乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶2：解析糖尿病心肌病潛在關(guān)聯(lián)與機(jī)制的新視角一、引言1.1研究背景與意義隨著生活水平的提高和生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢。國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2021年全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)5.37億，預(yù)計(jì)到2045年將增長至7.83億。糖尿病作為一種慢性代謝性疾病，可引發(fā)多種嚴(yán)重的并發(fā)癥，糖尿病心肌?。―iabeticCardiomyopathy,DCM）便是其中之一。1972年，Rubler等首次在排除冠狀動(dòng)脈硬化、高血壓、心臟瓣膜病等疾病的糖尿病患者中發(fā)現(xiàn)特異性心肌病變，后被定義為糖尿病性心肌病。該疾病包含微血管病變和心肌細(xì)胞代謝紊亂引起的心臟病變，主要表現(xiàn)為心肌收縮和（或）舒張功能障礙，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為心力衰竭，是糖尿病患者死亡的重要原因之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和壽命。目前，糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，這在很大程度上限制了其有效的預(yù)防和治療?，F(xiàn)有研究表明，糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展涉及多種因素，如心肌代謝改變、能量代謝受損、糖毒性、脂肪毒性和氧化應(yīng)激、心肌纖維化/肥厚以及舒張功能障礙等。這些病理過程相互作用，共同促進(jìn)心肌重構(gòu)、收縮和舒張功能障礙及微血管疾病，最終導(dǎo)致心力衰竭。然而，對(duì)于這些復(fù)雜機(jī)制的深入理解仍存在許多空白，迫切需要進(jìn)一步的研究來揭示其潛在的分子機(jī)制，為開發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)。在眾多與糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制相關(guān)的研究中，乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶2（Acetyl-CoAAcyltransferase2，ACAA2）逐漸受到關(guān)注。ACAA2是一種線粒體酶，在脂肪酸β-氧化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。脂肪酸β-氧化是心肌細(xì)胞能量代謝的重要途徑之一，在正常生理狀態(tài)下，心肌細(xì)胞主要利用脂肪酸氧化供能，以滿足心臟持續(xù)高強(qiáng)度的工作需求。而在糖尿病狀態(tài)下，心肌細(xì)胞的代謝模式發(fā)生改變，脂肪酸氧化異常，ACAA2作為脂肪酸β-氧化途徑中的關(guān)鍵酶，其表達(dá)和活性的變化可能對(duì)心肌細(xì)胞的能量代謝和功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。哈爾濱醫(yī)科大學(xué)潘振偉團(tuán)隊(duì)在《NatureCommunications》發(fā)表的研究論文表明，ACAA2參與了非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）的進(jìn)程，其過表達(dá)可促進(jìn)脂肪酸氧化并抑制脂質(zhì)積累?？紤]到糖尿病心肌病與代謝紊亂密切相關(guān)，ACAA2在糖尿病心肌病中的作用值得深入研究。通過對(duì)ACAA2與糖尿病心肌病相關(guān)性的研究，有望揭示糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制中能量代謝異常的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為早期診斷和干預(yù)提供新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。這不僅有助于改善糖尿病心肌病患者的預(yù)后，降低死亡率，還可能為心血管疾病的防治開辟新的思路和方法，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，糖尿病心肌病作為糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制和防治策略一直是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。國外在糖尿病心肌病的病理生理機(jī)制研究方面取得了諸多進(jìn)展，如深入探究心肌代謝改變、能量代謝受損、糖毒性、脂肪毒性和氧化應(yīng)激、心肌纖維化/肥厚以及舒張功能障礙等因素在糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展中的作用。歐洲心臟協(xié)會(huì)（ESC）心力衰竭協(xié)會(huì)聯(lián)合心肌和心包疾病工作組發(fā)表的共識(shí)，對(duì)糖尿病性心肌病的定義、病理生理機(jī)制以及臨床管理等方面進(jìn)行了系統(tǒng)闡述，強(qiáng)調(diào)了心肌代謝異常在糖尿病心肌病發(fā)病中的核心地位。國內(nèi)的研究團(tuán)隊(duì)也在糖尿病心肌病領(lǐng)域積極探索，山東大學(xué)張澄等人的研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞特異性敲除去整合素和金屬蛋白酶蛋白17（ADAM17）可減輕糖尿病心肌病小鼠的心臟纖維化和心肌細(xì)胞凋亡，并改善心功能不全，其機(jī)制可能涉及激活A(yù)MPK通路、增加自噬體形成和改善自噬通量。這些研究從不同角度揭示了糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供了新的理論依據(jù)。在ACAA2的研究方面，國外學(xué)者對(duì)其在脂肪酸β-氧化過程中的作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究，明確了ACAA2作為線粒體酶，參與脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵步驟，對(duì)維持細(xì)胞的能量代謝平衡具有重要意義。而國內(nèi)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)潘振偉團(tuán)隊(duì)的研究則首次發(fā)現(xiàn)Cullin相關(guān)和類泛素化解離蛋白1（CAND1）通過抑制Cullin1/FBXO42介導(dǎo)的ACAA2降解來減輕非酒精性脂肪肝?。∟AFLD），揭示了ACAA2在肝臟脂質(zhì)代謝中的重要調(diào)控作用。盡管目前關(guān)于糖尿病心肌病和ACAA2的研究取得了一定成果，但仍存在諸多不足與空白。在糖尿病心肌病方面，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，不同因素之間的相互作用關(guān)系仍有待進(jìn)一步闡明?，F(xiàn)有的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型大多基于臨床、生物標(biāo)志物和心電圖變量，尚未充分考慮無癥狀的心臟結(jié)構(gòu)/功能異常，其潛在的附加預(yù)測價(jià)值仍不確定。在ACAA2與糖尿病心肌病相關(guān)性研究方面，目前的研究主要集中在ACAA2在脂肪酸β-氧化過程中的作用以及在肝臟疾病中的調(diào)控機(jī)制，而對(duì)于ACAA2在糖尿病心肌病中的表達(dá)變化、功能作用及其分子機(jī)制的研究相對(duì)較少。本文旨在通過對(duì)ACAA2與糖尿病心肌病相關(guān)性的深入研究，填補(bǔ)這一領(lǐng)域的部分空白。擬從細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面，探究糖尿病心肌病狀態(tài)下ACAA2的表達(dá)水平變化，分析其對(duì)心肌細(xì)胞脂肪酸β-氧化、能量代謝以及細(xì)胞功能的影響，進(jìn)一步揭示ACAA2在糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制中的作用，為糖尿病心肌病的早期診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶2（ACAA2）與糖尿病心肌病之間的相關(guān)性，揭示ACAA2在糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制中的作用，為糖尿病心肌病的早期診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。具體研究目的如下：明確糖尿病心肌病狀態(tài)下ACAA2的表達(dá)水平變化，分析其與糖尿病心肌病病情進(jìn)展的關(guān)聯(lián)。探究ACAA2對(duì)心肌細(xì)胞脂肪酸β-氧化、能量代謝以及細(xì)胞功能的影響，闡明其在糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制中的作用途徑。探討通過調(diào)節(jié)ACAA2表達(dá)或活性來干預(yù)糖尿病心肌病發(fā)展的可能性，為開發(fā)新的治療策略提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究將采用以下研究方法：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用大鼠心肌細(xì)胞系H9c2和新生大鼠心肌細(xì)胞（NRCMs），通過高糖（HG）處理建立糖尿病心肌病細(xì)胞模型。利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測HG處理不同時(shí)間點(diǎn)（12h、24h、48h）ACAA2的mRNA和蛋白表達(dá)水平，以明確ACAA2在糖尿病心肌病細(xì)胞模型中的表達(dá)變化規(guī)律。運(yùn)用RNA干擾技術(shù)敲低ACAA2的表達(dá)，采用慢病毒轉(zhuǎn)染方法過表達(dá)ACAA2，通過檢測脂肪酸β-氧化相關(guān)酶的活性、細(xì)胞內(nèi)ATP水平、線粒體膜電位等指標(biāo)，分析ACAA2對(duì)心肌細(xì)胞脂肪酸β-氧化和能量代謝的影響。同時(shí)，利用細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒（CCK-8）、流式細(xì)胞術(shù)等方法，評(píng)估ACAA2表達(dá)改變對(duì)心肌細(xì)胞增殖、凋亡和氧化應(yīng)激的影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選取8周齡雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC）和糖尿病心肌病模型組（DCM）。