VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子：制備工藝與免疫原性的深度解析一、引言1.1研究背景豬細(xì)小病毒（PorcineParvovirus，PPV）作為一種單鏈DNA病毒，主要感染豬只，給牲畜生產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了重大的經(jīng)濟(jì)損失。PPV可經(jīng)胎盤(pán)垂直傳播，也可通過(guò)接觸感染豬的排泄物、分泌物等水平傳播，一旦傳入豬場(chǎng)，很容易在豬群中迅速擴(kuò)散。母豬在妊娠早期感染PPV，胚胎、胎豬死亡率最高可達(dá)80%-100%，會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、產(chǎn)仔數(shù)減少等癥狀，嚴(yán)重影響母豬的繁殖性能。公豬感染后精液帶毒，雖不影響受精率，但會(huì)成為病毒的傳播源。當(dāng)前，針對(duì)豬細(xì)小病毒的治療方法存在諸多局限性。一方面，PPV感染后缺乏特效治療藥物，主要以預(yù)防為主?，F(xiàn)有的疫苗雖然在一定程度上能夠預(yù)防感染，但仍存在一些問(wèn)題。傳統(tǒng)的滅活疫苗免疫效果相對(duì)較弱，需要多次免疫才能達(dá)到較好的保護(hù)效果，且免疫持續(xù)期較短。弱毒疫苗雖然免疫原性較強(qiáng)，但存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)導(dǎo)致疫苗接種豬發(fā)病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)潛在威脅。此外，隨著PPV的不斷變異，現(xiàn)有的疫苗對(duì)一些新的變異株的保護(hù)效果可能會(huì)降低，這也給豬細(xì)小病毒病的防控帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，病毒樣粒子（Virus-LikeParticles，VLPs）因其良好的免疫原性，在預(yù)防、診斷和治療方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。VLPs是由病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白自動(dòng)組裝而成的空心顆粒，沒(méi)有病毒的核酸，不能自主復(fù)制，在形態(tài)上與天然病毒粒子相同或相似。由于VLPs不含有病毒的遺傳物質(zhì)，因此不具有感染性，但卻保留了天然病毒的抗原表位，能夠有效地激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。目前，基于VLP的疫苗已在人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒、流感病毒等疾病的預(yù)防中得到應(yīng)用，如針對(duì)人乳頭瘤病毒（HPV）的Gardasil和Cevarix、針對(duì)乙型肝炎病毒（HBV）的GenHevacB和Bio-Hep以及針對(duì)流感病毒的InflexalV、Hecolin等。在豬病防控領(lǐng)域，VLPs也逐漸成為研究熱點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)新型豬細(xì)小病毒疫苗提供了新的思路。VP22短肽是一種具有良好抗原性的肽鏈，由22個(gè)氨基酸組成，具有高度透過(guò)細(xì)胞膜和定位到細(xì)胞核的功能。它能夠?qū)⑼庠吹鞍邹D(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中，這一特性使得VP22短肽在基因治療和疫苗研究等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在病毒蛋白研究中，VP22短肽已被廣泛應(yīng)用，例如將VP22短肽與其他病毒蛋白融合，可增強(qiáng)蛋白的免疫原性和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)效率。將VP22短肽融合至豬細(xì)小病毒VLP表面，有可能提高VLP的免疫效果，為豬細(xì)小病毒的預(yù)防、診斷和治療提供一種新的策略。1.2研究目的與意義本研究旨在制備VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行初步研究，為豬細(xì)小病毒的預(yù)防、診斷和治療提供新的思路和方法。具體而言，本研究的目的包括：通過(guò)基因工程技術(shù)，將VP22短肽與豬細(xì)小病毒的結(jié)構(gòu)蛋白融合，構(gòu)建表達(dá)VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子的重組表達(dá)系統(tǒng)，并優(yōu)化表達(dá)條件，實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)；利用蛋白純化技術(shù)，對(duì)表達(dá)的VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子進(jìn)行純化和鑒定，確保其純度和結(jié)構(gòu)完整性；通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子的免疫原性，包括誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，為開(kāi)發(fā)新型豬細(xì)小病毒疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究的意義在于：為豬細(xì)小病毒的防控提供新的策略。目前，針對(duì)豬細(xì)小病毒的疫苗存在免疫效果不理想、毒力返強(qiáng)等問(wèn)題，本研究制備的VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子，有望提高疫苗的免疫原性和安全性，為豬細(xì)小病毒病的防控提供更有效的手段；豐富病毒樣粒子的研究?jī)?nèi)容。VP22短肽具有獨(dú)特的細(xì)胞穿透和核定位功能，將其與豬細(xì)小病毒樣粒子融合，不僅可以拓展VLPs的應(yīng)用領(lǐng)域，還可以為研究VLPs的免疫機(jī)制提供新的模型；為其他病毒疫苗的研發(fā)提供參考。本研究中采用的基因工程技術(shù)和免疫原性評(píng)價(jià)方法，可為其他病毒疫苗的研發(fā)提供借鑒和參考，推動(dòng)病毒疫苗領(lǐng)域的發(fā)展。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀豬細(xì)小病毒樣粒子（PPV-VLPs）的研究始于20世紀(jì)90年代，Martine等在1992年將PPVVP2基因克隆到桿狀病毒系統(tǒng)中，成功在昆蟲(chóng)細(xì)胞中高效表達(dá)并證明VP2多肽能夠自我裝配成VLPs，為PPV新型亞單位疫苗的研究開(kāi)辟了新路徑。此后，針對(duì)PPV-VLPs的研究不斷深入。F.G.A.Adriaan等在2006年利用昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的PPVVP2基因產(chǎn)物制備VLPs疫苗，發(fā)現(xiàn)添加免疫佐劑時(shí)，該疫苗可在豬體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的血清抗體，展現(xiàn)出良好的免疫效果。國(guó)內(nèi)學(xué)者也在該領(lǐng)域積極探索，如陳楊等在2011年成功利用偽狂犬病病毒（PRV）表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PPV的VP2蛋白并裝配成VLPs，為開(kāi)發(fā)二聯(lián)疫苗提供了可能。在免疫機(jī)制方面，研究表明PPV-VLPs能夠通過(guò)與天然病毒感染機(jī)體相似的途徑呈遞給免疫細(xì)胞（T、B淋巴細(xì)胞），有效誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。由于其不含有病毒核酸，安全性高，成為研制安全高效預(yù)防豬細(xì)小病毒病疫苗的潛在候選對(duì)象。但目前PPV-VLPs疫苗仍存在一些問(wèn)題，例如免疫原性有待進(jìn)一步提高，在規(guī)?；a(chǎn)過(guò)程中成本較高、產(chǎn)量較低等，限制了其廣泛應(yīng)用。VP22短肽作為一種具有高度透過(guò)細(xì)胞膜和定位到細(xì)胞核功能的肽鏈，自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在基因治療和疫苗研究等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。