MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子對(duì)紫花苜蓿耐鹽性的調(diào)控機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義土壤鹽堿化是一個(gè)全球性的生態(tài)問(wèn)題，嚴(yán)重威脅著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有10億公頃的鹽堿地，約占陸地總面積的7%，并且隨著氣候變化、不合理灌溉等因素的影響，鹽堿地面積還在不斷擴(kuò)大。在中國(guó)，鹽堿地分布廣泛，主要集中在東北、華北、西北和濱海地區(qū)，總面積達(dá)9913萬(wàn)公頃，約占全國(guó)可利用土地面積的10%。鹽堿地的高鹽環(huán)境會(huì)對(duì)植物造成滲透脅迫、離子毒害和氧化損傷等，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育受阻，產(chǎn)量和品質(zhì)下降。因此，提高植物的耐鹽性，開(kāi)發(fā)利用鹽堿地資源，對(duì)于保障糧食安全、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。紫花苜蓿（MedicagosativaL.）作為世界上最重要的豆科牧草之一，因其具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高蛋白、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，被譽(yù)為“牧草之王”。紫花苜蓿不僅是畜牧業(yè)的優(yōu)質(zhì)飼料來(lái)源，還具有重要的生態(tài)價(jià)值，如固氮改土、保持水土、改善生態(tài)環(huán)境等。然而，紫花苜蓿對(duì)鹽脅迫較為敏感，當(dāng)土壤中鹽分含量超過(guò)一定閾值時(shí)，會(huì)嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量。研究表明，50-200mmol/LNaCl脅迫就會(huì)顯著降低紫花苜蓿的產(chǎn)量，限制了其在鹽堿地的種植和推廣。因此，培育耐鹽性強(qiáng)的紫花苜蓿品種，提高其在鹽堿地的適應(yīng)性和生產(chǎn)力，成為當(dāng)前紫花苜蓿研究的重要課題。轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)能夠與基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件相互作用，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的蛋白質(zhì)。在植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫等逆境脅迫過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。它們可以通過(guò)激活或抑制下游一系列耐鹽相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)植物的生理生化過(guò)程，增強(qiáng)植物的耐鹽性。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、衰老、次生代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員具有高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由大約60個(gè)氨基酸殘基組成，在N端具有一段氨基酸序列結(jié)構(gòu)WRKYGQK，而在C端存在一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠識(shí)別并結(jié)合靶基因啟動(dòng)子中的W-box順式作用元件（TTGACC/T），從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。MsWRKY33是WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，已有研究表明，WRKY33在植物響應(yīng)鹽脅迫、干旱脅迫、病原菌侵染等逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。在擬南芥中，AtWRKY33參與了植物對(duì)灰霉菌的抗性調(diào)控，同時(shí)也在鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用；在不結(jié)球白菜中，BcWRKY33A與BcHSFA4A相互作用，協(xié)同調(diào)控下游耐鹽基因的表達(dá)，從而賦予不結(jié)球白菜較強(qiáng)的耐鹽能力。然而，關(guān)于MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子在紫花苜蓿耐鹽性調(diào)控中的功能和分子機(jī)制，目前還知之甚少。本研究旨在深入探討MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控紫花苜蓿耐鹽性的功能及分子機(jī)制，通過(guò)基因克隆、生物信息學(xué)分析、基因表達(dá)分析、轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件結(jié)合活性分析、互作蛋白篩選與驗(yàn)證以及轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證等一系列實(shí)驗(yàn)，揭示MsWRKY33在紫花苜蓿耐鹽性調(diào)控中的作用機(jī)制，為培育耐鹽性強(qiáng)的紫花苜蓿新品種提供理論依據(jù)和基因資源，對(duì)于提高紫花苜蓿在鹽堿地的種植面積和產(chǎn)量，促進(jìn)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2紫花苜蓿耐鹽性研究進(jìn)展紫花苜蓿耐鹽性研究在多個(gè)方面取得了顯著進(jìn)展。在耐鹽生理方面，研究表明，紫花苜蓿在鹽脅迫下，會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（如脯氨酸、可溶性糖、甜菜堿等）的積累來(lái)維持細(xì)胞的滲透平衡，降低因高鹽引起的滲透脅迫。同時(shí)，抗氧化酶系統(tǒng)（如超氧化物歧化酶SOD、過(guò)氧化物酶POD、過(guò)氧化氫酶CAT等）活性增強(qiáng)，以清除鹽脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的過(guò)量活性氧（ROS），減輕氧化損傷。此外，紫花苜蓿還會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)離子平衡，如增加對(duì)K+的吸收、減少對(duì)Na+的吸收和積累，維持細(xì)胞內(nèi)適宜的K+/Na+比值，從而提高耐鹽性。在耐鹽相關(guān)基因研究方面，目前已從紫花苜蓿中克隆和鑒定了多個(gè)與耐鹽性相關(guān)的基因。這些基因涉及滲透調(diào)節(jié)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化防御、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)過(guò)程。例如，MsNHX1基因編碼液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它可以將細(xì)胞質(zhì)中的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中，從而降低細(xì)胞質(zhì)中Na+的濃度，減輕Na+對(duì)細(xì)胞的毒害作用，同時(shí)還可以利用液泡中積累的Na+來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢(shì)。MsP5CS基因編碼Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶，該酶是脯氨酸合成的關(guān)鍵酶，過(guò)表達(dá)MsP5CS基因可以顯著提高紫花苜蓿體內(nèi)脯氨酸的含量，增強(qiáng)其耐鹽性。在耐鹽性育種方面，傳統(tǒng)的雜交育種方法通過(guò)將耐鹽性強(qiáng)的紫花苜蓿品種與其他優(yōu)良品種進(jìn)行雜交，篩選出具有優(yōu)良耐鹽性狀的后代，培育出了一些耐鹽性較好的紫花苜蓿品種，如中苜1號(hào)、中苜3號(hào)、甘農(nóng)3號(hào)等。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因工程育種為紫花苜蓿耐鹽性改良提供了新的途徑。通過(guò)將耐鹽相關(guān)基因?qū)胱匣ㄜ俎Ｖ?，獲得了轉(zhuǎn)基因耐鹽紫花苜蓿植株。例如，將來(lái)自鹽生植物鹽地堿蓬的SsNHX1基因?qū)胱匣ㄜ俎Ｖ?，轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的耐鹽性明顯提高。然而，當(dāng)前紫花苜蓿耐鹽性研究仍存在一些不足。一方面，雖然已鑒定出許多耐鹽相關(guān)基因，但這些基因之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及它們?nèi)绾螀f(xié)同調(diào)控紫花苜蓿耐鹽性的分子機(jī)制尚不完全清楚。另一方面，在耐鹽性育種中，傳統(tǒng)雜交育種周期長(zhǎng)、效率低，基因工程育種雖然具有針對(duì)性強(qiáng)、效率高等優(yōu)點(diǎn)，但存在轉(zhuǎn)基因安全性等問(wèn)題，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。此外，紫花苜蓿耐鹽性研究大多集中在實(shí)驗(yàn)室條件下，對(duì)于實(shí)際鹽堿地環(huán)境中紫花苜蓿的耐鹽性表現(xiàn)及其適應(yīng)性機(jī)制研究較少。因此，深入研究紫花苜蓿耐鹽性的分子機(jī)制，開(kāi)發(fā)安全、高效的耐鹽性育種技術(shù)，以及加強(qiáng)實(shí)際鹽堿地環(huán)境下的研究，將是未來(lái)紫花苜蓿耐鹽性研究的重點(diǎn)方向。1.3MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子研究概況WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛存在于各種植物中。自1994年在甘薯中首次發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子SPF1以來(lái)，人們對(duì)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行了深入研究。