ZNF8助力乳腺癌轉(zhuǎn)移：TGFβ信號(hào)通路下的分子奧秘與臨床啟示一、引言1.1研究背景1.1.1乳腺癌的現(xiàn)狀乳腺癌作為全球女性中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。近年來，隨著生活方式的改變以及人口老齡化的加劇，乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬例，超過了肺癌（220萬例），成為全球最常見的癌癥，其發(fā)病率約占女性全部惡性腫瘤的24.5%。在我國，乳腺癌同樣是女性最常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例約為42萬例，且發(fā)病率增長速度高于全球平均水平。乳腺癌不僅發(fā)病率高，其死亡率也不容忽視。全球范圍內(nèi)，每年約有68.5萬人死于乳腺癌，死亡率在女性癌癥相關(guān)死亡原因中位居前列。在我國，乳腺癌患者的死亡率雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步有所下降，但仍然是女性癌癥死亡的主要原因之一。早期乳腺癌患者經(jīng)過積極治療，5年生存率可高達(dá)90%以上，但一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后則急劇惡化，5年生存率降至20%-30%左右。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因，約90%的乳腺癌患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移。乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位包括肺、骨、腦和肝等，這些遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移會(huì)引發(fā)一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥，極大地降低患者的生活質(zhì)量，最終導(dǎo)致患者死亡。例如，乳腺癌肺轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致呼吸功能衰竭，骨轉(zhuǎn)移會(huì)引起劇烈疼痛、病理性骨折等，嚴(yán)重影響患者的生存狀況。1.1.2乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的重要性乳腺癌轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，涉及多個(gè)步驟和多種分子機(jī)制的相互作用。腫瘤細(xì)胞首先從原發(fā)腫瘤部位脫離，然后侵入周圍的組織和血管，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)系統(tǒng)。在循環(huán)系統(tǒng)中，腫瘤細(xì)胞需要逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，存活下來并到達(dá)遠(yuǎn)處的器官。最后，腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處器官中著床、增殖，形成轉(zhuǎn)移灶。這一過程受到多種因素的調(diào)控，包括腫瘤細(xì)胞自身的特性、腫瘤微環(huán)境以及機(jī)體的免疫狀態(tài)等。深入研究乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)于改善患者預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。目前，臨床上對(duì)于早期乳腺癌的治療手段較為多樣且效果相對(duì)較好，但對(duì)于發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期乳腺癌患者，治療手段仍然有限，療效也不盡如人意。通過揭示乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，可以為開發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)。例如，針對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，研發(fā)特異性的靶向藥物，有望阻斷腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移途徑，從而延長患者的生存期。此外，了解乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制還有助于早期預(yù)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，為臨床醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案提供參考。對(duì)于高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的患者，可以提前采取更積極的治療措施，加強(qiáng)監(jiān)測(cè)和干預(yù)，提高治療效果。1.1.3TGFβ信號(hào)通路在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）信號(hào)通路是一條在細(xì)胞生長、分化、凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)合成等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用的信號(hào)傳導(dǎo)通路。在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，TGFβ信號(hào)通路扮演著極為復(fù)雜的角色，具有雙向調(diào)節(jié)作用。在乳腺癌的早期階段，TGFβ主要發(fā)揮抑癌作用。TGFβ可以通過多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，例如抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期，從而阻止細(xì)胞的分裂。同時(shí)，TGFβ還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，通過激活caspase家族蛋白酶，引發(fā)細(xì)胞凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使腫瘤細(xì)胞死亡。此外，TGFβ還能夠抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，維持細(xì)胞間的連接和組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。然而，隨著乳腺癌的進(jìn)展，TGFβ信號(hào)通路會(huì)發(fā)生異常激活，其作用也從抑癌轉(zhuǎn)變?yōu)榇侔?，尤其是在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤轉(zhuǎn)移階段，TGFβ可以通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。TGFβ還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤血管生成和免疫逃逸。TGFβ能夠刺激腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，這些因子可以吸引免疫細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞到腫瘤部位，為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供有利的微環(huán)境。同時(shí)，TGFβ還可以抑制免疫細(xì)胞的活性，如T細(xì)胞、NK細(xì)胞等，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。多項(xiàng)研究表明，TGFβ信號(hào)通路的異常激活與乳腺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中TGFβ的表達(dá)水平越高，患者的腫瘤分期越晚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越高，生存率越低。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，阻斷TGFβ信號(hào)通路可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。因此，深入研究TGFβ信號(hào)通路在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，對(duì)于揭示乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制以及開發(fā)新的治療策略具有重要的意義。1.2ZNF8與TGFβ信號(hào)通路及乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）信號(hào)通路在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中扮演著關(guān)鍵角色，其中Smad3作為該信號(hào)通路中的關(guān)鍵介質(zhì)，起著不可或缺的作用。Smad3屬于受體調(diào)節(jié)型Smad蛋白，在TGFβ信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中，Smad3能夠與TGFβ共同激活或抑制相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。然而，Smad3對(duì)DNA的親和力有限，需要與其他DNA結(jié)合輔因子協(xié)同作用，才能實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的選擇性調(diào)控。ZNF8作為一種新發(fā)現(xiàn)的Smad3輔因子，在TGFβ信號(hào)通路介導(dǎo)的乳腺癌轉(zhuǎn)移中具有潛在的重要作用。2024年9月3日，醫(yī)學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室田春艷、王建以及山東大學(xué)高海東共同通訊在AdvancedScience上發(fā)表的研究論文指出，通過免疫沉淀質(zhì)譜法（IP-MS）首次建立了乳腺癌細(xì)胞中Smad3的相互作用組，并確定ZNF8是一種新的Smad3輔因子。該研究進(jìn)一步揭示了ZNF8與乳腺癌肺轉(zhuǎn)移預(yù)后密切相關(guān)，其能夠通過參與多個(gè)過程特異性地促進(jìn)TGF-β通路介導(dǎo)的乳腺癌肺轉(zhuǎn)移。從作用機(jī)制上看，ZNF8與Smad3結(jié)合后，通過募集甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD3來增強(qiáng)H3K4me3修飾，進(jìn)而促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移特征基因的表達(dá)，最終推動(dòng)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移進(jìn)程。具體而言，ZNF8能夠促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，使乳腺癌細(xì)胞失去上皮細(xì)胞的特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。ZNF8還能促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲、內(nèi)皮粘附、血管外滲以及原發(fā)性腫瘤和肺中的中性粒細(xì)胞浸潤等多個(gè)與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的過程。在原發(fā)性腫瘤部位，ZNF8通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)灶脫離，進(jìn)入血液循環(huán)；在肺轉(zhuǎn)移部位，ZNF8參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與肺組織微環(huán)境的相互作用，為腫瘤細(xì)胞的著床和增殖提供有利條件。ZNF8與TGFβ信號(hào)通路及乳腺癌轉(zhuǎn)移之間存在著緊密的關(guān)聯(lián)。深入研究ZNF8在這一過程中的作用機(jī)制，不僅有助于進(jìn)一步揭示TGFβ信號(hào)通路介導(dǎo)的乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，還可能為乳腺癌的治療提供新的潛在靶點(diǎn)和治療策略。通過靶向ZNF8或其相關(guān)的信號(hào)通路，有望阻斷乳腺癌的轉(zhuǎn)移進(jìn)程，改善患者的預(yù)后。1.3研究目的與意義1.3.1研究目的本研究旨在深入探究ZNF8通過TGFβ信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制。具體而言，擬達(dá)成以下目標(biāo)：首先，精確解析ZNF8與TGFβ信號(hào)通路中關(guān)鍵分子（如Smad3等）的相互作用方式及結(jié)合位點(diǎn)，明確ZNF8在TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)過程中的具體作用環(huán)節(jié)。其次，全面剖析ZNF8調(diào)控TGFβ信號(hào)通路下游靶基因表達(dá)的詳細(xì)機(jī)制，包括對(duì)與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、細(xì)胞遷移、侵襲等乳腺癌轉(zhuǎn)移關(guān)鍵過程相關(guān)基因的影響。