下調(diào)長鏈非編碼RNAHOTAIR：對人宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的抑制及機制探究一、引言1.1研究背景與意義宮頸癌是全球范圍內(nèi)嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在女性惡性腫瘤中位居前列。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，2020年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例約60.4萬例，死亡病例約34.2萬例。在我國，宮頸癌同樣是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，嚴重影響著廣大女性的生活質(zhì)量和生命健康。近年來，雖然宮頸癌的篩查和治療技術(shù)取得了一定的進展，但對于晚期或復發(fā)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者，治療效果仍不理想，其5年生存率較低。因此，深入探究宮頸癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和策略，對于提高宮頸癌的治療效果和患者生存率具有重要意義。長鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的非編碼RNA分子，不具備蛋白質(zhì)編碼能力，但在基因表達調(diào)控、細胞分化、胚胎發(fā)育等多種生物學過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。隨著研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明lncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中扮演著重要角色，可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的生物學行為調(diào)控。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOXtranscriptantisenseRNA，HOTAIR）是一種研究較為廣泛的lncRNA，其長度約為2.2kb，位于HOXc基因簇的12q13染色體區(qū)域內(nèi)，從該簇的反義鏈轉(zhuǎn)錄。HOTAIR通過與多梳抑制復合物2（PRC2）和組蛋白去甲基化酶1（LSD1）相互作用，調(diào)控與腫瘤細胞增殖、凋亡或轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的組蛋白修飾，從而影響這些基因的轉(zhuǎn)錄沉默或激活，最終參與腫瘤細胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移過程。大量研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在多種惡性腫瘤中異常高表達，包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌等，且其高表達與腫瘤的不良預后密切相關(guān)。在宮頸癌的研究中，HOTAIR同樣備受關(guān)注。已有研究表明，HOTAIR在宮頸癌組織和細胞系中顯著高表達，其表達水平與宮頸癌患者的臨床分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。進一步的功能研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR通過調(diào)控一系列下游靶基因和信號通路，促進宮頸癌細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，抑制細胞凋亡，從而在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮癌基因的作用。然而，目前對于HOTAIR在宮頸癌中的具體作用機制尚未完全明確，仍存在許多亟待解決的問題。下調(diào)HOTAIR的表達為宮頸癌的治療提供了新的潛在策略。通過抑制HOTAIR的功能，可以阻斷其對下游靶基因和信號通路的激活，從而抑制宮頸癌細胞的惡性生物學行為，為宮頸癌的治療開辟新的途徑。深入研究下調(diào)HOTAIR對人宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的抑制作用及機制，不僅有助于揭示宮頸癌的發(fā)病機制，還可能為臨床治療提供新的靶點和方法，具有重要的理論意義和臨床應用價值。一方面，從理論層面來看，進一步明確HOTAIR在宮頸癌中的作用機制，能夠豐富我們對腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機制的認識，為腫瘤生物學領(lǐng)域的研究提供新的思路和方向。另一方面，在臨床實踐中，以HOTAIR為靶點開發(fā)新的治療策略，有望提高宮頸癌的治療效果，改善患者的預后，減輕患者的痛苦和社會的醫(yī)療負擔，具有重要的現(xiàn)實意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對于HOTAIR與宮頸癌關(guān)系的研究開展較早且較為深入。Rinn等首次發(fā)現(xiàn)HOTAIR在轉(zhuǎn)移的乳腺癌中高表達后，學者們開始關(guān)注其在其他腫瘤中的作用，其中就包括宮頸癌。Kim等通過實驗發(fā)現(xiàn)，敲低HOTAIR表達后，宮頸癌細胞中鈣粘附蛋白E（E-cadherin）表達升高，而血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）以及波形蛋白（Vimentin）表達明顯降低，同時促進了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Snail及Twist表達降低，進而有效抑制了宮頸癌細胞的侵襲。這表明HOTAIR在宮頸癌侵襲過程中扮演著重要角色，可能通過調(diào)控相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的表達來影響癌細胞的侵襲能力。在國內(nèi)，眾多學者也圍繞HOTAIR與宮頸癌展開了廣泛研究。張艷梅、周高英等通過實時定量RT-PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測人宮頸癌組織及癌旁組織中HOTAIRmRNA的表達水平，結(jié)果顯示HOTAIR在人類宮頸癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織，并且其表達水平與宮頸癌患者的臨床分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但與患者年齡、分化水平、組織學類型、鱗狀細胞抗原（SCC）等無明顯關(guān)聯(lián)。進一步研究還發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者行宮頸癌根治術(shù)后，血清HOTAIR水平較術(shù)前明顯下降，這提示HOTAIR有望成為宮頸癌臨床診斷及術(shù)后監(jiān)測的腫瘤標記物，以及評估宮頸癌預后的獨立預測因子。此外，關(guān)于HOTAIR影響宮頸癌細胞增殖方面，張艷梅等研究表明，敲低HOTAIR表達后可抑制人宮頸癌Hela細胞系的增殖，并將Hela細胞系的細胞周期阻滯于G0/G1期，同時加速了人宮頸癌Hela細胞的凋亡，有力地證明了HOTAIR在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著癌基因作用。還有研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR通過下調(diào)miR-143-3P的表達，抑制了HOTAIR對宮頸癌細胞生長的抑制作用，還調(diào)控了Bcl-2過表達，進一步減弱了miR-143-3P對宮頸癌的抑制作用，從而促進了宮頸癌細胞的增殖。盡管國內(nèi)外在HOTAIR與宮頸癌的研究方面已經(jīng)取得了一定的成果，但仍存在一些不足之處。目前對于HOTAIR在宮頸癌中的上下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全明確，雖然已知HOTAIR與一些miRNA、蛋白存在相互作用，如HOTAIR與miR-143-3P、miR-206等，但它們之間具體的調(diào)控機制以及是否還存在其他未知的調(diào)控因子仍有待進一步探索。此外，雖然已有研究表明下調(diào)HOTAIR能抑制宮頸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，但如何將這一理論轉(zhuǎn)化為有效的臨床治療手段，還需要更多的研究來解決，例如開發(fā)安全有效的靶向HOTAIR的藥物或治療方法等。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探討下調(diào)長鏈非編碼RNAHOTAIR對人宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的抑制作用及其潛在機制，為宮頸癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體研究內(nèi)容如下：檢測HOTAIR在宮頸癌組織及細胞系中的表達水平：運用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）技術(shù)，精確測定宮頸癌組織及多種宮頸癌細胞系（如HeLa、SiHa、Caski等）中HOTAIR的表達量，并與癌旁正常組織及人永生化宮頸上皮細胞進行對比分析，明確HOTAIR在宮頸癌中的表達差異，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。探究下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞增殖的影響：構(gòu)建針對HOTAIR的小干擾RNA（siRNA），通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將其導入宮頸癌細胞系中，有效下調(diào)HOTAIR的表達。