miR-101與miR-144：奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞調(diào)控機制的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義奶山羊產(chǎn)業(yè)作為畜牧業(yè)的重要組成部分，近年來在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出穩(wěn)步發(fā)展的態(tài)勢。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織數(shù)據(jù)顯示，2020年全球奶山羊存欄約22092.14萬只，山羊奶產(chǎn)量達(dá)2062.96萬噸。奶山羊憑借其能夠在惡劣環(huán)境下依靠低質(zhì)飼料存活、飼料轉(zhuǎn)化效率高、養(yǎng)殖成本低、抗病強、繁殖快、產(chǎn)奶多、乳質(zhì)優(yōu)等諸多優(yōu)勢，在世界各地廣泛養(yǎng)殖，尤其在亞洲和非洲等地區(qū)，成為許多養(yǎng)殖戶增收的重要途徑。繁殖性能是奶山羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，直接關(guān)系到奶山羊養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。高繁殖性能意味著更多的羊羔產(chǎn)出，不僅能夠擴大養(yǎng)殖規(guī)模，還能增加羊奶及相關(guān)產(chǎn)品的供應(yīng)，滿足市場對山羊奶日益增長的需求。然而，在實際養(yǎng)殖過程中，奶山羊的繁殖性能受到多種因素的制約，如品種、營養(yǎng)、環(huán)境以及疾病等。其中，卵泡發(fā)育和卵巢功能的正常發(fā)揮是保證奶山羊繁殖性能的基礎(chǔ)。卵泡發(fā)育是一個復(fù)雜而精細(xì)的生理過程，受到多種基因、信號通路以及細(xì)胞因子的調(diào)控。卵巢顆粒細(xì)胞作為卵泡的重要組成部分，對卵泡的生長、發(fā)育、成熟和排卵起著至關(guān)重要的作用。顆粒細(xì)胞的增殖、分化和凋亡狀態(tài)直接影響著卵泡的命運，如果顆粒細(xì)胞的功能出現(xiàn)異常，可能導(dǎo)致卵泡發(fā)育受阻、閉鎖，進(jìn)而影響奶山羊的繁殖性能。MicroRNA（miRNA）是一類長度約為22個核苷酸的非編碼小分子RNA，通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促進(jìn)其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。近年來的研究表明，miRNA在卵泡發(fā)育、卵巢功能維持以及生殖內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等生殖過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。不同的miRNA在卵巢組織中呈現(xiàn)出特異性的表達(dá)模式，并且通過調(diào)控不同的靶基因參與到卵泡發(fā)育的各個階段。例如，一些miRNA可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖和分化，而另一些則可能誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞的凋亡，從而影響卵泡的發(fā)育進(jìn)程。深入研究miRNA對卵巢顆粒細(xì)胞的調(diào)控機制，有助于揭示奶山羊繁殖性能的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為提高奶山羊繁殖性能提供新的理論依據(jù)和技術(shù)手段。miR-101和miR-144作為miRNA家族中的重要成員，在多種生物過程中被報道具有重要作用。在腫瘤研究領(lǐng)域，miR-101被發(fā)現(xiàn)可以通過抑制某些癌基因的表達(dá)，發(fā)揮抑癌作用，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等過程；miR-144也被證實參與了細(xì)胞代謝、氧化應(yīng)激等多種生理病理過程的調(diào)控。然而，在奶山羊繁殖領(lǐng)域，關(guān)于miR-101和miR-144對卵巢顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用研究還相對較少。探究它們在奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中的功能及作用機制，對于豐富奶山羊繁殖生物學(xué)理論，提高奶山羊的繁殖性能具有重要的科學(xué)意義和實際應(yīng)用價值。一方面，通過揭示miR-101和miR-144對卵巢顆粒細(xì)胞增殖、凋亡以及相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控規(guī)律，能夠深入了解奶山羊卵泡發(fā)育的分子機制，為解決奶山羊繁殖障礙等問題提供理論基礎(chǔ)；另一方面，基于這些研究成果，有望開發(fā)出針對奶山羊繁殖性能調(diào)控的新型生物技術(shù)，如通過基因編輯或miRNA類似物/抑制劑的應(yīng)用，精準(zhǔn)調(diào)控奶山羊的繁殖過程，提高養(yǎng)殖效益，推動奶山羊產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。1.2研究目的本研究旨在深入探究miR-101和miR-144對奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用及分子機制，為揭示奶山羊卵泡發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù)，具體研究目的如下：明確miR-101和miR-144對奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響：通過體外培養(yǎng)奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)或抑制miR-101和miR-144的表達(dá)，運用CCK-8、EdU、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測細(xì)胞增殖和凋亡情況，明確miR-101和miR-144對奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響。篩選并驗證miR-101和miR-144在奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中的靶基因：借助生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-101和miR-144在奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中的潛在靶基因，構(gòu)建雙熒光素酶報告載體和突變載體，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?、Realtime-qPCR及WesternBlot等技術(shù)，驗證miR-101和miR-144與靶基因之間的靶向調(diào)控關(guān)系。揭示miR-101和miR-144通過靶基因調(diào)控奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞的信號通路：基于已驗證的靶基因，運用通路抑制劑和激動劑處理細(xì)胞，結(jié)合WesternBlot、Realtime-qPCR等技術(shù)，研究miR-101和miR-144對相關(guān)信號通路關(guān)鍵蛋白和基因表達(dá)的影響，從而揭示miR-101和miR-144通過靶基因調(diào)控奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞的信號通路。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1miR-101的研究現(xiàn)狀miR-101在多種生物過程中的研究不斷深入。在細(xì)胞增殖調(diào)控方面，大量研究表明其發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如在腫瘤細(xì)胞中，miR-101被證實可通過抑制某些癌基因的表達(dá)來阻礙細(xì)胞增殖。一項針對乳腺癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，miR-101能夠靶向EZH2基因，抑制其表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在正常細(xì)胞生理過程中，miR-101也參與其中，有研究報道其在成纖維細(xì)胞的增殖調(diào)控中發(fā)揮作用，通過調(diào)控相關(guān)靶基因影響細(xì)胞周期進(jìn)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖速率。在細(xì)胞凋亡調(diào)控方面，miR-101同樣具有重要意義。許多研究表明它可以通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因來影響細(xì)胞凋亡。在神經(jīng)細(xì)胞中，當(dāng)受到損傷或處于應(yīng)激狀態(tài)時，miR-101的表達(dá)變化會影響細(xì)胞凋亡進(jìn)程，其可通過靶向調(diào)控Bcl-2家族成員的表達(dá)，如抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在心血管疾病研究中也發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞在缺血再灌注損傷時，miR-101表達(dá)上調(diào)，通過調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡基因，減輕心肌細(xì)胞的凋亡，對心肌起到一定的保護(hù)作用。在生殖領(lǐng)域，目前關(guān)于miR-101的研究主要集中在哺乳動物的生殖器官發(fā)育和生殖細(xì)胞的功能調(diào)控方面。在小鼠卵巢發(fā)育過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)miR-101在不同發(fā)育階段的卵泡中表達(dá)存在差異，且其表達(dá)變化與卵泡的生長、發(fā)育和閉鎖密切相關(guān)。通過對miR-101基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，其卵巢功能出現(xiàn)異常，卵泡發(fā)育受阻，顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡失衡，這表明miR-101在小鼠卵巢功能維持和卵泡發(fā)育中發(fā)揮著不可或缺的作用。在人類生殖醫(yī)學(xué)研究中，有研究報道m(xù)iR-101在多囊卵巢綜合征患者的卵巢組織中表達(dá)異常，推測其可能參與了多囊卵巢綜合征的發(fā)病機制，影響卵巢的排卵功能和激素分泌。1.3.2miR-144的研究現(xiàn)狀miR-144在細(xì)胞代謝過程中具有重要的調(diào)控作用。研究表明，它可以參與調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝等過程。