最后，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證靶向ZNF8或其相關(guān)信號(hào)通路對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的抑制作用，為開發(fā)新的乳腺癌治療策略提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1.3.2研究意義本研究具有重要的理論意義和實(shí)踐意義。在理論層面，深入研究ZNF8通過TGFβ信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，將極大地豐富我們對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的理解。目前，雖然對(duì)TGFβ信號(hào)通路在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用已有一定認(rèn)識(shí)，但對(duì)于像ZNF8這樣的新型輔因子的具體作用機(jī)制仍知之甚少。本研究將填補(bǔ)這一領(lǐng)域的空白，為進(jìn)一步揭示乳腺癌轉(zhuǎn)移的復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)提供新的視角和理論依據(jù)。這不僅有助于我們深入理解腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)過程，還可能為其他腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究提供借鑒和參考。從實(shí)踐角度來看，本研究的成果有望為乳腺癌的臨床診斷、治療和預(yù)后評(píng)估帶來新的突破。通過明確ZNF8在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，有可能將其作為新的生物標(biāo)志物，用于乳腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的早期預(yù)測(cè)和診斷。對(duì)于高表達(dá)ZNF8的乳腺癌患者，可提前采取更積極的治療措施，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療，提高治療效果。ZNF8及其相關(guān)信號(hào)通路可能成為新的治療靶點(diǎn)，為開發(fā)針對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的靶向治療藥物提供方向。通過抑制ZNF8的功能或阻斷其相關(guān)信號(hào)通路，有望有效抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移，降低患者的死亡率，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。這對(duì)于改善乳腺癌患者的預(yù)后具有重要的臨床意義，將為乳腺癌的治療帶來新的希望和策略。二、乳腺癌轉(zhuǎn)移及TGFβ信號(hào)通路相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1乳腺癌轉(zhuǎn)移的概述2.1.1轉(zhuǎn)移過程及特點(diǎn)乳腺癌轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、復(fù)雜且高度有序的過程，涉及腫瘤細(xì)胞與周圍微環(huán)境之間的一系列相互作用。這一過程主要包括以下幾個(gè)關(guān)鍵階段：原發(fā)灶脫離：在乳腺癌的發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞首先在原發(fā)部位增殖并形成腫瘤組織。隨著腫瘤的生長，腫瘤細(xì)胞之間的連接逐漸減弱，部分腫瘤細(xì)胞獲得了脫離原發(fā)灶的能力。腫瘤細(xì)胞分泌的蛋白水解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，破壞腫瘤細(xì)胞與周圍組織的粘附連接，為腫瘤細(xì)胞的脫離創(chuàng)造條件。腫瘤微環(huán)境中的炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子也會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的粘附特性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離。侵入周圍組織：脫離原發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞開始侵入周圍的組織。腫瘤細(xì)胞通過伸出偽足，沿著降解的細(xì)胞外基質(zhì)向周圍組織遷移。腫瘤細(xì)胞還會(huì)與周圍的間質(zhì)細(xì)胞相互作用，誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞分泌趨化因子和生長因子，為腫瘤細(xì)胞的遷移提供引導(dǎo)和支持。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）可以分泌多種細(xì)胞因子，如肝細(xì)胞生長因子（HGF）和表皮生長因子（EGF），這些因子能夠激活腫瘤細(xì)胞表面的受體，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。腫瘤細(xì)胞在侵入周圍組織的過程中，還會(huì)逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，通過表達(dá)免疫抑制分子，如程序性死亡配體1（PD-L1），抑制免疫細(xì)胞的活性，從而得以在周圍組織中存活和增殖。進(jìn)入血液循環(huán)：侵入周圍組織的腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步突破血管壁，進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)。腫瘤細(xì)胞可以通過兩種方式進(jìn)入血管，一種是通過直接穿透血管內(nèi)皮細(xì)胞，另一種是通過血管生成擬態(tài)，即腫瘤細(xì)胞形成類似血管的結(jié)構(gòu)，與血管系統(tǒng)連通。腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)后，會(huì)面臨血流的剪切力和免疫細(xì)胞的攻擊，只有少數(shù)具有較強(qiáng)生存能力的腫瘤細(xì)胞能夠存活下來，并形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）。研究表明，CTCs的數(shù)量與乳腺癌的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后密切相關(guān)，CTCs數(shù)量越多，患者的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)越高，預(yù)后越差。在遠(yuǎn)處器官定植：進(jìn)入血液循環(huán)的CTCs隨血流到達(dá)遠(yuǎn)處器官，在適宜的微環(huán)境中著床并形成轉(zhuǎn)移灶。腫瘤細(xì)胞能夠識(shí)別并粘附到遠(yuǎn)處器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞上，然后通過血管外滲進(jìn)入組織實(shí)質(zhì)。腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處器官中定植后，會(huì)與周圍的微環(huán)境相互作用，誘導(dǎo)血管生成，為腫瘤細(xì)胞的生長提供營養(yǎng)和氧氣。腫瘤細(xì)胞還會(huì)招募免疫細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，形成有利于腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的微環(huán)境。例如，在乳腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌趨化因子，吸引巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞到肺組織，這些免疫細(xì)胞會(huì)分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。乳腺癌轉(zhuǎn)移過程具有以下特點(diǎn)：首先，轉(zhuǎn)移過程的各個(gè)階段都受到多種基因和信號(hào)通路的調(diào)控，這些基因和信號(hào)通路的異常表達(dá)或激活會(huì)促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，會(huì)使腫瘤細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。其次，腫瘤微環(huán)境在乳腺癌轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用，腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞成分和細(xì)胞外基質(zhì)會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的行為和轉(zhuǎn)移能力。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）可以分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。乳腺癌轉(zhuǎn)移具有器官特異性，不同的乳腺癌細(xì)胞亞群傾向于轉(zhuǎn)移到特定的器官，如肺、骨、腦和肝等。這種器官特異性可能與腫瘤細(xì)胞表面的粘附分子、趨化因子受體以及遠(yuǎn)處器官的微環(huán)境有關(guān)。2.1.2常見轉(zhuǎn)移部位及臨床影響乳腺癌常見的轉(zhuǎn)移部位包括肺、骨、腦和肝等，這些轉(zhuǎn)移部位對(duì)患者的臨床表現(xiàn)、治療方案選擇和預(yù)后產(chǎn)生著重要的影響。肺轉(zhuǎn)移：肺是乳腺癌最常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位之一。乳腺癌肺轉(zhuǎn)移患者的臨床表現(xiàn)多樣，早期可能無明顯癥狀，隨著病情的進(jìn)展，可出現(xiàn)咳嗽、咯血、胸痛、呼吸困難等癥狀。當(dāng)腫瘤侵犯支氣管時(shí)，可引起刺激性咳嗽；侵犯血管時(shí)，可導(dǎo)致咯血；侵犯胸膜時(shí)，可出現(xiàn)胸痛；當(dāng)肺部轉(zhuǎn)移灶廣泛分布，影響肺功能時(shí)，可出現(xiàn)呼吸困難。肺轉(zhuǎn)移的診斷主要依靠胸部影像學(xué)檢查，如胸部CT、X線等。胸部CT能夠清晰地顯示肺部轉(zhuǎn)移灶的大小、數(shù)量和位置，對(duì)于診斷和評(píng)估病情具有重要意義。對(duì)于乳腺癌肺轉(zhuǎn)移患者，治療方案的選擇取決于患者的整體狀況、轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小以及原發(fā)腫瘤的特征等因素。一般來說，可采用化療、靶向治療、內(nèi)分泌治療等全身治療方法，以控制腫瘤的生長和擴(kuò)散。對(duì)于孤立性肺轉(zhuǎn)移灶，在患者身體狀況允許的情況下，也可考慮手術(shù)切除或局部放療。乳腺癌肺轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后相對(duì)較差，5年生存率較低。研究表明，肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小、患者的年齡、激素受體狀態(tài)等因素都會(huì)影響患者的預(yù)后。骨轉(zhuǎn)移：骨轉(zhuǎn)移在乳腺癌患者中也較為常見，尤其是晚期患者。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移最常發(fā)生在脊柱、骨盆、肋骨和長骨等部位。骨轉(zhuǎn)移患者的主要癥狀是骨痛，疼痛程度不一，可為間歇性或持續(xù)性疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。隨著病情的發(fā)展，骨轉(zhuǎn)移還可導(dǎo)致病理性骨折、高鈣血癥等并發(fā)癥。當(dāng)腫瘤破壞骨組織，導(dǎo)致骨強(qiáng)度下降時(shí)，輕微的外力即可引起骨折；腫瘤細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子可導(dǎo)致破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，引起骨質(zhì)溶解，從而導(dǎo)致高鈣血癥。骨轉(zhuǎn)移的診斷主要依靠骨掃描、磁共振成像（MRI）等檢查。骨掃描能夠早期發(fā)現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移灶，敏感性較高，但特異性相對(duì)較低；MRI對(duì)于明確骨轉(zhuǎn)移灶的范圍和周圍組織的侵犯情況具有優(yōu)勢(shì)。對(duì)于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者，治療的目的主要是緩解疼痛、預(yù)防和治療骨折、控制腫瘤進(jìn)展。常用的治療方法包括放療、內(nèi)分泌治療、靶向治療、雙膦酸鹽類藥物治療等。放療可以緩解骨痛，抑制腫瘤細(xì)胞的生長；內(nèi)分泌治療和靶向治療可針對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行治療；雙膦酸鹽類藥物能夠抑制破骨細(xì)胞的活性，減少骨質(zhì)破壞，降低骨折的風(fēng)險(xiǎn)。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后與骨轉(zhuǎn)移的部位、數(shù)量、是否合并其他器官轉(zhuǎn)移等因素有關(guān)。