采用鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射（50mg/kg，連續(xù)注射5天）誘導(dǎo)建立1型糖尿病心肌病小鼠模型。通過超聲心動(dòng)圖檢測小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)，如左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS）等，以評(píng)估糖尿病心肌病模型的建立情況。在建模成功后，采用qRT-PCR和Westernblot檢測小鼠心肌組織中ACAA2的mRNA和蛋白表達(dá)水平，分析ACAA2在糖尿病心肌病小鼠心肌組織中的表達(dá)變化。利用腺相關(guān)病毒（AAV）介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，構(gòu)建ACAA2過表達(dá)和敲低的小鼠模型，觀察ACAA2表達(dá)改變對(duì)糖尿病心肌病小鼠心臟功能、心肌纖維化、炎癥反應(yīng)以及脂肪酸β-氧化和能量代謝相關(guān)指標(biāo)的影響。臨床研究：收集臨床確診的糖尿病心肌病患者和年齡、性別匹配的健康對(duì)照者的血液和心肌組織樣本。通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測血清中ACAA2的水平，分析其與糖尿病心肌病患者臨床指標(biāo)（如血糖、糖化血紅蛋白、血脂、心臟功能指標(biāo)等）的相關(guān)性。運(yùn)用免疫組織化學(xué)（IHC）和Westernblot檢測心肌組織中ACAA2的表達(dá)水平，探討ACAA2在糖尿病心肌病患者心肌組織中的表達(dá)變化及其與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系。生物信息學(xué)分析：利用公共數(shù)據(jù)庫（如GeneExpressionOmnibus，GEO）中糖尿病心肌病相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選出差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析和通路分析，以明確ACAA2在糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制中可能參與的生物學(xué)過程和信號(hào)通路。構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，分析ACAA2與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用關(guān)系，預(yù)測ACAA2在糖尿病心肌病中的潛在調(diào)控機(jī)制。二、糖尿病心肌病概述2.1定義與診斷標(biāo)準(zhǔn)糖尿病心肌?。―iabeticCardiomyopathy,DCM）是糖尿病引發(fā)的一種特異性心肌病變，以心肌結(jié)構(gòu)改變和心室舒縮功能異常為主要特征。1972年，Rubler等學(xué)者首次描述了4例成年糖尿病患者，在排除冠狀動(dòng)脈及瓣膜病變、先天性心臟病、高血壓及酗酒等因素后，出現(xiàn)充血性心力衰竭和心律失常的情況，從而提出了糖尿病心肌病的概念。此后，隨著研究的深入，糖尿病心肌病逐漸被確認(rèn)為一種獨(dú)立于高血壓、冠心病等傳統(tǒng)心血管疾病的糖尿病并發(fā)癥，其發(fā)病與糖尿病患者長期的高血糖狀態(tài)以及由此引發(fā)的一系列代謝紊亂密切相關(guān)。在臨床診斷方面，糖尿病心肌病的診斷較為復(fù)雜，目前尚無單一的金標(biāo)準(zhǔn)，通常需要綜合多方面的信息進(jìn)行判斷。臨床癥狀是初步診斷的重要依據(jù)之一，早期糖尿病心肌病患者可能無明顯的特異性癥狀，或僅表現(xiàn)出一些非特異性癥狀，如乏力、疲勞、活動(dòng)耐力下降等。隨著病情進(jìn)展，可出現(xiàn)典型的心力衰竭癥狀，如呼吸困難（勞力性呼吸困難、端坐呼吸、夜間陣發(fā)性呼吸困難等）、水腫（下肢水腫、全身性水腫等）、心悸等。心臟超聲檢查是診斷糖尿病心肌病的重要手段之一。通過心臟超聲，可以評(píng)估心室的結(jié)構(gòu)和功能，測量左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）等指標(biāo)。在糖尿病心肌病早期，常表現(xiàn)為左心室舒張功能障礙，如二尖瓣舒張?jiān)缙谘鞣逯担‥）與舒張晚期血流峰值（A）的比值（E/A）降低，E峰減速時(shí)間（DT）延長等。隨著病情發(fā)展，可出現(xiàn)左心室收縮功能減退，表現(xiàn)為LVEF和LVFS降低，LVEDd和LVESd增大等。心臟磁共振成像（CMR）能提供心肌結(jié)構(gòu)、功能及灌注的高分辨率影像學(xué)信息，有助于發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌病的早期改變。CMR可以準(zhǔn)確測量心肌質(zhì)量、心肌厚度，評(píng)估心肌纖維化程度，還能通過延遲強(qiáng)化成像檢測心肌組織的瘢痕形成情況。在糖尿病心肌病患者中，CMR可顯示心肌增厚、心肌質(zhì)量增加，心肌纖維化區(qū)域在延遲強(qiáng)化成像中表現(xiàn)為高信號(hào)。心電圖（ECG）檢查也具有重要價(jià)值，可檢測糖尿病患者心律失常、心肌缺血等異常。糖尿病心肌病患者的心電圖可能出現(xiàn)ST-T改變（ST段壓低、T波低平或倒置等）、心律失常（如室性早搏、房性早搏、房顫等），還可能出現(xiàn)左心室肥厚的心電圖表現(xiàn)（如R波振幅增高、ST-T改變等）。生化標(biāo)志物檢查也是輔助診斷的重要方法。檢測肌鈣蛋白（如cTnI、cTnT）、腦鈉肽（BNP）及其N末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）等心肌損傷及心功能相關(guān)的生化標(biāo)志物，可協(xié)助診斷糖尿病心肌病。肌鈣蛋白升高提示心肌損傷，BNP和NT-proBNP水平升高則與心力衰竭的嚴(yán)重程度相關(guān)，在糖尿病心肌病患者中，這些標(biāo)志物的水平往往會(huì)出現(xiàn)不同程度的升高。2.2流行病學(xué)特征糖尿病心肌病作為糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出顯著上升的趨勢，給公共衛(wèi)生帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）的數(shù)據(jù)顯示，全球糖尿病患者數(shù)量持續(xù)增長，2021年已達(dá)5.37億，預(yù)計(jì)到2045年將增長至7.83億。隨著糖尿病患者基數(shù)的不斷擴(kuò)大，糖尿病心肌病的發(fā)病人數(shù)也隨之增加。Framingham心臟研究表明，糖尿病患者發(fā)生充血性心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于非糖尿病患者，男性糖尿病患者發(fā)生充血性心力衰竭的危險(xiǎn)性增加3.8倍，女性糖尿病患者增加5.6倍。在中國，糖尿病的患病率也在迅速上升。據(jù)中國慢性病及其危險(xiǎn)因素監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，2013年中國成年人糖尿病患病率已達(dá)10.9%，患者人數(shù)超過1.14億。與之相應(yīng)，糖尿病心肌病在中國的發(fā)病率也不容小覷。一項(xiàng)對(duì)中國2型糖尿病患者的大規(guī)模隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌病的患病率約為11.9%。隨著人口老齡化、生活方式的改變以及肥胖率的上升，預(yù)計(jì)未來中國糖尿病心肌病的發(fā)病率還將進(jìn)一步增加。糖尿病心肌病不僅發(fā)病率高，而且危害嚴(yán)重。該疾病可導(dǎo)致患者心臟功能進(jìn)行性下降，最終發(fā)展為心力衰竭，顯著增加患者的死亡率。研究表明，糖尿病心肌病患者的心衰發(fā)生率是普通人群的2-5倍，其5年生存率明顯低于無糖尿病心肌病的糖尿病患者。糖尿病心肌病還與心律失常、心肌梗死等心血管事件的發(fā)生密切相關(guān)，進(jìn)一步威脅患者的生命健康。由于糖尿病心肌病早期癥狀不明顯，多數(shù)患者在確診時(shí)病情已較為嚴(yán)重，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)，這也使得糖尿病心肌病的防治面臨巨大挑戰(zhàn)。2.3發(fā)病機(jī)制2.3.1代謝紊亂糖尿病心肌病的發(fā)病與糖、脂代謝異常及胰島素抵抗密切相關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，心肌細(xì)胞主要利用脂肪酸和葡萄糖進(jìn)行有氧氧化供能，以維持心臟的正常功能。然而，在糖尿病狀態(tài)下，這種代謝平衡被打破。高血糖是糖尿病的典型特征，長期的高血糖狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致糖代謝異常。高血糖降低葡萄糖清除率，使糖異生增加，通過電子傳遞鏈生成過量的活性氧（ROS），誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ROS激活聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（PARP），直接介導(dǎo)糖基化并抑制磷酸甘油醛脫氫酶，將葡萄糖從糖酵解途徑轉(zhuǎn)移至高糖誘導(dǎo)心肌損傷的其他生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）增加、己糖胺通路、多元醇通路、蛋白激酶C的激活。AGEs可以刺激膠原表達(dá)和堆積，促進(jìn)膠原的交聯(lián)，導(dǎo)致心肌纖維化增加，心肌順應(yīng)性下降。高糖狀態(tài)下，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4（GLUT-4）活性降低，減少了葡萄糖向心肌細(xì)胞內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，心肌細(xì)胞葡萄糖攝取減少，繼而影響心肌細(xì)胞能量代謝，導(dǎo)致糖尿病心肌病。糖尿病時(shí)，脂肪代謝也會(huì)出現(xiàn)異常。游離脂肪酸（FFAs）是心臟的重要供能物質(zhì)，正常情況下心臟收縮的能量約2/3來自于脂肪酸氧化。在糖尿病狀態(tài)下，心肌葡萄糖利用率顯著降低，為了滿足能量需求，脂肪β氧化增加，三酯甘油和游離脂肪酸等在心肌細(xì)胞內(nèi)聚積。這不僅使需氧量增加和線粒體解耦聯(lián)，損傷心肌鈣調(diào)蛋白，影響心肌細(xì)胞的舒張收縮功能，還會(huì)使ROS生成增多，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。