Chapter4核酸

NucleicAcids重點(diǎn)內(nèi)容：核酸的組成DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)及測(cè)序方法三種RNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)核酸的性質(zhì)常見(jiàn)的核酸研究技術(shù)二十一世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)生命=核酸+蛋白質(zhì)二十一世紀(jì)是核酸、蛋白質(zhì)的世紀(jì)生命是？概述由儲(chǔ)藏遺傳信息的核酸和調(diào)節(jié)代謝的酶蛋白組成的系統(tǒng)。FriedrichMiescher

DNA發(fā)現(xiàn)者第一節(jié)核酸的種類、分布與功能一、核酸的種類與分布（一）核酸的種類（RNA、DNA）

DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）:tRNA(transferRNA)、mRNA(messengerRNA)、rRNA（ribosomalRNA）特殊功能的RNA:小分子細(xì)胞核RNA（snRNA）、細(xì)胞質(zhì)小RNA（scRNA）、反義RNA（antisenseRNA）、雙鏈RNA（dsRNA）、具有催化活性的RNA（ribozyme）

真核生物原核生物

DNA細(xì)胞核（95%）線粒體、葉綠體（5%）核質(zhì)區(qū)（擬核）

RNA細(xì)胞質(zhì)（75%）線粒體、葉綠體（15%）細(xì)胞核（10%）細(xì)胞質(zhì)（二）核酸的分布二、核酸的生物學(xué)功能

（一）DNA是主要的遺傳物質(zhì)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)：1944，O.T.

Avery肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1952，A.Hershey和M.Chase噬菌體感染實(shí)驗(yàn)1944年，O.T.Avery（美）肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),首次證明DNA是細(xì)菌的遺傳物質(zhì)。Hershey-Chase（1952）噬菌體侵染細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)。（二）RNA生物學(xué)功能RNA的功能：1.參與蛋白質(zhì)的合成

rRNA(75-80%)tRNA(10-15%)mRNA(2-5%)2.遺傳物質(zhì)3.具有生物催化劑功能4.參與基因表達(dá)的調(diào)控第二節(jié)：核酸的化學(xué)組成一、核酸的元素組成

基本元素：CHONP

核酸的元素組成有兩個(gè)特點(diǎn)：1.一般不含S。2.P含量較多，并且恒定（9%-10%）。因此，實(shí)驗(yàn)室中用定磷法進(jìn)行核酸的定量分析。（DNA9.9%、RNA9.5%）二核酸的分子組成核酸（nucleicacid)核苷酸(nucleotide)磷酸(phosphoricacid)核苷(nucleoside)戊糖(pentose)堿基(base)1．核苷酸（1）Base:核酸中除了5類基本的堿基外，還有一些含量甚少的稀有堿基，多數(shù)是甲基化的產(chǎn)物。如：稀有堿基1’2’4’3’5’（2）戊糖DNASugar:deoxy-ribose（3）核苷nucleoside核苷由戊糖和堿基縮合而成，嘌呤的N9或嘧啶的N1與戊糖C-1’-OH以C-N糖苷鍵相連接。dANNNNNH2OHHOHOCH2HHHH9NONOOHOCH2HHHHOHOHU1假尿苷

胸腺嘧啶核糖核苷稀有核苷（tRNA）（4）核苷酸nucleotide核苷酸是核苷的磷酸酯。如：DNA為5′-磷酸-脫氧核糖核苷、RNA的為5′-磷酸-核糖核苷。2．核苷酸衍生物ATP是生物體內(nèi)分布最廣和最重要的一種核苷酸衍生物，能量載體。它的結(jié)構(gòu)如下：（1）ATP(腺嘌呤核糖核苷三磷酸)