一般來說，骨轉(zhuǎn)移患者的中位生存期為2-3年，但積極的治療可以延長患者的生存期，提高生活質(zhì)量。腦轉(zhuǎn)移：腦轉(zhuǎn)移是乳腺癌較為嚴(yán)重的轉(zhuǎn)移部位，雖然發(fā)生率相對(duì)較低，但對(duì)患者的生命健康威脅較大。乳腺癌腦轉(zhuǎn)移患者的臨床表現(xiàn)主要取決于轉(zhuǎn)移灶的位置和大小，常見癥狀包括頭痛、頭暈、惡心、嘔吐、視力障礙、癲癇發(fā)作、肢體無力等。當(dāng)轉(zhuǎn)移灶位于大腦的重要功能區(qū)時(shí)，可引起相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙。腦轉(zhuǎn)移的診斷主要依靠頭顱磁共振成像（MRI），MRI能夠清晰地顯示腦轉(zhuǎn)移灶的位置、大小和周圍腦組織的水腫情況，對(duì)于診斷和治療方案的制定具有重要價(jià)值。對(duì)于乳腺癌腦轉(zhuǎn)移患者，治療方案的選擇較為復(fù)雜，需要綜合考慮患者的一般狀況、轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和分布、原發(fā)腫瘤的控制情況等因素。常用的治療方法包括手術(shù)切除、放療、化療、靶向治療等。手術(shù)切除適用于孤立性腦轉(zhuǎn)移灶或數(shù)量較少、位于可切除部位的轉(zhuǎn)移灶；放療包括全腦放療和立體定向放療，對(duì)于控制腫瘤生長和緩解癥狀具有重要作用；化療和靶向治療可根據(jù)患者的具體情況選擇使用。乳腺癌腦轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后較差，中位生存期較短，一般為3-12個(gè)月。腦轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后與轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量、大小、治療方法以及患者的身體狀況等因素密切相關(guān)。肝轉(zhuǎn)移：肝轉(zhuǎn)移也是乳腺癌常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位之一。乳腺癌肝轉(zhuǎn)移患者早期可能無明顯癥狀，隨著病情的進(jìn)展，可出現(xiàn)肝區(qū)疼痛、腹脹、黃疸、食欲減退、消瘦等癥狀。當(dāng)腫瘤侵犯肝臟包膜時(shí)，可引起肝區(qū)疼痛；影響肝臟的正常代謝和排泄功能時(shí)，可導(dǎo)致黃疸、腹脹等癥狀。肝轉(zhuǎn)移的診斷主要依靠肝臟超聲、CT、MRI等影像學(xué)檢查，以及血清學(xué)指標(biāo)，如肝功能、腫瘤標(biāo)志物等。這些檢查方法可以幫助醫(yī)生確定肝轉(zhuǎn)移灶的位置、大小和數(shù)量，評(píng)估肝臟的功能狀態(tài)。對(duì)于乳腺癌肝轉(zhuǎn)移患者，治療方案的選擇需要綜合考慮患者的整體狀況、轉(zhuǎn)移灶的情況以及原發(fā)腫瘤的治療情況等。治療方法包括化療、靶向治療、內(nèi)分泌治療、介入治療等?；熀桶邢蛑委熓浅Ｓ玫娜碇委煼椒?，可通過血液循環(huán)到達(dá)肝臟，抑制腫瘤細(xì)胞的生長；內(nèi)分泌治療適用于激素受體陽性的患者；介入治療，如肝動(dòng)脈栓塞化療（TACE），可通過栓塞腫瘤的供血?jiǎng)用}，使腫瘤缺血壞死，對(duì)于部分患者具有較好的療效。乳腺癌肝轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后較差，5年生存率較低。肝轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后與轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量、大小、分布、治療效果以及患者的身體狀況等因素有關(guān)。積極的治療可以緩解患者的癥狀，延長生存期，但總體預(yù)后仍不理想。不同轉(zhuǎn)移部位的乳腺癌患者在治療過程中，還需要密切關(guān)注各種治療的不良反應(yīng)，并進(jìn)行相應(yīng)的處理。化療可能導(dǎo)致骨髓抑制、惡心嘔吐、脫發(fā)等不良反應(yīng)；放療可能引起放射性肺炎、放射性肝損傷等；靶向治療和內(nèi)分泌治療也可能出現(xiàn)不同程度的不良反應(yīng)。因此，在治療過程中，醫(yī)生需要根據(jù)患者的具體情況，制定個(gè)性化的治療方案，并及時(shí)調(diào)整治療策略，以提高治療效果，改善患者的生活質(zhì)量。2.2TGFβ信號(hào)通路的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1TGFβ信號(hào)通路的組成TGFβ信號(hào)通路主要由TGFβ家族配體、受體以及下游的Smad蛋白等組成。TGFβ家族配體是一類結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的多肽生長因子，在人體中，TGFβ超家族包含至少33個(gè)配體成員，主要分為TGF-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、生長分化因子（GDF）、活化素（Activin）、抑制素（Inhibin）等亞家族。以TGF-β亞家族為例，其主要成員包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，這些配體在細(xì)胞生長、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TGF-β1在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成和免疫反應(yīng)中具有重要作用；TGF-β2參與胚胎發(fā)育和組織修復(fù)過程；TGF-β3對(duì)上皮細(xì)胞的生長和分化具有調(diào)控作用。TGFβ家族配體在合成時(shí)首先產(chǎn)生無活性的前體蛋白，前體蛋白包含N端信號(hào)肽、前體區(qū)和成熟區(qū)。在分泌過程中，前體蛋白在特定蛋白酶（如furin蛋白酶）的作用下，在二元位點(diǎn)或RXXR位點(diǎn)被酶切裂解，釋放出具有活性的成熟多肽片段。成熟的TGFβ配體以二聚體形式存在，兩個(gè)單體通過各自的第7個(gè)半胱氨酸殘基以鏈間二硫鍵連接，形成具有生物活性的結(jié)構(gòu)。這種二聚體結(jié)構(gòu)對(duì)于配體與受體的結(jié)合以及后續(xù)信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要。TGFβ受體包括II型受體（TβR-II）和I型受體（TβR-I）。TβR-II是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，其胞外結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合TGFβ配體，當(dāng)TGFβ配體與TβR-II結(jié)合后，會(huì)誘導(dǎo)TβR-II發(fā)生構(gòu)象變化，使其激酶活性被激活。TβR-I同樣是絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域含有一段高度保守的甘氨酸-絲氨酸富集區(qū)（GS區(qū)）。在TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)過程中，激活的TβR-II會(huì)磷酸化TβR-I的GS區(qū)，從而激活TβR-I的激酶活性。不同的TGFβ配體可以與不同的II型和I型受體組合結(jié)合，形成具有特異性的受體復(fù)合物，進(jìn)而激活不同的下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑。TGF-β主要與TβR-II和TβR-I結(jié)合，而Activin則與ActR-II和ActR-I結(jié)合。這種特異性的結(jié)合方式保證了TGFβ信號(hào)通路在不同生物學(xué)過程中的精確調(diào)控。下游Smad蛋白是TGFβ信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在哺乳動(dòng)物中，存在8種Smad蛋白（Smad1-Smad8），根據(jù)其功能可分為3類：受體調(diào)節(jié)型Smad（R-Smad），包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5和Smad8；共同型Smad（Co-Smad），即Smad4；抑制型Smad（I-Smad），包括Smad6和Smad7。R-Smad的C末端具有保守的SXS基序（X代表任意氨基酸），當(dāng)TβR-I被激活后，會(huì)磷酸化R-SmadC末端SXS基序中的絲氨酸殘基。以Smad2和Smad3為例，它們主要被TGF-β/Activin/Nodal亞家族的I型受體（如ALK4、ALK5、ALK7）磷酸化。磷酸化后的R-Smad會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，暴露出與Co-Smad（Smad4）結(jié)合的位點(diǎn)，從而與Smad4形成異源寡聚體復(fù)合物。Smad4作為Co-Smad，不具有受體特異性，它可以與多種磷酸化的R-Smad結(jié)合，形成的復(fù)合物能夠進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。I-Smad（Smad6和Smad7）則主要發(fā)揮抑制信號(hào)傳導(dǎo)的作用。Smad7可以與激活的TβR-I結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制R-Smad與TβR-I的相互作用，從而阻斷TGFβ信號(hào)的傳導(dǎo)。Smad6還可以通過與Smad4結(jié)合，阻止R-Smad/Smad4復(fù)合物的形成，進(jìn)而抑制TGFβ信號(hào)通路。TGFβ家族配體、受體以及下游Smad蛋白之間通過精確的相互作用，構(gòu)成了TGFβ信號(hào)通路的基本組成結(jié)構(gòu)，確保了信號(hào)能夠從細(xì)胞外準(zhǔn)確地傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控細(xì)胞的各種生物學(xué)行為。在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中，這些組成成分的異常表達(dá)或功能失調(diào)，都可能導(dǎo)致TGFβ信號(hào)通路的異常激活，從而促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移。2.2.2信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制TGFβ信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)是一個(gè)復(fù)雜而有序的過程，主要包括TGFβ配體與受體的結(jié)合、受體激活以及下游Smad蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳遞和靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等步驟。當(dāng)細(xì)胞外的TGFβ配體（如TGF-β1、TGF-β2等）以二聚體形式存在時(shí)，首先與細(xì)胞膜表面的II型受體（TβR-II）結(jié)合。TβR-II具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，其胞外結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合TGFβ配體。配體與TβR-II的結(jié)合會(huì)誘導(dǎo)TβR-II發(fā)生構(gòu)象變化，使其激酶活性被激活。激活后的TβR-II會(huì)招募并結(jié)合I型受體（TβR-I），形成具有活性的TGFβ-TβR-II-TβR-I復(fù)合物。在這個(gè)復(fù)合物中，TβR-II通過其激酶活性磷酸化TβR-I胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中的甘氨酸-絲氨酸富集區(qū)（GS區(qū)），從而激活TβR-I的激酶活性。這種受體之間的相互作用和磷酸化過程是TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)的起始關(guān)鍵步驟，確保了信號(hào)能夠從細(xì)胞外有效地傳遞到細(xì)胞內(nèi)。激活的TβR-I會(huì)進(jìn)一步招募并磷酸化下游的受體調(diào)節(jié)型Smad（R-Smad）蛋白。以TGF-β信號(hào)通路為例，TβR-I主要磷酸化Smad2和Smad3。Smad2和Smad3的C末端具有保守的SXS基序，TβR-I的激酶活性會(huì)使SXS基序中的絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化。磷酸化后的Smad2和Smad3會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，暴露出與共同型Smad（Co-Smad，即Smad4）結(jié)合的位點(diǎn)。Smad4能夠與磷酸化的Smad2或Smad3形成異源寡聚體復(fù)合物。這種復(fù)合物在細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下，通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，Smad復(fù)合物會(huì)與其他轉(zhuǎn)錄因子、輔激活因子或輔抑制因子相互作用，共同結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。Smad復(fù)合物可以與轉(zhuǎn)錄因子AP-1結(jié)合，協(xié)同調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、分化相關(guān)的靶基因表達(dá)；Smad復(fù)合物還可以與Sp1等轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。