在病毒蛋白研究中，VP22短肽常被用于增強(qiáng)蛋白的免疫原性和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)效率。劉金鳳等在2017年采用融合PCR方法將豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）Cap基因和人單純皰疹病毒Ⅰ型病毒（HSV-1）VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域串聯(lián)，構(gòu)建重組桿狀病毒，證實(shí)C端融合VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域序列不影響Cap蛋白的組裝，為研制安全、高效的PCV2疫苗奠定了基礎(chǔ)。然而，目前關(guān)于VP22短肽的研究多集中在其與其他病毒蛋白的融合以及在基因治療載體方面的應(yīng)用，對(duì)于VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子的研究還相對(duì)較少。將VP22短肽融合至豬細(xì)小病毒VLP表面，是否能有效提高VLP的免疫原性，以及這種融合粒子在體內(nèi)的免疫應(yīng)答機(jī)制如何等問(wèn)題，尚未得到深入研究。在制備工藝上，如何實(shí)現(xiàn)VP22短肽與豬細(xì)小病毒樣粒子的高效融合與表達(dá)，也是當(dāng)前研究的空白點(diǎn)之一。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1豬細(xì)小病毒概述2.1.1生物學(xué)特性豬細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，呈球形，無(wú)囊膜，直徑約為18-26nm。病毒粒子由32個(gè)殼粒組成，呈二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)。其基因組為單鏈線(xiàn)狀DNA，長(zhǎng)度約為5kb，包含兩個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框（ORF），分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2。VP2是構(gòu)成病毒衣殼的主要成分，約占病毒總蛋白的80%以上，其抗原性強(qiáng)，在病毒的免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。豬細(xì)小病毒具有較強(qiáng)的抵抗力，對(duì)熱、酸、堿以及常用的消毒藥都有一定的耐受性。在56℃條件下處理48h或者在70℃條件下處理2h，病毒依舊具有感染力；但在80℃條件下處理5min，病毒的感染性和血凝活性會(huì)消失。該病毒對(duì)pH值的適應(yīng)范圍較廣，在pH3.0-9.0的環(huán)境中都能存活。此外，豬細(xì)小病毒對(duì)氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑不敏感，這使得其在外界環(huán)境中能夠存活較長(zhǎng)時(shí)間，增加了傳播的風(fēng)險(xiǎn)。在體外培養(yǎng)方面，豬細(xì)小病毒可在多種細(xì)胞系中生長(zhǎng)，如豬腎細(xì)胞（PK-15）、豬睪丸細(xì)胞（ST）等。在適宜的培養(yǎng)條件下，病毒感染細(xì)胞后，會(huì)引起細(xì)胞病變（CPE），表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、皺縮、脫落等。病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖過(guò)程包括吸附、侵入、脫殼、生物合成、組裝和釋放等階段。病毒感染細(xì)胞后，首先通過(guò)其表面的蛋白與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，然后侵入細(xì)胞內(nèi)。在細(xì)胞內(nèi)，病毒利用宿主細(xì)胞的代謝機(jī)制進(jìn)行核酸復(fù)制和蛋白質(zhì)合成，隨后組裝成新的病毒粒子并釋放到細(xì)胞外，繼續(xù)感染其他細(xì)胞。2.1.2致病機(jī)理豬細(xì)小病毒主要感染妊娠母豬，引發(fā)母豬繁殖障礙，其致病機(jī)制較為復(fù)雜。當(dāng)母豬感染豬細(xì)小病毒后，病毒會(huì)在體內(nèi)迅速增殖，并通過(guò)血液循環(huán)侵入子宮，感染胚胎或胎兒。病毒感染胚胎或胎兒后，會(huì)導(dǎo)致其發(fā)育異常，最終出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等癥狀。研究表明，豬細(xì)小病毒對(duì)胎兒的損害主要是由于病毒感染導(dǎo)致胎兒細(xì)胞的凋亡和壞死。病毒感染胎兒細(xì)胞后，會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；同時(shí)，病毒的增殖也會(huì)消耗細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，導(dǎo)致細(xì)胞壞死。此外，病毒感染還會(huì)引起胎兒免疫系統(tǒng)的紊亂，使其無(wú)法有效地抵御病毒的感染，進(jìn)一步加重了胎兒的損傷。在母豬感染豬細(xì)小病毒的過(guò)程中，病毒血癥的出現(xiàn)是病毒感染胎兒的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。一般來(lái)說(shuō)，母豬感染病毒后，需要經(jīng)過(guò)10-14天才會(huì)出現(xiàn)病毒血癥，此時(shí)病毒才能通過(guò)胎盤(pán)感染胎兒。一旦病毒侵入子宮，會(huì)以較慢的速度從一個(gè)胚胎蔓延到另一個(gè)胚胎，導(dǎo)致不同大小的木乃伊胎出現(xiàn)。此外，母豬的免疫力和感染病毒的時(shí)間、劑量等因素也會(huì)影響病毒的致病過(guò)程。如果母豬在妊娠早期感染病毒，由于胚胎的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，對(duì)病毒的抵抗力較弱，因此更容易受到病毒的感染和損害。而如果母豬在妊娠后期感染病毒，胎兒的免疫系統(tǒng)已經(jīng)逐漸發(fā)育完善，對(duì)病毒的抵抗力相對(duì)較強(qiáng)，此時(shí)胎兒可能會(huì)形成針對(duì)該病毒的抵抗力，產(chǎn)后血清學(xué)檢查呈陽(yáng)性，但不一定會(huì)出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。2.1.3流行病學(xué)特點(diǎn)豬細(xì)小病毒的宿主范圍較為狹窄，豬是其唯一的已知宿主，不同年齡、性別和品種的家豬、野豬都可感染，但發(fā)病常見(jiàn)于初產(chǎn)母豬。該病的傳染源主要來(lái)自感染細(xì)小病毒的母豬和帶毒的公豬，后備母豬比經(jīng)產(chǎn)母豬易感染。病毒能通過(guò)胎盤(pán)垂直傳播，而帶毒豬所產(chǎn)的活豬可能帶毒排毒時(shí)間很長(zhǎng)甚至終生。此外，感染種公豬也是該病最危險(xiǎn)的傳染源之一，可在公豬的精液、精索、附睪、性腺中分離到病毒，種公豬通過(guò)配種傳染給易感母豬，并使該病傳播擴(kuò)散。豬細(xì)小病毒的傳播途徑主要包括胎盤(pán)感染、精液傳播、呼吸道傳播和消化道傳播。病毒可經(jīng)胎盤(pán)垂直感染胎兒，也可通過(guò)交配感染母豬。此外，病毒還可通過(guò)被污染的食物、環(huán)境，經(jīng)呼吸道、消化道感染豬只。鼠類(lèi)也可傳播本病，它們可能通過(guò)接觸感染豬的排泄物或分泌物，攜帶病毒并傳播給其他豬只。豬細(xì)小病毒病一般呈地方流行性或散發(fā)。一旦豬場(chǎng)發(fā)生本病后，可持續(xù)多年。該病的發(fā)生與季節(jié)緊密相關(guān)，通常在每年4-10月發(fā)生，或者在母豬交配、產(chǎn)仔后的一段時(shí)間內(nèi)發(fā)生。在規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)中，由于豬只密度大、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件復(fù)雜等因素，更容易發(fā)生豬細(xì)小病毒病的傳播和流行。此外，豬群的免疫力、疫苗接種情況等也會(huì)影響該病的流行情況。如果豬群的免疫力較低，未進(jìn)行有效的疫苗接種，一旦引入感染豬或接觸到病毒污染的環(huán)境，就容易引發(fā)疫情。