(2)GTP(鳥(niǎo)嘌呤核糖核苷三磷酸)（3）環(huán)核苷酸cAMP和cGMP激素的第二信使，cAMP調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝。cAMP和cGMP的環(huán)狀磷酯鍵是一個(gè)高能鍵。比ATP水解能高得多。（4）輔酶的組成成分HSCoA、NAD+、NADP+、FAD等輔助因子。（1）參與DNA、RNA的合成、蛋白質(zhì)的合成。（2）在能量轉(zhuǎn)化中起重要作用，ATP是生物體內(nèi)能量的通用貨幣。（3）是構(gòu)成多種輔酶的成分：NAD、NADP、FAD、FMN和CoA。（4）參與細(xì)胞中的代謝與調(diào)節(jié)（cAMP、cGMP、UDP-葡萄糖）。3．核苷酸的生物學(xué)作用小結(jié)UDP-葡萄糖4．多聚核苷酸(DNA/RNA)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)多聚核苷酸是通過(guò)核苷酸的5’-P與另一分子核苷酸的C3’-OH形成磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。DNA或RNA鏈的特點(diǎn)：一端為C5′帶有一個(gè)自由磷酸基，稱為5′-磷酸端（常用5′-P表示）；另一端C3’帶有自由的羥基，稱為3′-羥基端（常用3′-OH表示）。當(dāng)表示DNA或RNA鏈時(shí)，必須注明它的方向是5′→3′或是3′→5′（具有方向性）。一、DNA的分子結(jié)構(gòu)（一）DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)1.定義：指DNA分子中脫氧核苷酸的排列順序。即數(shù)量龐大的四種堿基的排列順序。2.DNA的堿基組成（Chargaff定則）：（1）在所有的DNA中，A=T，G=C即A+G=T+C（2）DNA的堿基組成具有種的特異性，即不同生物物種的DNA具有自己獨(dú)特的堿基組成，但沒(méi)有組織和器官的特異性。

第三節(jié)：核酸的分子結(jié)構(gòu)3.DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的表示法:5′3′結(jié)構(gòu)式5′3′

p

p

p

pOH3′ACTG1′線條式5′

ACTGCATAGCTCGA3′5′

pACTGCATAGCTCGAOH

3′字母式DNA測(cè)序的生物學(xué)意義

DNA是遺傳信息的儲(chǔ)存者和傳遞者，遺傳信息是由堿基序列體現(xiàn)的，堿基序列略有改變，即可引起遺傳信息的顯著改變。所以DNA測(cè)序是研究DNA

功能的基礎(chǔ)。

DNA測(cè)序的實(shí)驗(yàn)方法雙脫氧終止法（Sanger法）和化學(xué)法（Gilbert法）4.DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究方法：DNA的雙脫氧終止法測(cè)序策略體外合成一段與待測(cè)DNA序列互補(bǔ)的隨機(jī)DNA片段群。Deoxynucleotide;DideoxynucleotideDideoxynucleotidech04\DNASequencing.mov（二）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)1.定義：

DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)指DNA的兩條多聚核苷酸鏈間通過(guò)氫鍵形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。2．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)1）DNA由兩條反平行的多核苷酸鏈組成，兩條鏈繞同一中心軸相纏繞，形成右手雙股螺旋，一條5’→3’，另一條3’→5’。螺旋上有大溝和小溝。