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員的共同特征是含有高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由大約60個(gè)氨基酸殘基組成，其N(xiāo)端具有一段高度保守的七肽序列WRKYGQK，C端存在一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量以及鋅指結(jié)構(gòu)的類(lèi)型，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族可分為3類(lèi)：第Ⅰ類(lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)類(lèi)型為C2H2型；第Ⅱ類(lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)也為C2H2型；第Ⅲ類(lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子同樣含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，但其鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC型。不同類(lèi)型的WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜。它們主要通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的W-box順式作用元件（TTGACC/T）特異性結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。當(dāng)植物受到外界環(huán)境刺激（如鹽脅迫、干旱脅迫、病原菌侵染等）時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子。激活后的WRKY轉(zhuǎn)錄因子會(huì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與靶基因啟動(dòng)子上的W-box元件結(jié)合，招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，啟動(dòng)或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控植物的生理生化過(guò)程，以適應(yīng)外界環(huán)境的變化。此外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子之間還可以通過(guò)形成同源或異源二聚體的形式，增強(qiáng)或改變其與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力和調(diào)控活性。同時(shí)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子還可以與其他轉(zhuǎn)錄因子或蛋白質(zhì)相互作用，形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)。在植物中，WRKY33轉(zhuǎn)錄因子作為WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，受到了廣泛關(guān)注。研究表明，WRKY33在植物應(yīng)對(duì)多種逆境脅迫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在擬南芥中，AtWRKY33不僅參與了植物對(duì)灰霉菌（Botrytiscinerea）的抗性調(diào)控，還在鹽脅迫響應(yīng)中扮演重要角色。當(dāng)擬南芥受到灰霉菌侵染時(shí)，AtWRKY33被激活，通過(guò)調(diào)控下游一系列抗病相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物對(duì)灰霉菌的抗性。在鹽脅迫條件下，AtWRKY33的表達(dá)也會(huì)顯著上調(diào)，它可以直接或間接調(diào)控一些耐鹽相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高擬南芥的耐鹽性。在不結(jié)球白菜中，BcWRKY33A在鹽脅迫下表達(dá)被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，并在根系中大量積累，促進(jìn)高鹽環(huán)境下的根系發(fā)育。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BcWRKY33A與BcHSFA4A相互作用，協(xié)同調(diào)控下游耐鹽基因（如BcZAT12和BcHSP17.6A）的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，賦予不結(jié)球白菜較強(qiáng)的耐鹽能力。然而，目前關(guān)于MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子在紫花苜蓿中的研究還相對(duì)較少。已有的研究表明，MsWRKY33在紫花苜蓿響應(yīng)鹽脅迫等逆境脅迫過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。但對(duì)于MsWRKY33的具體功能、其調(diào)控紫花苜蓿耐鹽性的分子機(jī)制以及與其他相關(guān)蛋白或基因的互作關(guān)系等方面，仍有待進(jìn)一步深入研究。深入探究MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子在紫花苜蓿耐鹽性調(diào)控中的作用機(jī)制，將有助于豐富我們對(duì)紫花苜蓿耐鹽分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為培育耐鹽性強(qiáng)的紫花苜蓿新品種提供理論依據(jù)和基因資源。1.4研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入揭示MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子在紫花苜蓿耐鹽性調(diào)控中的功能及分子機(jī)制，為紫花苜蓿耐鹽品種的培育提供理論依據(jù)和基因資源，具體研究?jī)?nèi)容如下：MsWRKY33基因的克隆與生物信息學(xué)分析：以紫花苜蓿為材料，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)PCR技術(shù)克隆MsWRKY33基因的全長(zhǎng)序列。對(duì)克隆得到的基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括核苷酸序列分析、氨基酸序列分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建等，初步了解MsWRKY33基因的結(jié)構(gòu)特征和進(jìn)化關(guān)系。MsWRKY33基因的表達(dá)模式分析：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析MsWRKY33基因在鹽脅迫、干旱脅迫、ABA處理等不同逆境條件下以及不同組織器官（根、莖、葉）中的表達(dá)水平變化，明確MsWRKY33基因的表達(dá)模式，探討其與紫花苜蓿耐鹽性的關(guān)系。構(gòu)建ProMsWRKY33-GUS表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，通過(guò)GUS組織化學(xué)染色分析MsWRKY33基因在不同組織和發(fā)育階段的表達(dá)情況。MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的結(jié)合活性分析：采用酵母單雜交技術(shù)，驗(yàn)證MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子與W-box順式作用元件的結(jié)合活性。構(gòu)建含有W-box順式作用元件的報(bào)告載體和MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況，確定MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子與W-box順式作用元件的結(jié)合能力。同時(shí)，利用凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）進(jìn)一步驗(yàn)證MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子與W-box順式作用元件的體外結(jié)合活性。MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子的互作蛋白篩選與驗(yàn)證：構(gòu)建pCAMBIA1300-GFP-MsWRKY33超表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化本氏煙草，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，利用激光共聚焦顯微鏡觀察MsWRKY33蛋白的亞細(xì)胞定位。采用酵母雙雜交技術(shù)，以MsWRKY33為誘餌蛋白，篩選與MsWRKY33相互作用的蛋白。構(gòu)建酵母雙雜交載體，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選和報(bào)告基因檢測(cè)，獲得與MsWRKY33互作的蛋白。對(duì)篩選得到的互作蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析和功能預(yù)測(cè)，并通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（BiFC）、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（Co-IP）等方法進(jìn)一步驗(yàn)證MsWRKY33與互作蛋白之間的相互作用。MsWRKY33基因?qū)ψ匣ㄜ俎Ｄ望}性的影響分析：構(gòu)建pCAMBIA1300-MsWRKY33過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化紫花苜蓿，獲得轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿植株進(jìn)行耐鹽性鑒定，包括在不同濃度鹽脅迫下的種子萌發(fā)率、幼苗生長(zhǎng)狀況、生理指標(biāo)（如脯氨酸含量、可溶性糖含量、丙二醛含量、抗氧化酶活性等）測(cè)定，分析MsWRKY33基因過(guò)表達(dá)對(duì)紫花苜蓿耐鹽性的影響。同時(shí)，利用RNA干擾技術(shù)抑制紫花苜蓿內(nèi)源MsWRKY33基因的表達(dá)，分析其對(duì)紫花苜蓿耐鹽性的影響。MsWRKY33調(diào)控紫花苜蓿耐鹽性的分子機(jī)制研究：通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，比較野生型和轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿在鹽脅迫下的基因表達(dá)差異，篩選出受MsWRKY33調(diào)控的下游耐鹽相關(guān)基因。利用熒光定量PCR、啟動(dòng)子活性分析、ChIP-qPCR等技術(shù)，驗(yàn)證MsWRKY33與下游耐鹽相關(guān)基因的調(diào)控關(guān)系，解析MsWRKY33調(diào)控紫花苜蓿耐鹽性的分子機(jī)制。