圩孕猩⒙涞脚囵B(yǎng)基中

用培養(yǎng)基洗滌幾次除去花藥壁

花粉重新培養(yǎng)在新鮮培養(yǎng)液中

7.花粉植株形態(tài)發(fā)生方式

胚胎發(fā)生途徑：小電子發(fā)育與合子發(fā)育相似，經(jīng)歷球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉胚等階段，但沒

有胚柄。

愈傷組織發(fā)生途徑：產(chǎn)生愈傷組織，分化出胚狀體或不定芽。

7.單倍體植株的鑒定

1、染皂體直接計數(shù)法：細胞學鑒定，通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進行制片，直接計數(shù)染色體數(shù)

目。

2、間接鑒定

植株形態(tài)學鑒定法：單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長，花粉粒小，不結(jié)實。

細胞形態(tài)學鑒定：葉片保衛(wèi)細胞大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍

性具有高度的相關(guān)性。

掃描細胞光度儀鑒定（流式細胞儀）：主要測定葉片單個細胞中DNA的含量確定細胞的倍性，材料的

使用量可少到1cm2。

8.水稻花藥培養(yǎng)過程

旗葉鞘用70%酒精擦洗一遍一一剝?nèi)テ烊~鞘，取出稻穗一一10%漂白粉10min一一無菌水洗3次一

一左手持穗，右手用鑲子取花藥，放無菌培養(yǎng)皿中一一用接種環(huán)接種到培養(yǎng)基上一一垮養(yǎng)5天，花藥

變褐，20天后花藥裂開，長出淡黃色的花粉愈傷組織，先長芽，后長根，形成幼苗。

9.花藥和花粉培養(yǎng)的應用

1）誘導形成單倍體，快速獲得純系，縮短育種周期；

2）有利于篩選隱性突變體，提高選擇效率；

3）有利于隱性基因控制性狀的選擇

4）遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料

5）克服遠緣雜交后代不育。

第六章原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合

1.原生質(zhì)體：原生質(zhì)體去掉細胞壁的由質(zhì)膜包裹著的裸細胞。

2.原生質(zhì)體的酶分離法：收率高、活力強、完整性好。分離原生質(zhì)體最有效。

（1）酶的種類及特點：分離原生質(zhì)體的酶多是一些復合酶制劑，以其所含的主要酶的作用分為：a、

纖維素酶類；b、半纖維素酶類；c、果膠酶類；d、崩潰酶；e、蝸牛酶

（2）酶液的配制：酶的配比和濃度（見裸本）、滲透壓和稔定劑及PH。

2.原生質(zhì)體的純化

1）沉降法（過濾離心法）：低速離心使原生質(zhì)體沉于底部。

2）漂浮法：根據(jù)原生質(zhì)體和細胞或細胞碎片的比重不同，分離出原生質(zhì)體。

3）不連續(xù)梯度離心法：在離心管中首先放入不同濃度的Ficoll溶液，構(gòu)成不同梯度，在上部滴入

l-2ml酶一原生質(zhì)體混合液，在150g離心5min，不同比重的原生質(zhì)體漂浮在不同的濃度梯度的

界面上，用吸管吸出原生質(zhì)體，懸浮洗滌備用。

3.影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素

1）供試材料

2）酶的種類，組合和酶解時間

3）滲透壓穩(wěn)定劑：糖醇或可溶性糖、無機鹽類組成的有機溶液

4）質(zhì)膜穩(wěn)定劑

4.影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素

原生質(zhì)體活力培養(yǎng)基成分

原生質(zhì)體起始密度培養(yǎng)條件

滲透壓穩(wěn)定劑植物材料和基因型

5.原生質(zhì)體融合:也稱體細胞雜交，就是分離下來的不同親本雜交的原生質(zhì)體，在人工控制下，像

性細胞受精作用那樣互相融合成一體。

第七章體細胞無性系變異

1.體細胞無性系變異：外植體一脫分化-再分化過程一產(chǎn)生的再生植株中表現(xiàn)出的變異。

2.體細胞無性系變異的篩選與檢測

篩選原理建立在有區(qū)別地殺死正常型細胞的基礎上：

1）正篩選：殺死正常細胞

2）負篩選：先使正常細胞生長，抑制突變細胞。而后用英物殺死分裂細胞。（亞硝酸鹽和核苜酸類

似物）

3）“綠島”法：用某種化學物質(zhì)作用于植株葉片，使細胞發(fā)生突變，葉片局部呈現(xiàn)綠色斑點，切下

這部分進行組織培養(yǎng)，通過培養(yǎng)細胞的再分化，使抗性細胞分化成完整植株。

4）抗病細胞突變體：在離體條件下直接以毒素為選擇壓力篩選抗病細胞突變體，再進一步生出抗病

植株

檢測：形態(tài)學鑒定；生物化學鑒定：蛋白質(zhì)水平；

細胞學鑒定：核型，染色洋結(jié)構(gòu)和數(shù)目；分子水平鑒定：RFLP，RAPD，SSR等

3.影響體細胞無性系變異的因素和應用