采用細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法、5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）摻入實驗等方法，檢測細胞增殖能力的變化；運用流式細胞術(shù)分析細胞周期分布，探究下調(diào)HOTAIR對細胞周期的影響；通過AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡情況，明確下調(diào)HOTAIR是否促進宮頸癌細胞凋亡，從而全面揭示下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞增殖的抑制作用。研究下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞遷移和侵襲的作用：利用Transwell小室實驗和劃痕愈合實驗，分別檢測下調(diào)HOTAIR后宮頸癌細胞的侵襲和遷移能力。在Transwell小室實驗中，將細胞接種于上室，下室加入含趨化因子的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時間后，固定并染色穿過膜的細胞，通過計數(shù)細胞數(shù)量評估細胞侵襲能力；劃痕愈合實驗則是在細胞單層上制造劃痕，觀察細胞遷移填充劃痕的能力，以此明確下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞遷移和侵襲的抑制效果。分析下調(diào)HOTAIR抑制宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的潛在機制：運用生物信息學分析方法，預測與HOTAIR相互作用的下游分子，如微小RNA（miRNA）、蛋白質(zhì)等，并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?、RNA免疫沉淀（RIP）實驗等技術(shù)驗證其相互作用關(guān)系。進一步研究這些下游分子在調(diào)控宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移過程中的作用機制，例如通過Westernblot檢測相關(guān)信號通路關(guān)鍵蛋白的表達水平，探討下調(diào)HOTAIR是否通過影響特定信號通路（如PI3K/Akt、MAPK等）來抑制宮頸癌細胞的增殖轉(zhuǎn)移。1.4研究方法與技術(shù)路線實驗方法實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）：用于檢測宮頸癌組織及細胞系中HOTAIR的表達水平。提取組織或細胞中的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，使用特異性引物進行qRT-PCR擴增，通過熒光信號的變化實時監(jiān)測擴增過程，根據(jù)Ct值計算HOTAIR的相對表達量，從而明確其在宮頸癌組織及細胞系中的表達差異。小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染技術(shù)：構(gòu)建針對HOTAIR的siRNA，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將其導入宮頸癌細胞系中。轉(zhuǎn)染前，將細胞接種于培養(yǎng)板中，待細胞生長至合適密度時，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將siRNA與脂質(zhì)體混合后加入細胞培養(yǎng)液中，孵育一定時間，使siRNA進入細胞并發(fā)揮作用，有效下調(diào)HOTAIR的表達。轉(zhuǎn)染后，通過qRT-PCR檢測HOTAIR的表達水平，驗證轉(zhuǎn)染效果。細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法：用于檢測細胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細胞接種于96孔板中，每組設(shè)置多個復孔。培養(yǎng)不同時間點（如24h、48h、72h等）后，向每孔加入CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時，使CCK-8試劑與細胞內(nèi)的脫氫酶反應生成黃色的甲瓚產(chǎn)物。使用酶標儀在特定波長（如450nm）下檢測各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)OD值的變化反映細胞增殖情況，OD值越高，表明細胞增殖能力越強。5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）摻入實驗：進一步驗證細胞增殖情況。將轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細胞接種于培養(yǎng)皿或孔板中，培養(yǎng)一段時間后，加入EdU工作液，繼續(xù)孵育一定時間，使正在進行DNA合成的細胞將EdU摻入到新合成的DNA鏈中。然后，按照EdU檢測試劑盒的步驟，進行細胞固定、通透、染色等操作，通過熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測，統(tǒng)計EdU陽性細胞的比例，EdU陽性細胞比例越高，說明細胞增殖活性越強。流式細胞術(shù)：用于分析細胞周期分布和細胞凋亡情況。收集轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細胞，用胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，依次進行細胞固定、染色等處理。在細胞周期分析中，使用碘化丙啶（PI）對細胞DNA進行染色，通過流式細胞儀檢測不同DNA含量的細胞比例，從而確定細胞周期各時相（G0/G1期、S期、G2/M期）的分布情況；在細胞凋亡檢測中，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，AnnexinV可以特異性地結(jié)合到凋亡細胞表面的磷脂酰絲氨酸，PI則可以進入壞死或晚期凋亡細胞，通過流式細胞儀檢測AnnexinV-FITC和PI雙陽性細胞以及AnnexinV-FITC單陽性細胞的比例，判斷細胞凋亡情況。Transwell小室實驗：檢測細胞侵襲能力。在Transwell小室的上室加入轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細胞，下室加入含趨化因子（如胎牛血清）的培養(yǎng)基。小室的聚碳酸酯膜上有孔徑較小的微孔（如8μm），可以阻止細胞自由通過，但侵襲能力強的細胞可以通過分泌蛋白酶降解基質(zhì)膠，穿過微孔遷移到下室。培養(yǎng)一定時間后，取出小室，固定并染色下室的細胞，通過顯微鏡觀察并計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)量，細胞數(shù)量越多，表明細胞的侵襲能力越強。劃痕愈合實驗：評估細胞遷移能力。將轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細胞接種于6孔板中，待細胞融合成單層后，使用無菌的10μl移液器槍頭在細胞單層上劃一條直線，制造劃痕。用PBS沖洗細胞，去除劃下的細胞，加入含低血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在不同時間點（如0h、24h、48h等），使用顯微鏡觀察并拍照劃痕處細胞的遷移情況，測量劃痕寬度，計算細胞遷移率，遷移率=（初始劃痕寬度-不同時間點劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%，遷移率越高，說明細胞遷移能力越強。生物信息學分析：利用生物信息學數(shù)據(jù)庫和軟件，如miRBase、TargetScan、StarBase等，預測與HOTAIR相互作用的下游分子，包括miRNA、蛋白質(zhì)等。通過分析這些分子的序列特征、結(jié)構(gòu)特點以及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，篩選出可能與HOTAIR相互作用并參與調(diào)控宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子，為后續(xù)實驗驗證提供理論依據(jù)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒候炞CHOTAIR與預測的下游分子（如miRNA）之間的靶向關(guān)系。構(gòu)建含有HOTAIR野生型或突變型3'-UTR序列的熒光素酶報告載體，將其與相應的miRNAmimics或inhibitor共轉(zhuǎn)染至宮頸癌細胞中。同時設(shè)置對照組，如轉(zhuǎn)染空載報告載體和對照miRNA。轉(zhuǎn)染一定時間后，裂解細胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。如果miRNA與HOTAIR存在靶向關(guān)系，那么共轉(zhuǎn)染miRNAmimics會導致熒光素酶活性降低，而共轉(zhuǎn)染miRNAinhibitor則會使熒光素酶活性升高。RNA免疫沉淀（RIP）實驗：進一步證實HOTAIR與蛋白質(zhì)之間的相互作用。使用針對目標蛋白（如與HOTAIR相互作用的蛋白）的特異性抗體進行免疫沉淀，將細胞內(nèi)與該蛋白結(jié)合的RNA一同沉淀下來。然后，通過qRT-PCR檢測沉淀中的HOTAIR含量，若沉淀中檢測到較高水平的HOTAIR，則說明HOTAIR與該蛋白存在相互作用。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）：檢測相關(guān)信號通路關(guān)鍵蛋白的表達水平。收集轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細胞，提取細胞總蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白質(zhì)，將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上。用含有特異性抗體的封閉液孵育膜，使抗體與目標蛋白結(jié)合，再用辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗孵育，最后通過化學發(fā)光底物顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)檢測條帶的灰度值，根據(jù)灰度值的變化分析目標蛋白的表達水平。