2.2病毒樣粒子（VLP）2.2.1VLP的結(jié)構(gòu)與形成機(jī)制病毒樣粒子（Virus-LikeParticles，VLPs）是一種由病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白自動(dòng)組裝而成的空心顆粒，其結(jié)構(gòu)與天然病毒粒子相似，但不含有病毒的核酸。VLPs的大小、形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征取決于組成它們的病毒蛋白種類(lèi)和組裝方式。例如，人乳頭瘤病毒（HPV）的VLPs呈二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，直徑約為55nm，由L1蛋白組裝而成；乙型肝炎病毒（HBV）的VLPs則有球形和絲狀兩種形態(tài)，球形VLPs直徑約為22nm，由S蛋白組裝而成。VLPs的形成機(jī)制主要基于病毒結(jié)構(gòu)蛋白之間的相互作用以及與細(xì)胞膜等生物膜的相互作用。以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)VLPs為例，當(dāng)病毒結(jié)構(gòu)蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)后，它們會(huì)首先形成寡聚體，然后這些寡聚體進(jìn)一步組裝成VLPs。在組裝過(guò)程中，蛋白質(zhì)的折疊、修飾以及與其他分子的相互作用都起著關(guān)鍵作用。研究表明，一些輔助蛋白或分子伴侶可能參與了VLPs的組裝過(guò)程，它們能夠幫助病毒結(jié)構(gòu)蛋白正確折疊和組裝，提高VLPs的形成效率。此外，細(xì)胞膜等生物膜也為VLPs的組裝提供了模板和環(huán)境，一些VLPs在組裝過(guò)程中會(huì)與細(xì)胞膜結(jié)合，利用細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)來(lái)穩(wěn)定自身的結(jié)構(gòu)。2.2.2VLP的免疫機(jī)制當(dāng)VLPs進(jìn)入機(jī)體后，首先會(huì)被抗原呈遞細(xì)胞（APCs），如樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）、巨噬細(xì)胞等識(shí)別和攝取。APCs通過(guò)其表面的模式識(shí)別受體（PRRs），如Toll樣受體（TLRs）等，識(shí)別VLPs表面的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答。在細(xì)胞內(nèi)，VLPs被加工處理成抗原肽，并與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子結(jié)合，形成MHC-抗原肽復(fù)合物。該復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)到APCs表面，呈遞給T淋巴細(xì)胞，激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答。同時(shí)，VLPs表面的抗原表位也能夠直接激活B淋巴細(xì)胞，使其分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗體。這些抗體可以與VLPs結(jié)合，通過(guò)中和作用、調(diào)理作用等機(jī)制清除病毒。此外，VLPs還能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTLs），殺傷被病毒感染的細(xì)胞。研究表明，VLPs誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答具有較強(qiáng)的記憶性，能夠在機(jī)體再次接觸相同病原體時(shí)，迅速產(chǎn)生免疫反應(yīng)，提供長(zhǎng)期的免疫保護(hù)。2.2.3在疫苗研發(fā)中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，VLPs展現(xiàn)出多方面的顯著優(yōu)勢(shì)。從安全性角度來(lái)看，由于VLPs不含有病毒的遺傳物質(zhì)，不存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，也不會(huì)導(dǎo)致機(jī)體感染病毒。與傳統(tǒng)的減毒活疫苗相比，VLPs疫苗的安全性更高，尤其適合免疫功能低下的人群使用。在免疫原性方面，VLPs具有高度重復(fù)的抗原表位，能夠以類(lèi)似天然病毒的方式被免疫系統(tǒng)識(shí)別，從而激發(fā)強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。研究表明，VLPs疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的特異性抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，且免疫記憶持久，能夠提供長(zhǎng)期的免疫保護(hù)。此外，VLPs在疫苗研發(fā)中還具有良好的可設(shè)計(jì)性和多樣性。通過(guò)基因工程技術(shù)，可以對(duì)VLPs的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，將不同病毒的抗原表位或其他免疫調(diào)節(jié)分子融合到VLPs中，構(gòu)建多價(jià)或多功能的疫苗。這種可設(shè)計(jì)性使得VLPs能夠針對(duì)不同的病原體和免疫需求進(jìn)行定制，為開(kāi)發(fā)新型疫苗提供了廣闊的空間。在生產(chǎn)工藝上，VLPs可以在多種表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，如細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，這為大規(guī)模生產(chǎn)VLPs疫苗提供了技術(shù)支持，降低了生產(chǎn)成本。2.3VP22短肽2.3.1結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)VP22短肽由22個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列為：MALPVTALLLPLALLLAPALL（單字母代碼：MALPVTALLLPLALLLAPALL）。該短肽具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，富含丙氨酸（Ala）和亮氨酸（Leu），這些氨基酸的疏水性使得VP22短肽能夠與細(xì)胞膜相互作用，從而實(shí)現(xiàn)穿透細(xì)胞膜的功能。研究表明，VP22短肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋組成，這種結(jié)構(gòu)賦予了短肽較高的穩(wěn)定性和柔韌性，使其能夠在不同的環(huán)境中保持活性。VP22短肽最顯著的功能是能夠高度透過(guò)細(xì)胞膜并定位到細(xì)胞核中。當(dāng)VP22短肽與外源蛋白融合后，它可以攜帶外源蛋白進(jìn)入細(xì)胞，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)。這種功能的實(shí)現(xiàn)機(jī)制主要是通過(guò)VP22短肽與細(xì)胞膜上的磷脂分子相互作用，形成一種類(lèi)似于通道的結(jié)構(gòu)，從而使融合蛋白能夠穿過(guò)細(xì)胞膜。進(jìn)入細(xì)胞后，VP22短肽通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，利用細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸系統(tǒng)將融合蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核。VP22短肽的這種細(xì)胞穿透和核定位功能在基因治療和疫苗研究等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在基因治療中，VP22短肽可以作為載體，將治療基因輸送到細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)基因的高效表達(dá)；在疫苗研究中，VP22短肽可以增強(qiáng)抗原蛋白的免疫原性，促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞的攝取和加工，從而提高疫苗的免疫效果。2.3.2在病毒蛋白研究中的應(yīng)用案例在病毒蛋白研究領(lǐng)域，VP22短肽已被廣泛應(yīng)用，并取得了一系列重要成果。