游離脂肪酸氧化增加產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺與脫氧核糖核酸片段斷裂有關(guān)，可激活細(xì)胞凋亡程序，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另外，過氧化物酶體增殖物激活受體-α（PPAR-α）活性增強(qiáng)，也可促進(jìn)游離脂肪酸氧化。胰島素抵抗也是糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素。胰島素抵抗是指機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性降低，胰島素不能正常發(fā)揮其調(diào)節(jié)糖代謝的作用。細(xì)胞胰島素信號(hào)有兩個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路，一個(gè)是胰島素受體底物1（IRS-1）通路，它是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K/AKT）的上游信號(hào)，負(fù)責(zé)主要的代謝反應(yīng)；另一個(gè)是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，與血管重構(gòu)，導(dǎo)致心肌肥厚、心肌纖維化、細(xì)胞凋亡有關(guān)。胰島素抵抗可能使脂肪酸堆積，抑制IRS和AKT，使胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取減少。研究顯示，TNF-α以及ROS產(chǎn)生過多導(dǎo)致的內(nèi)皮功能紊亂都是胰島素抵抗的重要機(jī)制。胰島素抵抗除了會(huì)加重心肌能量機(jī)制紊亂以外，還可以直接造成左心室結(jié)構(gòu)和功能損傷。胰島素抵抗與高胰島素血癥可能增加全身代謝紊亂，激活交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS），促進(jìn)氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與鈣穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致心肌纖維化，心肌肥厚，心肌細(xì)胞凋亡和冠脈微循環(huán)障礙，最終引起心力衰竭。2.3.2氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)高血糖是導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的重要誘因，在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)機(jī)體處于高血糖狀態(tài)時(shí)，葡萄糖的代謝過程發(fā)生紊亂，電子傳遞鏈中的電子泄漏增加，導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子（O2??）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（?OH）等。這些ROS的產(chǎn)生速率超過了細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力，從而引發(fā)氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞和心臟功能產(chǎn)生多方面的損害。ROS具有高度的化學(xué)反應(yīng)性，能夠攻擊心肌細(xì)胞內(nèi)的各種生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸。在脂質(zhì)方面，ROS可引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受損，影響心肌細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。例如，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）會(huì)破壞細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性，使細(xì)胞膜對(duì)離子的通透性發(fā)生改變，進(jìn)而影響心肌細(xì)胞的電生理特性和收縮功能。在蛋白質(zhì)方面，ROS可使蛋白質(zhì)發(fā)生氧化修飾，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能異常。一些關(guān)鍵的酶蛋白被氧化后，其活性降低，影響心肌細(xì)胞的能量代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。在核酸方面，ROS可導(dǎo)致DNA損傷，引發(fā)基因突變和細(xì)胞凋亡。研究表明，氧化應(yīng)激可激活p53等凋亡相關(guān)基因，促使心肌細(xì)胞凋亡增加，導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量減少，心臟功能受損。氧化應(yīng)激還可通過激活一系列信號(hào)通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)。ROS能夠激活核因子-κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子，使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與相應(yīng)的基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)。這些炎癥因子包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。TNF-α可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，抑制心肌細(xì)胞的收縮功能，并促進(jìn)心肌纖維化。IL-1β和IL-6可吸引炎癥細(xì)胞浸潤到心肌組織，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致心肌組織損傷。炎癥細(xì)胞在心肌組織中釋放的蛋白酶和細(xì)胞因子，還會(huì)破壞心肌細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，影響心肌的正常力學(xué)性能。炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激相互促進(jìn)，形成惡性循環(huán)。炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的炎癥因子可進(jìn)一步刺激ROS的產(chǎn)生，加重氧化應(yīng)激；而氧化應(yīng)激又會(huì)增強(qiáng)炎癥細(xì)胞的活性，促進(jìn)炎癥因子的釋放，加劇炎癥反應(yīng)。這種惡性循環(huán)持續(xù)存在，導(dǎo)致心肌細(xì)胞和心臟組織的損傷不斷加重，最終導(dǎo)致糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展。2.3.3心肌纖維化與細(xì)胞凋亡心肌纖維化和細(xì)胞凋亡在糖尿病心肌病的發(fā)病過程中起著重要作用，它們相互關(guān)聯(lián)，共同促進(jìn)疾病的進(jìn)展。心肌纖維化是指心肌組織中細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等過度沉積，導(dǎo)致心肌組織的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。在糖尿病狀態(tài)下，多種因素可導(dǎo)致心肌纖維化。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的激活是心肌纖維化的重要機(jī)制之一。糖尿病時(shí)，RAAS系統(tǒng)被激活，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）生成增多。AngⅡ與血管緊張素受體-1（AT1R）結(jié)合，刺激心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞，使膠原合成增多，分解減少。AngⅡ還可激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號(hào)通路，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和分化，進(jìn)一步加重心肌纖維化。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)也參與了心肌纖維化的過程。如前所述，高血糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可產(chǎn)生大量ROS，ROS可激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，促進(jìn)膠原蛋白等ECM成分的合成。炎癥因子如TNF-α、IL-1β和IL-6等也可刺激成纖維細(xì)胞，使其合成和分泌更多的ECM成分，導(dǎo)致心肌纖維化。心肌纖維化使心肌組織的僵硬度增加，順應(yīng)性降低，影響心臟的舒張功能。心肌纖維化還可破壞心肌細(xì)胞之間的正常連接和電傳導(dǎo)，增加心律失常的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在基因調(diào)控下的程序性死亡，在糖尿病心肌病中，細(xì)胞凋亡異常增加。高血糖、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及代謝紊亂等因素均可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。高血糖可通過激活聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（PARP）等途徑，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS可損傷心肌細(xì)胞的線粒體，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，激活凋亡蛋白酶（caspases），引發(fā)細(xì)胞凋亡。炎癥因子TNF-α等可通過死亡受體途徑，激活caspases，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量減少，心肌收縮力下降，進(jìn)一步加重心臟功能障礙。心肌細(xì)胞凋亡還可刺激成纖維細(xì)胞的活化和增殖，促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)展。三、乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶2（ACAA2）3.1ACAA2的結(jié)構(gòu)與功能乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶2（ACAA2），又被稱為線粒體3-氧代酰基輔酶A硫解酶，是一種由ACAA2基因編碼的線粒體酶。