因素：基因型、外植體來源、再生途徑、培養(yǎng)基成分、溫度、促進染色體變異、組織原有的倍數(shù)性

應用：

a）農(nóng)藝性狀改良方面：株高突變體的篩選與應用、生育期形狀的改良、產(chǎn)量性狀的改良、育性性狀

突變體、優(yōu)良恢復系突變體

b）品質(zhì)改良方面：蛋白質(zhì)含量變異體、儲藏蛋白變異體、氨基酸含量變異體

c）抗性改良方面：抗病突變體的篩選、抗除草劑突變體、耐鹽突變體、抗旱突變體'抗寒突變體、

抗金屬離子脅迫突變體

第八章分子生物學基本實驗技術(shù)和部分已知序列基因克隆

1.分子生物學實驗室設備：

2.電建工是帶電荷的膠體顆粒在電場中的移動

3.電泳的三要素：凈電荷、電場、支持介質(zhì)

4.凝膠電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）

5.電泳分離生物大分子的原理:由于混合物中各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量以及分子量的不同,

在同一電場的作用下，它們泳動的方向和速度也不同C因此，在一定時間各姐分移動的距離不同，

從而達到分離和鑒定的目的。

6.遷移率：是指帶電顆粒在單位電場下泳動的速度。

7.影響遷移率的、外在因素

因：靜電荷的多少；大小和形狀

外因：電場強度、溶液的pH值、溶液的離子強度、溫度的影響、支持物的影響、電滲

8.質(zhì)粒DNA的構(gòu)象

9.瓊脂糖凝膠電泳和電泳緩沖液

瓊脂糖（agarose）是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結(jié)構(gòu)單元是D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。

輟沖液存儲液妲成成份/L特點及用途

7AE50?雙播DNA分子隧蝌要比另兩耋快JO%

242。ins始螺蜿在其中電泳時更符合實際分子質(zhì)髭

57.1ml冰乙聯(lián)回收DNA片段時首選，大片段分離效果好

100ml0.5mol/LED7A(pH8.0)蝮沖容量小，過夜電泳不可選用

TBE5?小片段（＜1kb）分離效果好

54gTris回收效率差而不宜用于回收電泳

275硼眼輟沖容量大，過夜電泳適合

20ml0.5mol/LED7A(pH8.0)

TPE10?瑞酸鹽在乙酹作用下析出，也不適合回收電泳

108gTris蝮沖容量大，過夜電泳適合

15.5ml(85%,1679gAnl)

40ml0.5moi/LEDTA(pH8.0)

許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成直徑從50nm到略大于

200n】n的三維篩孔的通道。

10.澳化乙錠：一種高度靈敏的熒光染色劑，用于觀察瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA

11.聚丙烯酰胺凝膠電泳（PolyacrylamideGelElectrophoresis）：以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介

質(zhì)的一種常用電泳技術(shù),用亍分離蛋白質(zhì)和寡核甘酸。

12.聚丙烯酰胺凝膠電泳分禺原理：分子篩效應和電荷效應

13.破碎細胞的方法

a）高速組織搗碎機搗碎d）液氮研磨法

b）玻璃勻漿器勻漿e）化學父理法（SDS、LDS，吐溫80等）

c）超聲波處理法f）生化法（溶菌酶、纖維素酶等）

14.核酸濃度的測定

測DNA:純的DNA樣品OD260/OD280應為1.8，OD260m/OD230應大于2.0

1）OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染。

2）小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；

3）OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核昔酸、鼠基酸、酚等

測RNA:純的RNA樣品其OD260/OD280應介于1.7-2.0之間，OD260/OD230比值應大于2.0。

1）若RNA樣品OD260/OD280比值太小，說明有蛋白質(zhì)或酚的污染；

2）比埴大于2.0時，可能被異硫副酸麻等污染；

3）OD260/OD230比值小于2.0時表明有小分子及鹽存在。

15.核酸的保存

（1）對DNA:①DNA樣品溶于pH8.0的TE，4°C或-20℃保存；

②長期保存樣品中可加入1滴氯仿。

（2）對RNA:①RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc（pH5.2）或雙蒸滅菌水中，-70℃保存；

②長期保存可以沉淀形式貯于乙爵中；

③在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC（氧銳核糖核昔復合物）凍貯于-70℃,可保存數(shù)