劉金鳳等在2017年的研究中，將豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）Cap基因和人單純皰疹病毒Ⅰ型病毒（HSV-1）VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域串聯(lián)，構(gòu)建重組桿狀病毒。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，C端融合VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域序列不影響Cap蛋白的組裝，且重組病毒樣顆粒能夠在昆蟲(chóng)細(xì)胞中成功表達(dá)，并具有良好的反應(yīng)原性。這一研究為研制安全、高效的PCV2疫苗奠定了基礎(chǔ)。在另一項(xiàng)關(guān)于禽流感病毒（AIV）的研究中，科研人員將VP22短肽與AIV的血凝素（HA）蛋白融合，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。結(jié)果表明，融合蛋白能夠在真核細(xì)胞中高效表達(dá)，且VP22短肽顯著增強(qiáng)了HA蛋白的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)效率和免疫原性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，接種融合蛋白的小鼠產(chǎn)生了更高水平的特異性抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)AIV的攻擊具有更強(qiáng)的抵抗力。此外，在乙型肝炎病毒（HBV）的研究中，VP22短肽也被用于增強(qiáng)HBV表面抗原（HBsAg）的免疫效果。將VP22短肽與HBsAg融合后，融合蛋白能夠更有效地被抗原呈遞細(xì)胞攝取和加工，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。這些應(yīng)用案例充分展示了VP22短肽在病毒蛋白研究中的重要作用，為開(kāi)發(fā)新型病毒疫苗和診斷試劑提供了新的策略和方法。三、VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子的制備3.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器3.1.1材料豬細(xì)小病毒毒株選用流行的強(qiáng)毒株，如NADL-8株，從感染豬的組織中分離獲得，經(jīng)鑒定后保存于-80℃冰箱備用。表達(dá)載體選擇pFastBac1桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，該載體含有多克隆位點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止子等元件，便于目的基因的克隆和表達(dá)。宿主細(xì)胞為昆蟲(chóng)細(xì)胞系Sf9，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，在含有10%胎牛血清的Grace's昆蟲(chóng)培養(yǎng)基中，于27℃、5%CO?條件下培養(yǎng)。相關(guān)試劑包括限制性?xún)?nèi)切酶XhoI、BamHI（購(gòu)自ThermoFisherScientific公司），用于酶切表達(dá)載體和目的基因，以便進(jìn)行基因克隆；T4DNA連接酶（購(gòu)自NewEnglandBiolabs公司），用于連接酶切后的表達(dá)載體和目的基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒；DNAMarker（購(gòu)自TaKaRa公司），在核酸電泳中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于判斷目的基因和重組質(zhì)粒的大??；蛋白Marker（購(gòu)自ThermoFisherScientific公司），在蛋白質(zhì)電泳中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于判斷表達(dá)蛋白的大??；質(zhì)粒提取試劑盒（購(gòu)自O(shè)mega公司），用于提取重組質(zhì)粒，保證質(zhì)粒的純度和質(zhì)量；DNA凝膠回收試劑盒（購(gòu)自Qiagen公司），用于回收酶切后的目的基因和載體片段，去除雜質(zhì)；PCRMix（購(gòu)自TaKaRa公司），包含了PCR反應(yīng)所需的DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等成分，簡(jiǎn)化了PCR反應(yīng)體系的配制過(guò)程；IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，購(gòu)自Sigma公司），作為誘導(dǎo)劑，用于誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)；SDS凝膠制備試劑盒（購(gòu)自Bio-Rad公司），用于制備聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分析；Westernblot相關(guān)試劑，如封閉液（5%脫脂奶粉）、一抗（抗豬細(xì)小病毒VP2蛋白單克隆抗體，自制）、二抗（HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購(gòu)自JacksonImmunoResearch公司）等，用于檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況。3.1.2儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)所需的儀器設(shè)備包括PCR儀（型號(hào)為AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler），用于擴(kuò)增目的基因，通過(guò)精確控制溫度變化，實(shí)現(xiàn)DNA的復(fù)制和擴(kuò)增；離心機(jī)（型號(hào)為Eppendorf5424R），用于離心分離樣品，如細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)等，通過(guò)高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，使不同密度的物質(zhì)分離；電泳儀（型號(hào)為Bio-RadPowerPacBasic），用于核酸和蛋白質(zhì)的電泳分析，在電場(chǎng)的作用下，使核酸和蛋白質(zhì)在凝膠中遷移，根據(jù)遷移速率的不同進(jìn)行分離和鑒定；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)為Bio-RadChemiDocMP），用于觀察和記錄電泳后的凝膠圖像，通過(guò)對(duì)凝膠進(jìn)行拍照和分析，獲取核酸和蛋白質(zhì)的相關(guān)信息；恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)為T(mén)hermoScientificHeratherm），用于培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞，提供適宜的溫度、濕度和氣體環(huán)境，滿(mǎn)足細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的需求；超凈工作臺(tái)（型號(hào)為蘇州安泰SW-CJ-2FD），為細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作提供無(wú)菌環(huán)境，防止微生物污染；冷凍離心機(jī)（型號(hào)為BeckmanCoulterOptimaXPN-100），用于低溫離心分離樣品，在低溫條件下，保護(hù)生物分子的活性和穩(wěn)定性；超聲波細(xì)胞破碎儀（型號(hào)為寧波新芝SCIENTZ-IID），用于破碎細(xì)胞，釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)，通過(guò)超聲波的作用，使細(xì)胞破裂。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1引物設(shè)計(jì)與合成參考GenBank中豬細(xì)小病毒VP2基因序列（登錄號(hào)：XXXXXX）以及已知的VP22短肽氨基酸序列，利用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增VP22短肽基因的引物，上游引物VP22-F：5'-ATGGCCCTCCCCGTCACCGCC-3'，引入XhoI酶切位點(diǎn)；下游引物VP22-R：5'-GCGGATCCCTACCCCTCGCCCTCTTCT-3'，引入BamHI酶切位點(diǎn)。