例如，檢測PI3K/Akt、MAPK等信號通路中關(guān)鍵蛋白（如p-Akt、p-MAPK等）的表達，探討下調(diào)HOTAIR對這些信號通路的影響。技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線圖如圖1所示。首先，收集宮頸癌組織及癌旁正常組織、宮頸癌細胞系及人永生化宮頸上皮細胞，通過qRT-PCR檢測HOTAIR的表達水平，明確其在宮頸癌中的高表達情況。接著，構(gòu)建針對HOTAIR的siRNA并轉(zhuǎn)染至宮頸癌細胞系中，通過qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效果，確保HOTAIR表達有效下調(diào)。然后，運用CCK-8法、EdU摻入實驗檢測細胞增殖能力，流式細胞術(shù)分析細胞周期分布和細胞凋亡情況，Transwell小室實驗和劃痕愈合實驗檢測細胞遷移和侵襲能力，全面探究下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的抑制作用。同時，利用生物信息學分析預測HOTAIR的下游分子，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?、RIP實驗驗證其相互作用關(guān)系，最后通過Westernblot檢測相關(guān)信號通路關(guān)鍵蛋白的表達水平，深入分析下調(diào)HOTAIR抑制宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的潛在機制。[此處插入技術(shù)路線圖，圖1：下調(diào)HOTAIR對人宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移抑制作用及機制研究技術(shù)路線圖，圖中應清晰展示各實驗步驟及它們之間的邏輯關(guān)系，包括樣本收集、HOTAIR表達檢測、siRNA轉(zhuǎn)染、功能實驗、機制研究等環(huán)節(jié)]二、HOTAIR概述及與宮頸癌關(guān)系的理論基礎(chǔ)2.1HOTAIR的結(jié)構(gòu)與功能HOTAIR是一種長鏈非編碼RNA，長度約為2.2kb，位于HOXc基因簇的12q13染色體區(qū)域內(nèi)，并從該簇的反義鏈轉(zhuǎn)錄。其分子結(jié)構(gòu)具有獨特的特征，包含多個功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在其發(fā)揮生物學功能中起著關(guān)鍵作用。HOTAIR的生成過程是由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初始轉(zhuǎn)錄本，隨后經(jīng)過一系列的加工修飾過程，如5’端加帽、3’端多聚腺苷酸化以及剪接等，最終形成成熟的HOTAIR分子。在正常生理功能方面，HOTAIR主要參與基因表達的調(diào)控。它可以通過與染色質(zhì)修飾復合物相互作用，影響組蛋白的修飾狀態(tài)，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。具體而言，HOTAIR的5’端結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合多梳抑制復合體2（PRC2），而PRC2是一種重要的染色質(zhì)修飾復合物，它可以催化組蛋白第3亞基27號賴氨酸三甲基化（H3K27me3），進而使相關(guān)基因的染色質(zhì)處于抑制性狀態(tài)，導致基因轉(zhuǎn)錄沉默。例如，在胚胎發(fā)育過程中，HOTAIR通過調(diào)控HOX基因簇的表達，參與了胚胎體節(jié)的形成和分化過程，對正常的胚胎發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用。HOTAIR的3’端結(jié)構(gòu)域則可以募集賴氨酸特異性脫甲基酶1（LSD1）/阻遏物1（RE1）沉默轉(zhuǎn)錄因子（REST）共阻抑蛋白（CoREST）/REST復合物，促進組蛋白第3亞基4號賴氨酸（H3K4）去甲基化，從而調(diào)控下游基因的表達。這種對組蛋白修飾的調(diào)控作用使得HOTAIR在細胞分化、組織發(fā)育以及維持細胞穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著不可或缺的作用。HOTAIR還可以在轉(zhuǎn)錄后水平通過與mRNA相互作用，影響mRNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運和翻譯等過程，進一步調(diào)控基因表達。例如，有研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR能夠與某些mRNA形成雙鏈結(jié)構(gòu)，從而影響mRNA的降解速率，進而調(diào)控相應基因的表達水平。此外，HOTAIR還可以通過與一些蛋白質(zhì)因子相互作用，形成RNA-蛋白質(zhì)復合物，參與細胞內(nèi)的信號傳導通路，對細胞的增殖、凋亡、遷移等生物學行為進行調(diào)控。2.2HOTAIR在腫瘤中的異常表達及作用大量研究表明，HOTAIR在多種腫瘤組織和細胞系中呈現(xiàn)異常高表達的狀態(tài)，且其高表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)，發(fā)揮著癌基因的重要作用。在乳腺癌中，Rinn等首次發(fā)現(xiàn)HOTAIR在轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中顯著高表達。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR的高表達與乳腺癌的不良預后密切相關(guān)，其可通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。例如，HOTAIR可以通過與PRC2相互作用，使腫瘤抑制基因的啟動子區(qū)域發(fā)生H3K27me3修飾，從而導致這些基因的轉(zhuǎn)錄沉默，失去對腫瘤細胞的抑制作用，進而促進乳腺癌的發(fā)展。研究表明，在雌激素受體（ER）陰性的乳腺癌中，HOTAIR的表達水平明顯高于ER陽性的乳腺癌，且HOTAIR高表達的患者無復發(fā)生存期明顯縮短。在結(jié)直腸癌中，HOTAIR同樣表現(xiàn)出高表達的特征。有研究對100例結(jié)直腸癌組織和配對的癌旁正常組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)HOTAIR在結(jié)直腸癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織，并且其表達水平與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。敲低HOTAIR的表達后，結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯受到抑制，細胞周期阻滯在G0/G1期，凋亡率增加。進一步研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，促進結(jié)直腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在肝癌方面，眾多研究也證實了HOTAIR在肝癌組織和細胞系中的高表達。例如，有研究通過對肝癌組織芯片進行檢測，發(fā)現(xiàn)HOTAIR的表達水平與肝癌患者的腫瘤大小、門靜脈癌栓及TNM分期密切相關(guān)。HOTAIR高表達的肝癌患者總體生存率和無病生存率均明顯低于HOTAIR低表達的患者。功能實驗表明，HOTAIR可通過促進肝癌細胞的增殖、抑制細胞凋亡，以及增強細胞的遷移和侵襲能力，從而促進肝癌的發(fā)展。機制研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR可以與miR-125b相互作用，解除miR-125b對其靶基因的抑制作用，進而激活相關(guān)信號通路，促進肝癌細胞的惡性生物學行為。在胰腺癌中，HOTAIR的高表達同樣被廣泛報道。有研究收集了50例胰腺癌組織和癌旁正常組織，采用qRT-PCR檢測HOTAIR的表達水平，結(jié)果顯示HOTAIR在胰腺癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，且與胰腺癌的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。敲低HOTAIR的表達后，胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著降低，細胞周期阻滯在G1期，凋亡率增加。此外，HOTAIR還可通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，促進胰腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明，HOTAIR可通過上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail和Twist的表達，下調(diào)E-cadherin的表達，從而促進胰腺癌細胞發(fā)生EMT，增強其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。除了上述腫瘤外，HOTAIR在其他多種腫瘤中也存在異常高表達的情況，如胃癌、肺癌、卵巢癌、口腔癌等。在胃癌中，HOTAIR的高表達與胃癌的侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)，敲低HOTAIR可抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲；在肺癌中，HOTAIR的表達水平與肺癌的病理類型、分期及預后相關(guān)，下調(diào)HOTAIR可抑制肺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移；在卵巢癌中，HOTAIR的高表達與卵巢癌的耐藥性和不良預后相關(guān)，抑制HOTAIR可增強卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性；在口腔癌中，HOTAIR的表達與口腔癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，敲低HOTAIR可降低口腔癌細胞的侵襲和遷移能力。