年。

16.DNA片段的回收：方法有壓碎法、低融點瓊脂糖法、凍融法等，也有現(xiàn)成的試劑盒供應。

17.Polymerasechainreaction-PCR:聚合酶鉞反應-PCR:使用變性，退火至引物和DNA聚合酶

指導的DNA合成的循環(huán)擴增DNA區(qū)段的方法

18.引物設計：首先引物要跟模板緊密結(jié)合，其次弓I物與引物之間不能有穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)存

在，再次引物不能在別的非目的位點引起DNA聚合反應(即錯配)

19.核酸探針的標記與分子雜交：切口平移法、隨機引物標記法、末端標記法

20.分子克隆的基本技術(shù)路線

a)分離制備目的基因或DNA片段；

b)目的DNA與載體在體外進行連接；

c)重組DNA分子轉(zhuǎn)入宿主細胞；

d)篩選及鑒定陽性重組體；

e)重組體的擴增。

21.WhatisGenecloning?什么是基因克?。?/p>

就是制作它的許多副本

基因可以是天然基因的精確拷貝

基因可以是天然基因的改變版本

22.WhyCloneDNA?為什么要克隆DNA?

(1).可以分離特定基因并確定其核昔酸序列

(2).可以鑒定和分析DNA的控制序列

(3).可以研究蛋白質(zhì)/酶/RNA功能

(4).可以鑒定突變，例如與特定疾病相關(guān)的基因缺陷

(5).生物體可以“設計”用于特定目的，例如胰島素產(chǎn)生，抗蟲性等

23.ffhyisDNACloningImportant?為什么DNA克隆很重要？

DNA克隆用于尋找基因，繪制基因并在物種之間轉(zhuǎn)移它們

克隆技術(shù)用于尋找遺傳疾病的攜帶者，進行基因治療，并創(chuàng)造抗病植物

24.HowisDNAcloned?（Cell-basedDNAcloning；Cell-freeDNAcloning（PCR））如何克隆DNA?

基于細胞的DNA克?。粺o細胞DNA克?。≒CR）

25.RecombinantDNAtechnology重組DNA技術(shù):DNA片段與自我復制載體連接以產(chǎn)生在宿主細胞中

復制的重組DNA分子的技術(shù)

26.What'sNeededtoCloneDNA?克隆DNA需要什么？

1）一種在特定位點切割DNA的方法

2）用于克隆DNA的載體分子

3）可以復制（克?。〥NA的地方

27.Restrictionenzymes限制酶：在特定位點切割DNA的細菌酶

28.Plasmids質(zhì)粒：天然存在的染色體外DNA。質(zhì)粒是環(huán)狀dsDNA；質(zhì)粒可以通過限制酶切割，留下

粘性末端；可以通過將新的DNA片段連接到質(zhì)粒的粘性末端來構(gòu)建人工質(zhì)粒

29.Plasmidsusefulascloningvectorsmusthave:?用作克隆載體的質(zhì)粒必須具有

復制者（復制起點）

選擇標記（抗生素抗性基因）

克隆位點（插入外源DNA不會破壞復制或使必需標記失活的位點）

30.StepsintheProcessofCloning?克隆過程中的步驟？

a）用限制酶切割DNA，產(chǎn)生的片段以特定序列結(jié)束

b）片段與由相同酶切割的載體分子混合，DNA連接酶與重組DNA分子結(jié)合

c）將具有插入的DNA片段的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移到細菌細胞中，重組質(zhì)粒復制并產(chǎn)生重組DNA分子的許多

克隆

31.DNAcanbeinsertedintoaEcolicell：熱激轉(zhuǎn)化法；電激轉(zhuǎn)化法

32.基因已知序列和部分已知序列克隆基因：PCR法、文庫篩選法

33.載體準備：載體DNA——酶切,純化——去磷酸化——連接

34.文庫篩選法：通過使.用探針并選文庫,可以從文庫中回收特定基因的克隆

35.陽性克隆的篩選

a）抗性篩選d）PCR篩選

b）雜交篩選e）酶切篩選

c）藍白斑篩選f）非重組質(zhì)粒致死篩選

36.ClonedLibraries克隆圖書維：來自一個來源的克隆DNA序列的集合是文庫

37.Genomiclibraryconstruction基因組文庫構(gòu)建:

38.FindingaSpecificCloneinaLibrary在圖書館中找到特定克隆?通過使用探針篩選文庫，

可以從文庫中回收特定基因的克隆

39.Southemblot：Southern印跡:一種將DNA片段從凝膠轉(zhuǎn)移到膜過濾器的方法

40.DNAsequencingDNA測序:一種確定DNA片段核昔竣序列的技術(shù)，基因組項目中使用的基本方法

41.質(zhì)卷：廣泛存在于生物界，從細菌、放線菌、絲狀真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人類機體