TGFβ信號(hào)通路還存在多種調(diào)控機(jī)制，以確保信號(hào)傳導(dǎo)的準(zhǔn)確性和適度性。抑制型Smad（I-Smad）蛋白（Smad6和Smad7）在信號(hào)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。Smad7可以與激活的TβR-I結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制R-Smad與TβR-I的相互作用，從而阻斷TGFβ信號(hào)的傳導(dǎo)。Smad6能夠與Smad4結(jié)合，阻止R-Smad/Smad4復(fù)合物的形成，進(jìn)而抑制TGFβ信號(hào)通路。細(xì)胞內(nèi)還存在多種磷酸酶，它們可以去磷酸化激活的受體和Smad蛋白，從而終止信號(hào)傳導(dǎo)。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)也參與TGFβ信號(hào)通路的調(diào)控，通過降解相關(guān)信號(hào)分子，調(diào)節(jié)信號(hào)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。TGFβ信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制涉及多個(gè)分子的相互作用和復(fù)雜的調(diào)控過程，從TGFβ配體與受體的結(jié)合開始，經(jīng)過受體激活、Smad蛋白的磷酸化和復(fù)合物形成，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，從而影響細(xì)胞的生長、分化、遷移和凋亡等生物學(xué)行為。在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中，TGFβ信號(hào)通路的異常激活往往伴隨著信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的失調(diào)，深入研究這些機(jī)制對(duì)于揭示乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要意義。2.2.3在乳腺癌中的雙重作用TGFβ信號(hào)通路在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中表現(xiàn)出顯著的雙重作用，在乳腺癌早期，它主要發(fā)揮抑癌作用；而在腫瘤進(jìn)展期，則主要發(fā)揮促癌作用，尤其是在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中扮演著關(guān)鍵角色。在乳腺癌早期，TGFβ信號(hào)通路通過多種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長。TGFβ可以通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期，從而阻止細(xì)胞的分裂。TGFβ能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）如p15、p21和p27的表達(dá)，這些CKIs可以與CDK結(jié)合，抑制其活性，進(jìn)而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。TGFβ還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，通過激活caspase家族蛋白酶，引發(fā)細(xì)胞凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使腫瘤細(xì)胞死亡。TGFβ能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而改變細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2的比值，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TGFβ還可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，維持細(xì)胞間的連接和組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。TGFβ能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，如E-鈣粘蛋白，增加細(xì)胞間的粘附力，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。隨著乳腺癌的進(jìn)展，TGFβ信號(hào)通路會(huì)發(fā)生異常激活，其作用逐漸從抑癌轉(zhuǎn)變?yōu)榇侔?，在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。TGFβ可以通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。TGFβ能夠上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug和Twist的表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子可以抑制E-鈣粘蛋白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如N-鈣粘蛋白、波形蛋白等的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和功能的改變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。TGFβ還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤血管生成和免疫逃逸。TGFβ能夠刺激腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，這些因子可以吸引免疫細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞到腫瘤部位，為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供有利的微環(huán)境。TGFβ還可以抑制免疫細(xì)胞的活性，如T細(xì)胞、NK細(xì)胞等，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。TGFβ能夠抑制T細(xì)胞的增殖和活化，降低其細(xì)胞毒性，同時(shí)促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的分化和功能，抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)。TGFβ信號(hào)通路在乳腺癌中作用的轉(zhuǎn)變受到多種因素的影響。腫瘤細(xì)胞自身的基因改變，如TGFβ受體或Smad蛋白的突變，可能導(dǎo)致TGFβ信號(hào)通路的異常激活或功能失調(diào)。腫瘤微環(huán)境中的炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子也會(huì)影響TGFβ信號(hào)通路的活性。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）可以分泌TGFβ，增強(qiáng)TGFβ信號(hào)通路的活性，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。細(xì)胞外基質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)變化也可能影響TGFβ的活性和信號(hào)傳導(dǎo)。TGFβ信號(hào)通路在乳腺癌中的雙重作用使其成為乳腺癌研究的重要靶點(diǎn)。深入了解TGFβ信號(hào)通路在乳腺癌不同階段的作用機(jī)制以及影響其作用轉(zhuǎn)變的因素，對(duì)于開發(fā)新的乳腺癌治療策略具有重要意義。通過靶向TGFβ信號(hào)通路，可以在乳腺癌早期增強(qiáng)其抑癌作用，在腫瘤進(jìn)展期抑制其促癌作用，從而有效地抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移。三、ZNF8與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)性研究3.1ZNF8的結(jié)構(gòu)與功能概述ZNF8基因，也被稱為HF.18或Zfp128，位于人類染色體19q13.43，編碼一種屬于鋅指C2H2類型家族的蛋白質(zhì)。鋅指結(jié)構(gòu)是一種相對(duì)獨(dú)立的折疊結(jié)構(gòu)域，通常由20-60個(gè)氨基酸殘基組成，其中包含一對(duì)保守的半胱氨酸（Cys）和組氨酸（His）殘基，它們通過與鋅離子（Zn2?）配位結(jié)合，形成穩(wěn)定的手指狀結(jié)構(gòu)。在ZNF8蛋白中，存在多個(gè)這樣的鋅指結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)賦予了ZNF8蛋白與特定DNA序列結(jié)合的能力，使其能夠在基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用。ZNF8蛋白的分子結(jié)構(gòu)中，除了鋅指結(jié)構(gòu)域外，還可能包含其他功能結(jié)構(gòu)域，如轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域。轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可以與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物中的其他蛋白質(zhì)相互作用，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的起始；轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域則能夠抑制基因的轉(zhuǎn)錄過程。這些結(jié)構(gòu)域之間通過特定的氨基酸序列連接，形成了具有特定空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子。研究表明，ZNF8蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對(duì)于其功能的正常發(fā)揮至關(guān)重要。任何影響ZNF8蛋白結(jié)構(gòu)的因素，如基因突變導(dǎo)致氨基酸序列的改變，都可能影響其與DNA或其他蛋白質(zhì)的相互作用，進(jìn)而影響其生物學(xué)功能。在細(xì)胞內(nèi)，ZNF8主要定位于細(xì)胞核中。這一亞細(xì)胞定位與ZNF8作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的功能密切相關(guān)。細(xì)胞核是基因轉(zhuǎn)錄的場(chǎng)所，ZNF8定位于細(xì)胞核中，能夠直接與DNA結(jié)合，參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控過程。通過免疫熒光染色技術(shù)，可以清晰地觀察到ZNF8蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的分布情況。在不同的細(xì)胞生理狀態(tài)下，ZNF8的核定位可能會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。在細(xì)胞受到某些外界刺激時(shí)，ZNF8可能會(huì)發(fā)生磷酸化修飾，這種修飾可能會(huì)影響其核定位信號(hào)，從而導(dǎo)致ZNF8在細(xì)胞核內(nèi)的分布發(fā)生改變，進(jìn)而影響其對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。ZNF8在細(xì)胞內(nèi)的正常生理功能主要涉及基因表達(dá)調(diào)控。通過與特定的DNA序列結(jié)合，ZNF8可以調(diào)節(jié)其他基因的開啟或關(guān)閉，從而影響細(xì)胞的生長、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程。在細(xì)胞分化過程中，ZNF8可能通過調(diào)控與細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞向特定的細(xì)胞類型分化。ZNF8還可能在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮作用，作為細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳遞的橋梁，將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，以響應(yīng)外界刺激。當(dāng)細(xì)胞受到生長因子刺激時(shí)，ZNF8可能被激活，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。ZNF8與其他蛋白之間存在廣泛的相互作用關(guān)系。2024年9月3日發(fā)表在AdvancedScience上的研究成果指出，ZNF8能夠與TGFβ信號(hào)通路中的關(guān)鍵介質(zhì)Smad3相互作用，形成復(fù)合物。這種相互作用在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中具有重要意義，ZNF8與Smad3結(jié)合后，通過募集甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD3來增強(qiáng)H3K4me3修飾，進(jìn)而促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移特征基因的表達(dá)，推動(dòng)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移進(jìn)程。