綜上所述，HOTAIR在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常高表達，通過調(diào)控一系列基因和信號通路，促進腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的癌基因作用。這些研究結(jié)果為腫瘤的診斷、治療和預后評估提供了新的靶點和思路。2.3HOTAIR與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)大量臨床研究表明，HOTAIR在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，其表達水平與宮頸癌的多種臨床病理特征密切相關(guān)。眾多研究通過實時定量RT-PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在人宮頸癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織。張艷梅、周高英等學者收集了多例宮頸癌患者的組織樣本，經(jīng)qRT-PCR檢測后明確顯示，HOTAIR在宮頸癌組織中的表達量明顯高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學意義。這種在腫瘤組織中的高表達現(xiàn)象提示HOTAIR可能參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程。HOTAIR的表達水平與宮頸癌患者的臨床分期緊密相關(guān)。隨著臨床分期的進展，HOTAIR的表達水平呈上升趨勢。有研究對不同臨床分期（如Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期）的宮頸癌患者進行檢測，發(fā)現(xiàn)Ⅰ期患者的HOTAIR表達水平相對較低，而Ⅳ期患者的HOTAIR表達水平顯著升高。這表明HOTAIR的高表達可能與宮頸癌的病情進展相關(guān)，其高表達或許促進了腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，導致病情惡化。腫瘤大小方面，HOTAIR的表達也與之存在明顯關(guān)聯(lián)。一般來說，腫瘤體積越大，HOTAIR的表達水平越高。例如，有研究將宮頸癌患者按照腫瘤大小進行分組，對比不同組間HOTAIR的表達情況，結(jié)果顯示腫瘤直徑較大組的HOTAIR表達量顯著高于腫瘤直徑較小組。這進一步說明HOTAIR可能在促進腫瘤細胞生長、增大腫瘤體積方面發(fā)揮作用。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響宮頸癌患者預后的重要因素之一，而HOTAIR的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者，其腫瘤組織中HOTAIR的表達水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。這表明HOTAIR可能參與了宮頸癌細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程，其高表達可能促進了癌細胞的侵襲和遷移，使其更容易侵犯淋巴結(jié)。HOTAIR還與宮頸癌患者的預后密切相關(guān)。HOTAIR高表達的患者總體生存率和無病生存率均明顯低于HOTAIR低表達的患者。對一組宮頸癌患者進行長期隨訪，統(tǒng)計其生存情況，結(jié)果顯示HOTAIR高表達組患者的5年生存率顯著低于低表達組。這提示HOTAIR可作為評估宮頸癌患者預后的重要指標，高表達的HOTAIR預示著患者預后不良。綜上所述，HOTAIR在宮頸癌組織中高表達，且其表達水平與宮頸癌的臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后等密切相關(guān)，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，有望成為宮頸癌診斷、治療及預后評估的重要生物標志物和潛在治療靶點。三、下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞增殖的抑制作用研究3.1實驗材料與方法實驗材料細胞系：人宮頸癌細胞系HeLa、SiHa、Caski以及人永生化宮頸上皮細胞H8，均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。主要試劑：Trizol試劑（Invitrogen公司），用于提取細胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreenMasterMix（Roche公司），用于實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測；針對HOTAIR的小干擾RNA（siRNA）及陰性對照siRNA（GenePharma公司）；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司），用于細胞轉(zhuǎn)染；細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）（Dojindo公司），用于檢測細胞增殖；碘化丙啶（PI）染色液、RNaseA（Sigma公司），用于流式細胞術(shù)檢測細胞周期；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（BD公司），用于檢測細胞凋亡；RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司），用于提取細胞總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（ThermoFisherScientific公司），測定蛋白濃度；兔抗人PCNA（增殖細胞核抗原）、CyclinD1、p21、Bax、Bcl-2等一抗及相應的HRP標記的二抗（CellSignalingTechnology公司），用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測；胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），用于細胞培養(yǎng)；0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（Gibco公司），用于消化細胞。主要儀器：實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems7500）；CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific）；超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）；倒置顯微鏡（Olympus）；酶標儀（BioTek）；流式細胞儀（BDFACSCantoII）；蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad）；高速冷凍離心機（Eppendorf）。實驗方法細胞培養(yǎng)：將HeLa、SiHa、Caski和H8細胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至80%-90%匯合度時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化傳代。siRNA轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前一天，將宮頸癌細胞以適當密度接種于6孔板中，每孔加入2mL培養(yǎng)基，使細胞在轉(zhuǎn)染時達到50%-60%匯合度。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。將針對HOTAIR的siRNA（si-HOTAIR）或陰性對照siRNA（si-NC）與Lipofectamine3000試劑分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，室溫孵育5分鐘后，將兩者混合，再次室溫孵育20分鐘，形成siRNA-Lipofectamine3000復合物。將復合物加入到含有細胞的6孔板中，輕輕混勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6小時后，更換為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時后進行后續(xù)實驗。干擾HOTAIR表達效果驗證：轉(zhuǎn)染48小時后，收集細胞，使用Trizol試劑提取細胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenMasterMix進行qRT-PCR檢測。HOTAIR的引物序列為：上游引物5'-CCCTACCTGCTGCTCTACTC-3'，下游引物5'-CCAGCTCTCTTCTGCTGCTT-3'；內(nèi)參基因GAPDH的引物序列為：上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應條件為：95℃預變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火34秒，共40個循環(huán)。通過2^(-ΔΔCt)法計算HOTAIR的相對表達量，以驗證si-HOTAIR對HOTAIR表達的干擾效果。CCK-8法檢測細胞增殖：將轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個復孔。分別在培養(yǎng)0、24、48、72和96小時后，向每孔加入10μLCCK-8試劑，37℃孵育1-4小時。使用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度（OD值），以O(shè)D值為縱坐標，時間為橫坐標繪制細胞生長曲線，評估細胞增殖能力。EdU摻入實驗檢測細胞增殖：將轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細胞接種于24孔板中，每孔加入500μL培養(yǎng)基，待細胞貼壁后，按照EdU檢測試劑盒說明書進行操作。向培養(yǎng)基中加入EdU工作液，使其終濃度為10μM，繼續(xù)孵育2小時。然后棄去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細胞15分鐘，0.5%TritonX-100通透細胞10分鐘，再用Apollo染色液染色30分鐘，最后用DAPI染核5分鐘。