同時(shí)，設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增豬細(xì)小病毒VP2基因的引物，上游引物VP2-F：5'-CGCCTCGAGATGGACTACAACCAGCCC-3'，引入XhoI酶切位點(diǎn)；下游引物VP2-R：5'-CGCGGATCCTTAGGCGTCCCCTTGCAG-3'，引入BamHI酶切位點(diǎn)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后的引物經(jīng)PAGE純化后，用無(wú)菌去離子水溶解至100μM的儲(chǔ)存濃度，保存于-20℃冰箱備用。3.2.2基因擴(kuò)增與重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建以提取的豬細(xì)小病毒基因組DNA為模板，進(jìn)行VP2基因的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括2×PCRMix25μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板DNA1μL，ddH?O22μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。同時(shí)，以合成的VP22短肽基因片段為模板，按照同樣的PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行VP22短肽基因的擴(kuò)增。將擴(kuò)增得到的VP22短肽基因和VP2基因分別用XhoI和BamHI進(jìn)行雙酶切，酶切體系為20μL，包括10×Buffer2μL，限制性?xún)?nèi)切酶XhoI和BamHI各1μL，DNA片段5μL，ddH?O11μL，37℃水浴酶切2h。酶切后的VP22短肽基因和VP2基因經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收后，與同樣經(jīng)XhoI和BamHI雙酶切并回收的pFastBac1桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體進(jìn)行連接。連接體系為10μL，包括T4DNA連接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，載體DNA1μL，目的基因DNA7μL，16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。取5μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入800μL無(wú)抗LB液體培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)1h。然后將菌液涂布于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取重組質(zhì)粒，用XhoI和BamHI進(jìn)行雙酶切鑒定，同時(shí)進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。3.2.3蛋白表達(dá)與純化將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行同源重組。取5μL重組質(zhì)粒加入到100μLDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入800μL無(wú)抗LB液體培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)4h。然后將菌液涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）、慶大霉素（7μg/mL）、四環(huán)素（10μg/mL）和IPTG（40μg/mL）、X-gal（40μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)48h。挑取白色菌落接種于含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取重組桿粒Bacmid，用M13引物進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的重組桿粒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將重組桿粒Bacmid轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9中，制備重組桿狀病毒。取1μg重組桿粒Bacmid加入到50μL無(wú)血清Grace's昆蟲(chóng)培養(yǎng)基中，輕輕混勻；取2μLCellfectinIIReagent加入到50μL無(wú)血清Grace's昆蟲(chóng)培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置5min。然后將兩者混合，輕輕混勻，室溫靜置20min。將混合液加入到含有1×10?個(gè)Sf9細(xì)胞的6孔板中，輕輕混勻，27℃培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，即為第一代重組桿狀病毒（P1）。將P1代重組桿狀病毒以1MOI（感染復(fù)數(shù)）的比例感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞，27℃培養(yǎng)72h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，即為第二代重組桿狀病毒（P2）。用P2代重組桿狀病毒以1MOI的比例感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)物。將細(xì)胞培養(yǎng)物在4℃、8000r/min條件下離心10min，收集上清。向上清中加入硫酸銨，使其終濃度達(dá)到40%，4℃攪拌過(guò)夜。然后在4℃、12000r/min條件下離心30min，收集沉淀。將沉淀用適量的PBS緩沖液溶解，透析去除硫酸銨，得到初步純化的重組蛋白。進(jìn)一步采用鎳柱親和層析法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。將初步純化的重組蛋白上樣到Ni-NTAHis?BindResin鎳柱中，用含有20mM咪唑的PBS緩沖液洗脫雜蛋白，再用含有250mM咪唑的PBS緩沖液洗脫目的蛋白。收集洗脫峰，用SDS和Westernblot對(duì)純化后的重組蛋白進(jìn)行鑒定。3.2.4病毒樣粒子的組裝與鑒定將純化后的VP22短肽融合豬細(xì)小病毒重組蛋白在體外進(jìn)行組裝，形成病毒樣粒子。將重組蛋白溶液與含有10mMMgCl?、10mMCaCl?的組裝緩沖液按照1:1的比例混合，4℃孵育過(guò)夜。然后將組裝后的樣品在4℃、10000r/min條件下離心10min，去除未組裝的蛋白和雜質(zhì)。將沉淀用適量的PBS緩沖液重懸，得到病毒樣粒子溶液。采用透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)病毒樣粒子的形態(tài)和大小進(jìn)行觀察。將病毒樣粒子溶液滴加到銅網(wǎng)上，用2%磷鎢酸負(fù)染5min，自然干燥后，在透射電子顯微鏡下觀察。同時(shí)，利用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）技術(shù)測(cè)定病毒樣粒子的粒徑分布。將病毒樣粒子溶液稀釋至適當(dāng)濃度，加入到DLS樣品池中，在25℃條件下測(cè)定粒徑分布。此外，通過(guò)Westernblot和ELISA等方法對(duì)病毒樣粒子表面的抗原表位進(jìn)行鑒定，以確定病毒樣粒子的免疫活性。3.3結(jié)果與分析利用設(shè)計(jì)合成的引物，以豬細(xì)小病毒基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，VP2基因擴(kuò)增出約1.7kb的特異性條帶，VP22短肽基因擴(kuò)增出約70bp的特異性條帶，與預(yù)期大小一致（圖1）。這表明引物設(shè)計(jì)合理，PCR反應(yīng)條件優(yōu)化得當(dāng)，成功擴(kuò)增出了目的基因，為后續(xù)的重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。