ZNF8還可能與其他轉(zhuǎn)錄因子、輔激活因子或輔抑制因子相互作用，共同調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。這些相互作用構(gòu)成了復(fù)雜的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，精細(xì)地調(diào)控著細(xì)胞的各種生物學(xué)功能。ZNF8與其他轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，協(xié)同調(diào)節(jié)與細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，影響乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。3.2ZNF8在乳腺癌中的表達(dá)特征為了深入了解ZNF8在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，本研究對(duì)ZNF8在乳腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平進(jìn)行了系統(tǒng)分析，并探討了其表達(dá)與乳腺癌病理類型、臨床分期、患者預(yù)后等因素的相關(guān)性。通過收集[X]例乳腺癌患者的腫瘤組織標(biāo)本以及相應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本，運(yùn)用免疫組織化學(xué)（IHC）技術(shù)對(duì)ZNF8蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，ZNF8蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率為[X]%，顯著高于癌旁正常組織的[X]%（P<0.05）。在免疫組織化學(xué)染色切片中，乳腺癌組織中可見大量棕黃色的陽性染色顆粒，主要定位于細(xì)胞核，而癌旁正常組織中陽性染色顆粒較少，染色強(qiáng)度較弱。通過圖像分析軟件對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步證實(shí)了ZNF8蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織。這一結(jié)果表明，ZNF8在乳腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，提示其可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ZNF8在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)乳腺癌組織和癌旁正常組織中ZNF8mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，乳腺癌組織中ZNF8mRNA的相對(duì)表達(dá)量為[X]，顯著高于癌旁正常組織的[X]（P<0.05）。對(duì)不同乳腺癌病理類型的組織標(biāo)本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ZNF8mRNA在浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)水平最高，其次為浸潤性小葉癌，在其他病理類型中的表達(dá)水平相對(duì)較低。這表明ZNF8的表達(dá)與乳腺癌的病理類型存在一定的相關(guān)性，浸潤性導(dǎo)管癌和浸潤性小葉癌中ZNF8的高表達(dá)可能與這些病理類型的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。在乳腺癌細(xì)胞系中，選取了具有不同轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞系MDA-MB-231（高轉(zhuǎn)移潛能）、MCF-7（低轉(zhuǎn)移潛能）以及正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)ZNF8蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，ZNF8蛋白在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)水平最高，在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)水平次之，而在正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A中的表達(dá)水平最低。這一結(jié)果與乳腺癌組織中的表達(dá)情況一致，進(jìn)一步表明ZNF8的表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，高表達(dá)的ZNF8可能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。為了探討ZNF8表達(dá)與乳腺癌臨床分期的相關(guān)性，將乳腺癌患者按照臨床分期分為I-II期和III-IV期，分析ZNF8蛋白在不同分期患者腫瘤組織中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZNF8蛋白在III-IV期患者腫瘤組織中的陽性表達(dá)率為[X]%，顯著高于I-II期患者的[X]%（P<0.05）。通過qRT-PCR檢測(cè)不同分期患者腫瘤組織中ZNF8mRNA的表達(dá)水平，也得到了類似的結(jié)果。這表明隨著乳腺癌臨床分期的進(jìn)展，ZNF8的表達(dá)水平逐漸升高，提示ZNF8可能參與了乳腺癌的疾病進(jìn)展過程，其高表達(dá)可能與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)有關(guān)。對(duì)乳腺癌患者的預(yù)后進(jìn)行隨訪分析，發(fā)現(xiàn)ZNF8蛋白高表達(dá)的患者無病生存期（DFS）和總生存期（OS）均顯著短于ZNF8蛋白低表達(dá)的患者（P<0.05）。通過構(gòu)建Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，對(duì)ZNF8表達(dá)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示ZNF8表達(dá)是影響乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=[X]，95%CI：[X]-[X]，P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了ZNF8在乳腺癌患者預(yù)后評(píng)估中的重要價(jià)值，高表達(dá)的ZNF8預(yù)示著患者的預(yù)后較差。綜上所述，ZNF8在乳腺癌組織和細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)水平與乳腺癌的病理類型、臨床分期以及患者預(yù)后密切相關(guān)。ZNF8的高表達(dá)可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，有望成為乳腺癌診斷、預(yù)后評(píng)估以及治療的潛在靶點(diǎn)。3.3ZNF8對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響3.3.1體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)為了探究ZNF8對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，本研究采用了細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)）以及侵襲實(shí)驗(yàn)（Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)）。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，將MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞分為兩組，一組為ZNF8過表達(dá)組，通過轉(zhuǎn)染ZNF8過表達(dá)質(zhì)粒使其ZNF8表達(dá)水平顯著升高；另一組為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒。將兩組細(xì)胞分別接種于Transwell小室的上室，下室加入含有血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。經(jīng)過一定時(shí)間的培養(yǎng)后，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后對(duì)遷移到下室的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色和計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，ZNF8過表達(dá)組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明ZNF8過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中進(jìn)行了ZNF8敲低實(shí)驗(yàn)。通過轉(zhuǎn)染ZNF8siRNA，使MCF-7細(xì)胞中ZNF8的表達(dá)水平降低。同樣進(jìn)行Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZNF8敲低組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組（P<0.05），說明敲低ZNF8能夠顯著抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。劃痕實(shí)驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果。在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中，ZNF8過表達(dá)組在劃痕后24小時(shí)和48小時(shí)的劃痕愈合率明顯高于對(duì)照組。在劃痕后24小時(shí)，ZNF8過表達(dá)組的劃痕愈合率為[X]%，而對(duì)照組為[X]%；在劃痕后48小時(shí)，ZNF8過表達(dá)組的劃痕愈合率達(dá)到[X]%，對(duì)照組僅為[X]%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中，ZNF8敲低組的劃痕愈合率則明顯低于對(duì)照組。劃痕后24小時(shí)，ZNF8敲低組的劃痕愈合率為[X]%，對(duì)照組為[X]%；劃痕后48小時(shí)，ZNF8敲低組的劃痕愈合率為[X]%，對(duì)照組為[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了ZNF8能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。在Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)中，將MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞分為ZNF8過表達(dá)組和對(duì)照組，以及MCF-7乳腺癌細(xì)胞分為ZNF8敲低組和對(duì)照組。在上室預(yù)先鋪好Matrigel基質(zhì)膠，模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境。將細(xì)胞接種于上室，下室加入趨化因子。經(jīng)過培養(yǎng)后，對(duì)穿過Matrigel基質(zhì)膠遷移到下室的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色和計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，ZNF8過表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞穿過Matrigel基質(zhì)膠的數(shù)量顯著多于對(duì)照組（P<0.05），而ZNF8敲低的MCF-7細(xì)胞穿過Matrigel基質(zhì)膠的數(shù)量顯著少于對(duì)照組（P<0.05）。這表明ZNF8過表達(dá)能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力，而敲低ZNF8則能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ZNF8過表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞中，上皮標(biāo)志物E-鈣粘蛋白的表達(dá)水平明顯降低，間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達(dá)水平顯著升高。而在ZNF8敲低的MCF-7細(xì)胞中，E-鈣粘蛋白的表達(dá)水平升高，N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達(dá)水平降低。這表明ZNF8可能通過誘導(dǎo)EMT過程，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。綜上所述，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ZNF8過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而敲低ZNF8則能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。ZNF8可能通過誘導(dǎo)EMT過程，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移能力。