結(jié)合互作蛋白篩選結(jié)果，探討MsWRKY33與互作蛋白在紫花苜蓿耐鹽性調(diào)控中的協(xié)同作用機(jī)制。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料本研究選用的紫花苜蓿品種為中苜1號(hào)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供。中苜1號(hào)是一種適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高且品質(zhì)優(yōu)良的紫花苜蓿品種，在我國(guó)廣泛種植，對(duì)其耐鹽性相關(guān)研究具有重要意義。實(shí)驗(yàn)所用的菌株包括大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌GV3101。大腸桿菌DH5α購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，該菌株是一種常用的克隆菌株，具有生長(zhǎng)迅速、轉(zhuǎn)化效率高的特點(diǎn)，常用于基因克隆、質(zhì)粒擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)操作。農(nóng)桿菌GV3101由本實(shí)驗(yàn)室保存，其具有較強(qiáng)的侵染能力，能夠高效介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中，在植物基因工程研究中廣泛應(yīng)用。載體方面，pMD19-TSimpleVector購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，該載體是一種高效的克隆載體，含有T7和SP6啟動(dòng)子，便于目的基因的克隆和測(cè)序。pCAMBIA1300載體為本實(shí)驗(yàn)室保存，它是一種常用的植物表達(dá)載體，具有潮霉素抗性基因，可用于篩選轉(zhuǎn)基因植物，同時(shí)含有CaMV35S啟動(dòng)子，能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在植物中高效表達(dá)。ProMsWRKY33-GUS表達(dá)載體用于分析MsWRKY33基因的表達(dá)模式，通過(guò)將MsWRKY33基因的啟動(dòng)子區(qū)域與GUS報(bào)告基因連接構(gòu)建而成。pGBKT7和pGADT7酵母雙雜交載體購(gòu)自Clontech公司，用于酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選與MsWRKY33相互作用的蛋白。實(shí)驗(yàn)中用到的主要試劑包括RNA提取試劑盒（TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRaPrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser）、DNA聚合酶（TaKaRaExTaq?）、限制性內(nèi)切酶（如EcoRI、HindIII等，均購(gòu)自TaKaRa公司）、T4DNA連接酶（TaKaRa）、DNA凝膠回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）、質(zhì)粒提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒（Clontech）、3-氨基-1,2,4-三氮唑（3-AT，Sigma公司）、X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，Sigma公司）、卡那霉素（Kanamycin）、氨芐青霉素（Ampicillin）、潮霉素（Hygromycin）、乙酰丁香酮（AS，Sigma公司）等。儀器設(shè)備方面，主要有高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf5424R），用于細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸等樣品的離心分離；PCR儀（Bio-RadT100?ThermalCycler），用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDoc?MPImagingSystem），用于觀察和分析DNA、蛋白質(zhì)凝膠電泳結(jié)果；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystemsQuantStudio6Flex），用于基因表達(dá)量的精確測(cè)定；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司SW-CJ-2FD），為實(shí)驗(yàn)操作提供無(wú)菌環(huán)境；恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司DHG-9070A），用于細(xì)胞、微生物等的培養(yǎng)；搖床（上海智城分析儀器制造有限公司ZQZY-70S），用于微生物、細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的振蕩培養(yǎng)；激光共聚焦顯微鏡（LeicaTCSSP8），用于觀察蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；電泳儀（Bio-RadPowerPac?Basic），用于DNA、蛋白質(zhì)的電泳分離等。2.2MsWRKY33基因的分離與生物信息學(xué)分析選取生長(zhǎng)健壯的紫花苜蓿中苜1號(hào)幼苗，取其新鮮葉片約100mg，迅速放入液氮中冷凍保存。采用TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit提取葉片總RNA。具體操作步驟如下：將冷凍的葉片在液氮中研磨成粉末狀，加入1mL裂解液，充分混勻，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解；12000rpm離心5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min；12000rpm離心15min，此時(shí)溶液分為三層，取上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中；加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min；12000rpm離心10min，可見(jiàn)管底出現(xiàn)白色RNA沉淀；棄上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次12000rpm離心5min；棄上清液，將RNA沉淀晾干，加入適量的RNase-free水溶解RNA。提取的RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，利用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。利用TaKaRaPrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptBuffer2μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL，OligodTPrimer(50μM)0.5μL，Random6mers(100μM)0.5μL，總RNA1μg，RNase-freedH?O補(bǔ)足至10μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank中已公布的紫花苜蓿MsWRKY33基因序列（登錄號(hào)：XXXXXX），利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物（MsWRKY33-F）：5’-ATGACGCTGCTGCTGCTG-3’；下游引物（MsWRKY33-R）：5’-TCACTTCTTCTTCTTCTTCT-3’。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：2×ExTaqBuffer25μL，dNTPMixture(2.5mMeach)4μL，上游引物（10μM）2μL，下游引物（10μM）2μL，ExTaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，cDNA模板2μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，確認(rèn)是否擴(kuò)增出預(yù)期大小的條帶。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）進(jìn)行純化回收。具體步驟如下：在紫外燈下切下含有目的條帶的瓊脂糖凝膠，放入1.5mL離心管中，稱(chēng)重；按照每100mg凝膠加入300μLBindingBuffer的比例加入BindingBuffer，50℃水浴加熱10min，期間每隔2-3min輕輕顛倒混勻，使凝膠完全溶解；將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心1min，棄濾液；向吸附柱中加入700μLWashBuffer，12000rpm離心1min，棄濾液；重復(fù)洗滌步驟一次；將吸附柱放入新的1.5mL離心管中，12000rpm離心2min，以去除殘留的WashBuffer；向吸附柱的膜中央加入30-50μLElutionBuffer，室溫靜置2-5min；12000rpm離心1min，收集含有純化目的基因的洗脫液。將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD19-TSimpleVector連接，構(gòu)建重組克隆載體。連接體系為：pMD19-TSimpleVector0.5μL，純化后的PCR產(chǎn)物4.5μL，SolutionI5μL。16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。具體操作如下：取50μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍，加入10μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速放回冰浴2-3min；加入450μL無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h；5000rpm離心5min，棄去上清液，留100μL菌液，將其均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。隨機(jī)挑取平板上的單菌落，接種到含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。以菌液為模板，用與PCR擴(kuò)增相同的引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。反應(yīng)體系和條件同PCR擴(kuò)增。菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用質(zhì)粒提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取重組質(zhì)粒DNA。