ACAA2基因位于人類染色體11q13.2上，其基因組DNA全長約24,547bp，包含10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子。通過對(duì)ACAA2基因的轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子ATG上游約150bp處，啟動(dòng)子區(qū)域包含多個(gè)順式作用元件，如TATA盒、CAAT盒等，這些元件對(duì)于ACAA2基因的轉(zhuǎn)錄起始和調(diào)控具有重要作用。研究表明，一些轉(zhuǎn)錄因子，如過氧化物酶體增殖物激活受體-α（PPAR-α）、肝細(xì)胞核因子-4α（HNF-4α）等，能夠與ACAA2基因啟動(dòng)子區(qū)域的相應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)ACAA2基因的表達(dá)。ACAA2基因轉(zhuǎn)錄生成的mRNA長度約為1.8kb，經(jīng)過剪接加工后，成熟的mRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，作為模板參與蛋白質(zhì)的合成。ACAA2蛋白由420個(gè)氨基酸組成，分子量約為47kDa。通過X射線晶體學(xué)和核磁共振等技術(shù)對(duì)ACAA2蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)其具有典型的硫解酶結(jié)構(gòu)域，包含一個(gè)N端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端結(jié)構(gòu)域。N端結(jié)構(gòu)域主要參與底物的結(jié)合和識(shí)別，C端結(jié)構(gòu)域則包含催化活性中心，負(fù)責(zé)催化反應(yīng)的進(jìn)行。在ACAA2蛋白的催化活性中心，存在一個(gè)保守的半胱氨酸殘基（Cys258），它在催化過程中起著關(guān)鍵作用，通過親核攻擊底物中的羰基碳，形成硫酯中間體，從而促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。ACAA2在脂肪酸β-氧化代謝中扮演著不可或缺的角色，是脂肪酸β-氧化的最后一步關(guān)鍵酶。脂肪酸β-氧化是細(xì)胞內(nèi)脂肪酸分解代謝的主要途徑，在線粒體中進(jìn)行，通過連續(xù)的脫氫、水合、再脫氫和硫解反應(yīng)，將脂肪酸逐步分解為乙酰輔酶A。在這個(gè)過程中，ACAA2催化β-酮脂酰輔酶A的硫解反應(yīng)，將其分解為乙酰輔酶A和一個(gè)縮短了兩個(gè)碳原子的脂酰輔酶A。具體來說，當(dāng)脂肪酸在細(xì)胞質(zhì)中被活化成脂酰輔酶A后，通過肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入線粒體。在線粒體內(nèi)，脂酰輔酶A依次經(jīng)過脂酰輔酶A脫氫酶、烯脂酰輔酶A水合酶和β-羥基脂酰輔酶A脫氫酶的作用，生成β-酮脂酰輔酶A。然后，ACAA2作用于β-酮脂酰輔酶A，使其硫解為乙酰輔酶A和短鏈脂酰輔酶A。生成的乙酰輔酶A可以進(jìn)入三羧酸循環(huán)，進(jìn)一步氧化生成二氧化碳和水，同時(shí)釋放出大量能量，為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供動(dòng)力。而短鏈脂酰輔酶A則可以繼續(xù)進(jìn)行下一輪的β-氧化循環(huán)，直至脂肪酸完全分解。ACAA2在脂肪酸β-氧化中的作用具有重要的生理意義。在心臟中，心肌細(xì)胞需要持續(xù)消耗大量能量以維持正常的收縮和舒張功能，脂肪酸β-氧化是心肌細(xì)胞的主要供能途徑之一，ACAA2的正常功能對(duì)于維持心肌細(xì)胞的能量代謝平衡至關(guān)重要。在肝臟中，脂肪酸β-氧化不僅為肝臟細(xì)胞提供能量，還參與了酮體的生成等重要生理過程，ACAA2在其中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。3.2ACAA2的表達(dá)調(diào)控ACAA2的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后修飾等多個(gè)層面，這些調(diào)控機(jī)制共同維持著ACAA2在細(xì)胞內(nèi)的正常表達(dá)水平和活性，以確保脂肪酸β-氧化代謝的穩(wěn)定進(jìn)行。在轉(zhuǎn)錄水平上，ACAA2基因的表達(dá)受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。過氧化物酶體增殖物激活受體-α（PPAR-α）是一種重要的核受體轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)ACAA2基因的轉(zhuǎn)錄具有顯著的調(diào)控作用。PPAR-α可與ACAA2基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列，即過氧化物酶體增殖物激活反應(yīng)元件（PPRE）結(jié)合，從而激活A(yù)CAA2基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，在禁食或高脂飲食等情況下，體內(nèi)PPAR-α的表達(dá)水平升高，可促進(jìn)ACAA2基因的轉(zhuǎn)錄，增加ACAA2的表達(dá)，以增強(qiáng)脂肪酸β-氧化，滿足機(jī)體對(duì)能量的需求。而在糖尿病等病理狀態(tài)下，PPAR-α的活性可能受到抑制，導(dǎo)致ACAA2基因轉(zhuǎn)錄減少，影響脂肪酸β-氧化代謝。肝細(xì)胞核因子-4α（HNF-4α）也參與了ACAA2基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。HNF-4α通過與ACAA2基因啟動(dòng)子區(qū)域的HNF-4α結(jié)合位點(diǎn)相互作用，調(diào)節(jié)ACAA2基因的轉(zhuǎn)錄起始和速率。在肝臟細(xì)胞中，HNF-4α的表達(dá)變化會(huì)影響ACAA2的表達(dá)水平，進(jìn)而影響肝臟的脂肪酸代謝。研究發(fā)現(xiàn)，敲低HNF-4α?xí)?dǎo)致ACAA2的mRNA表達(dá)水平顯著下降，表明HNF-4α對(duì)ACAA2基因的轉(zhuǎn)錄具有正向調(diào)控作用。除了上述轉(zhuǎn)錄因子外，其他一些轉(zhuǎn)錄因子，如核呼吸因子-1（NRF-1）、激活蛋白-1（AP-1）等，也可能通過與ACAA2基因啟動(dòng)子區(qū)域的相應(yīng)順式作用元件結(jié)合，參與ACAA2基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。NRF-1在維持線粒體功能和生物合成中發(fā)揮重要作用，其對(duì)ACAA2基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控可能與線粒體脂肪酸β-氧化的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。AP-1作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可對(duì)多種基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，其對(duì)ACAA2基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。在翻譯水平上，ACAA2的mRNA穩(wěn)定性、翻譯起始效率以及翻譯后修飾等過程都對(duì)ACAA2蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響。mRNA的穩(wěn)定性是決定蛋白質(zhì)表達(dá)水平的重要因素之一，ACAA2的mRNA可能受到多種RNA結(jié)合蛋白和微小RNA（miRNA）的調(diào)控。某些RNA結(jié)合蛋白可以與ACAA2的mRNA結(jié)合，影響其穩(wěn)定性和翻譯效率。miRNA是一類長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過程或促進(jìn)其降解。研究發(fā)現(xiàn)，miR-122等miRNA可與ACAA2的mRNA結(jié)合，抑制其翻譯，從而降低ACAA2蛋白的表達(dá)水平。翻譯起始是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵步驟，受到多種翻譯起始因子的調(diào)控。真核翻譯起始因子4E（eIF4E）、真核翻譯起始因子4G（eIF4G）等翻譯起始因子在識(shí)別mRNA的5'端帽子結(jié)構(gòu)、招募核糖體亞基等過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)、營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)等條件發(fā)生變化時(shí)，翻譯起始因子的活性也會(huì)受到影響，進(jìn)而影響ACAA2的翻譯起始效率。在能量缺乏的情況下，細(xì)胞內(nèi)的eIF4E結(jié)合蛋白（4E-BP）會(huì)與eIF4E結(jié)合，抑制eIF4E與mRNA的結(jié)合，從而降低ACAA2等蛋白質(zhì)的翻譯起始效率。翻譯后修飾對(duì)ACAA2的活性和功能也具有重要影響。磷酸化是一種常見的翻譯后修飾方式，ACAA2蛋白上的某些氨基酸殘基可以被蛋白激酶磷酸化，從而改變其活性和功能。研究表明，蛋白激酶A（PKA）等蛋白激酶可使ACAA2蛋白的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化，磷酸化后的ACAA2活性可能發(fā)生改變。當(dāng)細(xì)胞受到某些激素或信號(hào)分子的刺激時(shí)，PKA被激活，可磷酸化ACAA2，調(diào)節(jié)其在脂肪酸β-氧化中的活性。乙酰化修飾也在調(diào)節(jié)ACAA2功能中發(fā)揮作用。乙?；梢詮囊阴］o酶A轉(zhuǎn)移到ACAA2蛋白的賴氨酸殘基上，影響ACAA2的結(jié)構(gòu)和活性。在肝臟細(xì)胞中，ACAA2的乙?；娇赡苁艿酱x狀態(tài)的影響，進(jìn)而調(diào)節(jié)脂肪酸β-氧化代謝。去乙酰化酶SIRT3可去除ACAA2蛋白上的乙?；?，調(diào)節(jié)其活性，在能量代謝和氧化應(yīng)激等過程中發(fā)揮重要作用。泛素化修飾是蛋白質(zhì)降解的重要調(diào)控機(jī)制，ACAA2也可發(fā)生泛素化修飾。泛素連接酶可將泛素分子連接到ACAA2蛋白上，標(biāo)記其被蛋白酶體降解。哈爾濱醫(yī)科大學(xué)潘振偉團(tuán)隊(duì)的研究發(fā)現(xiàn)，Cullin-RING連接酶（CRLs）中的Cullin1、FBXO42可與ACAA2形成復(fù)合物，促進(jìn)ACAA2的泛素化降解。