DNAdoublehelixBFormmajorgrooveminorgroove2）嘌呤與嘧啶堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)。磷酸與脫氧核糖在雙螺旋外側(cè)。磷酸與脫氧核糖彼此通過(guò)3’、5’-磷酸二酯鍵相連接，構(gòu)成DNA分子的骨架。堿基平面與縱軸垂直，糖環(huán)平面與縱軸平行。3）兩條核苷酸鏈，依靠堿基互補(bǔ)形成的氫鍵結(jié)合在一起。A和T之間形成兩個(gè)氫鍵，G與C之間形成三個(gè)氫鍵。雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)關(guān)系。4）螺旋橫截面的直徑約為2nm，每條鏈相鄰兩個(gè)堿基平面之間的距離為0.34nm，每10個(gè)核苷酸形成一個(gè)螺旋，其螺距（即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈）高度為3.4nm。3．DNA雙螺旋的穩(wěn)定因素維持DNA穩(wěn)定性的主要因素包括：兩條DNA鏈之間堿基配對(duì)形成的氫鍵和堿基堆積力；另外，磷酸基團(tuán)上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽(yáng)離子間形成的離子鍵及范德華力對(duì)維持雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性上也起一定的作用。B-DNA：典型的Watson-Crick雙螺旋DNA。右手雙股螺旋。在相對(duì)濕度為92%時(shí)的DNA鈉鹽。接近DNA在細(xì)胞中的構(gòu)象。A-DNA：在相對(duì)濕度為75%以下時(shí)的DNA纖維。右手雙螺旋，外形粗短，RNA-RNA、RNA-DNA雜交分子具有這種結(jié)構(gòu)。Z-DNA：左手雙螺旋DNA。天然B-DNA的局部區(qū)域可以形成Z-DNA。4．DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的多型性P489表13－6列出了A、B、Z型DNA的主要特征數(shù)據(jù)。DNA三鏈結(jié)構(gòu)常出現(xiàn)在DNA復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)或調(diào)節(jié)位點(diǎn)。

第三股鏈的存在可能使一些調(diào)控蛋白或RNA聚合酶等難以與該區(qū)段結(jié)合，從而阻遏有關(guān)遺傳信息的表達(dá)。TAT、C+GC兩種堿基配對(duì)方式（Hoogsteen配對(duì)）。

DNA三股螺旋（H-DNA）：H-DNA的結(jié)構(gòu)（三）DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)一、定義：DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)指在DNA雙螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上通過(guò)扭曲和折疊所形成的特定構(gòu)象。超螺旋是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的一種類型。超螺旋即DNA雙螺旋的螺旋。DNA超螺旋的意義：

使DNA形成高度致密狀態(tài)從而得以裝入核中HumangenomeDNAlength=3x109x0.34x10-9=1.02mCellsize:10-6to10-5m

推動(dòng)DNA結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化以滿足功能上的需要。如負(fù)超螺旋分子所受張力會(huì)引起互補(bǔ)鏈分開(kāi)導(dǎo)致局部變性，利于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。超螺旋RNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)RNA的U替代DNA中的T，組成RNA的核苷酸也是以3′-5′磷酸二酯鍵連接。RNA是單鏈分子，因此，在RNA分子中，并不遵守A＋G＝T＋C的比例關(guān)系。RNA分子中，部分區(qū)域也能形成雙螺旋結(jié)構(gòu)（類似A-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)），不能形成雙螺旋的部分，則形成突環(huán)。這種結(jié)構(gòu)可以形象地稱為“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)或莖環(huán)結(jié)構(gòu)。二、RNA的分子結(jié)構(gòu)RNA的主要類型：

tRNA、mRNA和rRNA在RNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，堿基的配對(duì)情況不象DNA中嚴(yán)格。G除了可以和C配對(duì)外，也可以和U配對(duì)。G-U配對(duì)形成的氫鍵較弱。不同類型的RNA,其二級(jí)結(jié)構(gòu)有明顯的差異。tRNA中除了常見(jiàn)的堿基外，還存在一些稀有堿基，這類堿基大部分位于突環(huán)部分.1.tRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：分子量25kDa左右，大約由70－90個(gè)核苷酸組成，沉降系數(shù)為4S左右。分子中含有較多的修飾成分。3′-末端都具有CpCpAOH的結(jié)構(gòu)。5′端多為pG,也有pC。（一）tRNA2、tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)大都呈“三葉草”形狀，一般具有四臂四環(huán)：包括氨基酸接受臂、反密碼（環(huán)）臂、二氫尿嘧啶（環(huán)）臂、TC（環(huán)）臂和可變環(huán)。氨基酸接受臂