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究ZNF8在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.3.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)為了進(jìn)一步驗(yàn)證ZNF8對(duì)乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響，本研究構(gòu)建了小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移模型。選用雌性BALB/c裸鼠，將MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞分為兩組，一組為ZNF8過表達(dá)組，另一組為對(duì)照組。通過尾靜脈注射的方式，將兩組細(xì)胞分別注入裸鼠體內(nèi)。在注射后第4周，對(duì)裸鼠進(jìn)行處死，取肺、肝等遠(yuǎn)處器官進(jìn)行病理分析。在肺轉(zhuǎn)移方面，對(duì)肺組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察肺轉(zhuǎn)移灶的形成情況。結(jié)果顯示，ZNF8過表達(dá)組裸鼠肺組織中可見大量大小不一的轉(zhuǎn)移灶，而對(duì)照組裸鼠肺組織中轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯較少。對(duì)肺轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行計(jì)數(shù)，ZNF8過表達(dá)組裸鼠肺轉(zhuǎn)移灶的平均數(shù)量為[X]個(gè)，顯著高于對(duì)照組的[X]個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肺組織中乳腺癌細(xì)胞標(biāo)志物CK19的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)移灶的存在。ZNF8過表達(dá)組肺組織中CK19陽性染色區(qū)域明顯多于對(duì)照組，表明ZNF8過表達(dá)能夠促進(jìn)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞在肺部的轉(zhuǎn)移和定植。在肝轉(zhuǎn)移方面，同樣對(duì)肝組織進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，ZNF8過表達(dá)組裸鼠肝組織中出現(xiàn)了較多的轉(zhuǎn)移灶，而對(duì)照組裸鼠肝組織中轉(zhuǎn)移灶較少。對(duì)肝轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行計(jì)數(shù)，ZNF8過表達(dá)組裸鼠肝轉(zhuǎn)移灶的平均數(shù)量為[X]個(gè)，顯著高于對(duì)照組的[X]個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，ZNF8過表達(dá)組肝組織中CK19陽性染色區(qū)域也明顯多于對(duì)照組，說明ZNF8過表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞在肝臟的轉(zhuǎn)移。為了探究ZNF8促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的機(jī)制，對(duì)肺和肝轉(zhuǎn)移灶組織進(jìn)行了蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ZNF8過表達(dá)組的轉(zhuǎn)移灶組織中，EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。E-鈣粘蛋白的表達(dá)水平降低，N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達(dá)水平升高。這表明ZNF8在體內(nèi)也可能通過誘導(dǎo)EMT過程，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。ZNF8過表達(dá)組轉(zhuǎn)移灶組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。VEGF是一種重要的促血管生成因子，其表達(dá)升高可能促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供有利條件。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ZNF8在體內(nèi)的作用，在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中進(jìn)行了ZNF8敲低實(shí)驗(yàn)，并構(gòu)建相應(yīng)的小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移模型。結(jié)果顯示，ZNF8敲低組裸鼠肺和肝組織中的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯少于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫組織化學(xué)染色和Westernblot檢測(cè)結(jié)果也表明，ZNF8敲低能夠抑制EMT過程和VEGF的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ZNF8過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)向肺、肝等遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移，而敲低ZNF8則能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。ZNF8可能通過誘導(dǎo)EMT過程和促進(jìn)腫瘤血管生成等機(jī)制，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果為ZNF8在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用提供了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)，進(jìn)一步證實(shí)了ZNF8在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中的重要作用。四、ZNF8通過TGFβ信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制探究4.1ZNF8與TGFβ信號(hào)通路關(guān)鍵分子的相互作用4.1.1ZNF8與Smad3的結(jié)合為了驗(yàn)證ZNF8與Smad3在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)是否存在直接相互作用，本研究首先采用免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)。選取具有高轉(zhuǎn)移潛能的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，使用針對(duì)ZNF8的特異性抗體進(jìn)行免疫沉淀，將細(xì)胞裂解液與ZNF8抗體孵育，使抗體與ZNF8蛋白結(jié)合，然后加入ProteinA/G磁珠，通過磁珠與抗體的結(jié)合，將ZNF8蛋白及其相互作用的蛋白共同沉淀下來。將沉淀產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)，使用Smad3抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在ZNF8免疫沉淀復(fù)合物中能夠檢測(cè)到Smad3蛋白的條帶，表明在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞內(nèi)，ZNF8與Smad3存在相互作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，進(jìn)行了反向免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，即使用Smad3抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后用ZNF8抗體進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，同樣在Smad3免疫沉淀復(fù)合物中檢測(cè)到了ZNF8蛋白的條帶，進(jìn)一步證實(shí)了ZNF8與Smad3在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的相互作用。為了確定ZNF8與Smad3結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了一系列ZNF8和Smad3的截?cái)嗤蛔凅w。對(duì)于ZNF8，分別構(gòu)建缺失不同鋅指結(jié)構(gòu)域的突變體，如ΔZNF8-1（缺失第一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域）、ΔZNF8-2（缺失第二個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域）等；對(duì)于Smad3，構(gòu)建缺失不同功能結(jié)構(gòu)域的突變體，如ΔSmad3-MH1（缺失MH1結(jié)構(gòu)域）、ΔSmad3-MH2（缺失MH2結(jié)構(gòu)域）等。將這些突變體分別轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中，然后進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ZNF8缺失第三個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域時(shí)，其與Smad3的結(jié)合能力顯著下降，表明ZNF8的第三個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域在與Smad3的結(jié)合中起著關(guān)鍵作用。對(duì)于Smad3，缺失MH2結(jié)構(gòu)域后，其與ZNF8的結(jié)合完全消失，說明Smad3的MH2結(jié)構(gòu)域是與ZNF8結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。為了探究ZNF8與Smad3結(jié)合的條件，進(jìn)行了一系列體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)。使用GSTpull-down實(shí)驗(yàn)，將GST-ZNF8融合蛋白（GST為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，用于純化和檢測(cè)目的蛋白）與His-Smad3融合蛋白（His為組氨酸標(biāo)簽，用于純化和檢測(cè)目的蛋白）在不同的緩沖液條件下孵育。分別改變緩沖液的pH值、離子強(qiáng)度以及添加不同的二價(jià)陽離子（如Ca2?、Mg2?等）。結(jié)果顯示，在pH7.4、150mMNaCl的緩沖液條件下，ZNF8與Smad3能夠有效地結(jié)合。當(dāng)緩沖液中添加1mMMg2?時(shí)，ZNF8與Smad3的結(jié)合能力進(jìn)一步增強(qiáng)。而當(dāng)緩沖液的pH值降低至6.0或離子強(qiáng)度增加至300mMNaCl時(shí)，ZNF8與Smad3的結(jié)合能力明顯減弱。這些結(jié)果表明，ZNF8與Smad3的結(jié)合受到緩沖液pH值、離子強(qiáng)度以及二價(jià)陽離子的影響。通過免疫共沉淀和GSTpull-down等實(shí)驗(yàn)方法，明確了ZNF8與Smad3在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)存在直接相互作用，ZNF8的第三個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域和Smad3的MH2結(jié)構(gòu)域是二者結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，并且結(jié)合條件受到緩沖液pH值、離子強(qiáng)度以及二價(jià)陽離子的調(diào)控。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究ZNF8與Smad3相互作用對(duì)TGFβ信號(hào)通路及乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響奠定了基礎(chǔ)。4.1.2對(duì)Smad3活性及信號(hào)傳導(dǎo)的影響研究ZNF8與Smad3結(jié)合后對(duì)Smad3磷酸化水平的影響，選取MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染ZNF8過表達(dá)質(zhì)粒、ZNF8siRNA以及對(duì)照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，提取細(xì)胞總蛋白，使用針對(duì)磷酸化Smad3（p-Smad3）和總Smad3的特異性抗體，通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)Smad3的磷酸化水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ZNF8過表達(dá)組中p-Smad3的蛋白表達(dá)水平顯著升高，而ZNF8siRNA轉(zhuǎn)染組中p-Smad3的蛋白表達(dá)水平明顯降低。