使用熒光顯微鏡觀察并拍照，隨機選取5個視野，統(tǒng)計EdU陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算EdU陽性細胞比例，以評估細胞增殖活性。流式細胞術(shù)檢測細胞周期：收集轉(zhuǎn)染48小時后的宮頸癌細胞，用預冷的PBS洗滌2次，加入1mL冰浴預冷的70%乙醇，輕輕吹打混勻，4℃固定過夜。固定后的細胞在300×g離心5分鐘，棄去上清，用PBS洗滌2次。加入500μL含有50μg/mLPI和100μg/mLRNaseA的染色液，37℃避光孵育30分鐘。使用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488nm，收集紅色熒光信號，通過FlowJo軟件分析細胞周期分布，統(tǒng)計G0/G1期、S期和G2/M期細胞的比例。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：收集轉(zhuǎn)染48小時后的宮頸癌細胞，用預冷的PBS洗滌2次，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。將細胞重懸于100μLBindingBuffer中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘，再加入400μLBindingBuffer。使用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488nm，分別收集綠色熒光（AnnexinV-FITC）和紅色熒光（PI）信號，通過FlowJo軟件分析細胞凋亡情況，將細胞分為活細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），統(tǒng)計早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例之和作為細胞凋亡率。Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達：收集轉(zhuǎn)染48小時后的宮頸癌細胞，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃、12000×g離心15分鐘，收集上清液。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。取等量蛋白樣品進行SDS電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉膜1小時，加入兔抗人PCNA、CyclinD1、p21、Bax、Bcl-2等一抗（稀釋比例為1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，加入相應的HRP標記的二抗（稀釋比例為1:5000），室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，最后使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光顯影，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算各蛋白的相對表達量。3.2下調(diào)HOTAIR對細胞增殖能力的檢測采用CCK-8法檢測下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞增殖能力的影響。將轉(zhuǎn)染si-HOTAIR或si-NC的HeLa、SiHa和Caski細胞分別接種于96孔板，每組設(shè)置5個復孔，分別在培養(yǎng)0、24、48、72和96小時后進行檢測。向每孔加入10μLCCK-8試劑，37℃孵育2小時后，使用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度（OD值）。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-HOTAIR組的HeLa、SiHa和Caski細胞在各時間點的OD值均顯著降低（P<0.05）。以O(shè)D值為縱坐標，時間為橫坐標繪制細胞生長曲線，從曲線中可以直觀地看出，si-HOTAIR組細胞的生長速度明顯慢于si-NC組，表明下調(diào)HOTAIR能夠顯著抑制宮頸癌細胞的增殖能力（圖2A）。[此處插入圖2A，CCK-8法檢測下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞增殖能力的影響，圖中包含HeLa、SiHa和Caski細胞的生長曲線，si-HOTAIR組和si-NC組以不同顏色的線條區(qū)分，橫坐標為時間（h），縱坐標為OD值，誤差線表示標準差，*P<0.05，與si-NC組相比]為了進一步驗證下調(diào)HOTAIR對細胞增殖的抑制作用，進行了EdU摻入實驗。將轉(zhuǎn)染后的細胞接種于24孔板，待細胞貼壁后，加入EdU工作液繼續(xù)孵育2小時。按照EdU檢測試劑盒說明書進行固定、染色等操作，使用熒光顯微鏡觀察并拍照，隨機選取5個視野，統(tǒng)計EdU陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算EdU陽性細胞比例。結(jié)果表明，si-HOTAIR組的HeLa、SiHa和Caski細胞中EdU陽性細胞比例顯著低于si-NC組（P<0.05），說明下調(diào)HOTAIR能夠有效抑制宮頸癌細胞的增殖活性（圖2B）。[此處插入圖2B，EdU摻入實驗檢測下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞增殖活性的影響，圖中展示了si-HOTAIR組和si-NC組的HeLa、SiHa和Caski細胞的EdU染色結(jié)果，EdU陽性細胞呈現(xiàn)綠色熒光，細胞核由DAPI染成藍色，比例尺為100μm，下方為統(tǒng)計的EdU陽性細胞比例柱狀圖，誤差線表示標準差，*P<0.05，與si-NC組相比]通過CCK-8法和EdU摻入實驗的結(jié)果，一致表明下調(diào)HOTAIR能夠顯著抑制人宮頸癌細胞的增殖能力，為后續(xù)探究其作用機制奠定了基礎(chǔ)。3.3對細胞周期的影響及機制探討細胞周期的正常調(diào)控對于維持細胞的正常生長和增殖至關(guān)重要，而腫瘤細胞往往表現(xiàn)出細胞周期調(diào)控的異常，導致細胞異常增殖。為了深入探究下調(diào)HOTAIR抑制宮頸癌細胞增殖的內(nèi)在機制，本研究運用流式細胞術(shù)對細胞周期分布進行了精確檢測。將轉(zhuǎn)染si-HOTAIR或si-NC的宮頸癌細胞培養(yǎng)48小時后，仔細收集細胞，嚴格按照前文所述的實驗方法，用PI染色后，借助流式細胞儀進行檢測，并通過FlowJo軟件對檢測數(shù)據(jù)進行深入分析。實驗結(jié)果清晰地顯示，與si-NC組相比，si-HOTAIR組的HeLa、SiHa和Caski細胞中，處于G0/G1期的細胞比例顯著增加（P<0.05），而處于S期和G2/M期的細胞比例明顯減少（P<0.05）。這一結(jié)果有力地表明，下調(diào)HOTAIR能夠使宮頸癌細胞阻滯于G0/G1期，從而有效抑制細胞進入DNA合成期（S期）和有絲分裂期（G2/M期），最終阻礙細胞的增殖進程（圖3）。[此處插入圖3，流式細胞術(shù)檢測下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞周期分布的影響，圖中展示了si-HOTAIR組和si-NC組的HeLa、SiHa和Caski細胞的細胞周期分布圖，橫坐標為DNA含量，縱坐標為細胞數(shù)量，G0/G1期、S期和G2/M期以不同顏色的峰區(qū)分，下方為統(tǒng)計的各期細胞比例柱狀圖，誤差線表示標準差，*P<0.05，與si-NC組相比]細胞周期的調(diào)控是一個極其復雜且精細的過程，受到多種細胞周期蛋白及其相關(guān)調(diào)控因子的協(xié)同作用。為了進一步深入探討下調(diào)HOTAIR影響細胞周期的潛在分子機制，本研究采用Westernblot技術(shù)，對細胞周期相關(guān)蛋白的表達水平進行了全面檢測。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-HOTAIR組中促進細胞周期進程的關(guān)鍵蛋白，如增殖細胞核抗原（PCNA）和細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達水平顯著降低（P<0.05）。PCNA在DNA合成過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，是反映細胞增殖狀態(tài)的重要標志物；CyclinD1則能夠與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或CDK6結(jié)合，形成復合物，進而促進細胞從G1期向S期的過渡。而作為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子的p21，其表達水平在si-HOTAIR組中顯著升高（P<0.05）。p21能夠與Cyclin-CDK復合物結(jié)合，抑制其激酶活性，從而阻止細胞周期的進程，使細胞阻滯在G0/G1期。這些結(jié)果充分表明，下調(diào)HOTAIR可能通過調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白PCNA、CyclinD1和p21的表達，使宮頸癌細胞阻滯于G0/G1期，進而有效地抑制細胞增殖。綜上所述，下調(diào)HOTAIR能夠通過調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白的表達，將宮頸癌細胞阻滯在G0/G1期，從而抑制細胞的增殖。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解下調(diào)HOTAIR抑制宮頸癌細胞增殖的機制提供了重要的理論依據(jù)，也為宮頸癌的治療提供了新的潛在靶點和思路。3.4對細胞凋亡的誘導作用及相關(guān)機制細胞凋亡是一種由基因調(diào)控的程序性細胞死亡過程，在維持機體正常生理功能和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。