在肝臟細(xì)胞中，miR-144能夠通過靶向調(diào)控某些關(guān)鍵基因，影響糖異生和脂肪酸合成相關(guān)酶的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)血糖和血脂水平。在糖尿病研究模型中，發(fā)現(xiàn)miR-144的表達(dá)異常與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過調(diào)節(jié)miR-144的表達(dá)，可以改善胰島素敏感性，調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)。在氧化應(yīng)激反應(yīng)中，miR-144也扮演著重要角色。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激時，miR-144的表達(dá)會發(fā)生變化，進(jìn)而調(diào)控抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的抗氧化能力。在神經(jīng)細(xì)胞中，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，研究發(fā)現(xiàn)miR-144可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等，減輕氧化應(yīng)激對神經(jīng)細(xì)胞的損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞功能。在生殖領(lǐng)域，miR-144的研究相對較少，但已有研究表明其在生殖過程中具有一定作用。在魚類生殖研究中，發(fā)現(xiàn)miR-144在卵巢和精巢中的表達(dá)具有特異性，且其表達(dá)水平與生殖周期相關(guān)，推測其可能參與了魚類生殖細(xì)胞的發(fā)育和成熟過程。在哺乳動物中，有研究報道m(xù)iR-144在小鼠卵巢中的表達(dá)與卵泡的發(fā)育階段有關(guān)，在優(yōu)勢卵泡中的表達(dá)水平明顯高于閉鎖卵泡，提示其可能對卵泡的正常發(fā)育和維持具有重要意義。1.3.3miRNA對卵巢顆粒細(xì)胞調(diào)控的研究現(xiàn)狀在卵泡發(fā)育過程中，miRNA對卵巢顆粒細(xì)胞的增殖、分化和凋亡起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。眾多研究表明，不同的miRNA通過靶向不同的基因，參與到顆粒細(xì)胞的各種生理過程中。例如，miR-21被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，其通過靶向PTEN基因，抑制PTEN的表達(dá)，從而激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖。而miR-15a則具有相反的作用，它可以抑制卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，通過靶向相關(guān)增殖促進(jìn)基因，如CCND1等，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞增殖受到抑制。在顆粒細(xì)胞分化方面，miRNA也發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-378可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞向黃體細(xì)胞分化，其通過調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如增加C/EBPβ的表達(dá)，促進(jìn)顆粒細(xì)胞的黃體化進(jìn)程，從而影響卵巢的內(nèi)分泌功能。在顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)控方面，miR-143被報道可以誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，其通過靶向抗凋亡基因Bcl-2，降低Bcl-2的表達(dá)水平，使細(xì)胞凋亡增加，影響卵泡的發(fā)育和閉鎖。目前針對奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞的研究中，也逐漸揭示了一些miRNA的調(diào)控作用。有研究對奶山羊不同發(fā)育階段卵泡中的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一系列差異表達(dá)的miRNA，如miR-181a、miR-222等，推測它們可能參與了奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡和分化調(diào)控。但關(guān)于miR-101和miR-144對奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用，目前的研究還較為有限，仍有待進(jìn)一步深入探究。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法靶基因預(yù)測：運用生物信息學(xué)軟件，如TargetScan、miRanda和PicTar等，對miR-101和miR-144在奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測。通過綜合分析這些軟件的預(yù)測結(jié)果，篩選出在多個軟件中均被預(yù)測為靶基因的基因，作為后續(xù)研究的重點候選靶基因。載體構(gòu)建：根據(jù)預(yù)測得到的靶基因，設(shè)計特異性引物，通過PCR擴增靶基因的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）序列。將擴增得到的3'-UTR序列克隆至雙熒光素酶報告載體中，構(gòu)建野生型雙熒光素酶報告載體。同時，利用定點突變技術(shù)對3'-UTR序列中與miR-101和miR-144結(jié)合的位點進(jìn)行突變，構(gòu)建突變型雙熒光素酶報告載體。此外，構(gòu)建靶基因的過表達(dá)載體和干擾載體，用于后續(xù)的功能驗證實驗。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或電穿孔轉(zhuǎn)染法，將化學(xué)合成的miR-101和miR-144模擬物、抑制劑以及構(gòu)建好的各種載體轉(zhuǎn)染至奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞和293T細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染前，對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，使其處于對數(shù)生長期，以提高轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后，通過熒光顯微鏡觀察或qRT-PCR檢測，驗證轉(zhuǎn)染效果。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒簩⒁吧秃屯蛔冃碗p熒光素酶報告載體分別與miR-101或miR-144模擬物共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時后，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，檢測細(xì)胞內(nèi)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。通過比較不同組之間熒光素酶活性的比值，判斷miR-101和miR-144與靶基因之間是否存在靶向調(diào)控關(guān)系。CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染后的奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)不同時間后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)OD值繪制細(xì)胞生長曲線，評估m(xù)iR-101和miR-144對細(xì)胞增殖的影響。EdU法檢測細(xì)胞增殖：按照EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒的操作說明，將轉(zhuǎn)染后的奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行EdU標(biāo)記。孵育一定時間后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，再用Apollo染色液染色，最后用DAPI染核。通過熒光顯微鏡觀察，統(tǒng)計EdU陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比例，計算細(xì)胞增殖率，進(jìn)一步驗證miR-101和miR-144對細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：收集轉(zhuǎn)染后的奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞，用PBS洗滌后，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞。再依次加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15-20分鐘。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，分析早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）的比例，研究miR-101和miR-144對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。Realtime-qPCR檢測基因表達(dá)：提取轉(zhuǎn)染后奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物，通過Realtime-qPCR技術(shù)檢測miR-101、miR-144、靶基因以及相關(guān)信號通路關(guān)鍵基因的表達(dá)水平。以β-actin或U6作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量，分析基因表達(dá)的變化情況。WesternBlot檢測蛋白表達(dá)：裂解轉(zhuǎn)染后的奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，然后加入一抗孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜后，加入相應(yīng)的二抗孵育1-2小時。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測目的蛋白的表達(dá)水平，分析蛋白表達(dá)的變化情況。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：首先，采集健康成年奶山羊的卵巢組織，分離培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞。利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-101和miR-144的靶基因，并構(gòu)建相關(guān)載體。