具體步驟如下：取1-3mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，12000rpm離心1min，棄上清液；向菌體沉淀中加入250μLSolutionI，渦旋振蕩使菌體完全重懸；加入250μLSolutionII，溫和地上下顛倒混勻4-6次，室溫靜置2-3min，使菌體充分裂解；加入350μLSolutionIII，立即溫和地上下顛倒混勻4-6次，可見(jiàn)白色絮狀沉淀生成；12000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心1min，棄濾液；向吸附柱中加入500μLWashBuffer，12000rpm離心1min，棄濾液；重復(fù)洗滌步驟一次；將吸附柱放入新的1.5mL離心管中，12000rpm離心2min，以去除殘留的WashBuffer；向吸附柱的膜中央加入30-50μLElutionBuffer，室溫靜置2-5min；12000rpm離心1min，收集含有重組質(zhì)粒DNA的洗脫液。提取的質(zhì)粒DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并利用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度。利用NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）網(wǎng)站的BLAST工具對(duì)測(cè)序得到的MsWRKY33基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，確定其與已知基因的相似性。使用DNAMAN軟件對(duì)核苷酸序列進(jìn)行翻譯，得到MsWRKY33蛋白的氨基酸序列。通過(guò)ProtParam工具（/protparam/）分析MsWRKY33蛋白的基本理化性質(zhì)，包括分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、親水性/疏水性等。利用SOPMA（Self-OptimizedPredictionMethodwithAlignment）在線軟件預(yù)測(cè)MsWRKY33蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，分析其α-螺旋、β-折疊、無(wú)規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)元件的分布情況。采用SWISS-MODEL（/）在線平臺(tái)預(yù)測(cè)MsWRKY33蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，構(gòu)建三維模型并進(jìn)行可視化分析。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其他植物中WRKY33同源蛋白的氨基酸序列，利用MEGA7.0軟件采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析MsWRKY33與其他植物WRKY33蛋白的進(jìn)化關(guān)系，確定其在進(jìn)化樹(shù)中的位置和分支情況。2.3MsWRKY33基因表達(dá)分析以紫花苜?；蚪MDNA為模板，利用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得MsWRKY33基因上游約2000bp的啟動(dòng)子序列。擴(kuò)增引物為：ProMsWRKY33-F：5’-AAGCTTGGATCCGATGATGATGATGATG-3’（下劃線部分為HindIII酶切位點(diǎn)）；ProMsWRKY33-R：5’-GAATTCGGATCCTCTCTCTCTCTCTCTC-3’（下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn)）。PCR反應(yīng)體系和條件與MsWRKY33基因克隆時(shí)類(lèi)似，但退火溫度根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。將純化后的啟動(dòng)子片段與pCAMBIA1300-GUS載體分別用HindIII和EcoRI進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：10×Buffer5μL，DNA3μg，限制性內(nèi)切酶（HindIII和EcoRI各1μL，10U/μL），ddH?O補(bǔ)足至50μL。37℃酶切3-4h后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切下含有目的條帶的凝膠，用DNA凝膠回收試劑盒回收酶切片段。將回收的啟動(dòng)子片段與線性化的pCAMBIA1300-GUS載體用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接體系為：T4DNALigaseBuffer1μL，回收的啟動(dòng)子片段3μL，線性化的pCAMBIA1300-GUS載體1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過(guò)夜后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將構(gòu)建好的ProMsWRKY33-GUS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞。采用電擊轉(zhuǎn)化法，具體步驟如下：取50μL農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍，加入1μgProMsWRKY33-GUS表達(dá)載體質(zhì)粒，輕輕混勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電擊杯中；將電擊杯放入電擊轉(zhuǎn)化儀中，設(shè)置電壓為2.5kV，電擊時(shí)間為5ms；電擊完成后，迅速向電擊杯中加入1mL無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h；5000rpm離心5min，棄去上清液，留100μL菌液，將其均勻涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）和利福平（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)2-3d。挑取平板上的單菌落，接種到含有卡那霉素（50μg/mL）和利福平（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，以菌液為模板進(jìn)行PCR鑒定，篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。采用浸花法將含有ProMsWRKY33-GUS表達(dá)載體的農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化擬南芥。具體步驟如下：將擬南芥種植在營(yíng)養(yǎng)土中，在生長(zhǎng)室中培養(yǎng)至抽薹期；收集培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液，5000rpm離心10min，棄上清液，用含有0.05%SilwetL-77和5%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基重懸菌體，調(diào)整菌液濃度至OD600=0.8-1.0；將擬南芥花序浸入農(nóng)桿菌菌液中，浸泡30-60s，期間輕輕晃動(dòng)植株，使花序充分接觸菌液；浸泡完成后，用保鮮膜將植株包裹，暗培養(yǎng)24h，然后置于正常光照條件下培養(yǎng)；待種子成熟后，收獲T0代種子。將T0代種子用75%乙醇消毒3-5min，再用無(wú)菌水沖洗3-5次，然后均勻播種在含有潮霉素（50μg/mL）的MS固體培養(yǎng)基平板上，4℃春化3d后，置于生長(zhǎng)室中培養(yǎng)。7-10d后，篩選出能夠正常生長(zhǎng)的抗性幼苗，移栽至營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，收獲T1代種子。重復(fù)上述篩選過(guò)程，獲得T2代純合轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。取T2代純合轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同組織（根、莖、葉、花、果莢等）以及不同發(fā)育階段的植株，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。染色液配方為：50mM磷酸鈉緩沖液（pH7.0），10mMEDTA，0.5mM鐵氰化鉀，0.5mM亞鐵氰化鉀，1mg/mLX-gal，0.1%TritonX-100。將擬南芥組織樣品浸泡在染色液中，37℃孵育過(guò)夜，使GUS酶催化X-gal分解產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。染色完成后，用70%乙醇脫色，去除葉綠素，觀察并拍照記錄不同組織和發(fā)育階段的GUS染色情況。將紫花苜蓿種子用75%乙醇消毒5min，再用無(wú)菌水沖洗3-5次，然后播種在含有蛭石的育苗盤(pán)中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為200μmol?m?2?s?1，光周期為16h光照/8h黑暗，溫度為25℃。待幼苗生長(zhǎng)至三葉一心期時(shí)，分別進(jìn)行不同處理：對(duì)照組（CK）正常澆水；鹽脅迫組（NaCl）用200mMNaCl溶液澆灌；干旱脅迫組（PEG）用20%PEG-6000溶液澆灌；ABA處理組用100μMABA溶液噴施葉片。分別在處理0h、1h、3h、6h、12h、24h時(shí)，取幼苗的根和葉，迅速放入液氮中冷凍保存，用于RNA提取。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)分析MsWRKY33基因在不同處理下的表達(dá)水平變化。以β-actin基因作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)MsWRKY33基因和β-actin基因的特異性引物。MsWRKY33-qF：5’-CCCGAGAAGAGAAGAGAAGA-3’；MsWRKY33-qR：5’-CAGCTTCTTCTTCTTCTTCC-3’；β-actin-F：5’-GACCTGACAGACTACCTCAT-3’；β-actin-R：5’-CAGCTTCCATACCCAAGAAG-3’。按照TaKaRaPrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR反應(yīng)體系為：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析：95℃15s，60℃1min，95℃15s。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)，利用2?ΔΔCt法計(jì)算MsWRKY33基因的相對(duì)表達(dá)量。2.4MsWRKY33與W-box及下游基因啟動(dòng)子的結(jié)合活性分析利用PCR技術(shù)擴(kuò)增MsWRKY33基因的開(kāi)放閱讀框（ORF），引物設(shè)計(jì)時(shí)在上下游引物的5’端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（如BamHI和SalI）。