將擴(kuò)增得到的VP22短肽基因和VP2基因分別與pFastBac1桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行XhoI和BamHI雙酶切鑒定，結(jié)果顯示，酶切后得到了與預(yù)期大小相符的片段，VP22-VP2重組質(zhì)粒酶切后得到約70bp和5.4kb的片段，VP2重組質(zhì)粒酶切后得到約1.7kb和5.4kb的片段（圖2）。同時(shí)，PCR鑒定也得到了相應(yīng)的目的基因條帶。測(cè)序結(jié)果表明，插入的VP22短肽基因和VP2基因序列正確，無(wú)堿基突變，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pFastBac1-VP22-VP2和pFastBac1-VP2。將重組桿粒Bacmid轉(zhuǎn)染至昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9中，制備重組桿狀病毒。經(jīng)過(guò)多次傳代和擴(kuò)增后，收集細(xì)胞培養(yǎng)物，通過(guò)SDS和Westernblot對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定。SDS結(jié)果顯示，在約70kDa處出現(xiàn)了特異性條帶，與預(yù)期的VP22短肽融合豬細(xì)小病毒VP2蛋白大小一致（圖3）。Westernblot結(jié)果表明，該條帶能夠與抗豬細(xì)小病毒VP2蛋白單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了重組蛋白的表達(dá)（圖4）。利用鎳柱親和層析法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，純化后的蛋白純度達(dá)到了90%以上，滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。將純化后的VP22短肽融合豬細(xì)小病毒重組蛋白在體外進(jìn)行組裝，形成病毒樣粒子。透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，組裝后的病毒樣粒子呈球形，直徑約為20-25nm，與天然豬細(xì)小病毒粒子的大小和形態(tài)相似（圖5）。動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測(cè)定結(jié)果表明，病毒樣粒子的粒徑分布較為均勻，平均粒徑為（22.5±1.5）nm。Westernblot和ELISA結(jié)果顯示，病毒樣粒子表面含有豬細(xì)小病毒VP2蛋白的抗原表位，具有良好的免疫活性，能夠與抗豬細(xì)小病毒VP2蛋白單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合。四、VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子免疫原性研究4.1免疫原性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與分組選用6-8周齡、體重20-25g的雌性BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，共40只，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱(chēng)]。小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度為50%-60%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。將40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。分別為：VP22-VP2VLPs組、VP2VLPs組、PPV滅活疫苗組和PBS對(duì)照組。VP22-VP2VLPs組接種本研究制備的VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子；VP2VLPs組接種未融合VP22短肽的豬細(xì)小病毒樣粒子；PPV滅活疫苗組接種市售的豬細(xì)小病毒滅活疫苗（購(gòu)自[疫苗生產(chǎn)廠家名稱(chēng)]）；PBS對(duì)照組接種等量的無(wú)菌PBS緩沖液。分組的依據(jù)是為了對(duì)比不同免疫原對(duì)小鼠免疫反應(yīng)的影響，VP22-VP2VLPs組和VP2VLPs組用于探究VP22短肽融合對(duì)病毒樣粒子免疫原性的增強(qiáng)作用，PPV滅活疫苗組作為陽(yáng)性對(duì)照，用于評(píng)估新型免疫原與傳統(tǒng)疫苗的免疫效果差異，PBS對(duì)照組則用于排除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中其他因素對(duì)小鼠免疫反應(yīng)的干擾。4.1.2免疫方案制定免疫原劑量的確定參考相關(guān)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。VP22-VP2VLPs組和VP2VLPs組的免疫劑量均為每只小鼠每次接種50μg蛋白，PPV滅活疫苗組按照疫苗說(shuō)明書(shū)推薦劑量進(jìn)行接種，PBS對(duì)照組接種等量的PBS緩沖液，體積為100μL。免疫途徑采用肌肉注射，選擇小鼠后腿肌肉作為注射部位。肌肉注射能夠使免疫原直接進(jìn)入肌肉組織，肌肉組織中含有豐富的血管和淋巴管，有利于免疫原的吸收和運(yùn)輸，從而激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。免疫次數(shù)為3次，每次免疫間隔2周。初次免疫后，機(jī)體的免疫系統(tǒng)需要一定的時(shí)間來(lái)識(shí)別和處理免疫原，產(chǎn)生初次免疫應(yīng)答。間隔2周進(jìn)行第二次免疫，可以進(jìn)一步刺激免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，使機(jī)體產(chǎn)生更多的抗體和免疫細(xì)胞。第三次免疫則能夠鞏固免疫記憶，延長(zhǎng)免疫保護(hù)的時(shí)間。每次免疫后，密切觀察小鼠的健康狀況，包括精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化等，記錄是否出現(xiàn)不良反應(yīng)，如發(fā)熱、腹瀉、局部紅腫等。4.2免疫反應(yīng)檢測(cè)指標(biāo)與方法4.2.1抗體水平檢測(cè)在免疫后的第0、2、4、6周，通過(guò)小鼠眼眶采血的方式收集血液樣本，每次采集量約為200μL。血液樣本在室溫下靜置1-2h，使血液凝固，然后在4℃、3000r/min條件下離心15min，分離血清。將分離得到的血清保存于-80℃冰箱備用，避免反復(fù)凍融，以保證血清中抗體的活性。采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)免疫小鼠血清中的抗體水平。具體步驟如下：用包被緩沖液將豬細(xì)小病毒VP2蛋白稀釋至1μg/mL，加入到96孔酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃過(guò)夜包被。包被結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌3次，每次3min，以去除未結(jié)合的抗原。然后加入封閉液（5%脫脂奶粉），每孔200μL，37℃封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，再次用PBST洗滌3次。將待檢血清樣本用PBST進(jìn)行2倍系列倍比稀釋?zhuān)瑥?:100開(kāi)始，加入到酶標(biāo)板中，每孔100μL，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（未免疫小鼠血清）和陽(yáng)性對(duì)照（已知高滴度的抗豬細(xì)小病毒血清），37℃孵育1h。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌5次。加入用封閉液1:2000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃孵育1h。再次用PBST洗滌5次。加入TMB單組份顯色液，每孔100μL，室溫避光反應(yīng)15min。最后加入ELISA終止液，每孔100μL，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處讀取吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算抗體效價(jià)，以P/N值（樣品孔吸光值/陰性對(duì)照孔吸光值）≥2.1判定為陽(yáng)性。