將miR-101和miR-144模擬物、抑制劑以及載體轉(zhuǎn)染至卵巢顆粒細(xì)胞和293T細(xì)胞中，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C靶向關(guān)系。運用CCK-8法、EdU法和流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-101和miR-144對卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響。通過Realtime-qPCR和WesternBlot檢測靶基因及相關(guān)信號通路關(guān)鍵基因和蛋白的表達(dá)變化，從而揭示miR-101和miR-144對奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞的調(diào)控機制。[此處插入技術(shù)路線圖]圖1-1技術(shù)路線圖[此處插入技術(shù)路線圖]圖1-1技術(shù)路線圖圖1-1技術(shù)路線圖二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1卵泡發(fā)育相關(guān)理論2.1.1卵泡發(fā)育與閉鎖過程卵泡發(fā)育是一個復(fù)雜且有序的生理過程，從原始卵泡逐漸發(fā)育為成熟卵泡，這一過程受到多種激素、細(xì)胞因子以及基因的精確調(diào)控。在胚胎時期，女性卵巢中就已形成大量的原始卵泡，這些原始卵泡由一個初級卵母細(xì)胞和周圍一層扁平的顆粒細(xì)胞組成，處于相對靜止的狀態(tài)。進(jìn)入青春期后，在促性腺激素等多種激素的刺激下，原始卵泡開始啟動發(fā)育。原始卵泡首先發(fā)育為初級卵泡，此階段初級卵母細(xì)胞體積增大，周圍的顆粒細(xì)胞由扁平變?yōu)榱⒎綘?，并且開始增殖，細(xì)胞層數(shù)逐漸增多。同時，在顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間出現(xiàn)一層嗜酸性的透明帶，它主要由糖蛋白組成，對于卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的物質(zhì)交換和信號傳遞起著重要作用。隨著卵泡的進(jìn)一步發(fā)育，初級卵泡轉(zhuǎn)變?yōu)榇渭壜雅?，此時卵泡體積進(jìn)一步增大，顆粒細(xì)胞層數(shù)繼續(xù)增加，卵泡周圍開始形成卵泡膜，卵泡膜分為內(nèi)膜層和外膜層，內(nèi)膜層含有豐富的血管和細(xì)胞，具有分泌雄激素的功能，外膜層主要由結(jié)締組織構(gòu)成，起到支持和保護(hù)卵泡的作用。當(dāng)卵泡發(fā)育到一定階段，會出現(xiàn)卵泡腔，這標(biāo)志著卵泡進(jìn)入三級卵泡階段。卵泡腔內(nèi)充滿了由顆粒細(xì)胞分泌的卵泡液，卵泡液中含有多種營養(yǎng)物質(zhì)、激素和細(xì)胞因子，為卵泡的生長發(fā)育提供必要的環(huán)境。隨著卵泡液的不斷增多，卵泡腔逐漸擴大，卵母細(xì)胞及其周圍的顆粒細(xì)胞被擠到卵泡的一側(cè)，形成卵丘。最后，卵泡發(fā)育成熟，成為成熟卵泡，也稱為格拉夫卵泡。成熟卵泡體積顯著增大，直徑可達(dá)18-23mm，突出于卵巢表面。此時，卵母細(xì)胞完成第一次減數(shù)分裂，排出第一極體，成為次級卵母細(xì)胞，等待排卵。然而，在卵泡發(fā)育過程中，并非所有的卵泡都能順利發(fā)育成熟并排卵，大部分卵泡會發(fā)生閉鎖，這是一種生理性的退化過程。卵泡閉鎖可以發(fā)生在卵泡發(fā)育的任何階段，從原始卵泡到成熟卵泡都有可能出現(xiàn)。卵泡閉鎖的發(fā)生機制主要與細(xì)胞凋亡有關(guān)，當(dāng)卵泡內(nèi)的細(xì)胞受到各種因素的影響，如激素失衡、營養(yǎng)缺乏、生長因子不足或過多、氧化應(yīng)激等，會激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，導(dǎo)致卵泡細(xì)胞尤其是顆粒細(xì)胞的凋亡增加，從而使卵泡停止發(fā)育并逐漸退化。在卵泡閉鎖過程中，首先表現(xiàn)為顆粒細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞核固縮、碎裂，細(xì)胞膜皺縮，隨后卵泡膜細(xì)胞也會發(fā)生凋亡，卵泡結(jié)構(gòu)被破壞，最終被吸收消失。例如，當(dāng)體內(nèi)促性腺激素水平不足時，卵泡無法獲得足夠的刺激信號，顆粒細(xì)胞增殖受到抑制，凋亡增加，導(dǎo)致卵泡閉鎖；另外，當(dāng)卵泡受到氧化應(yīng)激損傷時，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)失衡，活性氧自由基積累，會誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡，引發(fā)卵泡閉鎖。2.1.2卵泡中顆粒細(xì)胞的功能與作用顆粒細(xì)胞作為卵泡的重要組成部分，在卵泡發(fā)育、激素分泌、細(xì)胞間通訊等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在卵泡發(fā)育過程中，顆粒細(xì)胞的增殖和分化是卵泡生長的重要標(biāo)志。從原始卵泡發(fā)育到初級卵泡，顆粒細(xì)胞由扁平變?yōu)榱⒎綘畈㈤_始增殖，為卵泡的進(jìn)一步發(fā)育奠定基礎(chǔ)。在卵泡發(fā)育的各個階段，顆粒細(xì)胞的持續(xù)增殖使得卵泡體積不斷增大，結(jié)構(gòu)逐漸完善。例如，在初級卵泡向次級卵泡轉(zhuǎn)變過程中，顆粒細(xì)胞層數(shù)的增多和體積的增大，促進(jìn)了卵泡的生長和發(fā)育。同時，顆粒細(xì)胞的分化也與卵泡的成熟密切相關(guān)，隨著卵泡發(fā)育，顆粒細(xì)胞會表達(dá)不同的受體和基因，獲得特定的功能，如在排卵前，顆粒細(xì)胞會表達(dá)大量的促黃體生成素（LH）受體，對LH的刺激產(chǎn)生應(yīng)答，從而啟動排卵和黃體化過程。顆粒細(xì)胞在激素分泌方面起著核心作用。在卵泡發(fā)育早期，顆粒細(xì)胞主要分泌雌激素。顆粒細(xì)胞內(nèi)含有芳香化酶，它可以將卵泡膜細(xì)胞合成的雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，這一過程稱為雄激素的芳香化作用。雌激素對于女性生殖系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持至關(guān)重要，它可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜的增殖和增厚，為受精卵著床做好準(zhǔn)備；同時，雌激素還能反饋調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸（HPO軸），通過抑制促性腺激素釋放激素（GnRH）和促性腺激素的分泌，維持體內(nèi)激素水平的平衡。當(dāng)卵泡發(fā)育到一定階段，尤其是排卵后，顆粒細(xì)胞會發(fā)生黃體化，轉(zhuǎn)變?yōu)辄S體細(xì)胞，開始分泌孕激素。孕激素可以使子宮內(nèi)膜從增殖期轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谄?，為胚胎著床和發(fā)育提供適宜的環(huán)境；同時，孕激素還具有抑制子宮收縮、降低子宮對催產(chǎn)素敏感性的作用，有助于維持妊娠。細(xì)胞間通訊方面，顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞之間存在著緊密的通訊聯(lián)系，通過間隙連接和旁分泌等方式進(jìn)行物質(zhì)交換和信號傳遞。顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間通過間隙連接形成一個功能整體，間隙連接允許小分子物質(zhì)如營養(yǎng)物質(zhì)、離子、信號分子等在兩者之間自由交換。顆粒細(xì)胞可以為卵母細(xì)胞提供營養(yǎng)支持，如能量底物、核苷酸和氨基酸等，滿足卵母細(xì)胞生長和發(fā)育的需求；同時，顆粒細(xì)胞還能調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的生長和成熟分裂，通過分泌一些減數(shù)分裂促進(jìn)因子和信號分子，影響卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞的成熟。例如，顆粒細(xì)胞分泌的Kit配體可以作用于卵母細(xì)胞表面的c-kit受體，促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟。在與卵泡膜細(xì)胞的通訊中，顆粒細(xì)胞與卵泡膜細(xì)胞相互協(xié)作，共同完成激素的合成和分泌。卵泡膜細(xì)胞主要合成雄激素，而顆粒細(xì)胞則將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，兩者之間形成一個完整的激素合成體系。此外，顆粒細(xì)胞還能分泌一些生長因子和細(xì)胞因子，如胰島素樣生長因子（IGF）、表皮生長因子（EGF）等，通過旁分泌的方式作用于卵泡膜細(xì)胞和自身，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和功能。2.2miRNA的生物合成及調(diào)控機制2.2.1miRNA的生成過程miRNA的生成是一個復(fù)雜且精細(xì)的過程，涉及多個關(guān)鍵步驟和多種酶的參與。其過程從細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄開始，首先，基因組中的miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ的作用下轉(zhuǎn)錄生成初級轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）。pri-miRNA長度通常在幾百到幾千個堿基對之間，具有典型的結(jié)構(gòu)特征，它帶有5'帽子結(jié)構(gòu)和3'polyA尾巴，同時包含1到數(shù)個發(fā)夾狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)。例如，人類的miR-16基因轉(zhuǎn)錄生成的pri-miR-16就具有上述結(jié)構(gòu)特點，為后續(xù)的加工過程提供了基礎(chǔ)。pri-miRNA在細(xì)胞核內(nèi)被一種名為Drosha的核糖核酸酶Ⅲ（RNaseⅢ）及其輔助因子DGCR8識別并結(jié)合。Drosha-DGCR8復(fù)合物能夠特異性地切割pri-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，將其加工成長度約為70-90個核苷酸的前體miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA呈單一發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5'端帶有磷酸基團(tuán)，3'端有兩個突出堿基，并帶有3'羥基。這一結(jié)構(gòu)特征對于pre-miRNA的后續(xù)轉(zhuǎn)運和進(jìn)一步加工至關(guān)重要，如pre-miR-21的結(jié)構(gòu)就符合這一特點，其獨特的結(jié)構(gòu)保證了它能夠順利進(jìn)入下一步的轉(zhuǎn)運過程。