這表明ZNF8能夠促進(jìn)Smad3的磷酸化，增強(qiáng)其活性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入TGFβ1刺激，觀察ZNF8對(duì)Smad3磷酸化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TGFβ1刺激下，ZNF8過表達(dá)組中p-Smad3的增加更為明顯，而ZNF8siRNA轉(zhuǎn)染組中p-Smad3的增加幅度較小。這說明ZNF8能夠協(xié)同TGFβ1促進(jìn)Smad3的磷酸化，增強(qiáng)TGFβ信號(hào)通路的激活。研究ZNF8對(duì)Smad3核轉(zhuǎn)位能力的影響，采用免疫熒光染色技術(shù)。將MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF8過表達(dá)質(zhì)粒、ZNF8siRNA或?qū)φ召|(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，用TGFβ1刺激細(xì)胞30分鐘。然后將細(xì)胞固定、透化，用Smad3抗體進(jìn)行孵育，再用熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行染色，通過激光共聚焦顯微鏡觀察Smad3在細(xì)胞內(nèi)的定位。結(jié)果顯示，在對(duì)照組中，TGFβ1刺激后，部分Smad3從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。在ZNF8過表達(dá)組中，細(xì)胞核內(nèi)Smad3的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明更多的Smad3發(fā)生了核轉(zhuǎn)位。而在ZNF8siRNA轉(zhuǎn)染組中，細(xì)胞核內(nèi)Smad3的熒光強(qiáng)度較弱，Smad3的核轉(zhuǎn)位受到抑制。這表明ZNF8能夠促進(jìn)Smad3在TGFβ1刺激下的核轉(zhuǎn)位，使其能夠更有效地進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。為了探究ZNF8與Smad3結(jié)合后對(duì)Smad3與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用的影響，采用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析的方法。在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染ZNF8過表達(dá)質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒，然后用TGFβ1刺激細(xì)胞。使用Smad3抗體進(jìn)行免疫共沉淀，將沉淀產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析，鑒定與Smad3相互作用的蛋白質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ZNF8過表達(dá)組中，Smad3與轉(zhuǎn)錄因子AP-1（由c-Jun和c-Fos組成）的相互作用明顯增強(qiáng)。進(jìn)一步通過免疫共沉淀和Westernblot驗(yàn)證，結(jié)果顯示，在ZNF8過表達(dá)組中，能夠檢測(cè)到更多的AP-1與Smad3共沉淀。這表明ZNF8與Smad3結(jié)合后，能夠促進(jìn)Smad3與AP-1的相互作用。已知AP-1在調(diào)控與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)中具有重要作用，ZNF8通過促進(jìn)Smad3與AP-1的相互作用，可能協(xié)同調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。ZNF8與Smad3結(jié)合后，能夠促進(jìn)Smad3的磷酸化，增強(qiáng)其活性，促進(jìn)Smad3在TGFβ1刺激下的核轉(zhuǎn)位，使其能夠更有效地進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。ZNF8還能促進(jìn)Smad3與轉(zhuǎn)錄因子AP-1的相互作用，協(xié)同調(diào)控與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果揭示了ZNF8通過調(diào)節(jié)Smad3的活性及信號(hào)傳導(dǎo)，在TGFβ信號(hào)通路介導(dǎo)的乳腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。4.2ZNF8通過TGFβ信號(hào)通路調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)4.2.1肺轉(zhuǎn)移特征基因的篩選與驗(yàn)證為了篩選出受ZNF8和TGFβ信號(hào)通路共同調(diào)控的與乳腺癌肺轉(zhuǎn)移相關(guān)的特征基因，本研究首先采用基因芯片技術(shù)，對(duì)ZNF8過表達(dá)和敲低的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞以及正常對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。將MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞分為三組，分別轉(zhuǎn)染ZNF8過表達(dá)質(zhì)粒、ZNF8siRNA和對(duì)照質(zhì)粒，培養(yǎng)48小時(shí)后提取細(xì)胞總RNA。將提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后標(biāo)記熒光染料，與基因芯片進(jìn)行雜交。通過掃描芯片，獲取基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并使用專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ZNF8過表達(dá)組中有[X]個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，[X]個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；ZNF8敲低組中有[X]個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，[X]個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證基因芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用RNA測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)對(duì)上述三組細(xì)胞進(jìn)行分析。RNA-seq技術(shù)能夠更全面、準(zhǔn)確地檢測(cè)基因的表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄本信息。將提取的細(xì)胞總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和片段化處理，然后構(gòu)建cDNA文庫，進(jìn)行高通量測(cè)序。通過生物信息學(xué)分析，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)、注釋和差異表達(dá)基因分析。RNA-seq結(jié)果與基因芯片結(jié)果具有較高的一致性，進(jìn)一步證實(shí)了基因芯片篩選出的差異表達(dá)基因的可靠性。在基因芯片和RNA-seq分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道，篩選出與乳腺癌肺轉(zhuǎn)移相關(guān)的特征基因。這些基因涉及多個(gè)生物學(xué)過程，如細(xì)胞遷移、侵襲、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、血管生成等。選擇其中[X]個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。為了驗(yàn)證篩選出的肺轉(zhuǎn)移特征基因的表達(dá)變化，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)。以β-actin作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)針對(duì)每個(gè)特征基因的特異性引物。提取ZNF8過表達(dá)、敲低和對(duì)照組MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，計(jì)算每個(gè)特征基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，在ZNF8過表達(dá)組中，[X]個(gè)特征基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，與基因芯片和RNA-seq結(jié)果一致；在ZNF8敲低組中，這些特征基因的表達(dá)水平明顯下調(diào)。這表明ZNF8能夠調(diào)控這些肺轉(zhuǎn)移特征基因的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些基因在蛋白水平的表達(dá)變化，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）。提取ZNF8過表達(dá)、敲低和對(duì)照組MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的總蛋白，通過SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用特異性抗體分別檢測(cè)每個(gè)特征基因編碼的蛋白表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參蛋白。結(jié)果顯示，在ZNF8過表達(dá)組中，[X]個(gè)特征基因編碼的蛋白表達(dá)水平顯著升高；在ZNF8敲低組中，這些蛋白的表達(dá)水平明顯降低。這進(jìn)一步證實(shí)了ZNF8對(duì)肺轉(zhuǎn)移特征基因表達(dá)的調(diào)控作用。為了探究這些肺轉(zhuǎn)移特征基因在乳腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中的功能，進(jìn)行了功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。針對(duì)每個(gè)特征基因，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的siRNA，轉(zhuǎn)染MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，敲低其表達(dá)水平。然后進(jìn)行Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)和小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)中，敲低特征基因表達(dá)后，MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯減弱。在小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)中，敲低特征基因表達(dá)后，小鼠肺組織中的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著減少。這些結(jié)果表明，篩選出的肺轉(zhuǎn)移特征基因在乳腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，ZNF8可能通過調(diào)控這些基因的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。通過基因芯片、RNA測(cè)序等技術(shù)篩選出受ZNF8和TGFβ信號(hào)通路共同調(diào)控的與乳腺癌肺轉(zhuǎn)移相關(guān)的特征基因，并通過qRT-PCR、Westernblot等實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，這些特征基因在乳腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中具有重要功能。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究ZNF8通過TGFβ信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供了重要的基因靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2.2基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me3修飾的調(diào)控在確定了受ZNF8和TGFβ信號(hào)通路共同調(diào)控的肺轉(zhuǎn)移特征基因后，深入探究ZNF8與Smad3結(jié)合后，如何募集甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD3到這些基因啟動(dòng)子區(qū)域，增強(qiáng)H3K4me3修飾，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的具體機(jī)制。采用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證ZNF8、Smad3和SMYD3是否能夠結(jié)合到肺轉(zhuǎn)移特征基因的啟動(dòng)子區(qū)域。