15I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件主要起草人：張?jiān)旅贰②w世華、宋越、白帆、王娜、戴伶俐、張帆、楊斌、劉1間接ELISA方法檢測(cè)羊溶血性曼氏桿菌抗體本文件規(guī)定了應(yīng)用間接ELISA檢測(cè)羊溶血性曼氏桿菌抗本文件適用于羊溶血性曼氏桿菌PlpE蛋白3.1或抗原與相應(yīng)的抗原或抗體形成酶標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物，在一定底物參與下，復(fù)合物上的酶催化底3.2辣根過氧化物酶horseradish與堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）常被用于免疫酶技術(shù)中的抗體或抗抗體的標(biāo)記，而3.33.423.53.63.73.84.2陽性血清分離鑒定并經(jīng)測(cè)序確定為溶血性曼氏桿菌的菌液制備全菌滅活抗原，并用其免疫3月齡羔羊制備標(biāo)4.3陰性血清4,4酶結(jié)合物4.5碳酸鹽包被液4,6磷酸鹽緩沖溶液調(diào)整pH值為7.4，超純水定容至1000mL，121℃高壓蒸汽滅4.7封閉液稱取脫脂乳5.0g，溶于100mL磷酸鹽34.8洗滌液4.9稀釋液4.10底物液A稱取TMB200.0mg，無水乙醇（或二甲基亞砜）100mL，加超純水至10004.11底物液B4.12終止液量取5.6mL濃硫酸（18mol/L）與94.4mL超純水混合，冷卻至室4.13TSA稱取胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化鈉5.0g，超純水1000mL，混合，微熱溶解，調(diào)節(jié)pH值為7.3，加入15.0g瓊脂，加熱融化后，121℃高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至約60℃,在無菌操作條件下傾注約20mL至無菌平皿中。加蓋后在室溫放至凝固。制備好的培養(yǎng)基宜在2℃~8℃4,14TSB稱取胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化鈉5.0g，超純水1000mL，混合解，調(diào)節(jié)pH值為7.3，121℃高壓蒸汽滅菌15min。制備好的培養(yǎng)基宜在2℃~8℃保存。4.15LB液體培養(yǎng)基值為7.3，121℃高壓蒸汽滅菌15min。制備好的培養(yǎng)基宜在2℃~8℃保存。求下傾注約20mL至無菌平皿中。加蓋后在室溫放至凝固。制備好的培養(yǎng)基宜在2℃~8℃保存。5.3天平：稱量范圍0g~500g，讀數(shù)精確度0.01g。5.5低溫離心機(jī)。45.10冰箱。采血器室溫靜置2h，待血液凝固后，將其放入冰箱2℃~8℃3h后，4000r/min離心10min，用移6.2樣本存放及運(yùn)送血清樣本若在一周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，可在冰箱中2℃~8℃保存，落接種于含5%馬血清TSB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)12h~16h后，用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取全菌DNA。28b原核表達(dá)載體分別用NdeI和XhoI限制性內(nèi)切酶酶切，經(jīng)連接酶連接并轉(zhuǎn)化于大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞將含有質(zhì)粒PlpE-pET-28b的大腸桿菌原核表達(dá)載體在含有終濃度為100振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6，加入IPTG使其終濃度為1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心收集57.2ELISA檢測(cè)100μL/孔加入至酶聯(lián)反應(yīng)板，置4℃冰箱過夜，次日甩掉包被液，用PBST洗滌酶聯(lián)反應(yīng)板3次。7.3判定標(biāo)準(zhǔn)的確定在已經(jīng)確定的間接ELISA條件下，對(duì)經(jīng)間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)抗體陰性的20份羊血清，用重組PlpE抗原S/P=(樣品血清A值－陰性血清A值)/(陽