4.2.2細(xì)胞因子水平檢測(cè)在末次免疫后1周，通過(guò)小鼠眼眶采血收集血液樣本，分離血清，保存于-80℃冰箱備用。采用超敏電化學(xué)發(fā)光技術(shù)（MesoScaleDiscovery，MSD）檢測(cè)免疫小鼠血清中相關(guān)細(xì)胞因子水平，包括白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）等。這些細(xì)胞因子在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，IL-2主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的活性；IL-4主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，參與體液免疫反應(yīng)，促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和分化，誘導(dǎo)抗體類(lèi)別轉(zhuǎn)換為IgE；IFN-γ主要由Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)，抑制病毒復(fù)制。MSD檢測(cè)的具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。首先將捕獲抗體包被到MSD96孔石墨電極板上，4℃過(guò)夜。然后用洗液洗滌3次，加入封閉液，室溫封閉1h。封閉后，再次洗滌3次。將血清樣本用稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度，加入到孔板中，同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品和空白對(duì)照，室溫孵育2h。孵育結(jié)束后，洗滌3次。加入檢測(cè)抗體，室溫孵育1h。再次洗滌3次。加入ReadBufferT，在MSD超敏多因子電化學(xué)發(fā)光分析儀MESOSector600或QuickplexSQ120上讀取信號(hào)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算細(xì)胞因子的濃度。4.2.3細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)在末次免疫后2周，處死小鼠，取脾臟組織，制備脾細(xì)胞懸液。將脾細(xì)胞懸液調(diào)整至適當(dāng)濃度，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1×10?個(gè)細(xì)胞。分別加入豬細(xì)小病毒VP2蛋白（終濃度為10μg/mL）作為刺激抗原，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（只加培養(yǎng)基）和陽(yáng)性對(duì)照（ConA，終濃度為5μg/mL），37℃、5%CO?條件下培養(yǎng)72h。采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISpot）檢測(cè)脾細(xì)胞中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量。具體步驟如下：用包被抗體（抗小鼠IFN-γ單克隆抗體）包被PVDF板，4℃過(guò)夜。包被結(jié)束后，用洗液洗滌3次，加入封閉液，室溫封閉2h。封閉后，再次洗滌3次。將培養(yǎng)后的脾細(xì)胞懸液加入到PVDF板中，每孔100μL，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，37℃、5%CO?條件下孵育24h。孵育結(jié)束后，用洗液洗滌5次。加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體（抗小鼠IFN-γ生物素化抗體），室溫孵育2h。再次洗滌5次。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素，室溫孵育1h。洗滌5次后，加入BCIP/NBT底物孵育，待斑點(diǎn)出現(xiàn)后，用ELISpot酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)分泌IFN-γ的細(xì)胞。此外，利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟組織中CD4?和CD8?T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。將脾臟組織用福爾馬林固定，石蠟包埋，切成4μm厚的切片。切片脫蠟、水化后，進(jìn)行抗原修復(fù)。用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。加入封閉液，室溫封閉30min。分別加入抗CD4?和抗CD8?T淋巴細(xì)胞的一抗，4℃過(guò)夜。洗滌后，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。洗滌后，加入DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。通過(guò)檢測(cè)CD4?和CD8?T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，可以評(píng)估細(xì)胞免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和類(lèi)型。CD4?T淋巴細(xì)胞主要輔助其他免疫細(xì)胞發(fā)揮功能，促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)；CD8?T淋巴細(xì)胞則具有細(xì)胞毒性，能夠直接殺傷被病毒感染的細(xì)胞。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論在抗體水平檢測(cè)方面，通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)免疫小鼠血清中的抗體水平，結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出，在免疫后的第2周，VP22-VP2VLPs組、VP2VLPs組和PPV滅活疫苗組的小鼠血清中均檢測(cè)到了特異性抗體，但VP22-VP2VLPs組的抗體水平明顯高于VP2VLPs組和PPV滅活疫苗組（P<0.05）。隨著免疫次數(shù)的增加，各組小鼠血清中的抗體水平均逐漸升高，在第6周時(shí)達(dá)到峰值。其中，VP22-VP2VLPs組的抗體效價(jià)最高，達(dá)到了1:12800，顯著高于VP2VLPs組（1:6400）和PPV滅活疫苗組（1:3200）（P<0.05），而PBS對(duì)照組小鼠血清中未檢測(cè)到特異性抗體。這表明VP22短肽的融合顯著增強(qiáng)了豬細(xì)小病毒樣粒子的免疫原性，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更高水平的特異性抗體。VP22短肽的細(xì)胞穿透和核定位功能可能促進(jìn)了抗原的攝取和呈遞，從而增強(qiáng)了機(jī)體的體液免疫反應(yīng)。在細(xì)胞因子水平檢測(cè)方面，采用超敏電化學(xué)發(fā)光技術(shù)（MSD）檢測(cè)免疫小鼠血清中白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子水平，結(jié)果如表1所示。VP22-VP2VLPs組小鼠血清中IL-2、IFN-γ的水平顯著高于VP2VLPs組、PPV滅活疫苗組和PBS對(duì)照組（P<0.05），而IL-4的水平在各組之間無(wú)顯著差異（P>0.05）。IL-2和IFN-γ是Th1型細(xì)胞因子，主要參與細(xì)胞免疫反應(yīng)，它們的升高表明VP22-VP2VLPs能夠有效激活Th1型免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。而IL-4是Th2型細(xì)胞因子，主要參與體液免疫反應(yīng)，其水平在各組之間無(wú)顯著差異，說(shuō)明VP22短肽的融合對(duì)體液免疫相關(guān)的Th2型免疫應(yīng)答影響較小。在細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)方面，采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISpot）檢測(cè)脾細(xì)胞中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果如圖7所示。