選取MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染ZNF8過表達(dá)質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒，然后用TGFβ1刺激細(xì)胞。將細(xì)胞用甲醛固定，使蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)，然后裂解細(xì)胞，超聲破碎染色質(zhì)，將染色質(zhì)片段化。分別使用ZNF8抗體、Smad3抗體和SMYD3抗體進(jìn)行免疫沉淀，將與抗體結(jié)合的染色質(zhì)片段沉淀下來。用蛋白酶K消化交聯(lián)的蛋白質(zhì)，釋放出DNA片段。對(duì)沉淀的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)是否存在肺轉(zhuǎn)移特征基因啟動(dòng)子區(qū)域的特異性片段。結(jié)果顯示，在ZNF8過表達(dá)組中，ZNF8、Smad3和SMYD3抗體均能夠沉淀出肺轉(zhuǎn)移特征基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段，而在對(duì)照組中，沉淀出的DNA片段較少。這表明ZNF8、Smad3和SMYD3能夠結(jié)合到肺轉(zhuǎn)移特征基因的啟動(dòng)子區(qū)域，且ZNF8過表達(dá)能夠增強(qiáng)這種結(jié)合。為了探究ZNF8與Smad3結(jié)合對(duì)SMYD3募集的影響，構(gòu)建ZNF8和Smad3的截?cái)嗤蛔凅w。分別構(gòu)建缺失與Smad3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的ZNF8突變體（ΔZNF8-Smad3）和缺失與ZNF8結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Smad3突變體（ΔSmad3-ZNF8）。將這些突變體分別轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中，然后進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ZNF8缺失與Smad3結(jié)合結(jié)構(gòu)域時(shí)，SMYD3與肺轉(zhuǎn)移特征基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合明顯減弱；當(dāng)Smad3缺失與ZNF8結(jié)合結(jié)構(gòu)域時(shí)，SMYD3的結(jié)合也顯著下降。這表明ZNF8與Smad3的結(jié)合對(duì)于SMYD3募集到肺轉(zhuǎn)移特征基因啟動(dòng)子區(qū)域至關(guān)重要。采用甲基化特異性PCR（MS-PCR）和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）技術(shù)，檢測(cè)肺轉(zhuǎn)移特征基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me3修飾水平。提取ZNF8過表達(dá)、敲低和對(duì)照組MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的基因組DNA，用亞硫酸氫鈉處理，使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。然后設(shè)計(jì)針對(duì)H3K4me3修飾位點(diǎn)的特異性引物，進(jìn)行MS-PCR擴(kuò)增。通過電泳分析，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的甲基化狀態(tài)。使用HPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)H3K4me3修飾水平進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，在ZNF8過表達(dá)組中，肺轉(zhuǎn)移特征基因啟動(dòng)子區(qū)域的H3K4me3修飾水平顯著升高；在ZNF8敲低組中，H3K4me3修飾水平明顯降低。這表明ZNF8能夠通過募集SMYD3，增強(qiáng)肺轉(zhuǎn)移特征基因啟動(dòng)子區(qū)域的H3K4me3修飾。為了探究H3K4me3修飾對(duì)肺轉(zhuǎn)移特征基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響，采用RNA干擾技術(shù)敲低SMYD3的表達(dá)。設(shè)計(jì)并合成針對(duì)SMYD3的siRNA，轉(zhuǎn)染MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，使SMYD3的表達(dá)水平降低。然后進(jìn)行qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)肺轉(zhuǎn)移特征基因的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，敲低SMYD3后，肺轉(zhuǎn)移特征基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降。這表明H3K4me3修飾對(duì)于肺轉(zhuǎn)移特征基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)至關(guān)重要，ZNF8通過募集SMYD3增強(qiáng)H3K4me3修飾，從而促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移特征基因的表達(dá)。通過ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ZNF8、Smad3和SMYD3能夠結(jié)合到肺轉(zhuǎn)移特征基因的啟動(dòng)子區(qū)域，且ZNF8與Smad3的結(jié)合對(duì)于SMYD3的募集至關(guān)重要。通過MS-PCR和HPLC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)到ZNF8能夠增強(qiáng)肺轉(zhuǎn)移特征基因啟動(dòng)子區(qū)域的H3K4me3修飾，敲低SMYD3則會(huì)降低基因的表達(dá)水平。這些結(jié)果揭示了ZNF8通過TGFβ信號(hào)通路，募集SMYD3增強(qiáng)肺轉(zhuǎn)移特征基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me3修飾，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的具體機(jī)制，為深入理解ZNF8促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。4.3ZNF8介導(dǎo)的TGFβ信號(hào)通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響4.3.1上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程的調(diào)控為了探究ZNF8通過TGFβ信號(hào)通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT過程的影響，選取MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行研究。將細(xì)胞分為四組：對(duì)照組、ZNF8過表達(dá)組、TGFβ1刺激組以及ZNF8過表達(dá)聯(lián)合TGFβ1刺激組。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)各組細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ZNF8過表達(dá)組中E-cadherin的表達(dá)水平明顯降低，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平顯著升高。在TGFβ1刺激組中，也觀察到類似的變化趨勢(shì)。而在ZNF8過表達(dá)聯(lián)合TGFβ1刺激組中，E-cadherin的表達(dá)水平進(jìn)一步降低，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平升高更為明顯。這表明ZNF8過表達(dá)和TGFβ1刺激均能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，且二者具有協(xié)同作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ZNF8對(duì)EMT過程的影響，采用免疫熒光染色技術(shù)觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。在對(duì)照組中，MDA-MB-231細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞之間緊密連接，呈鵝卵石樣排列，E-cadherin在細(xì)胞膜上呈強(qiáng)陽性表達(dá)。在ZNF8過表達(dá)組中，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，變得細(xì)長，細(xì)胞間連接減少，呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特征，N-cadherin和Vimentin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯增強(qiáng)。在TGFβ1刺激組中，也觀察到類似的細(xì)胞形態(tài)改變。在ZNF8過表達(dá)聯(lián)合TGFβ1刺激組中，細(xì)胞形態(tài)的改變更為顯著，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)也更為強(qiáng)烈。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了ZNF8能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT。為了探究ZNF8通過TGFβ信號(hào)通路調(diào)控EMT過程的機(jī)制，檢測(cè)了EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和Twist的表達(dá)水平。通過qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，ZNF8過表達(dá)組和TGFβ1刺激組中Snail、Slug和Twist的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高。在ZNF8過表達(dá)聯(lián)合TGFβ1刺激組中，這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平升高更為明顯。這表明ZNF8可能通過上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制和N-cadherin、Vimentin等間質(zhì)標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄激活，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT。為了驗(yàn)證這一機(jī)制，采用RNA干擾技術(shù)敲低ZNF8的表達(dá)，并加入TGFβ1刺激。結(jié)果顯示，敲低ZNF8后，TGFβ1刺激誘導(dǎo)的Snail、Slug和Twist的表達(dá)升高受到抑制，E-cadherin的表達(dá)水平相對(duì)升高，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平降低。這進(jìn)一步證實(shí)了ZNF8在TGFβ信號(hào)通路介導(dǎo)的EMT過程中發(fā)揮著重要作用，通過上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的EMT過程，進(jìn)而增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。ZNF8通過TGFβ信號(hào)通路，上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和Twist的表達(dá)，抑制上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解ZNF8促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供了重要線索。4.3.2細(xì)胞遷移、侵襲及血管外滲等過程的影響為了研究ZNF8通過TGFβ信號(hào)通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，進(jìn)行了一系列體外實(shí)驗(yàn)。選取MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，分為對(duì)照組、ZNF8過表達(dá)組、TGFβ1刺激組以及ZNF8過表達(dá)聯(lián)合TGFβ1刺激組。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，將各組細(xì)胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含有血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)一定時(shí)間后，對(duì)遷移到下室的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色和計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ZNF8過表達(dá)組和TGFβ1刺激組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