中都含有

載體：指能傳遞能量或運載其他物盾的物體。

42.如何從一個巨大的基因組DNA中捉到目的基因DNA片段？

43.GenecloningwithPCR:可以通過PCR克隆技術(shù)在體外將不同來源的的特異基因或DNA片段插

入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體，構(gòu)建重組DNA分子，再導入到受體細胞中進行擴增和繁殖，經(jīng)過篩選，

把含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞再擴增提取獲得大量DNA。

44.重組質(zhì)粒的篩選：插入片段長度鑒定、插入片段方向性鑒定、DNA測序測定

45.基因文庫：一個生物體的基因組DNA用限制性切酶部分酶切后，將酶切片段插入到載體DNA分子

中，所有這些插入了基因組DNA片段的載體分子的集合體，將包含這個生物體的整個基因組，也

就是構(gòu)成了這個生物體的基因文庫。

46.探針：核酸探針，是一段帶有檢測標記，且順序已知的，與目的基因互補的核酸序列（DNA或RNAL

第九章植物遺傳轉(zhuǎn)化

1.農(nóng)桿菌質(zhì)粒載體系統(tǒng)和轉(zhuǎn)化

誘導表達

楂物傷口-一酚類物質(zhì)誘導信號一一信號受體(VIRA)--VIRG一一激活激活virB>virC'

virD'

VIRD核酸切酶VIRD2、VIRD4、VIRB、VIRE2等

virE、。力力表達一一T-DNA單鏈分子釋放一一轉(zhuǎn)移到寄主細胞一一整合到植物染色體中

根舟衣桿菌Ti原粒介導基因轉(zhuǎn)化

載體忖化發(fā)根農(nóng)才F的Ri質(zhì)粒介導基因轉(zhuǎn)化

植物遺傳轉(zhuǎn)｛

植物病毒載體介導基因轉(zhuǎn)化

直接轉(zhuǎn)化

化方法

利陽種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化：花構(gòu)管通道法

2.植物遺傳轉(zhuǎn)化方法

3.植物遺傳轉(zhuǎn)化載體的種類及特點。

按瞬時表達轉(zhuǎn)化

遺

傳

特

性

植

分

物

類

遺i穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化

傳

轉(zhuǎn)

-病毒我體介導的遺傳轉(zhuǎn)化

化

分「生物載體介導的遺傳轉(zhuǎn)化Y

按

類I農(nóng)桿前質(zhì)粒栽體介導的遺傳轉(zhuǎn)化

栽

體

特一聚乙二醉(PEG)介導

性-化學方法-

分

類-腑質(zhì)體法

【非生物載體介導的遺傳轉(zhuǎn)化《〃電穿孔法

基因槍法

［物理方法Y

顯微注射法

I超聲波法等

圖9-1植物遺傳轉(zhuǎn)化方法分類

4.天然Ti質(zhì)粒不能直接用作克隆和轉(zhuǎn)化外源基因的載體的原因？

①T-DNA區(qū)存在不利于植物遺傳轉(zhuǎn)化的基因

②Ti質(zhì)粒分子量過大，一般160?240kb，有的甚至達800kb，在基因工程中難以操作。

③大型Ti質(zhì)粒上分布著各種限制酶的多個切點，不易通過體外DNA重組技術(shù)直接向野生型Ti質(zhì)粒導

入外源基因。

④Ti質(zhì)粒上還存在一些對于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。

⑤Ti質(zhì)粒在大腸桿菌中不能復制。

5.載體Ti質(zhì)粒應具備的結(jié)構(gòu)

①選擇標記基因。如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，它能使轉(zhuǎn)化的植物細胞獲得對卡那霉素的抗性。

②DNA復制起始位點。它使Ti質(zhì)粒能在大腸桿菌中復制（用于克?。?，而植物轉(zhuǎn)化載體還同時帶有

可在土壤根癌農(nóng)桿菌中進行復制的復制起始位點（用于轉(zhuǎn)化）。

③T-DNA右邊緣序列。它對于T-DNA的整合必不可少。目前使用的大多數(shù)克隆載體都含有兩端的邊

緣序列。

④多克隆位點。為能方便克隆基因，人們在載體的左右T-DNA邊緣序列之間設計了一段DNA序列，

包含有一系列單個的限制性切酶的識別位點。

6.葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)移基因的一般程序

1）用打孔器取直徑為2mm的葉盤4）轉(zhuǎn)移到含卡那霉素的長芽培養(yǎng)基中生長

2）葉盤與根瘤土壤桿菌共培養(yǎng)5）轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生長

3）培養(yǎng)在飼養(yǎng)平皿濾紙上的葉盤6）移栽再生植株

7.根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導轉(zhuǎn)化的基本程序