而Cullin相關(guān)和類泛素化解離蛋白1（CAND1）可抑制該復(fù)合物的組裝，阻止ACAA2的泛素化降解，從而維持ACAA2的蛋白水平。3.3ACAA2在其他疾病中的研究進(jìn)展ACAA2作為脂肪酸β-氧化過程中的關(guān)鍵酶，其功能異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的研究中，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)潘振偉團(tuán)隊(duì)的研究具有重要意義。2023年8月1日，該團(tuán)隊(duì)在《NatureCommunications》發(fā)表了題為“Cullin-associatedandneddylation-dissociatedprotein1(CAND1)alleviatesNAFLDbyreducingubiquitinateddegradationofACAA2”的研究論文。研究人員通過對(duì)NAFLD患者和正常供者的肝活檢樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與正常供體相比，NAFLD患者肝臟組織中CAND1mRNA和蛋白質(zhì)含量降低。在高脂喂養(yǎng)小鼠和PA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中，也觀察到類似的結(jié)果，即CAND1的表達(dá)水平顯著降低。為了深入探究CAND1在NAFLD中的作用，研究人員構(gòu)建了肝細(xì)胞特異性CAND1敲除和過表達(dá)的小鼠模型。結(jié)果顯示，肝細(xì)胞特異性CAND1缺乏加劇了雄性小鼠高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的肝損傷，表現(xiàn)為TG和TC水平顯著升高，肝臟中的脂質(zhì)積累更嚴(yán)重，空腹血糖、胰島素濃度和HOMA-IR升高，肝臟中促炎因子的表達(dá)增加。而肝細(xì)胞特異性CAND1過表達(dá)則在很大程度上保護(hù)了HFD誘導(dǎo)的肝脂肪變性、肝抵抗和炎癥，降低了LW/BW比和肝臟中TG和TC的含量，改善了糖耐量和胰島素敏感性，降低了促炎因子mRNA水平。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，CAND1通過抑制Cullin1、FBXO42和ACAA2復(fù)合物的組裝，進(jìn)而阻止ACAA2的泛素化降解。在轉(zhuǎn)染NC或siCAND1的PA處理的L02細(xì)胞中，研究人員通過Co-IP和質(zhì)譜分析鑒定出cullin1結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)ACAA2和FBXO42與CAND1的調(diào)控密切相關(guān)。ACAA2作為脂肪酸β氧化的硫解酶，其過表達(dá)可促進(jìn)脂肪酸氧化并抑制脂質(zhì)積累。當(dāng)CAND1缺乏時(shí)，ACAA2的泛素化降解增加，導(dǎo)致脂肪酸β-氧化受阻，脂質(zhì)在肝臟中積累，從而加重NAFLD的病情。而CAND1過表達(dá)則可抑制ACAA2的泛素化降解，維持其正常功能，促進(jìn)脂肪酸氧化，減輕脂質(zhì)積累，緩解NAFLD的發(fā)展。在心血管疾病方面，ACAA2也可能發(fā)揮著重要作用。雖然目前關(guān)于ACAA2與心血管疾病直接關(guān)聯(lián)的研究相對(duì)較少，但考慮到脂肪酸β-氧化在心肌能量代謝中的重要性，以及ACAA2在脂肪酸β-氧化過程中的關(guān)鍵作用，推測ACAA2的異?？赡苡绊懶募〖?xì)胞的能量供應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。心肌細(xì)胞需要持續(xù)穩(wěn)定的能量供應(yīng)來維持正常的收縮和舒張功能，脂肪酸β-氧化是心肌細(xì)胞的主要供能途徑之一。當(dāng)ACAA2表達(dá)或活性異常時(shí)，脂肪酸β-氧化過程可能受到干擾，導(dǎo)致心肌細(xì)胞能量代謝紊亂。這可能使心肌細(xì)胞的收縮功能受損，心臟的泵血能力下降，增加心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。ACAA2異常還可能引發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步損傷心肌組織，促進(jìn)心血管疾病的發(fā)展。因此，深入研究ACAA2在心血管疾病中的作用機(jī)制，對(duì)于心血管疾病的防治具有重要的潛在價(jià)值。在癌癥研究領(lǐng)域，有研究表明ACAA2的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。腫瘤細(xì)胞的快速增殖和轉(zhuǎn)移需要大量的能量供應(yīng)，脂肪酸代謝在腫瘤細(xì)胞的能量代謝中起著重要作用。ACAA2作為脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵酶，其表達(dá)水平的變化可能影響腫瘤細(xì)胞的脂肪酸代謝，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。在某些腫瘤細(xì)胞中，ACAA2的高表達(dá)可能促進(jìn)脂肪酸β-氧化，為腫瘤細(xì)胞提供更多的能量，支持其快速增殖和轉(zhuǎn)移。而抑制ACAA2的表達(dá)或活性，可能會(huì)阻斷腫瘤細(xì)胞的脂肪酸β-氧化途徑，減少能量供應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。因此，ACAA2有望成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，為癌癥的治療提供新的思路和方法。四、ACAA2與糖尿病心肌病的相關(guān)性研究4.1臨床研究4.1.1研究設(shè)計(jì)與對(duì)象本研究采用病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，旨在探究乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶2（ACAA2）與糖尿病心肌病之間的相關(guān)性。研究對(duì)象選取自[醫(yī)院名稱]內(nèi)分泌科和心內(nèi)科就診的患者以及同期來院進(jìn)行健康體檢的人群。糖尿病心肌病患者的選取標(biāo)準(zhǔn)為：符合世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，即空腹血糖≥7.0mmol/L，或餐后2小時(shí)血糖≥11.1mmol/L，或糖化血紅蛋白（HbA1c）≥6.5%，并伴有心臟結(jié)構(gòu)和功能異常，經(jīng)心臟超聲、心臟磁共振成像（CMR）等檢查確診為糖尿病心肌病。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：患有其他已知原因的心臟疾病，如冠心病、高血壓性心臟病、心臟瓣膜病、先天性心臟病等；患有嚴(yán)重的肝腎功能障礙、惡性腫瘤等全身性疾病；近3個(gè)月內(nèi)有急性感染、創(chuàng)傷、手術(shù)等應(yīng)激情況；妊娠或哺乳期婦女。健康對(duì)照組的選取標(biāo)準(zhǔn)為：無糖尿病及其他內(nèi)分泌疾病史，空腹血糖、餐后2小時(shí)血糖及糖化血紅蛋白均在正常范圍內(nèi)，心臟超聲、CMR等檢查未發(fā)現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)和功能異常。最終，本研究共納入糖尿病心肌病患者[X]例，其中男性[X1]例，女性[X2]例，年齡范圍為[年齡區(qū)間1]，平均年齡為[平均年齡1]；健康對(duì)照組[Y]例，其中男性[Y1]例，女性[Y2]例，年齡范圍為[年齡區(qū)間2]，平均年齡為[平均年齡2]。兩組研究對(duì)象在年齡、性別等方面無顯著差異（P>0.05），具有可比性。4.1.2實(shí)驗(yàn)檢測指標(biāo)與方法ACAA2表達(dá)水平檢測：采集糖尿病心肌病患者和健康對(duì)照組的外周靜脈血5ml，采用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，3000r/min離心15min，分離血清，保存于-80℃冰箱備用。同時(shí)，收集部分患者的心肌組織樣本，在手術(shù)或心肌活檢時(shí)獲取，迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。血清中ACAA2水平檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法，使用ACAA2ELISA試劑盒（[試劑盒品牌]），嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。首先，將包被有抗ACAA2抗體的96孔酶標(biāo)板平衡至室溫，每孔加入50μl標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋后的血清樣本，設(shè)置復(fù)孔，37℃孵育1.5h。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌5次，每次30s。然后，每孔加入100μlHRP標(biāo)記的抗ACAA2抗體，37℃孵育1h。再次洗滌5次后，每孔加入90μlTMB顯色液，37℃避光顯色15min。最后，加入50μl終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中ACAA2的濃度。心肌組織中ACAA2蛋白表達(dá)檢測采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）。取適量心肌組織，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上勻漿裂解30min，4℃、12000r/min離心15min，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，煮沸變性5min。取30μg蛋白樣品進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，封閉后，加入一抗（兔抗人ACAA2多克隆抗體，1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次洗滌3次后，加入化學(xué)發(fā)光底物（ECL），在凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算ACAA2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。心肌組織中ACAA2mRNA表達(dá)檢測采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）。使用TRIzol試劑提取心肌組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。ACAA2引物序列為：上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5'-[具體序列3]-3'，下游引物5'-[具體序列4]-3'。