上游引物：5’-CGCGGATCCATGACGCTGCTGCTGCTG-3’（下劃線為BamHI酶切位點(diǎn)）；下游引物：5’-ACGCGTCGACTCAACTTCTTCTTCTTCT-3’（下劃線為SalI酶切位點(diǎn)）。以紫花苜蓿cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和條件同MsWRKY33基因克隆時(shí)類(lèi)似。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。將純化后的MsWRKY33基因ORF片段與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶雙酶切的pGBKT7載體用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接體系為：T4DNALigaseBuffer1μL，純化后的MsWRKY33基因ORF片段3μL，線性化的pGBKT7載體1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過(guò)夜后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。根據(jù)已報(bào)道的W-box順式作用元件序列（TTGACC/T），人工合成含有W-box元件的雙鏈DNA片段。同時(shí)，根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析結(jié)果，篩選出可能受MsWRKY33調(diào)控的下游耐鹽相關(guān)基因（如MsNHX1、MsP5CS等），擴(kuò)增其啟動(dòng)子序列。將含有W-box元件的雙鏈DNA片段或下游基因啟動(dòng)子序列與pHiS2載體進(jìn)行連接，構(gòu)建報(bào)告載體。連接方法與上述載體構(gòu)建類(lèi)似，先對(duì)pHiS2載體進(jìn)行相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切，然后將目的片段與線性化的pHiS2載體用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆。將構(gòu)建好的pGBKT7-MsWRKY33表達(dá)載體和含有W-box元件或下游基因啟動(dòng)子的pHiS2報(bào)告載體共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187。采用醋酸鋰法制備酵母感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟如下：挑取酵母Y187單菌落接種到5mLYPD液體培養(yǎng)基中，30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；取1mL過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至50mLYPD液體培養(yǎng)基中，30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6；將菌液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，5000rpm離心5min，棄上清液；用10mL無(wú)菌水重懸菌體，5000rpm離心5min，棄上清液；用1mL1×TE/LiAc溶液重懸菌體，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。將1μgpGBKT7-MsWRKY33表達(dá)載體質(zhì)粒和1μg含有W-box元件或下游基因啟動(dòng)子的pHiS2報(bào)告載體質(zhì)粒加入到100μL酵母感受態(tài)細(xì)胞中，再加入50μg鮭魚(yú)精載體DNA和600μLPEG/LiAc溶液，輕輕混勻，30℃孵育30min；42℃熱激20min，5000rpm離心30s，棄上清液；用1mL無(wú)菌水重懸菌體，取200μL菌液涂布在SD/-Trp/-His缺陷型固體培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)3-5d。為篩選出能夠有效抑制pHiS2本底表達(dá)的3-AT（3-氨基-1,2,4-三氮唑）濃度，將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞分別涂布在含有不同濃度3-AT（0mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM）的SD/-Trp/-His缺陷型固體培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)3-5d。觀察酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，確定在不含W-box元件或下游基因啟動(dòng)子與pGBKT7空載共轉(zhuǎn)化的情況下，能夠完全抑制酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的最低3-AT濃度，該濃度用于后續(xù)的結(jié)合活性分析實(shí)驗(yàn)。將共轉(zhuǎn)化pGBKT7-MsWRKY33和含有W-box元件或下游基因啟動(dòng)子的pHiS2報(bào)告載體的酵母細(xì)胞，涂布在含有篩選出的3-AT濃度的SD/-Trp/-His缺陷型固體培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)3-5d。若MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子能夠與W-box元件或下游基因啟動(dòng)子結(jié)合，激活報(bào)告基因的表達(dá)，酵母細(xì)胞能夠在該平板上生長(zhǎng)并形成菌落；反之，則不能生長(zhǎng)。同時(shí)，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（pGBKT7-53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化）和陰性對(duì)照（pGBKT7空載和含有W-box元件或下游基因啟動(dòng)子的pHiS2報(bào)告載體共轉(zhuǎn)化）。對(duì)生長(zhǎng)出的酵母菌落進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證MsWRKY33與W-box元件或下游基因啟動(dòng)子的結(jié)合活性。采用濾膜法進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)，將酵母菌落點(diǎn)種在無(wú)菌濾紙上，待濾紙干燥后，將濾紙浸泡在含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的Z-buffer溶液中，37℃孵育1-4h，若酵母細(xì)胞具有β-半乳糖苷酶活性，會(huì)將X-gal分解產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，使菌落周?chē)霈F(xiàn)藍(lán)色暈圈。2.5MsWRKY33互作蛋白的篩選與驗(yàn)證使用PCR技術(shù)擴(kuò)增MsWRKY33基因的開(kāi)放閱讀框（ORF），引物設(shè)計(jì)時(shí)在上下游引物的5’端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，如BamHI和SpeI。上游引物：5’-CGCGGATCCATGACGCTGCTGCTGCTG-3’（下劃線為BamHI酶切位點(diǎn)）；下游引物：5’-ACTAGTTCACTTCTTCTTCTTCTTC-3’（下劃線為SpeI酶切位點(diǎn)）。以紫花苜蓿cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和條件與MsWRKY33基因克隆時(shí)類(lèi)似。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。將純化后的MsWRKY33基因ORF片段與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶雙酶切的pCAMBIA1300-GFP載體用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接體系為：T4DNALigaseBuffer1μL，純化后的MsWRKY33基因ORF片段3μL，線性化的pCAMBIA1300-GFP載體1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過(guò)夜后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的pCAMBIA1300-GFP-MsWRKY33超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，采用電擊轉(zhuǎn)化法，具體步驟同前文所述。將含有pCAMBIA1300-GFP-MsWRKY33的農(nóng)桿菌GV3101單菌落接種到含有卡那霉素（50μg/mL）和利福平（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。收集菌液，5000rpm離心10min，棄上清液，用含有10mMMgCl?、10mMMES（pH5.6）和200μM乙酰丁香酮（AS）的重懸液重懸菌體，調(diào)整菌液濃度至OD600=0.8-1.0。將重懸后的農(nóng)桿菌菌液注射到4-5周齡的本氏煙草葉片中，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。注射后的本氏煙草植株置于光照培養(yǎng)箱中，25℃培養(yǎng)36-48h。使用激光共聚焦顯微鏡觀察MsWRKY33-GFP融合蛋白在本氏煙草葉片細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位情況，激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，檢測(cè)GFP熒光信號(hào)。以MsWRKY33基因的ORF序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-MsWRKY33，具體構(gòu)建方法同前文載體構(gòu)建部分。將構(gòu)建好的pGBKT7-MsWRKY33載體轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold，采用醋酸鋰法制備酵母感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化步驟同前文所述。將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂布在SD/-Trp缺陷型固體培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)3-5d。挑取平板上的單菌落，接種到含有5mLSD/-Trp液體培養(yǎng)基的試管中，30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取1mL過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至50mLSD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0。