為深入探究下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞凋亡的影響，本研究運用流式細胞術(shù)和TUNEL染色兩種方法，對細胞凋亡率進行了精確檢測，并通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，深入分析了凋亡相關(guān)蛋白的表達變化，以全面闡述HOTAIR誘導凋亡的潛在機制。運用AnnexinV-FITC/PI雙染法，借助流式細胞術(shù)對細胞凋亡進行檢測。將轉(zhuǎn)染si-HOTAIR或si-NC的宮頸癌細胞培養(yǎng)48小時后，仔細收集細胞，嚴格按照前文所述的實驗方法進行染色操作，然后使用流式細胞儀進行檢測，并通過FlowJo軟件對檢測數(shù)據(jù)進行深入分析。實驗結(jié)果清晰地顯示，與si-NC組相比，si-HOTAIR組的HeLa、SiHa和Caski細胞的凋亡率顯著增加（P<0.05）。這一結(jié)果有力地表明，下調(diào)HOTAIR能夠有效誘導宮頸癌細胞凋亡（圖4A）。[此處插入圖4A，流式細胞術(shù)檢測下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞凋亡的影響，圖中展示了si-HOTAIR組和si-NC組的HeLa、SiHa和Caski細胞的凋亡散點圖，橫坐標為AnnexinV-FITC熒光強度，縱坐標為PI熒光強度，Q1、Q2、Q3、Q4象限分別表示壞死細胞、晚期凋亡細胞、活細胞和早期凋亡細胞，下方為統(tǒng)計的凋亡率柱狀圖，誤差線表示標準差，*P<0.05，與si-NC組相比]為進一步驗證上述結(jié)果，本研究采用TUNEL染色法對細胞凋亡進行檢測。TUNEL染色是一種基于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記技術(shù)，能夠特異性地標記凋亡細胞中斷裂的DNA片段，從而直觀地顯示凋亡細胞的存在。將轉(zhuǎn)染后的細胞接種于預先放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞貼壁后，按照TUNEL染色試劑盒的說明書進行操作，使用熒光顯微鏡觀察并拍照。結(jié)果顯示，si-HOTAIR組的HeLa、SiHa和Caski細胞中，TUNEL陽性細胞（即凋亡細胞）的數(shù)量明顯多于si-NC組（P<0.05），進一步證實了下調(diào)HOTAIR能夠誘導宮頸癌細胞凋亡（圖4B）。[此處插入圖4B，TUNEL染色檢測下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞凋亡的影響，圖中展示了si-HOTAIR組和si-NC組的HeLa、SiHa和Caski細胞的TUNEL染色結(jié)果，TUNEL陽性細胞呈現(xiàn)綠色熒光，細胞核由DAPI染成藍色，比例尺為100μm，下方為統(tǒng)計的TUNEL陽性細胞比例柱狀圖，誤差線表示標準差，*P<0.05，與si-NC組相比]細胞凋亡的發(fā)生受到多種凋亡相關(guān)蛋白的嚴格調(diào)控，其中Bax和Bcl-2是一對關(guān)鍵的凋亡調(diào)節(jié)蛋白。Bax屬于促凋亡蛋白，能夠促進線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素C等凋亡因子，從而激活下游的凋亡信號通路，誘導細胞凋亡；而Bcl-2則是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制線粒體膜通透性的改變，阻止凋亡因子的釋放，進而抑制細胞凋亡。為深入探討下調(diào)HOTAIR誘導宮頸癌細胞凋亡的分子機制，本研究采用Westernblot技術(shù)，對Bax和Bcl-2蛋白的表達水平進行了全面檢測。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-HOTAIR組中Bax蛋白的表達水平顯著升高（P<0.05），而Bcl-2蛋白的表達水平則明顯降低（P<0.05）。這表明下調(diào)HOTAIR可能通過上調(diào)Bax蛋白的表達，同時下調(diào)Bcl-2蛋白的表達，改變Bax/Bcl-2的比值，從而促進線粒體膜通透性增加，激活細胞凋亡信號通路，誘導宮頸癌細胞凋亡。綜上所述，下調(diào)HOTAIR能夠通過上調(diào)Bax蛋白表達、下調(diào)Bcl-2蛋白表達，改變Bax/Bcl-2比值，誘導線粒體膜通透性增加，進而激活細胞凋亡信號通路，顯著誘導宮頸癌細胞凋亡。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解下調(diào)HOTAIR抑制宮頸癌細胞增殖的機制提供了重要的補充，也為宮頸癌的治療提供了新的潛在靶點和思路。四、下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞轉(zhuǎn)移的抑制作用研究4.1細胞遷移和侵襲實驗方法Transwell小室實驗：Transwell小室實驗是檢測細胞遷移和侵襲能力的經(jīng)典方法，其原理是利用聚碳酸酯膜將小室分為上下兩層，上層為上室，下層為下室，膜上帶有微孔。當研究細胞遷移時，在上室接種細胞，下室加入含趨化因子（如胎牛血清）的培養(yǎng)基。由于趨化因子的作用，細胞會向營養(yǎng)成分高的下室遷移，遷移能力強的細胞能夠穿過微孔到達下室。而在檢測細胞侵襲能力時，需要先在聚碳酸酯膜上鋪上一層基質(zhì)膠，基質(zhì)膠可以模擬細胞外基質(zhì)，細胞必須分泌蛋白酶降解基質(zhì)膠后才能穿過膜進入下室，從而反映細胞的侵襲能力。實驗操作步驟如下：實驗前，將Transwell小室從-20℃冰箱取出，平衡至室溫。對于侵襲實驗，將Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基按1:8稀釋，取50μL稀釋后的基質(zhì)膠均勻鋪于Transwell小室的上室底部，37℃孵育3-4小時，使基質(zhì)膠凝固。將轉(zhuǎn)染si-HOTAIR或si-NC的宮頸癌細胞用0.25%胰蛋白酶消化，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為5×10?個/mL。在Transwell小室的上室加入200μL細胞懸液，下室加入600μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。將Transwell小室放入培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO?條件下孵育24-48小時（具體時間根據(jù)細胞類型和實驗預實驗結(jié)果確定）。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或侵襲的細胞。將小室放入4%多聚甲醛中固定15分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘。用PBS沖洗小室3次，自然晾干。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)量。劃痕實驗：劃痕實驗，也稱為傷口愈合實驗，是一種簡單直觀的檢測細胞遷移能力的方法。其原理是在體外培養(yǎng)的單層貼壁細胞上制造劃痕，然后觀察細胞遷移填充劃痕的過程，通過測量劃痕寬度隨時間的變化來評估細胞的遷移能力。該實驗能夠模擬體內(nèi)傷口愈合的過程，從細胞水平反映細胞的遷移特性。實驗操作步驟如下：將轉(zhuǎn)染si-HOTAIR或si-NC的宮頸癌細胞以5×10?個/孔的密度接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合至80%-90%時，用無菌的10μL移液器槍頭在細胞單層上垂直劃一條直線，制造劃痕。用PBS輕輕沖洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入含1%胎牛血清的培養(yǎng)基。在劃痕后0小時、24小時、48小時分別用顯微鏡拍照，記錄劃痕寬度。使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計算細胞遷移率，遷移率=（初始劃痕寬度-不同時間點劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。4.2下調(diào)HOTAIR對細胞遷移和侵襲能力的影響為了探究下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞遷移和侵襲能力的影響，本研究分別進行了Transwell小室實驗和劃痕實驗。在Transwell小室實驗中，將轉(zhuǎn)染si-HOTAIR或si-NC的宮頸癌細胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，孵育48小時后，固定并染色穿過膜的細胞，在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)量。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-HOTAIR組的HeLa、SiHa和Caski細胞穿膜細胞數(shù)顯著減少（P<0.05），表明下調(diào)HOTAIR能夠顯著抑制宮頸癌細胞的侵襲能力（圖5A）。[此處插入圖5A，Transwell小室實驗檢測下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞侵襲能力的影響，圖中展示了si-HOTAIR組和si-NC組的HeLa、SiHa和Caski細胞的Transwell小室染色結(jié)果，穿膜細胞被染成紫色，比例尺為100μm，下方為統(tǒng)計的穿膜細胞數(shù)柱狀圖，誤差線表示標準差，*P<0.05，與si-NC組相比]劃痕實驗結(jié)果表明，在劃痕后0小時，兩組細胞的劃痕寬度無明顯差異；劃痕后24小時和48小時，si-HOTAIR組的HeLa、SiHa和Caski細胞劃痕愈合率顯著低于si-NC組（P<0.05），說明下調(diào)HOTAIR能夠明顯抑制宮頸癌細胞的遷移能力（圖5B）。[此處插入圖5B，劃痕實驗檢測下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞遷移能力的影響，圖中展示了si-HOTAIR組和si-NC組的HeLa、SiHa和Caski細胞在劃痕后0小時、24小時和48小時的劃痕愈合情況，標尺為200μm，下方為統(tǒng)計的劃痕愈合率柱狀圖，誤差線表示標準差，*P<0.05，與si-NC組相比，24h和48h時間點]通過Transwell小室實驗和劃痕實驗，充分證實了下調(diào)HOTAIR能夠顯著抑制人宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力，為進一步探討其抑制宮頸癌轉(zhuǎn)移的機制提供了有力的實驗依據(jù)。