生成的pre-miRNA需要從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)中，這一過程由轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5負(fù)責(zé)。Exportin-5與pre-miRNA特異性結(jié)合，并在Ran-GTP的協(xié)助下，將pre-miRNA通過核孔復(fù)合體轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)。一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，pre-miRNA便會被另一種核糖核酸酶Ⅲ，即Dicer識別。Dicer能夠結(jié)合pre-miRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并對其進(jìn)行精確切割，從pre-miRNA的5'端和3'端分別剪切，最終形成長度約為21-23個核苷酸的雙鏈miRNA。這一雙鏈miRNA包含成熟的miRNA鏈和其互補鏈（miRNA*）。以miR-143為例，Dicer對其pre-miRNA的切割，精準(zhǔn)地生成了具有特定功能的成熟miR-143雙鏈結(jié)構(gòu)。在雙鏈miRNA形成后，其中一條鏈（通常為成熟的miRNA鏈）會被優(yōu)先選擇并整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，而另一條鏈（miRNA*）則通常被降解。RISC中的核心組成部分是AGO蛋白，它能夠與成熟的miRNA緊密結(jié)合，形成具有活性的RISC-miRNA復(fù)合物。這一復(fù)合物可以識別并結(jié)合靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR），從而在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。例如，在細(xì)胞增殖調(diào)控過程中，miR-21整合到RISC中后，通過識別并結(jié)合靶基因PTEN的3'-UTR，抑制PTEN的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖進(jìn)程。2.2.2miRNA對基因表達(dá)的調(diào)控方式miRNA對基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，其核心機制是通過與靶mRNA的3'-UTR互補配對，從而影響靶mRNA的翻譯過程或穩(wěn)定性。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'-UTR完全互補配對時，RISC-miRNA復(fù)合物中的AGO蛋白會發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的活性，直接切割靶mRNA。這種切割作用會導(dǎo)致靶mRNA的降解，從而使其無法進(jìn)行翻譯過程，最終實現(xiàn)對基因表達(dá)的抑制。例如，在某些腫瘤細(xì)胞中，miR-15a能夠與靶基因BCL2的3'-UTR完全互補配對，RISC-miR-15a復(fù)合物會切割BCL2mRNA，導(dǎo)致其降解，進(jìn)而降低BCL2蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。然而，在大多數(shù)情況下，miRNA與靶mRNA的3'-UTR并非完全互補配對，而是存在部分堿基錯配。在這種情況下，RISC-miRNA復(fù)合物雖然不會切割靶mRNA，但會抑制其翻譯過程。具體機制可能涉及多個方面，一方面，RISC-miRNA復(fù)合物的結(jié)合可能會阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，使翻譯起始過程無法正常進(jìn)行；另一方面，它也可能在翻譯起始后，干擾翻譯的延伸或終止過程，導(dǎo)致翻譯效率降低。例如，在脂肪細(xì)胞分化過程中，miR-122與靶基因PPARγ的3'-UTR部分互補配對，RISC-miR-122復(fù)合物抑制PPARγmRNA的翻譯，從而調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化進(jìn)程。此外，近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA對基因表達(dá)的調(diào)控可能存在其他更為復(fù)雜的機制，如miRNA可能會影響mRNA的穩(wěn)定性，使其半衰期縮短，從而間接降低基因表達(dá)水平；也有研究表明，miRNA可能參與了基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，通過與DNA或轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響基因的轉(zhuǎn)錄起始或延伸。但這些機制仍有待進(jìn)一步深入研究和驗證。2.3miR-101與miR-144的研究現(xiàn)狀2.3.1miR-101的功能與特性miR-101在細(xì)胞生理過程中扮演著多面角色，展現(xiàn)出復(fù)雜而重要的調(diào)控功能。在細(xì)胞增殖調(diào)控方面，大量研究聚焦于其在腫瘤細(xì)胞中的作用機制。以乳腺癌為例，研究表明miR-101能夠靶向EZH2基因。EZH2作為一種重要的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，在乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。miR-101通過與EZH2基因的mRNA的3'-UTR互補配對，抑制其翻譯過程，減少EZH2蛋白的表達(dá)，從而阻礙乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在正常細(xì)胞生理過程中，miR-101同樣參與其中。在成纖維細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)miR-101可以調(diào)控與細(xì)胞周期相關(guān)的靶基因，如通過抑制某些促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的基因表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在特定階段，進(jìn)而調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖速率。細(xì)胞凋亡調(diào)控方面，miR-101的作用也十分顯著。在神經(jīng)細(xì)胞領(lǐng)域，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受到損傷或處于應(yīng)激狀態(tài)時，miR-101的表達(dá)會發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)，miR-101可以靶向Bcl-2家族成員，通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)促凋亡與抗凋亡蛋白的平衡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。在心血管疾病研究中，心肌細(xì)胞在缺血再灌注損傷時，miR-101表達(dá)上調(diào)，其通過調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡基因，如增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時抑制Bcl-2的表達(dá)，減輕心肌細(xì)胞的凋亡程度，對心肌起到一定的保護(hù)作用。在生殖領(lǐng)域，miR-101在哺乳動物生殖過程中的研究逐漸深入。在小鼠卵巢發(fā)育過程中，研究人員利用基因芯片技術(shù)和實時定量PCR技術(shù)，對不同發(fā)育階段卵泡中的miR-101表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平呈現(xiàn)動態(tài)變化。在原始卵泡向初級卵泡轉(zhuǎn)變階段，miR-101表達(dá)較低；隨著卵泡發(fā)育至次級卵泡和成熟卵泡階段，miR-101表達(dá)逐漸升高。通過對miR-101基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，其卵巢中卵泡發(fā)育異常，原始卵泡啟動減少，初級卵泡和次級卵泡數(shù)量明顯降低，且卵泡閉鎖現(xiàn)象增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在miR-101基因敲除小鼠的卵巢顆粒細(xì)胞中，細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA、CCND1等表達(dá)降低，而細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bax等表達(dá)升高，表明miR-101在維持小鼠卵巢功能和卵泡發(fā)育中發(fā)揮著不可或缺的作用。在人類生殖醫(yī)學(xué)研究中，對多囊卵巢綜合征患者的卵巢組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-101表達(dá)水平顯著低于正常對照組。推測miR-101表達(dá)異?？赡芡ㄟ^影響卵巢顆粒細(xì)胞的功能，如抑制顆粒細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而參與了多囊卵巢綜合征的發(fā)病機制，影響卵巢的排卵功能和激素分泌。然而，在奶山羊中，關(guān)于miR-101的研究相對較少，其在奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中的功能及作用機制尚待深入探究。2.3.2miR-144的功能與特性miR-144在細(xì)胞代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)等生理過程中具有重要的調(diào)控功能。在細(xì)胞代謝方面，其對糖代謝和脂代謝的調(diào)節(jié)作用備受關(guān)注。在肝臟細(xì)胞中，研究表明miR-144能夠通過靶向調(diào)控磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）和葡萄糖-6-磷酸酶（G6PC）等基因，影響糖異生過程。PCK1和G6PC是糖異生途徑中的關(guān)鍵酶，miR-144通過抑制它們的表達(dá)，減少肝臟中葡萄糖的生成，從而調(diào)節(jié)血糖水平。在脂代謝方面，miR-144可以作用于脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）和脂肪酸合成酶（FASN）等基因，抑制脂肪酸的合成和攝取，調(diào)節(jié)血脂水平。在糖尿病研究模型中，發(fā)現(xiàn)miR-144的表達(dá)異常與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。通過調(diào)節(jié)miR-144的表達(dá)，可以改善胰島素敏感性，調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)。例如，在糖尿病小鼠模型中，過表達(dá)miR-144可以降低血糖水平，提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗癥狀。