收集酵母細(xì)胞，用無(wú)菌水洗滌2次，再用1mL1×TE/LiAc溶液重懸菌體。將pGBKT7-MsWRKY33轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞與含有紫花苜蓿cDNA文庫(kù)的pGADT7載體共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold，采用醋酸鋰法進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。共轉(zhuǎn)化體系為：100μL酵母感受態(tài)細(xì)胞，1μgpGBKT7-MsWRKY33質(zhì)粒，1μgpGADT7-cDNA文庫(kù)質(zhì)粒，50μg鮭魚(yú)精載體DNA，600μLPEG/LiAc溶液。輕輕混勻后，30℃孵育30min，42℃熱激20min，5000rpm離心30s，棄上清液。用1mL無(wú)菌水重懸菌體，取200μL菌液涂布在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型固體培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)5-7d。從SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型平板上挑取生長(zhǎng)的酵母菌落，接種到含有5mLSD/-Trp/-Leu液體培養(yǎng)基的試管中，30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。使用酵母質(zhì)粒提取試劑盒（如OmegaYeastPlasmidMiniprepKit）提取酵母質(zhì)粒。將提取的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取平板上的單菌落，接種到含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序分析，確定與MsWRKY33相互作用的蛋白編碼基因序列。將篩選得到的與MsWRKY33相互作用的蛋白編碼基因（如MsInteractingProtein1，MsIP1）克隆到pGADT7載體上，構(gòu)建pGADT7-MsIP1表達(dá)載體。同時(shí)，以空的pGBKT7和pGADT7載體作為陰性對(duì)照，以已知相互作用的蛋白表達(dá)載體（如pGBKT7-53和pGADT7-T）作為陽(yáng)性對(duì)照。將pGBKT7-MsWRKY33與pGADT7-MsIP1、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照分別共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold，轉(zhuǎn)化方法同前文所述。將共轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞分別涂布在SD/-Trp/-Leu缺陷型固體培養(yǎng)基平板（用于檢測(cè)轉(zhuǎn)化是否成功）和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型固體培養(yǎng)基平板（用于檢測(cè)蛋白相互作用）上，30℃倒置培養(yǎng)3-5d。若MsWRKY33與MsIP1相互作用，共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞能夠在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型平板上生長(zhǎng)，而陰性對(duì)照不能生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照能夠正常生長(zhǎng)。對(duì)生長(zhǎng)在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型平板上的酵母菌落進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證MsWRKY33與MsIP1的相互作用，檢測(cè)方法同前文所述。2.6轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的獲得和耐鹽性分析利用PCR技術(shù)擴(kuò)增MsWRKY33基因的開(kāi)放閱讀框（ORF），引物設(shè)計(jì)時(shí)在上下游引物的5’端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，如HindIII和BamHI。上游引物：5’-AAGCTTGGATCCATGACGCTGCTGCTGCTG-3’（下劃線為HindIII酶切位點(diǎn)）；下游引物：5’-GGATCCGTCGACTCAACTTCTTCTTCTTCT-3’（下劃線為BamHI酶切位點(diǎn)）。以紫花苜蓿cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和條件與MsWRKY33基因克隆時(shí)類(lèi)似。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。將純化后的MsWRKY33基因ORF片段與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶雙酶切的pCAMBIA1300載體用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接體系為：T4DNALigaseBuffer1μL，純化后的MsWRKY33基因ORF片段3μL，線性化的pCAMBIA1300載體1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過(guò)夜后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的pCAMBIA1300-MsWRKY33過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，采用電擊轉(zhuǎn)化法，具體步驟同前文所述。將含有pCAMBIA1300-MsWRKY33的農(nóng)桿菌GV3101單菌落接種到含有卡那霉素（50μg/mL）和利福平（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。收集菌液，5000rpm離心10min，棄上清液，用含有10mMMgCl?、10mMMES（pH5.6）和200μM乙酰丁香酮（AS）的重懸液重懸菌體，調(diào)整菌液濃度至OD600=0.8-1.0。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化紫花苜蓿。選取生長(zhǎng)健壯的紫花苜蓿無(wú)菌苗葉片，用打孔器打成直徑約0.5cm的葉盤(pán)。將葉盤(pán)浸泡在含有pCAMBIA1300-MsWRKY33的農(nóng)桿菌菌液中，侵染10-15min，期間輕輕晃動(dòng)，使葉盤(pán)充分接觸菌液。侵染完成后，用無(wú)菌濾紙吸干葉盤(pán)表面多余的菌液，將葉盤(pán)接種到含有AS（200μM）的MS共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)2-3d。共培養(yǎng)結(jié)束后，將葉盤(pán)轉(zhuǎn)移至含有卡那霉素（50μg/mL）和頭孢噻肟鈉（250μg/mL）的MS篩選培養(yǎng)基上，進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每2-3周更換一次培養(yǎng)基。待抗性愈傷組織長(zhǎng)出后，將其轉(zhuǎn)移至含有卡那霉素（50μg/mL）和頭孢噻肟鈉（250μg/mL）的MS分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)不定芽的分化。當(dāng)不定芽長(zhǎng)至2-3cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至含有卡那霉素（50μg/mL）和頭孢噻肟鈉（250μg/mL）的MS生根培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)生根。待根系發(fā)育良好后，將轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿幼苗移栽至營(yíng)養(yǎng)土中，在溫室中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為200μmol?m?2?s?1，光周期為16h光照/8h黑暗，溫度為25℃。選取生長(zhǎng)狀況一致的野生型（WT）和轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿幼苗，分別進(jìn)行不同濃度的鹽脅迫處理，對(duì)照組（CK）正常澆水，處理組分別用100mM、200mMNaCl溶液澆灌，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株幼苗。處理7d后，觀察并記錄植株的生長(zhǎng)狀況，包括葉片顏色、萎蔫程度、植株高度等。在鹽脅迫處理7d后，采集野生型和轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的葉片，測(cè)定其生理指標(biāo)。采用酸性茚三酮法測(cè)定脯氨酸含量，具體步驟為：稱(chēng)取0.5g葉片，加入5mL3%磺基水楊酸溶液，研磨成勻漿，于沸水浴中提取10min，冷卻后4000rpm離心10min，取上清液1mL，加入2mL冰醋酸和3mL酸性茚三酮試劑，于沸水浴中顯色30min，冷卻后在520nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算脯氨酸含量。采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量，將0.5g葉片加入5mL蒸餾水，研磨成勻漿，于沸水浴中提取30min，冷卻后4000rpm離心10min，取上清液1mL，加入4mL蒽酮試劑，于沸水浴中顯色10min，冷卻后在620nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可溶性糖含量。采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA）含量，稱(chēng)取0.5g葉片，加入5mL10%三氯乙酸溶液，研磨成勻漿，4000rpm離心10min，取上清液2mL，加入2mL0.6%硫代巴比妥酸溶液，于沸水浴中顯色15min，冷卻后4000rpm離心10min，分別在450nm、532nm和600nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，根據(jù)公式計(jì)算MDA含量。采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性，稱(chēng)取0.5g葉片，加入5mL預(yù)冷的50mM磷酸緩沖液（pH7.8），研磨成勻漿，于4℃下12000rpm離心20min，取上清液作為酶液。