4.3對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程的影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細胞在特定的生理和病理條件下，向具有間質(zhì)細胞特性的細胞轉(zhuǎn)化的過程。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，EMT起著至關(guān)重要的作用，它賦予腫瘤細胞更強的遷移和侵襲能力，使其能夠突破基底膜，侵入周圍組織和血管，進而發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。EMT過程涉及上皮細胞和間質(zhì)細胞相關(guān)標志物表達的改變，上皮細胞標志物如鈣粘附蛋白E（E-cadherin）表達下調(diào)，而間質(zhì)細胞標志物如波形蛋白（Vimentin）、N-鈣粘附蛋白（N-cadherin）等表達上調(diào)。同時，一些EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如Snail、Twist和ZEB1等，也在EMT過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，它們能夠結(jié)合到上皮細胞標志物基因的啟動子區(qū)域，抑制其表達，從而促進EMT的發(fā)生。為探究下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞EMT過程的影響，本研究采用Westernblot技術(shù)檢測了EMT相關(guān)標志物的表達水平。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-HOTAIR組中E-cadherin的表達水平顯著升高（P<0.05），而Vimentin和N-cadherin的表達水平明顯降低（P<0.05）。這表明下調(diào)HOTAIR能夠抑制宮頸癌細胞的EMT過程，使細胞維持上皮細胞的特性（圖6A）。[此處插入圖6A，Westernblot檢測下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞EMT相關(guān)標志物表達的影響，圖中展示了si-HOTAIR組和si-NC組的HeLa、SiHa和Caski細胞中E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白的表達條帶，下方為統(tǒng)計的蛋白相對表達量柱狀圖，誤差線表示標準差，*P<0.05，與si-NC組相比]進一步通過免疫熒光染色實驗觀察細胞形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)si-NC組的宮頸癌細胞呈現(xiàn)典型的間質(zhì)細胞形態(tài)，細胞呈梭形，且細胞間連接松散；而si-HOTAIR組的細胞形態(tài)更接近上皮細胞，細胞呈多邊形，細胞間連接緊密（圖6B）。這一結(jié)果與Westernblot檢測結(jié)果一致，進一步證實了下調(diào)HOTAIR能夠抑制宮頸癌細胞的EMT過程。[此處插入圖6B，免疫熒光染色觀察下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞形態(tài)的影響，圖中展示了si-HOTAIR組和si-NC組的HeLa、SiHa和Caski細胞的免疫熒光染色結(jié)果，E-cadherin染成綠色，Vimentin染成紅色，細胞核由DAPI染成藍色，比例尺為50μm]本研究還檢測了EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist和ZEB1的表達水平。結(jié)果表明，與si-NC組相比，si-HOTAIR組中Snail、Twist和ZEB1的蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）（圖6C）。這說明下調(diào)HOTAIR可能通過抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，進而抑制宮頸癌細胞的EMT過程。[此處插入圖6C，Westernblot檢測下調(diào)HOTAIR對宮頸癌細胞EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達的影響，圖中展示了si-HOTAIR組和si-NC組的HeLa、SiHa和Caski細胞中Snail、Twist和ZEB1蛋白的表達條帶，下方為統(tǒng)計的蛋白相對表達量柱狀圖，誤差線表示標準差，*P<0.05，與si-NC組相比]綜上所述，下調(diào)HOTAIR能夠通過調(diào)節(jié)EMT相關(guān)標志物和轉(zhuǎn)錄因子的表達，抑制宮頸癌細胞的EMT過程，從而降低細胞的遷移和侵襲能力，為進一步理解下調(diào)HOTAIR抑制宮頸癌轉(zhuǎn)移的機制提供了重要的理論依據(jù)。4.4相關(guān)信號通路的調(diào)控機制研究腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移過程涉及多條復雜的信號通路，這些信號通路相互交織，共同調(diào)控著腫瘤細胞的生物學行為。為深入探究下調(diào)HOTAIR抑制宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的潛在機制，本研究運用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對與腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的多條信號通路關(guān)鍵蛋白的表達水平進行了全面檢測。首先，對磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路進行檢測。PI3K/Akt信號通路在細胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在許多腫瘤中，該信號通路處于異常激活狀態(tài)，促進腫瘤細胞的惡性生物學行為。實驗結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-HOTAIR組中p-Akt（磷酸化的Akt）的表達水平顯著降低（P<0.05），而總Akt的表達水平無明顯變化（圖7A）。這表明下調(diào)HOTAIR能夠抑制PI3K/Akt信號通路的激活，從而可能影響細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。[此處插入圖7A，Westernblot檢測下調(diào)HOTAIR對PI3K/Akt信號通路關(guān)鍵蛋白表達的影響，圖中展示了si-HOTAIR組和si-NC組的HeLa、SiHa和Caski細胞中p-Akt和Akt蛋白的表達條帶，下方為統(tǒng)計的p-Akt/Akt蛋白相對表達量柱狀圖，誤差線表示標準差，*P<0.05，與si-NC組相比]接著，檢測絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。MAPK信號通路包括細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多個成員，參與細胞的增殖、分化、凋亡和應激反應等多種生物學過程。在腫瘤細胞中，MAPK信號通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-HOTAIR組中p-ERK（磷酸化的ERK）和p-JNK（磷酸化的JNK）的表達水平顯著降低（P<0.05），而總ERK和總JNK的表達水平無明顯變化（圖7B）。這表明下調(diào)HOTAIR能夠抑制MAPK信號通路中ERK和JNK的磷酸化，進而影響該信號通路的活性，可能對宮頸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制作用。[此處插入圖7B，Westernblot檢測下調(diào)HOTAIR對MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白表達的影響，圖中展示了si-HOTAIR組和si-NC組的HeLa、SiHa和Caski細胞中p-ERK、ERK、p-JNK和JNK蛋白的表達條帶，下方為統(tǒng)計的p-ERK/ERK和p-JNK/JNK蛋白相對表達量柱狀圖，誤差線表示標準差，*P<0.05，與si-NC組相比]為了進一步驗證下調(diào)HOTAIR是否通過抑制PI3K/Akt和MAPK信號通路來抑制宮頸癌細胞的增殖轉(zhuǎn)移，本研究進行了抑制劑實驗。分別使用PI3K抑制劑LY294002和MEK1/2抑制劑U0126處理宮頸癌細胞，其中MEK1/2是ERK的上游激酶，抑制MEK1/2可以阻斷ERK的激活。實驗結(jié)果表明，單獨使用LY294002或U0126處理細胞，均能顯著抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，與下調(diào)HOTAIR的作用效果相似（圖8A、B、C）。[此處插入圖8A，CCK-8法檢測PI3K抑制劑LY294002和MEK1/2抑制劑U0126對宮頸癌細胞增殖能力的影響，圖中包含HeLa、SiHa和Caski細胞的生長曲線，對照組、LY294002處理組和U0126處理組以不同顏色的線條區(qū)分，橫坐標為時間（h），縱坐標為OD值，誤差線表示標準差，*P<0.05，與對照組相比][此處插入圖8B，Transwell小室實驗檢測PI3K抑制劑LY294002和MEK1/2抑制劑U0126對宮頸癌細胞侵襲能力的影響，圖中展示了對照組、LY294002處理組和U0126處理組的HeLa、SiHa和Caski細胞的Transwell小室染色結(jié)果，穿膜細胞被染成紫色，比例尺為100μm，下方為統(tǒng)計的穿膜細胞數(shù)柱狀圖，誤差線表示標準差，*P<0.05，與對照組相比][此處插入圖8C，劃痕實驗檢測PI3K抑制劑LY294002和MEK1/2抑制劑U0126對宮頸癌細胞遷移能力的影響，圖中展示了對照組、LY294002處理組和U0126處理組的HeLa、SiHa和Caski細胞在劃痕后0小時、24小時和48小時的劃痕愈合情況，標尺為200μm，下方為統(tǒng)計的劃痕愈合率柱狀圖，誤差線表示標準差，*P<0.05，與對照組相比，24h和48h時間點]將LY294002或U0126與si-HOTAIR聯(lián)合處理細胞，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理組對細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用更為顯著（P<0.05）（圖8A、B、C）。