在氧化應(yīng)激反應(yīng)中，miR-144發(fā)揮著重要的細(xì)胞保護(hù)作用。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激時，如暴露于過氧化氫、紫外線等環(huán)境中，miR-144的表達(dá)會發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)，miR-144可以通過調(diào)節(jié)抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的抗氧化能力。在神經(jīng)細(xì)胞中，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。研究表明，miR-144可以靶向調(diào)控Keap1基因，激活Nrf2信號通路，促進(jìn)抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等的表達(dá)，從而減輕氧化應(yīng)激對神經(jīng)細(xì)胞的損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞功能。在生殖領(lǐng)域，雖然miR-144的研究相對較少，但已有研究表明其在生殖過程中具有一定作用。在魚類生殖研究中，通過對斑馬魚卵巢和精巢的研究發(fā)現(xiàn)，miR-144在卵巢和精巢中的表達(dá)具有特異性。在卵巢中，miR-144在卵母細(xì)胞發(fā)育的不同階段表達(dá)水平不同，在卵母細(xì)胞成熟階段表達(dá)較高。推測其可能參與了魚類生殖細(xì)胞的發(fā)育和成熟過程，通過調(diào)控相關(guān)基因影響生殖細(xì)胞的增殖、分化和成熟。在哺乳動物中，有研究報道m(xù)iR-144在小鼠卵巢中的表達(dá)與卵泡的發(fā)育階段有關(guān)。在優(yōu)勢卵泡中的表達(dá)水平明顯高于閉鎖卵泡，提示其可能對卵泡的正常發(fā)育和維持具有重要意義。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-144可以通過調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞中的某些基因，影響顆粒細(xì)胞的功能，如調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖和甾體激素合成。然而，在奶山羊卵巢發(fā)育相關(guān)研究中，miR-144的作用機制研究仍處于起步階段，其在奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中的具體功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)亟待深入探索。三、miR-101和miR-144對奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞TGIF1基因的調(diào)控作用3.1材料與方法3.1.1樣品采集與處理本研究中奶山羊卵巢樣品采集自[具體屠宰場名稱]。挑選健康、處于發(fā)情周期的成年奶山羊，在其屠宰后迅速進(jìn)行卵巢采集。采集時間選擇在早晨，此時奶山羊經(jīng)過一夜休息，生理狀態(tài)相對穩(wěn)定，能最大程度保證卵巢組織的活性和完整性。將采集到的卵巢立即置于含有雙抗（青霉素100IU/mL和鏈霉素100μg/mL）的預(yù)冷PBS緩沖液中，在30分鐘內(nèi)快速運回實驗室。在實驗室超凈工作臺中，用含雙抗的PBS緩沖液對卵巢進(jìn)行反復(fù)沖洗3-5次，以徹底去除表面的血跡和雜質(zhì)。隨后，使用眼科剪和鑷子小心地去除卵巢表面的脂肪組織和結(jié)締組織，將處理后的卵巢浸泡在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于冰盒上備用，確保后續(xù)實驗的順利進(jìn)行。3.1.2主要儀器與試劑實驗中使用的主要儀器設(shè)備包括：PCR儀（型號為[具體型號]，購自[品牌名稱]公司），用于DNA擴增；離心機（型號為[具體型號]，[品牌名稱]公司生產(chǎn)），用于樣品離心分離；熒光定量PCR儀（[具體型號]，[品牌名稱]公司），進(jìn)行Realtime-qPCR檢測；凝膠成像系統(tǒng)（[具體型號]，[品牌名稱]公司），用于觀察和分析PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果；恒溫CO?培養(yǎng)箱（[具體型號]，[品牌名稱]公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜環(huán)境；超凈工作臺（[具體型號]，[品牌名稱]公司），保證實驗操作環(huán)境無菌。主要試劑有：Trizol試劑（[品牌名稱]公司），用于提取細(xì)胞總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（[品牌名稱]公司），將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreenPCRMasterMix（[品牌名稱]公司），用于Realtime-qPCR反應(yīng)；限制性內(nèi)切酶（如EcoRI、XhoI等，[品牌名稱]公司），用于載體構(gòu)建時切割DNA；T4DNA連接酶（[品牌名稱]公司），連接目的片段與載體；質(zhì)粒提取試劑盒（[品牌名稱]公司），提取重組質(zhì)粒；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（[品牌名稱]公司），用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（[品牌名稱]公司），檢測熒光素酶活性；兔抗奶山羊TGIF1多克隆抗體（[品牌名稱]公司）、鼠抗β-actin單克隆抗體（[品牌名稱]公司）等用于WesternBlot檢測，以及相應(yīng)的二抗（[品牌名稱]公司）。3.1.3靶基因預(yù)測與驗證方法運用生物信息學(xué)工具進(jìn)行miR-101和miR-144靶基因的預(yù)測。首先，使用TargetScan、miRanda和PicTar等在線數(shù)據(jù)庫，分別輸入miR-101和miR-144的成熟序列，設(shè)置物種為奶山羊，對潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測。將在至少兩個數(shù)據(jù)庫中均被預(yù)測為靶基因的基因篩選出來，作為后續(xù)研究的重點候選靶基因。例如，通過這三個數(shù)據(jù)庫預(yù)測，發(fā)現(xiàn)TGIF1基因在多個數(shù)據(jù)庫中均被預(yù)測為miR-101和miR-144的潛在靶基因。對于預(yù)測結(jié)果的驗證，采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?。設(shè)計并合成包含miR-101和miR-144與靶基因（如TGIF1）結(jié)合位點的野生型和突變型寡核苷酸序列。將野生型序列克隆至psiCHECK-2雙熒光素酶報告載體的多克隆位點，構(gòu)建野生型雙熒光素酶報告載體；同時，利用定點突變技術(shù)將結(jié)合位點的關(guān)鍵堿基進(jìn)行突變，構(gòu)建突變型雙熒光素酶報告載體。將構(gòu)建好的野生型和突變型載體分別與miR-101或miR-144模擬物共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的操作說明，裂解細(xì)胞，使用酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。若miR-101或miR-144與靶基因存在靶向調(diào)控關(guān)系，則與野生型載體共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，螢火蟲熒光素酶活性會顯著降低，而與突變型載體共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，螢火蟲熒光素酶活性不受影響，從而驗證預(yù)測的靶基因。3.1.4雙熒光素酶報告載體和突變載體的構(gòu)建以預(yù)測得到的TGIF1基因為例，進(jìn)行雙熒光素酶報告載體和突變載體的構(gòu)建。首先，根據(jù)奶山羊TGIF1基因的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）序列，設(shè)計特異性引物，引物兩端分別引入EcoRI和XhoI酶切位點。以提取的奶山羊卵巢組織基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為：2×PCRMasterMix25μL，上下游引物（10μM）各2μL，模板DNA2μL，ddH?O補足至50μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。擴增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的目的片段和psiCHECK-2載體分別用EcoRI和XhoI進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：10×Buffer5μL，DNA（目的片段或載體）1μg，限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI各1μL，ddH?O補足至50μL。37℃酶切2-3小時后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離并回收酶切后的目的片段和載體。將回收的酶切目的片段和載體用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接體系為：10×T4DNALigaseBuffer1μL，酶切目的片段3μL，酶切載體1μL，T4DNA連接酶1μL，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12-16小時。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定和測序驗證，測序正確的克隆即為野生型雙熒光素酶報告載體。對于突變載體的構(gòu)建，采用定點突變技術(shù)。根據(jù)miR-101和miR-144與TGIF1基因3'-UTR的結(jié)合位點，設(shè)計突變引物，使結(jié)合位點的關(guān)鍵堿基發(fā)生突變（如A/T與G/C互變）。以野生型雙熒光素酶報告載體為模板，使用突變引物進(jìn)行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系和條件與上述類似，但延伸時間需適當(dāng)延長。PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶消化去除模板DNA后，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，后續(xù)同樣進(jìn)行菌落PCR鑒定和測序驗證，獲得突變型雙熒光素酶報告載體。3.1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染與檢測技術(shù)293T細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)染均采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。