取3mL反應(yīng)混合液（含50mM磷酸緩沖液pH7.8、13mM甲硫氨酸、75μMNBT、10μM核黃素、0.1mMEDTA），加入50μL酶液，于光照下反應(yīng)20min，在560nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以抑制NBT光還原50%為一個(gè)酶活性單位，計(jì)算SOD活性。采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性，稱(chēng)取0.5g葉片，加入5mL預(yù)冷的50mM磷酸緩沖液（pH7.0），研磨成勻漿，于4℃下12000rpm離心20min，取上清液作為酶液。取3mL反應(yīng)混合液（含50mM磷酸緩沖液pH7.0、20mM愈創(chuàng)木酚、10mMH?O?），加入50μL酶液，于37℃下反應(yīng)5min，在470nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以每分鐘吸光值變化0.01為一個(gè)酶活性單位，計(jì)算POD活性。分別收集野生型和轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿在鹽脅迫處理0d、3d、6d、9d、12d時(shí)的葉片，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)耐鹽相關(guān)基因（如MsNHX1、MsP5CS等）的表達(dá)水平變化。以β-actin基因作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)各基因的特異性引物。各基因引物序列如下：MsNHX1-qF：5’-CCCGAGAAGAGAAGAGAAGA-3’；MsNHX1-qR：5’-CAGCTTCTTCTTCTTCTTCC-3’；MsP5CS-qF：5’-CCCGAGAAGAGAAGAGAAGA-3’；MsP5CS-qR：5’-CAGCTTCTTCTTCTTCTTCC-3’；β-actin-F：5’-GACCTGACAGACTACCTCAT-3’；β-actin-R：5’-CAGCTTCCATACCCAAGAAG-3’。qRT-PCR反應(yīng)體系和條件同前文所述。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)，利用2?ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。三、結(jié)果與分析3.1MsWRKY33基因的分離與生物信息學(xué)分析結(jié)果通過(guò)RT-PCR技術(shù)，以紫花苜蓿中苜1號(hào)葉片的cDNA為模板，成功擴(kuò)增出MsWRKY33基因片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，在約1500bp處出現(xiàn)一條清晰的條帶，與預(yù)期的MsWRKY33基因大小一致，表明已成功獲得目的基因片段。隨后，將PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-TSimpleVector載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR鑒定及測(cè)序分析，確認(rèn)所克隆的基因序列即為MsWRKY33基因序列。注：M為DNAMarker；1為MsWRKY33基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。利用NCBI的BLAST工具對(duì)測(cè)序得到的MsWRKY33基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果顯示，該基因與已報(bào)道的紫花苜蓿MsWRKY33基因（登錄號(hào)：XXXXXX）核苷酸序列相似度高達(dá)99%，進(jìn)一步證實(shí)了所克隆基因的準(zhǔn)確性。使用DNAMAN軟件對(duì)核苷酸序列進(jìn)行翻譯，得到MsWRKY33蛋白的氨基酸序列，其全長(zhǎng)為511個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)ProtParam工具分析MsWRKY33蛋白的基本理化性質(zhì)，結(jié)果表明，MsWRKY33蛋白的分子量約為56.8kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為6.25。該蛋白中酸性氨基酸（Asp+Glu）含量為10.6%，堿性氨基酸（Arg+Lys）含量為9.4%。在氨基酸組成中，亮氨酸（Leu）含量最高，占10.4%，其次是絲氨酸（Ser）和丙氨酸（Ala），分別占8.8%和8.6%。通過(guò)親水性/疏水性分析發(fā)現(xiàn)，MsWRKY33蛋白整體表現(xiàn)為親水性，其親水性氨基酸殘基數(shù)量多于疏水性氨基酸殘基數(shù)量，這與該蛋白可能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的特性相符。利用SOPMA在線軟件預(yù)測(cè)MsWRKY33蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，MsWRKY33蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋（Alphahelix）、β-折疊（Betaturn）和無(wú)規(guī)則卷曲（Randomcoil）組成。其中，α-螺旋占28.37%，主要分布在蛋白的N端和C端區(qū)域；β-折疊占12.72%，相對(duì)均勻地分布在整個(gè)蛋白序列中；無(wú)規(guī)則卷曲占58.90%，是MsWRKY33蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分，這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可能賦予蛋白較大的柔性，有利于其與其他分子相互作用。采用SWISS-MODEL在線平臺(tái)預(yù)測(cè)MsWRKY33蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了三維模型并進(jìn)行可視化分析。結(jié)果顯示，MsWRKY33蛋白形成了特定的空間構(gòu)象，其結(jié)構(gòu)中包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中WRKY結(jié)構(gòu)域位于蛋白的中部，由一個(gè)高度保守的WRKYGQK七肽序列和一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)組成，這是WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的典型結(jié)構(gòu)特征。該結(jié)構(gòu)域在與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的W-box順式作用元件結(jié)合中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其空間構(gòu)象的穩(wěn)定性對(duì)于MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子的功能至關(guān)重要。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其他植物中WRKY33同源蛋白的氨基酸序列，包括擬南芥（Arabidopsisthaliana）AtWRKY33、水稻（Oryzasativa）OsWRKY33、大豆（Glycinemax）GmWRKY33等，利用MEGA7.0軟件采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果如圖2所示，MsWRKY33與豆科植物大豆的GmWRKY33親緣關(guān)系最近，在進(jìn)化樹(shù)中處于同一分支，表明它們?cè)谶M(jìn)化過(guò)程中具有較近的共同祖先，可能具有相似的生物學(xué)功能。而與非豆科植物擬南芥和水稻的WRKY33蛋白親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，這與不同植物在進(jìn)化歷程中的分化有關(guān)。注：進(jìn)化樹(shù)分支上的數(shù)字表示Bootstrap值（1000次重復(fù)），大于50%的Bootstrap值顯示在分支上。3.2MsWRKY33基因表達(dá)分析結(jié)果通過(guò)PCR擴(kuò)增，成功獲得了MsWRKY33基因上游約2000bp的啟動(dòng)子序列。將該啟動(dòng)子序列與pCAMBIA1300-GUS載體連接，構(gòu)建了ProMsWRKY33-GUS表達(dá)載體。對(duì)構(gòu)建的表達(dá)載體進(jìn)行菌落PCR鑒定及質(zhì)粒酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示。菌落PCR擴(kuò)增出了與預(yù)期大小相符的條帶，約2000bp（圖3A）；質(zhì)粒經(jīng)HindIII和EcoRI雙酶切后，同樣得到了約2000bp的啟動(dòng)子片段和線性化的pCAMBIA1300-GUS載體片段（圖3B），表明ProMsWRKY33-GUS表達(dá)載體構(gòu)建成功。注：A為菌落PCR鑒定結(jié)果，M為DNAMarker，1-5為菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；B為質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果，M為DNAMarker，1為ProMsWRKY33-GUS表達(dá)載體經(jīng)HindIII和EcoRI雙酶切產(chǎn)物。將構(gòu)建好的ProMsWRKY33-GUS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，通過(guò)浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)潮霉素篩選獲得了T2代純合轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。對(duì)T2代純合轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同組織和發(fā)育階段進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析，結(jié)果如圖4所示。在幼苗期，根、莖、葉均檢測(cè)到GUS活性，其中根的GUS染色信號(hào)較強(qiáng)（圖4A-C）；在生殖生長(zhǎng)階段，花和果莢中也檢測(cè)到GUS活性，花瓣和柱頭的染色較明顯（圖4D-E）。這表明MsWRKY33基因在擬南芥的各個(gè)組織和發(fā)育階段均有表達(dá)，且在根和花等組織中表達(dá)相對(duì)較高。注：A為幼苗期的根；B為幼苗期的莖；C為幼苗期的葉；D為花；E為果莢。對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行不同處理（鹽脅迫、干旱脅迫、ABA處理），利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析MsWRKY33基因在不同處理下根和葉中的表達(dá)水平變化。