VP22-VP2VLPs組小鼠脾細(xì)胞中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量明顯多于VP2VLPs組、PPV滅活疫苗組和PBS對(duì)照組（P<0.05），表明VP22-VP2VLPs能夠刺激小鼠產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)更多的脾細(xì)胞分泌IFN-γ。此外，通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟組織中CD4?和CD8?T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，結(jié)果如圖8所示。VP22-VP2VLPs組小鼠脾臟組織中CD4?和CD8?T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量顯著高于VP2VLPs組、PPV滅活疫苗組和PBS對(duì)照組（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)了VP22-VP2VLPs能夠增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)。CD4?T淋巴細(xì)胞主要輔助其他免疫細(xì)胞發(fā)揮功能，促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)；CD8?T淋巴細(xì)胞則具有細(xì)胞毒性，能夠直接殺傷被病毒感染的細(xì)胞。VP22-VP2VLPs誘導(dǎo)的CD4?和CD8?T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增加，說(shuō)明其能夠有效激活機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)豬細(xì)小病毒的免疫防御能力。綜上所述，本研究制備的VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。VP22短肽的融合顯著增強(qiáng)了豬細(xì)小病毒樣粒子的免疫效果，為開(kāi)發(fā)新型豬細(xì)小病毒疫苗提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。然而，本研究?jī)H在小鼠模型中進(jìn)行了初步的免疫原性研究，未來(lái)還需要進(jìn)一步在豬等動(dòng)物模型中進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)其免疫保護(hù)效果、作用機(jī)制以及安全性等方面進(jìn)行深入研究，以推動(dòng)VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子疫苗的研發(fā)和應(yīng)用。五、結(jié)論與展望5.1研究總結(jié)本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，成功制備了VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了初步研究。在制備過(guò)程中，我們利用基因工程技術(shù)，將VP22短肽基因與豬細(xì)小病毒VP2基因進(jìn)行融合，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pFastBac1-VP22-VP2。通過(guò)對(duì)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染以及重組桿狀病毒的制備和擴(kuò)增，最終實(shí)現(xiàn)了VP22短肽融合豬細(xì)小病毒重組蛋白的高效表達(dá)。經(jīng)過(guò)純化和組裝，獲得了形態(tài)和大小與天然豬細(xì)小病毒粒子相似的病毒樣粒子，且該粒子表面含有豬細(xì)小病毒VP2蛋白的抗原表位，具有良好的免疫活性。在免疫原性研究方面，我們選用BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，設(shè)置了VP22-VP2VLPs組、VP2VLPs組、PPV滅活疫苗組和PBS對(duì)照組，通過(guò)肌肉注射的方式進(jìn)行免疫，并在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)小鼠的免疫反應(yīng)。結(jié)果表明，VP22短肽的融合顯著增強(qiáng)了豬細(xì)小病毒樣粒子的免疫原性。VP22-VP2VLPs組小鼠血清中的特異性抗體水平明顯高于VP2VLPs組和PPV滅活疫苗組，且隨著免疫次數(shù)的增加，抗體水平持續(xù)升高。在細(xì)胞因子水平檢測(cè)中，VP22-VP2VLPs組小鼠血清中Th1型細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的水平顯著升高，表明其能夠有效激活Th1型免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果也顯示，VP22-VP2VLPs組小鼠脾細(xì)胞中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，脾臟組織中CD4?和CD8?T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)了VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子能夠增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)。5.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)與不足本研究的創(chuàng)新之處在于首次將VP22短肽與豬細(xì)小病毒樣粒子進(jìn)行融合，利用VP22短肽獨(dú)特的細(xì)胞穿透和核定位功能，增強(qiáng)豬細(xì)小病毒樣粒子的免疫原性。在制備過(guò)程中，通過(guò)優(yōu)化基因克隆和重組表達(dá)技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了VP22短肽融合豬細(xì)小病毒重組蛋白的高效表達(dá)和組裝，為后續(xù)的免疫原性研究提供了充足的實(shí)驗(yàn)材料。在免疫原性評(píng)價(jià)方面，采用了多種檢測(cè)指標(biāo)和方法，全面評(píng)估了VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，為新型豬細(xì)小病毒疫苗的研發(fā)提供了較為系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，本研究也存在一些不足之處。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，雖然設(shè)置了多個(gè)對(duì)照組，但僅選用了BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，小鼠模型與豬的生理結(jié)構(gòu)和免疫反應(yīng)存在一定差異，可能會(huì)影響研究結(jié)果的外推性。未來(lái)的研究需要進(jìn)一步在豬等動(dòng)物模型中進(jìn)行驗(yàn)證，以更準(zhǔn)確地評(píng)估VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子的免疫效果。在樣本數(shù)量方面，每組小鼠僅為10只，樣本量相對(duì)較小，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差和不確定性增加。后續(xù)研究可以適當(dāng)增加樣本數(shù)量，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，本研究?jī)H對(duì)VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子的免疫原性進(jìn)行了初步研究，對(duì)于其免疫保護(hù)效果、作用機(jī)制以及安全性等方面的研究還不夠深入。未來(lái)需要進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)研究，全面評(píng)估VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子作為新型疫苗的可行性和應(yīng)用前景。5.3未來(lái)研究方向未來(lái)研究可進(jìn)一步優(yōu)化VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子的制備工藝，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)量