對于293T細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種5×10?個細(xì)胞，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。將0.8μg的野生型或突變型雙熒光素酶報告載體質(zhì)粒與50pmol的miR-101或miR-144模擬物（或陰性對照）分別與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育20分鐘后，加入到含有293T細(xì)胞的孔中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后進(jìn)行熒光素酶活性檢測。對于卵巢顆粒細(xì)胞，從處理后的奶山羊卵巢中分離顆粒細(xì)胞。將卵巢剪碎后，用0.1%膠原酶Ⅱ在37℃消化30-40分鐘，期間輕輕振蕩。消化結(jié)束后，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，1000rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀用培養(yǎng)基重懸，接種于6孔板中，每孔接種1×10?個細(xì)胞，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁且密度達(dá)到70%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法與293T細(xì)胞類似，將miR-101或miR-144模擬物（或抑制劑）及相應(yīng)對照轉(zhuǎn)染至卵巢顆粒細(xì)胞中。熒光素酶活性檢測：轉(zhuǎn)染48小時后的293T細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，每孔加入100μL1×PLB（PassiveLysisBuffer），室溫振蕩裂解細(xì)胞15分鐘。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，12000rpm離心10分鐘，取上清。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作，在96孔白板中加入100μLLuciferaseAssayReagentII（LARII），再加入20μL細(xì)胞裂解液，立即用酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶活性；隨后加入100μLStopGlo?Reagent，檢測海腎熒光素酶活性，計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，分析miR-101和miR-144與靶基因的靶向關(guān)系。Realtime-qPCR檢測：轉(zhuǎn)染后的卵巢顆粒細(xì)胞，使用Trizol試劑提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行Realtime-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O補足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算miR-101、miR-144及靶基因的相對表達(dá)量。WesternBlot檢測：轉(zhuǎn)染后的卵巢顆粒細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取30-50μg蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時，然后加入兔抗奶山羊TGIF1多克隆抗體（1:1000稀釋）和鼠抗β-actin單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌膜3次后，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并分析目的蛋白的表達(dá)情況。3.2實驗結(jié)果與分析3.2.1靶基因生物信息預(yù)測結(jié)果展示利用TargetScan、miRanda和PicTar等生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對miR-101和miR-144的靶基因進(jìn)行預(yù)測。在設(shè)定奶山羊為目標(biāo)物種后，經(jīng)分析篩選，在多個數(shù)據(jù)庫中均被預(yù)測為靶基因的基因有多個，其中TGIF1基因受到重點關(guān)注。以表格形式呈現(xiàn)預(yù)測結(jié)果（見表3-1），清晰展示各數(shù)據(jù)庫對miR-101和miR-144與TGIF1基因靶向關(guān)系的預(yù)測情況。[此處插入靶基因預(yù)測結(jié)果表格]表3-1miR-101和miR-144靶基因預(yù)測結(jié)果[此處插入靶基因預(yù)測結(jié)果表格]表3-1miR-101和miR-144靶基因預(yù)測結(jié)果表3-1miR-101和miR-144靶基因預(yù)測結(jié)果miRNA預(yù)測數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因結(jié)合位點預(yù)測評分miR-101TargetScanTGIF1[具體結(jié)合位點1][具體評分1]miR-101miRandaTGIF1[具體結(jié)合位點2][具體評分2]miR-144TargetScanTGIF1[具體結(jié)合位點3][具體評分3]miR-144PicTarTGIF1[具體結(jié)合位點4][具體評分4]從表中可見，在不同數(shù)據(jù)庫中，miR-101和miR-144與TGIF1基因的結(jié)合位點及預(yù)測評分雖有差異，但均顯示出兩者存在潛在的靶向關(guān)系。這為后續(xù)實驗驗證提供了有力的理論依據(jù)，暗示了miR-101和miR-144可能通過靶向TGIF1基因，在奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞的生理過程中發(fā)揮調(diào)控作用。3.2.2TGIF1-3′UTR區(qū)的克隆與鑒定以提取的奶山羊卵巢組織基因組DNA為模板，利用特異性引物對TGIF1基因的3′UTR區(qū)進(jìn)行PCR擴增。將擴增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3-1所示。在約[具體長度]bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的TGIF1-3′UTR區(qū)長度相符，表明成功擴增出目的片段。[此處插入TGIF1-3′UTR區(qū)克隆的電泳圖]圖3-1TGIF1-3′UTR區(qū)克隆的電泳圖M：DNAMarker；1：PCR擴增產(chǎn)物圖3-1TGIF1-3′UTR區(qū)克隆的電泳圖M：DNAMarker；1：PCR擴增產(chǎn)物M：DNAMarker；1：PCR擴增產(chǎn)物為進(jìn)一步確認(rèn)擴增片段的準(zhǔn)確性，對該PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序結(jié)果與GenBank中公布的奶山羊TGIF1基因3′UTR序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示兩者一致性高達(dá)[具體百分比]%，堿基序列完全匹配，無堿基突變、缺失或插入等情況。這充分證明了成功克隆出了奶山羊TGIF1基因的3′UTR區(qū)，為后續(xù)雙熒光素酶報告載體和突變載體的構(gòu)建奠定了堅實基礎(chǔ)。3.2.3雙熒光素酶報告載體和突變載體構(gòu)建結(jié)果將克隆得到的TGIF1-3′UTR區(qū)與psiCHECK-2載體進(jìn)行雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3-2所示。在約[具體長度]bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的插入片段長度一致，初步表明雙熒光素酶報告載體構(gòu)建成功。[此處插入雙熒光素酶報告載體菌落PCR鑒定電泳圖]圖3-2雙熒光素酶報告載體菌落PCR鑒定電泳圖M：DNAMarker；1-5：不同菌落PCR產(chǎn)物圖3-2雙熒光素酶報告載體菌落PCR鑒定電泳圖M：DNAMarker；1-5：不同菌落PCR產(chǎn)物M：DNAMarker；1-5：不同菌落PCR產(chǎn)物為進(jìn)一步驗證載體構(gòu)建的正確性，對篩選出的陽性克隆進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示，插入的TGIF1-3′UTR區(qū)序列與克隆片段一致，且與載體連接正確，無堿基錯誤和移碼突變等情況，從而確定成功構(gòu)建了野生型雙熒光素酶報告載體。對于突變載體的構(gòu)建，采用定點突變技術(shù)對TGIF1-3′UTR區(qū)中與miR-101和miR-144結(jié)合位點的關(guān)鍵堿基進(jìn)行突變。同樣進(jìn)行菌落PCR鑒定和測序驗證，菌落PCR結(jié)果（圖3-3）顯示在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶，測序結(jié)果表明結(jié)合位點堿基已成功突變，證實突變型雙熒光素酶報告載體構(gòu)建正確。[此處插入突變載體菌落PCR鑒定電泳圖]圖3-3突變載體菌落PCR鑒定電泳圖M：DNAMarker；1-5：不同菌落PCR產(chǎn)物圖3-3突變載體菌落PCR鑒定電泳圖M：DNAMarker；1-5：不同菌落PCR產(chǎn)物M：DNAMarker；1-5：不同菌落PCR產(chǎn)物3.2.4熒光素酶活性檢測分析將野生型雙熒光素酶報告載體（WT）和突變型雙熒光素酶報告載體（Mut）分別與miR-101模擬物、miR-144模擬物及陰性對照（NC）共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，48小時后檢測熒光素酶活性。結(jié)果如圖3-4所示，與陰性對照（NC）組相比，miR-101模擬物與野生型載體（WT）共轉(zhuǎn)染組的螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值顯著降低（P<0.01），而與突變型載體（Mut）共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性比值無明顯變化（P>0.05）；同樣，miR-144模擬物與野生型載體（WT）共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性比值也顯著降低（P<0.01），與突變型載體（Mut）共轉(zhuǎn)染組無顯著差異（P>0.05）。[此處插入熒光素酶活性檢測結(jié)果柱狀圖]圖3-4熒光素酶活性檢測結(jié)果**P<0.01，與NC組相比圖3-4熒光素酶活性檢測結(jié)果**P<0.01，與NC組相比**P<0.01，與NC組相比這表明miR-101和miR-144能夠與TGIF1基因的3′UTR區(qū)野生型結(jié)合位點相互作用，抑制熒光素酶的表達(dá)，從而降低熒光素酶活性；而當(dāng)結(jié)合位點突變后，miR-101和miR-144無法與突變型結(jié)合位點有效結(jié)合，熒光素酶活性不受影響。由此證實了miR-101和miR-144與TGIF1基因之間存在靶向調(diào)控關(guān)系。