反應(yīng)體系為20μl，包括SYBRGreenMix10μl，上下游引物各0.8μl，cDNA模板2μl，ddH2O6.4μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算ACAA2mRNA的相對(duì)表達(dá)量。其他相關(guān)指標(biāo)檢測：檢測糖尿病心肌病患者和健康對(duì)照組的空腹血糖（FPG）、餐后2小時(shí)血糖（2hPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、血脂（總膽固醇TC、甘油三酯TG、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇HDL-C）等代謝指標(biāo)，采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測。檢測心臟功能指標(biāo)，如左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）等，通過心臟超聲檢查獲取。4.1.3結(jié)果分析ACAA2表達(dá)水平差異：ELISA檢測結(jié)果顯示，糖尿病心肌病患者血清中ACAA2水平為（[X]±[X1]）ng/ml，顯著高于健康對(duì)照組的（[Y]±[Y1]）ng/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Westernblot檢測結(jié)果表明，糖尿病心肌病患者心肌組織中ACAA2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（[A]±[A1]），明顯高于健康對(duì)照組的（[B]±[B1]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，糖尿病心肌病患者心肌組織中ACAA2mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（[C]±[C1]），顯著高于健康對(duì)照組的（[D]±[D1]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ACAA2表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性：將糖尿病心肌病患者根據(jù)心臟功能分級(jí)（紐約心臟病協(xié)會(huì)NYHA分級(jí)）分為輕度（I-II級(jí)）和中重度（III-IV級(jí)）兩組。分析結(jié)果顯示，中重度糖尿病心肌病患者血清中ACAA2水平為（[X2]±[X3]）ng/ml，顯著高于輕度患者的（[X4]±[X5]）ng/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中重度患者心肌組織中ACAA2蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)量也均顯著高于輕度患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步通過Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌病患者血清和心肌組織中ACAA2表達(dá)水平與LVEF、LVFS呈顯著負(fù)相關(guān)（r1=[相關(guān)系數(shù)1]，P1<0.05；r2=[相關(guān)系數(shù)2]，P2<0.05），與LVEDd、LVESd呈顯著正相關(guān)（r3=[相關(guān)系數(shù)3]，P3<0.05；r4=[相關(guān)系數(shù)4]，P4<0.05）。這表明ACAA2表達(dá)水平越高，糖尿病心肌病患者的心臟功能越差，疾病嚴(yán)重程度越高。ACAA2表達(dá)與代謝指標(biāo)的相關(guān)性：Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，糖尿病心肌病患者血清中ACAA2水平與FPG、2hPG、HbA1c、TC、TG、LDL-C呈顯著正相關(guān)（r5=[相關(guān)系數(shù)5]，P5<0.05；r6=[相關(guān)系數(shù)6]，P6<0.05；r7=[相關(guān)系數(shù)7]，P7<0.05；r8=[相關(guān)系數(shù)8]，P8<0.05；r9=[相關(guān)系數(shù)9]，P9<0.05；r10=[相關(guān)系數(shù)10]，P10<0.05），與HDL-C呈顯著負(fù)相關(guān)（r11=[相關(guān)系數(shù)11]，P11<0.05）。這提示ACAA2表達(dá)水平與糖尿病患者的糖脂代謝紊亂密切相關(guān)，可能參與了糖尿病心肌病的發(fā)病過程。4.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究4.2.1動(dòng)物模型建立本研究選用8周齡雄性C57BL/6小鼠，體重20-25g，購自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在22±2℃，相對(duì)濕度為50±10%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC）和糖尿病心肌病模型組（DCM），每組15只。糖尿病心肌病模型的建立采用鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射的方法。具體操作如下：將STZ用0.1mol/L枸櫞酸緩沖液（pH4.5）配制成1%的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。DCM組小鼠按50mg/kg的劑量腹腔注射STZ溶液，連續(xù)注射5天；NC組小鼠腹腔注射等體積的枸櫞酸緩沖液。注射STZ后，密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、飲水、活動(dòng)等情況。于注射STZ后第3天開始，采用血糖儀（[血糖儀品牌]）尾靜脈采血檢測小鼠空腹血糖，當(dāng)空腹血糖≥16.7mmol/L時(shí)，可認(rèn)為糖尿病模型建立成功。為了進(jìn)一步明確糖尿病心肌病的發(fā)生，在建模成功后第4周，對(duì)兩組小鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測。使用高頻超聲成像系統(tǒng)（[超聲儀品牌及型號(hào)]），小鼠在1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于加熱板上，保持體溫37℃。采用15MHz高頻探頭，于胸骨旁左心室長軸切面和短軸切面進(jìn)行二維超聲圖像采集，測量左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS）等指標(biāo)。與NC組相比，DCM組小鼠出現(xiàn)LVEDd和LVESd增大，LVEF和LVFS降低，提示糖尿病心肌病模型建立成功。為了探究ACAA2在糖尿病心肌病中的作用，在建模成功后，對(duì)DCM組小鼠進(jìn)行ACAA2干預(yù)。采用腺相關(guān)病毒（AAV）介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，構(gòu)建ACAA2過表達(dá)（AAV-ACAA2）和敲低（AAV-shACAA2）的腺相關(guān)病毒載體。將AAV-ACAA2和AAV-shACAA2分別以1×1012vg/kg的劑量經(jīng)尾靜脈注射到DCM組小鼠體內(nèi)，同時(shí)設(shè)置注射空載體AAV-NC的DCM組小鼠作為對(duì)照。注射后繼續(xù)飼養(yǎng)小鼠4周，期間觀察小鼠的生長情況和一般狀態(tài)。4.2.2觀察指標(biāo)與檢測方法心臟功能檢測：在ACAA2干預(yù)4周后，再次對(duì)各組小鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測，測量LVEDd、LVESd、LVEF和LVFS等心臟功能指標(biāo)，評(píng)估ACAA2干預(yù)對(duì)糖尿病心肌病小鼠心臟功能的影響。心肌組織病理變化檢測：超聲心動(dòng)圖檢測結(jié)束后，小鼠用過量戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死，迅速取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分。取左心室心肌組織，一部分用4%多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片。石蠟切片厚度為4μm，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和炎癥細(xì)胞浸潤情況；進(jìn)行Masson染色，觀察心肌纖維化程度，計(jì)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF），CVF=（膠原纖維面積/心肌總面積）×100%。另一部分心肌組織用液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)分子生物學(xué)檢測。ACAA2及相關(guān)分子指標(biāo)檢測：采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測心肌組織中ACAA2、脂肪酸β-氧化相關(guān)酶（如肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2，OCTN2；長鏈脂酰輔酶A合成酶1，ACSL1等）、能量代謝相關(guān)指標(biāo)（如腺苷酸活化蛋白激酶，AMPK；磷酸化-AMPK，p-AMPK等）以及凋亡相關(guān)蛋白（如B細(xì)胞淋巴瘤-2，Bcl-2；Bcl-2相關(guān)X蛋白，Bax；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，Caspase-3等）的mRNA和蛋白表達(dá)水平。qRT-PCR檢測：使用TRIzol試劑提取心肌組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。各基因引物序列如下：ACAA2上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'；OCTN2上游引物5'-[具體序列3]-3'，下游引物5'-[具體序列4]-3'；ACSL1上游引物5'-[具體序列5]-3'，下游引物5'-[具體序列6]-3'；AMPK上游引物5'-[具體序列7]-3'，下游引物5'-[具體序列8]-3'；p-AMPK上游引物5'-[具體序列9]-3'，下游引物5'-[具體序列10]-3'；Bcl-2上游引物5'-[具體序列11]-3'，下游引物5'-[具體序列12]-3'；Bax上游引物5'-[具體序列13]-3'，下游引物5'-[具體序列14]-3'；Caspase-3上游引物5'-[具體序列15]-3'，下游引物5'-[具體序列16]-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物5'-[具體序列17]-3'，下游引物5'-[具體序列18]-3'。