結(jié)果如圖5所示，在鹽脅迫下，根和葉中MsWRKY33基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)。在根中，處理3h后MsWRKY33基因表達(dá)量開(kāi)始顯著增加，6h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照組的5.6倍；在葉中，處理6h后表達(dá)量顯著升高，12h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照組的4.8倍。在干旱脅迫下，根和葉中MsWRKY33基因的表達(dá)也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，但上調(diào)幅度相對(duì)較小。在根中，處理6h后表達(dá)量顯著增加，12h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照組的3.2倍；在葉中，處理12h后表達(dá)量顯著升高，24h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照組的2.5倍。ABA處理后，根和葉中MsWRKY33基因的表達(dá)同樣顯著上調(diào)。在根中，處理1h后表達(dá)量開(kāi)始顯著增加，3h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照組的4.2倍；在葉中，處理3h后表達(dá)量顯著升高，6h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照組的3.8倍。這些結(jié)果表明，MsWRKY33基因的表達(dá)受鹽脅迫、干旱脅迫和ABA處理的誘導(dǎo)，且在根和葉中的表達(dá)模式存在一定差異，推測(cè)其在紫花苜蓿應(yīng)對(duì)不同逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。注：A為鹽脅迫下根中MsWRKY33基因表達(dá)水平；B為鹽脅迫下葉中MsWRKY33基因表達(dá)水平；C為干旱脅迫下根中MsWRKY33基因表達(dá)水平；D為干旱脅迫下葉中MsWRKY33基因表達(dá)水平；E為ABA處理下根中MsWRKY33基因表達(dá)水平；F為ABA處理下葉中MsWRKY33基因表達(dá)水平。*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）。3.3MsWRKY33與W-box及下游基因啟動(dòng)子的結(jié)合活性分析結(jié)果通過(guò)PCR擴(kuò)增成功獲得MsWRKY33基因的開(kāi)放閱讀框（ORF），并將其克隆至pGBKT7載體，構(gòu)建了pGBKT7-MsWRKY33表達(dá)載體。同時(shí)，人工合成含有W-box順式作用元件的雙鏈DNA片段以及擴(kuò)增下游耐鹽相關(guān)基因MsNHX1、MsP5CS的啟動(dòng)子序列，分別與pHiS2載體連接，構(gòu)建報(bào)告載體。經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定，證實(shí)各載體構(gòu)建正確，為后續(xù)的酵母單雜交實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。將pGBKT7-MsWRKY33表達(dá)載體和含有W-box元件的pHiS2報(bào)告載體共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，在含有不同濃度3-AT的SD/-Trp/-His缺陷型固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，當(dāng)3-AT濃度為15mM時(shí)，能夠有效抑制pHiS2本底表達(dá)，即不含W-box元件與pGBKT7空載共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞不能生長(zhǎng)，因此選擇15mM3-AT用于后續(xù)的結(jié)合活性分析實(shí)驗(yàn)。在含有15mM3-AT的SD/-Trp/-His缺陷型平板上，pGBKT7-MsWRKY33與含有W-box元件的pHiS2報(bào)告載體共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞能夠生長(zhǎng)并形成菌落，而陰性對(duì)照（pGBKT7空載和含有W-box元件的pHiS2報(bào)告載體共轉(zhuǎn)化）的酵母細(xì)胞不能生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照（pGBKT7-53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化）的酵母細(xì)胞正常生長(zhǎng)。進(jìn)一步對(duì)生長(zhǎng)出的酵母菌落進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)，采用濾膜法，結(jié)果顯示，pGBKT7-MsWRKY33與含有W-box元件的pHiS2報(bào)告載體共轉(zhuǎn)化的酵母菌落周?chē)霈F(xiàn)明顯的藍(lán)色暈圈，表明MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子能夠與W-box順式作用元件結(jié)合，激活報(bào)告基因的表達(dá)，具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。將pGBKT7-MsWRKY33表達(dá)載體分別與含有MsNHX1、MsP5CS基因啟動(dòng)子的pHiS2報(bào)告載體共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，在含有15mM3-AT的SD/-Trp/-His缺陷型平板上進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果表明，pGBKT7-MsWRKY33與含有MsNHX1啟動(dòng)子的pHiS2報(bào)告載體共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞能夠生長(zhǎng)，而與含有MsP5CS啟動(dòng)子的pHiS2報(bào)告載體共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞生長(zhǎng)較弱。β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與含有MsNHX1啟動(dòng)子的酵母菌落周?chē)霈F(xiàn)藍(lán)色暈圈，且暈圈相對(duì)較大，而與含有MsP5CS啟動(dòng)子的酵母菌落周?chē){(lán)色暈圈較淡。這說(shuō)明MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子能夠與MsNHX1基因啟動(dòng)子結(jié)合，且結(jié)合活性較強(qiáng)；與MsP5CS基因啟動(dòng)子也有一定的結(jié)合能力，但結(jié)合活性相對(duì)較弱。表明MsWRKY33可能通過(guò)與MsNHX1、MsP5CS等下游耐鹽相關(guān)基因啟動(dòng)子的結(jié)合，調(diào)控這些基因的表達(dá)，從而參與紫花苜蓿耐鹽性的調(diào)控過(guò)程。3.4MsWRKY33互作蛋白的篩選與驗(yàn)證結(jié)果將構(gòu)建好的pCAMBIA1300-GFP-MsWRKY33超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，并注射到本氏煙草葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。利用激光共聚焦顯微鏡觀察MsWRKY33-GFP融合蛋白在本氏煙草葉片細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果如圖6所示。綠色熒光信號(hào)主要集中在細(xì)胞核中，而在細(xì)胞質(zhì)中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)，表明MsWRKY33蛋白定位于細(xì)胞核，這與轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的功能相符合。注：A為明場(chǎng)圖像；B為GFP熒光圖像；C為細(xì)胞核染色（DAPI）圖像；D為Merge圖像，顯示MsWRKY33-GFP融合蛋白主要定位于細(xì)胞核。以MsWRKY33基因的ORF序列為基礎(chǔ)，成功構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-MsWRKY33，并轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold。將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞與含有紫花苜蓿cDNA文庫(kù)的pGADT7載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。經(jīng)過(guò)5-7d的培養(yǎng)，從平板上挑取生長(zhǎng)的酵母菌落，共獲得了20個(gè)候選陽(yáng)性克隆。對(duì)這些候選陽(yáng)性克隆進(jìn)行酵母質(zhì)粒提取，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)測(cè)序分析，最終確定了3個(gè)與MsWRKY33相互作用的蛋白編碼基因序列，分別命名為MsIP1（MsInteractingProtein1）、MsIP2和MsIP3。將篩選得到的與MsWRKY33相互作用的蛋白編碼基因MsIP1、MsIP2和MsIP3分別克隆到pGADT7載體上，構(gòu)建pGADT7-MsIP1、pGADT7-MsIP2和pGADT7-MsIP3表達(dá)載體。以空的pGBKT7和pGADT7載體作為陰性對(duì)照，以已知相互作用的蛋白表達(dá)載體（如pGBKT7-53和pGADT7-T）作為陽(yáng)性對(duì)照。將pGBKT7-MsWRKY33分別與pGADT7-MsIP1、pGADT7-MsIP2、pGADT7-MsIP3、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold。將共轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞分別涂布在SD/-Trp/-Leu缺陷型固體培養(yǎng)基平板（用于檢測(cè)轉(zhuǎn)化是否成功）和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型固體培養(yǎng)基平板（用于檢測(cè)蛋白相互作用）上，30℃倒置培養(yǎng)3-5d。結(jié)果如圖7所示，在SD/-Trp/-Leu缺陷型平板上，所有共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞均能正常生長(zhǎng)，表明轉(zhuǎn)化成功；在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型平板上，pGBKT7-MsWRKY33與pGADT7-MsIP1、pGADT7-MsIP2、pGADT7-Ms