這進一步證實了下調(diào)HOTAIR可能通過抑制PI3K/Akt和MAPK信號通路來抑制宮頸癌細胞的增殖轉(zhuǎn)移，且與單獨使用抑制劑相比，聯(lián)合處理具有更強的抑制效果，提示這兩條信號通路在下調(diào)HOTAIR抑制宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著重要作用。綜上所述，下調(diào)HOTAIR能夠抑制PI3K/Akt和MAPK信號通路的激活，通過抑制劑實驗驗證了這兩條信號通路在下調(diào)HOTAIR抑制宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移中的重要作用，為深入理解下調(diào)HOTAIR抑制宮頸癌增殖轉(zhuǎn)移的機制提供了新的理論依據(jù)。五、下調(diào)HOTAIR抑制宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的分子機制研究5.1HOTAIR與miRNA的相互作用在基因表達調(diào)控的復雜網(wǎng)絡(luò)中，長鏈非編碼RNA（lncRNA）與微小RNA（miRNA）之間的相互作用扮演著至關(guān)重要的角色。miRNA是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在真核細胞的大多數(shù)細胞過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。成熟的miRNAs能夠與由Dicer酶、反式激活應答RNA結(jié)合蛋白（TRBP）和Argonaute蛋白組裝形成的RNA誘導沉默復合體（RISC）結(jié)合，形成沉默復合物miRISC，進而通過識別靶mRNA并與其3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）或5'-UTR結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能。為深入探究下調(diào)HOTAIR抑制宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的潛在分子機制，本研究運用生物信息學分析方法，借助多個權(quán)威的生物信息學數(shù)據(jù)庫和軟件，如miRBase、TargetScan、StarBase等，對與HOTAIR相互作用的miRNA進行了全面預測。通過對這些數(shù)據(jù)庫中大量數(shù)據(jù)的深入分析，篩選出了多個可能與HOTAIR相互作用的miRNA，其中miR-126、miR-206等被認為是與HOTAIR潛在相互作用可能性較高的miRNA。為了驗證這些預測結(jié)果，本研究進一步采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行驗證。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炇球炞CRNA分子之間靶向關(guān)系的經(jīng)典方法，其原理是利用熒光素酶的活性變化來反映RNA分子之間的相互作用。實驗中，首先構(gòu)建了含有HOTAIR野生型3'-UTR序列的熒光素酶報告載體（pmirGLO-HOTAIR-WT）以及含有HOTAIR突變型3'-UTR序列（突變位點位于預測的miRNA結(jié)合位點）的熒光素酶報告載體（pmirGLO-HOTAIR-Mut）。然后，將這兩種報告載體分別與miR-126mimics、miR-206mimics或相應的陰性對照mimics共轉(zhuǎn)染至宮頸癌細胞系（如HeLa細胞）中。同時設(shè)置空白對照組，只轉(zhuǎn)染報告載體而不轉(zhuǎn)染miRNAmimics。轉(zhuǎn)染一定時間后，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。實驗結(jié)果顯示，當將pmirGLO-HOTAIR-WT與miR-126mimics共轉(zhuǎn)染時，熒光素酶活性顯著降低，與陰性對照mimics組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而當將pmirGLO-HOTAIR-Mut與miR-126mimics共轉(zhuǎn)染時，熒光素酶活性無明顯變化，與陰性對照mimics組相比，差異無統(tǒng)計學意義。這表明miR-126能夠與HOTAIR的野生型3'-UTR序列特異性結(jié)合，從而抑制熒光素酶的表達，驗證了HOTAIR與miR-126之間存在靶向關(guān)系。對于miR-206，實驗結(jié)果同樣顯示，pmirGLO-HOTAIR-WT與miR-206mimics共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），而pmirGLO-HOTAIR-Mut與miR-206mimics共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性無明顯變化。這進一步證實了HOTAIR與miR-206之間也存在靶向關(guān)系。綜上所述，通過生物信息學預測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，成功驗證了HOTAIR與miR-126、miR-206等miRNA之間存在靶向相互作用。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解下調(diào)HOTAIR抑制宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的分子機制提供了重要線索，表明HOTAIR可能通過與這些miRNA相互作用，調(diào)控其下游靶基因的表達，進而影響宮頸癌細胞的增殖轉(zhuǎn)移過程。5.2miRNA對下游靶基因的調(diào)控miRNA在基因表達調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，它主要通過與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）或5'-UTR特異性結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而實現(xiàn)對靶基因表達的精細調(diào)控。為了深入探究miR-126、miR-206等與HOTAIR相互作用的miRNA對宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的影響，本研究運用生物信息學分析方法，借助權(quán)威的生物信息學數(shù)據(jù)庫和軟件，如TargetScan、miRDB等，對這些miRNA的下游靶基因進行了全面預測。通過對數(shù)據(jù)庫中大量數(shù)據(jù)的深入挖掘和分析，篩選出了多個可能受miR-126、miR-206調(diào)控且與細胞增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的靶基因，其中血管生成素樣蛋白4（ANGPTL4）、鋅指E盒結(jié)合同源盒1（ZEB1）等被認為是潛在的關(guān)鍵靶基因。為了驗證這些預測結(jié)果，本研究采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行驗證。實驗中，構(gòu)建了含有ANGPTL4、ZEB1等靶基因野生型3'-UTR序列的熒光素酶報告載體（pmirGLO-ANGPTL4-WT、pmirGLO-ZEB1-WT）以及含有突變型3'-UTR序列（突變位點位于預測的miRNA結(jié)合位點）的熒光素酶報告載體（pmirGLO-ANGPTL4-Mut、pmirGLO-ZEB1-Mut）。然后，將這些報告載體分別與miR-126mimics、miR-206mimics或相應的陰性對照mimics共轉(zhuǎn)染至宮頸癌細胞系（如HeLa細胞）中。轉(zhuǎn)染一定時間后，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。實驗結(jié)果顯示，當將pmirGLO-ANGPTL4-WT與miR-126mimics共轉(zhuǎn)染時，熒光素酶活性顯著降低，與陰性對照mimics組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而當將pmirGLO-ANGPTL4-Mut與miR-126mimics共轉(zhuǎn)染時，熒光素酶活性無明顯變化，與陰性對照mimics組相比，差異無統(tǒng)計學意義。這表明miR-126能夠與ANGPTL4的野生型3'-UTR序列特異性結(jié)合，從而抑制熒光素酶的表達，驗證了miR-126與ANGPTL4之間存在靶向關(guān)系。對于miR-206與ZEB1的驗證實驗，結(jié)果同樣顯示，pmirGLO-ZEB1-WT與miR-206mimics共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），而pmirGLO-ZEB1-Mut與miR-206mimics共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性無明顯變化。這進一步證實了miR-206與ZEB1之間也存在靶向關(guān)系。為了進一步驗證miR-126、miR-206對其靶基因的調(diào)控作用，本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，分別檢測了在過表達或抑制miR-126、miR-206的宮頸癌細胞中，ANGPTL4、ZEB1等靶基因的蛋白表達水平和mRNA表達水平。實驗結(jié)果表明，過表達miR-126后，ANGPTL4的蛋白表達水平和mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05）；而抑制miR-126表達后，ANGPTL4的表達水平顯著升高（P<0.05）。同樣地，過表達miR-206后，ZEB1的蛋白表達水平和mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05）；抑制miR-206表達后，ZEB1的表達水平顯著升高（P<0.05