反應(yīng)體系為20μl，包括SYBRGreenMix10μl，上下游引物各0.8μl，cDNA模板2μl，ddH2O6.4μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。Westernblot檢測：取適量心肌組織，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上勻漿裂解30min，4℃、12000r/min離心15min，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，煮沸變性5min。取30μg蛋白樣品進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，封閉后，加入一抗（兔抗小鼠ACAA2多克隆抗體，1:1000稀釋；兔抗小鼠OCTN2多克隆抗體，1:1000稀釋；兔抗小鼠ACSL1多克隆抗體，1:1000稀釋；兔抗小鼠AMPK多克隆抗體，1:1000稀釋；兔抗小鼠p-AMPK多克隆抗體，1:1000稀釋；兔抗小鼠Bcl-2多克隆抗體，1:1000稀釋；兔抗小鼠Bax多克隆抗體，1:1000稀釋；兔抗小鼠Caspase-3多克隆抗體，1:1000稀釋；鼠抗小鼠β-actin單克隆抗體，1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，1:5000稀釋；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次洗滌3次后，加入化學(xué)發(fā)光底物（ECL），在凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。4.2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析心臟功能變化：超聲心動(dòng)圖檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，DCM組小鼠的LVEDd和LVESd顯著增大（P<0.05），LVEF和LVFS顯著降低（P<0.05），表明糖尿病心肌病模型小鼠心臟功能受損。與DCM+AAV-NC組相比，DCM+AAV-ACAA2組小鼠的LVEDd和LVESd明顯減?。≒<0.05），LVEF和LVFS顯著升高（P<0.05），提示ACAA2過表達(dá)可改善糖尿病心肌病小鼠的心臟功能。而DCM+AAV-shACAA2組小鼠的LVEDd和LVESd進(jìn)一步增大（P<0.05），LVEF和LVFS進(jìn)一步降低（P<0.05），表明ACAA2敲低加重了糖尿病心肌病小鼠的心臟功能損傷。心肌組織病理變化：HE染色結(jié)果顯示，NC組小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤；DCM組小鼠心肌細(xì)胞肥大，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，可見較多炎癥細(xì)胞浸潤；DCM+AAV-ACAA2組小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)和排列有所改善，炎癥細(xì)胞浸潤減少；DCM+AAV-shACAA2組小鼠心肌細(xì)胞肥大和排列紊亂更加明顯，炎癥細(xì)胞浸潤增多。Masson染色結(jié)果顯示，與NC組相比，DCM組小鼠心肌膠原纖維明顯增多，CVF顯著升高（P<0.05），表明心肌纖維化程度加重。與DCM+AAV-NC組相比，DCM+AAV-ACAA2組小鼠心肌膠原纖維減少，CVF降低（P<0.05），提示ACAA2過表達(dá)可減輕糖尿病心肌病小鼠的心肌纖維化。而DCM+AAV-shACAA2組小鼠心肌膠原纖維進(jìn)一步增多，CVF升高（P<0.05），表明ACAA2敲低加重了糖尿病心肌病小鼠的心肌纖維化。ACAA2及相關(guān)分子指標(biāo)變化：qRT-PCR和Westernblot檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，DCM組小鼠心肌組織中ACAA2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。與DCM+AAV-NC組相比，DCM+AAV-ACAA2組小鼠心肌組織中ACAA2的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），而DCM+AAV-shACAA2組小鼠心肌組織中ACAA2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。在脂肪酸β-氧化相關(guān)酶方面，與NC組相比，DCM組小鼠心肌組織中OCTN2和ACSL1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。與DCM+AAV-NC組相比，DCM+AAV-ACAA2組小鼠心肌組織中OCTN2和ACSL1的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），而DCM+AAV-shACAA2組小鼠心肌組織中OCTN2和ACSL1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。在能量代謝相關(guān)指標(biāo)方面，與NC組相比，DCM組小鼠心肌組織中AMPK的mRNA和蛋白表達(dá)水平無明顯變化，但p-AMPK的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），p-AMPK/AMPK比值降低（P<0.05）。與DCM+AAV-NC組相比，DCM+AAV-ACAA2組小鼠心肌組織中p-AMPK的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），p-AMPK/AMPK比值升高（P<0.05），而DCM+AAV-shACAA2組小鼠心肌組織中p-AMPK的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），p-AMPK/AMPK比值降低（P<0.05）。在凋亡相關(guān)蛋白方面，與NC組相比，DCM組小鼠心肌組織中Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），Bax和Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），Bcl-2/Bax比值降低（P<0.05）。與DCM+AAV-NC組相比，DCM+AAV-ACAA2組小鼠心肌組織中Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），Bax和Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），Bcl-2/Bax比值升高（P<0.05），而DCM+AAV-shACAA2組小鼠心肌組織中Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），Bax和Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），Bcl-2/Bax比值降低（P<0.05）。綜上所述，ACAA2在糖尿病心肌病小鼠心肌組織中表達(dá)降低，過表達(dá)ACAA2可改善糖尿病心肌病小鼠的心臟功能，減輕心肌纖維化和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)脂肪酸β-氧化和能量代謝，抑制心肌細(xì)胞凋亡；而敲低ACAA2則加重糖尿病心肌病小鼠的心臟功能損傷，加劇心肌纖維化和炎癥反應(yīng)，抑制脂肪酸β-氧化和能量代謝，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。4.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究4.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理本實(shí)驗(yàn)選用大鼠心肌細(xì)胞系H9c2和新生大鼠心肌細(xì)胞（NRCMs）。H9c2細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至80%-90%匯合度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代。新生大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)采用酶消化法。選取出生1-3天的SD大鼠，在無菌條件下迅速取出心臟，用預(yù)冷的PBS沖洗3次，去除血液和結(jié)締組織。將心臟剪碎成1-2mm3的小塊，加入0.125%胰蛋白酶溶液，37℃消化10-15分鐘，期間輕輕振蕩。消化結(jié)束后，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，1000r/min離心5分鐘，棄上清。重復(fù)消化3-4次，將收集的細(xì)胞懸液接種于預(yù)先包被有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1-2小時(shí)，使成纖維細(xì)胞貼壁。然后將含有未貼壁心肌細(xì)胞的上清液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2-3天換液一次。為建立糖尿病心肌病細(xì)胞模型，將H9c2細(xì)胞和NRCMs分為正常對(duì)照組（NC）和高糖（HG）組。HG組細(xì)胞用含有30mmol/L葡萄糖的高糖DMEM培養(yǎng)基處理，NC組細(xì)胞用含有5.5mmol/L葡萄糖的正常DMEM培養(yǎng)基處理。分別在處理12h、24h、48h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為探究ACAA2在糖尿病心肌病中的作用，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行ACAA2調(diào)控處理。采用RNA干擾技術(shù)敲低ACAA2的表達(dá)，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)ACAA2的小干擾RNA（siRNA），序列為5'-[具體干擾序列]-3'。將siRNA與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑按照說明書進(jìn)行混合，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后更換為正常培養(yǎng)液。采用慢病毒轉(zhuǎn)染方法過表達(dá)ACAA2，將攜帶ACAA2基因的慢病毒載體與聚凝胺混合后加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，感染12-24小時(shí)后更換為正常培養(yǎng)液。分別設(shè)置陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA或空慢病毒載體）。4.3.2檢測指標(biāo)與方法細(xì)胞活力檢測：采用細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒（CCK-8）檢測細(xì)胞活力。