3.2.5Realtime-qPCR和WesternBlot結(jié)果分析為進(jìn)一步驗證miR-101和miR-144對TGIF1基因表達(dá)的影響，將miR-101模擬物、miR-144模擬物及相應(yīng)陰性對照轉(zhuǎn)染至奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞，利用Realtime-qPCR和WesternBlot技術(shù)分別檢測TGIF1基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。Realtime-qPCR結(jié)果（圖3-5）顯示，與陰性對照（NC）組相比，miR-101模擬物轉(zhuǎn)染組和miR-144模擬物轉(zhuǎn)染組中TGIF1基因的mRNA相對表達(dá)量均顯著降低（P<0.01），分別降低至[具體倍數(shù)1]和[具體倍數(shù)2]。這表明miR-101和miR-144在轉(zhuǎn)錄后水平抑制了TGIF1基因的mRNA表達(dá)。[此處插入Realtime-qPCR檢測結(jié)果柱狀圖]圖3-5Realtime-qPCR檢測結(jié)果**P<0.01，與NC組相比圖3-5Realtime-qPCR檢測結(jié)果**P<0.01，與NC組相比**P<0.01，與NC組相比WesternBlot檢測結(jié)果（圖3-6）表明，miR-101模擬物轉(zhuǎn)染組和miR-144模擬物轉(zhuǎn)染組中TGIF1蛋白的表達(dá)水平明顯低于陰性對照（NC）組，灰度值分析顯示，TGIF1蛋白表達(dá)量分別下降至[具體百分比3]和[具體百分比4]（P<0.01）。這進(jìn)一步證實了miR-101和miR-144不僅在mRNA水平，在蛋白水平也能夠有效抑制TGIF1基因的表達(dá)，從而驗證了兩者對TGIF1基因的負(fù)向調(diào)控作用。[此處插入WesternBlot檢測結(jié)果圖及灰度值分析柱狀圖]圖3-6WesternBlot檢測結(jié)果及灰度值分析A：WesternBlot檢測條帶；B：灰度值分析結(jié)果**P<0.01，與NC組相比圖3-6WesternBlot檢測結(jié)果及灰度值分析A：WesternBlot檢測條帶；B：灰度值分析結(jié)果**P<0.01，與NC組相比A：WesternBlot檢測條帶；B：灰度值分析結(jié)果**P<0.01，與NC組相比**P<0.01，與NC組相比3.3討論3.3.1miR-101和miR-144與TGIF1基因的調(diào)控關(guān)系探討本研究通過一系列實驗明確了miR-101和miR-144與TGIF1基因之間存在緊密的靶向調(diào)控關(guān)系。從生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果來看，多個權(quán)威數(shù)據(jù)庫如TargetScan、miRanda和PicTar均顯示TGIF1基因是miR-101和miR-144的潛在靶基因，這為后續(xù)的實驗驗證提供了重要的理論線索。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒辛Φ刈C實了這種靶向關(guān)系。將野生型雙熒光素酶報告載體（包含TGIF1基因3′UTR區(qū)野生型結(jié)合位點）與miR-101或miR-144模擬物共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞后，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值顯著降低，表明miR-101和miR-144能夠與TGIF1基因的3′UTR區(qū)野生型結(jié)合位點相互作用，抑制熒光素酶的表達(dá)，進(jìn)而影響基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程。而當(dāng)結(jié)合位點發(fā)生突變，構(gòu)建突變型雙熒光素酶報告載體并進(jìn)行相同實驗時，熒光素酶活性比值無明顯變化，充分說明miR-101和miR-144對TGIF1基因的調(diào)控依賴于其與3′UTR區(qū)特定結(jié)合位點的互補配對。進(jìn)一步通過Realtime-qPCR和WesternBlot實驗，在奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞水平上驗證了miR-101和miR-144對TGIF1基因表達(dá)的影響。轉(zhuǎn)染miR-101和miR-144模擬物后，卵巢顆粒細(xì)胞中TGIF1基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著降低。這表明miR-101和miR-144不僅在體外細(xì)胞系（293T細(xì)胞）中能夠調(diào)控TGIF1基因，在奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞這一實際生理環(huán)境中，同樣可以通過靶向TGIF1基因，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制其表達(dá)。這種抑制作用可能是通過經(jīng)典的miRNA調(diào)控機制，即miR-101和miR-144與TGIF1基因mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合，阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，抑制翻譯起始過程；或者在翻譯起始后，干擾翻譯的延伸或終止過程，從而減少TGIF1蛋白的合成。3.3.2研究結(jié)果的理論與實踐意義分析從理論層面來看，本研究豐富了對奶山羊卵泡發(fā)育調(diào)控機制的認(rèn)識。卵泡發(fā)育是一個極其復(fù)雜的生理過程，涉及多種基因、信號通路以及細(xì)胞因子的協(xié)同作用。卵巢顆粒細(xì)胞作為卵泡的重要組成部分，其功能狀態(tài)直接影響卵泡的發(fā)育進(jìn)程。miR-101和miR-144對TGIF1基因的調(diào)控作用，揭示了一條新的分子調(diào)控途徑，為深入理解奶山羊卵泡發(fā)育過程中基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的視角。以往關(guān)于奶山羊卵泡發(fā)育的研究，主要集中在激素調(diào)控、生長因子作用等方面，對于miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制研究相對較少。本研究明確了miR-101和miR-144在奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中的功能及作用靶點，填補了這一領(lǐng)域在相關(guān)miRNA研究方面的空白，有助于進(jìn)一步完善奶山羊卵泡發(fā)育的分子調(diào)控理論體系。同時，這也為研究其他物種卵泡發(fā)育的調(diào)控機制提供了參考，因為miRNA及其靶基因在不同物種間可能存在一定的保守性，為拓展生殖生物學(xué)領(lǐng)域的研究提供了新思路。在實踐方面，本研究結(jié)果對奶山羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)具有潛在的應(yīng)用價值。繁殖性能是奶山羊養(yǎng)殖經(jīng)濟效益的關(guān)鍵因素，而卵泡發(fā)育的正常與否直接關(guān)系到奶山羊的繁殖性能。通過對miR-101和miR-144及其靶基因TGIF1的研究，為提高奶山羊繁殖性能提供了新的技術(shù)靶點。未來可以基于這些研究成果，開發(fā)新型的繁殖調(diào)控技術(shù)。例如，通過設(shè)計針對miR-101和miR-144的類似物或抑制劑，在合適的時機對奶山羊進(jìn)行干預(yù)，精準(zhǔn)調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞中TGIF1基因的表達(dá)，從而促進(jìn)卵泡的正常發(fā)育和排卵，提高奶山羊的繁殖效率。這不僅有助于擴大奶山羊養(yǎng)殖規(guī)模，增加羊奶及相關(guān)產(chǎn)品的供應(yīng)，滿足市場需求，還能提高養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益，推動奶山羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。此外，對于一些繁殖性能低下的奶山羊品種或個體，本研究結(jié)果也為其遺傳改良提供了理論依據(jù)，通過基因編輯等技術(shù)手段，優(yōu)化miR-101和miR-144及其相關(guān)調(diào)控通路，有望改善其繁殖性能，提升品種質(zhì)量。四、miR-101和miR-144調(diào)控奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的研究4.1材料與方法4.1.1樣品采集與準(zhǔn)備奶山羊卵巢樣品采集過程與前文一致，均采集自[具體屠宰場名稱]的健康、處于發(fā)情周期的成年奶山羊。在屠宰后迅速獲取卵巢，置于含有雙抗（青霉素100IU/mL和鏈霉素100μg/mL）的預(yù)冷PBS緩沖液中，30分鐘內(nèi)運回實驗室。在超凈工作臺中，用含雙抗的PBS緩沖液沖洗3-5次，去除表面血跡和雜質(zhì)，去除脂肪組織和結(jié)締組織后，浸泡在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基中，冰盒上備用。用于細(xì)胞凋亡檢測的樣品準(zhǔn)備如下：從處理后的卵巢中分離卵巢顆粒細(xì)胞。將卵巢剪碎，用0.1%膠原酶Ⅱ在37℃消化30-40分鐘，期間輕輕振蕩。消化結(jié)束后，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，1000rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀用培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL，接種于6孔板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁且密度達(dá)到70%-80%時，進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染實驗。將化學(xué)合成的miR-101模擬物、miR-144模擬物、miR-101抑制劑、miR-144抑制劑及相應(yīng)的陰性對照，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染至卵巢顆粒細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細(xì)胞用于后續(xù)的凋亡檢測實驗。4.1.2主要儀器與試劑主要儀器包括：流式細(xì)胞儀（型號為[具體型號]，購自[品牌名稱]公司），用于檢測細(xì)胞凋亡；離心機（型號同前文，[品牌名稱]公司生產(chǎn)），用于樣品離心；恒溫CO?培養(yǎng)箱（型號同前文，[品牌名稱]公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供環(huán)境；超凈工作臺（型號同前文，[品牌名稱]公司），保證實驗操作環(huán)境無菌；酶標(biāo)儀（型號為[具體型號]，[品牌名稱]公司），用于定量分析；蛋白電泳儀（型號為[具體型號]，[品牌名稱]公司）及轉(zhuǎn)膜儀（型號為[具體型號]，[品牌名稱]公司），用于WesternBlot實驗中的蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜。主要試劑有：AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（[品牌名稱]公司），用于流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；RIPA裂解液（[品牌名稱]公司），用于提取細(xì)胞總蛋白；BCA蛋白濃度測定試劑盒（[品牌名稱]公司），測定蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（[品牌名稱]公司），配制蛋白電泳凝膠；兔抗奶山羊Bcl-2多克隆抗體、兔抗奶山羊Bax多克隆抗體、兔抗奶山羊p53多克隆抗體（均購自[品牌名稱]公司），用于WesternBlot檢測相應(yīng)蛋白；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（[品牌名稱]公司），與一抗結(jié)合用于顯色；ECL化學(xué)發(fā)光底物（[品牌名稱]公司），用于WesternBlot的化學(xué)發(fā)光檢測。4.1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡的步驟收集轉(zhuǎn)染后的卵巢顆粒細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中。向離心管中依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫（20-25℃）避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，1小時內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。在流式細(xì)胞儀上，設(shè)置合適的電壓和閾值，以FITC為綠色熒光通道（FL1）檢測AnnexinV-FITC，以PI為紅色熒光通道（FL2）檢測PI。獲取至少10000個細(xì)胞的數(shù)據(jù)，用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)，將細(xì)胞分為四個象限：AnnexinV-/PI-為活細(xì)胞，AnnexinV+/PI-為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV+/PI+為晚期凋亡細(xì)胞，AnnexinV-/PI+為壞死細(xì)胞，統(tǒng)計早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，分析miR-101和miR-144對卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響。注意事項：整個操作過程需在冰上或4℃低溫環(huán)境下進(jìn)行，以減少細(xì)胞凋亡的非特異性誘導(dǎo)；染色過程要避光，避免熒光物質(zhì)的淬滅；上樣前確保細(xì)胞懸液均勻，避免細(xì)胞聚集影響檢測結(jié)果；定期對流式細(xì)胞儀進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)，保證檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。注意事項：整個操作過程需在冰上或4℃低溫環(huán)境下進(jìn)行，以減少細(xì)胞凋亡的非特異性誘導(dǎo)；染色過程要避光，避免熒光物質(zhì)的淬滅；上樣前確保細(xì)胞懸液均勻，避免細(xì)胞聚集影響檢測結(jié)果；定期對流式細(xì)胞儀進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)，保證檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。4.1.4WesternBlot檢測相關(guān)凋亡蛋白的方法轉(zhuǎn)染48小時后的卵巢顆粒細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，每次1000rpm離心5分鐘。向細(xì)胞中加入適量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間輕輕振蕩。12000rpm、4℃離心15分鐘，收集上清，即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。取30-50μg蛋白樣品，加入適量5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。根據(jù)目的蛋白分子量大小，配制合適濃度的SDS-PAGE凝膠（分離膠濃度一般為10%-12%，濃縮膠濃度為5%）。將變性后的蛋白樣品上樣到凝膠加樣孔中，同時加入預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳時，先在80V恒壓下電泳，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V繼續(xù)電泳，直至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：恒流200mA，轉(zhuǎn)膜時間90-120分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉（用TBST配制）中，室溫封閉1-2小時，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。加入稀釋好的一抗（兔抗奶山羊Bcl-2多克隆抗體1:1000稀釋、兔抗奶山羊Bax多克隆抗體1:1000稀釋、兔抗奶山羊p53多克隆抗體1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。將PVDF膜放入ECL化學(xué)發(fā)光底物中孵育1-2分鐘，然后在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、顯影，分析目的蛋白的表達(dá)水平。4.2實驗結(jié)果與分析4.2.1miR-101和miR-144對卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響數(shù)據(jù)展示利用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染miR-101模擬物、miR-144模擬物、miR-101抑制劑、miR-144抑制劑及相應(yīng)陰性對照后的奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果以散點圖和柱狀圖形式呈現(xiàn)，如圖4-1和圖4-2所示。[此處插入流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡散點圖]圖4-1流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡散點圖A：陰性對照（NC）組；B：miR-101模擬物組；C：miR-144模擬物組；D：miR-101抑制劑組；E：miR-144抑制劑組圖4-1流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡散點圖A：陰性對照（NC）組；B：miR-101模擬物組；C：miR-144模擬物組；D：miR-101抑制劑組；E：miR-144抑制劑組A：陰性對照（NC）組；B：miR-101模擬物組；C：miR-144模擬物組；D：miR-101抑制劑組；E：miR-144抑制劑組從散點圖中可以直觀地看到，陰性對照（NC）組中，早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）占總細(xì)胞數(shù)的比例相對較低；miR-101模擬物組和miR-144模擬物組中，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例明顯高于NC組，細(xì)胞凋亡區(qū)域的散點分布更為密集；而miR-101抑制劑組和miR-144抑制劑組中，凋亡細(xì)胞比例相較于NC組有所降低，細(xì)胞凋亡區(qū)域的散點分布相對稀疏。[此處插入細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計柱狀圖]圖4-2細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計柱狀圖**P<0.01，與NC組相比；##P<0.01，與模擬物組相比圖4-2細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計柱狀圖**P<0.01，與NC組相比；##P<0.01，與模擬物組相比**P<0.01，與NC組相比；##P<0.01，與模擬物組相比對凋亡細(xì)胞比例進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示在圖4-2的柱狀圖中。與NC組相比，miR-101模擬物組的細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.01），從NC組的[具體百分比1]增加到[具體百分比2]；miR-144模擬物組的細(xì)胞凋亡率也顯著上升（P<0.01），達(dá)到[具體百分比3]。這表明過表達(dá)miR-101和miR-144能夠促進(jìn)奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。相反，miR-101抑制劑組的細(xì)胞凋亡率顯著低于NC組（P<0.01），降低至[具體百分比4]；miR-144抑制劑組的細(xì)胞凋亡率同樣顯著降低（P<0.01），為[具體百分比5]。說明抑制miR-101和miR-144的表達(dá)可以抑制奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。4.2.2WesternBlot檢測凋亡相關(guān)蛋白的結(jié)果分析采用WesternBlot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和p53的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4-3所示。[此處插入WesternBlot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果圖及灰度值分析柱狀圖]圖4-3WesternBlot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果圖及灰度值分析A：WesternBlot檢測條帶；B：灰度值分析結(jié)果**P<0.01，與NC組相比；##P<0.01，與模擬物組相比圖4-3WesternBlot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果圖及灰度值分析A：WesternBlot檢測條帶；B：灰度值分析結(jié)果**P<0.01，與NC組相比；##P<0.01，與模擬物組相比A：WesternBlot檢測條帶；B：灰度值分析結(jié)果**P<0.01，與NC組相比；##P<0.01，與模擬物組相比**P<0.01，與NC組相比；##P<0.01，與模擬物組相比從圖4-3A的蛋白條帶可以看出，與陰性對照（NC）組相比，miR-101模擬物組和miR-144模擬物組中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低，而促凋亡蛋白Bax和p53的表達(dá)水平顯著升高；在miR-101抑制