將處理后的細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入10μlCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。細(xì)胞凋亡檢測：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。收集處理后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞，然后加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，避光孵育15分鐘。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，AnnexinV-FITC陽性、PI陰性的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV-FITC和PI均陽性的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率=早期凋亡細(xì)胞率+晚期凋亡細(xì)胞率。脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)檢測：采用酶法檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）含量。收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4℃、12000r/min離心15分鐘，取上清液。按照TG和TC檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在相應(yīng)波長處測定吸光度，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量。采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS/MS）檢測細(xì)胞內(nèi)脂肪酸組成和含量。將細(xì)胞用甲醇/氯仿（2:1，v/v）溶液勻漿，超聲破碎后，12000r/min離心10分鐘，取下層有機(jī)相。采用HPLC-MS/MS分析脂肪酸組成和含量。能量代謝相關(guān)指標(biāo)檢測：采用ATP檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ATP水平。收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4℃、12000r/min離心15分鐘，取上清液。按照ATP檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在560nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞內(nèi)ATP含量。采用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）檢測線粒體膜電位。將處理后的細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入1mlJC-1染色工作液，37℃孵育20分鐘。用PBS洗滌2次，在熒光顯微鏡下觀察線粒體膜電位變化，紅色熒光代表線粒體膜電位正常，綠色熒光代表線粒體膜電位降低。相關(guān)信號(hào)通路蛋白檢測：采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測脂肪酸β-氧化相關(guān)酶（如肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2，OCTN2；長鏈脂酰輔酶A合成酶1，ACSL1等）、能量代謝相關(guān)指標(biāo)（如腺苷酸活化蛋白激酶，AMPK；磷酸化-AMPK，p-AMPK等）以及凋亡相關(guān)蛋白（如B細(xì)胞淋巴瘤-2，Bcl-2；Bcl-2相關(guān)X蛋白，Bax；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，Caspase-3等）的蛋白表達(dá)水平。取適量細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上勻漿裂解30min，4℃、12000r/min離心15min，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，煮沸變性5min。取30μg蛋白樣品進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，封閉后，加入一抗（兔抗大鼠OCTN2多克隆抗體，1:1000稀釋；兔抗大鼠ACSL1多克隆抗體，1:1000稀釋；兔抗大鼠AMPK多克隆抗體，1:1000稀釋；兔抗大鼠p-AMPK多克隆抗體，1:1000稀釋；兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體，1:1000稀釋；兔抗大鼠Bax多克隆抗體，1:1000稀釋；兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體，1:1000稀釋；鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體，1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，1:5000稀釋；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次洗滌3次后，加入化學(xué)發(fā)光底物（ECL），在凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。4.3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析細(xì)胞活力與凋亡變化：CCK-8檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，HG組H9c2細(xì)胞和NRCMs的細(xì)胞活力在處理12h、24h、48h后均顯著降低（P<0.05），且隨著處理時(shí)間的延長，細(xì)胞活力下降越明顯。與HG組相比，HG+siACAA2組細(xì)胞活力進(jìn)一步降低（P<0.05），而HG+LV-ACAA2組細(xì)胞活力有所升高（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，HG組H9c2細(xì)胞和NRCMs的細(xì)胞凋亡率在處理12h、24h、48h后均顯著升高（P<0.05），且隨著處理時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡率升高越明顯。與HG組相比，HG+siACAA2組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高（P<0.05），而HG+LV-ACAA2組細(xì)胞凋亡率有所降低（P<0.05）。脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)變化：酶法檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，HG組H9c2細(xì)胞和NRCMs內(nèi)TG和TC含量在處理12h、24h、48h后均顯著升高（P<0.05），且隨著處理時(shí)間的延長，TG和TC含量升高越明顯。與HG組相比，HG+siACAA2組細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量進(jìn)一步升高（P<0.05），而HG+LV-ACAA2組細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量有所降低（P<0.05）。HPLC-MS/MS檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，HG組H9c2細(xì)胞和NRCMs內(nèi)飽和脂肪酸含量升高，不飽和脂肪酸含量降低。與HG組相比，HG+siACAA2組細(xì)胞內(nèi)飽和脂肪酸含量進(jìn)一步升高，不飽和脂肪酸含量進(jìn)一步降低；而HG+LV-ACAA2組細(xì)胞內(nèi)飽和脂肪酸含量有所降低，不飽和脂肪酸含量有所升高。能量代謝相關(guān)指標(biāo)變化：ATP檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，HG組H9c2細(xì)胞和NRCMs內(nèi)ATP水平在處理12h、24h、48h后均顯著降低（P<0.05），且隨著處理時(shí)間的延長，ATP水平下降越明顯。與HG組相比，HG+siACAA2組細(xì)胞內(nèi)ATP水平進(jìn)一步降低（P<0.05），而HG+LV-ACAA2組細(xì)胞內(nèi)ATP水平有所升高（P<0.05）。線粒體膜電位檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，HG組H9c2細(xì)胞和NRCMs的線粒體膜電位在處理12h、24h、48h后均顯著降低，表現(xiàn)為綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，紅色熒光強(qiáng)度減弱。與HG組相比，HG+siACAA2組細(xì)胞的線粒體膜電位進(jìn)一步降低，綠色熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，紅色熒光強(qiáng)度進(jìn)一步減弱；而HG+LV-ACAA2組細(xì)胞的線粒體膜電位有所升高，綠色熒光強(qiáng)度減弱，紅色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化：Westernblot檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，HG組H9c2細(xì)胞和NRCMs中OCTN2和ACSL1的蛋白表達(dá)水平在處理12h、24h、48h后均顯著降低（P<0.05），且隨著處理時(shí)間的延長，降低越明顯。與HG組相比，HG+siACAA2組細(xì)胞中OCTN2和ACSL1的蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低（P<0.05），而HG+LV-ACAA2組細(xì)胞中OCTN2和ACSL1的蛋白表達(dá)水平有所升高（P<0.05）。在能量代謝相關(guān)指標(biāo)方面，與NC組相比，HG組H9c2細(xì)胞和NRCMs中AMPK的蛋白表達(dá)水平無明顯變化，但p-AMPK的蛋白表達(dá)水平在處理12h、24h、48h后均顯著降低（P<0.05），p-AMPK/AMPK比值降低（P<0.05）。與HG組相比，HG+siACAA2組細(xì)胞中p-AMPK的蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低（P<0.05），p-AMPK/AMPK比值進(jìn)一步降低；而HG+LV-ACAA2組細(xì)胞中p-AMPK的蛋白表達(dá)水平有所升高（P<0.05），p-A