包含有tRNA的3’-末端和5’-末端，3’-末端的最后3個(gè)核苷酸殘基都是CCAOH，氨基酸可與其成酯，該區(qū)在蛋白質(zhì)合成中起攜帶氨基酸的作用。

反密碼環(huán)

與氨基酸接受區(qū)相對(duì)，一般環(huán)中含有7個(gè)核苷酸殘基，其中環(huán)中正中的3個(gè)核苷酸殘基稱為反密碼子，與mRNA上的密碼子反向配對(duì)。tRNA的功能:在蛋白質(zhì)生物合成中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸和識(shí)別密碼子的作用。3、tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)在三葉草型二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，突環(huán)上未配對(duì)的堿基由于整個(gè)分子的扭曲而配成對(duì)，目前已知的tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)均為倒L形。（二）mRNA約占總RNA的5%。不同細(xì)胞的mRNA的鏈長(zhǎng)和分子量差異很大。它的功能是將DNA的遺傳信息傳遞到蛋白質(zhì)，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。1、mRNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)真核：?jiǎn)雾樂(lè)醋印?’-末端有“帽子”、3’-末端有polyA片段和非編碼區(qū)和非編碼區(qū)原核：多順?lè)醋?’-末端無(wú)“帽子”、3’-末端無(wú)polyA片段（病毒除外）有非編碼區(qū)有非編碼區(qū)順?lè)醋樱簃RNA上具有翻譯功能的核苷酸順序。極大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA在3’-末端有一段長(zhǎng)約20－250核苷酸的polyA。polyA是在轉(zhuǎn)錄后經(jīng)polyA聚合酶的作用而添加上去的。polyA可能的功能：與mRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移有關(guān)；與mRNA的半壽期有關(guān)，新合成的RNA其polyA鏈較長(zhǎng)，而衰老的mRNA，polyA鏈縮短。2）真核mRNA3’-polyA“尾巴”3）真核mRNA5’-“帽子”結(jié)構(gòu)(P229)

“帽子”結(jié)構(gòu)：甲基化的鳥(niǎo)苷酸通過(guò)焦磷酸與真核mRNA5’-末端的核苷酸以5’、5’-三磷酸二酯鍵相連。三種帽子結(jié)構(gòu)：

O型：m7G5’ppp5’NpI型：m7G5’ppp5’NmpNpII型：m7G5’ppp5’NmpNmpNp可能功能：

抵抗5’核酸外切酶降解mRNA。為核糖體提供識(shí)別位點(diǎn)，使mRNA很快與核糖體結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物的形成。**4）原核mRNA

無(wú)5’帽子和3’polyA，但有5’端先導(dǎo)區(qū)。

SD序列：5’端先導(dǎo)區(qū)中，有一段富含嘌呤的堿基序列，典型的為5’-AGGAGGU-3’，位于起始密碼子AUG前約10核苷酸處，此序列由Shine和Dalgarno發(fā)現(xiàn)，稱SD序列。通過(guò)SD序列和核糖體16S的rRNA的3’末端富含嘧啶堿基的序列互補(bǔ)。（三）rRNArRNA與核糖體結(jié)合蛋白一起構(gòu)成核糖體。大腸桿菌中有三類rRNA（原核）：

5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA

真核細(xì)胞有四類rRNA：

5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA★rRNA的功能：●組成核糖體●23SrRNA具有催化肽鍵形成的肽基轉(zhuǎn)移酶活性●參與tRNA與mRNA的結(jié)合蛋白質(zhì)的合成需要三種RNA的參與一、核酸的兩性解離DNApI為4～4.5，RNApI為2～2.5。RNA的等電點(diǎn)比DNA低是因?yàn)镽NA分子中核糖基2′-OH通過(guò)氫鍵促進(jìn)了磷酸基上質(zhì)子的解離。第四節(jié)核酸的性質(zhì)1.酸水解糖苷鍵和磷酸酯鍵都能被酸水解。2.堿水解室溫0.1mol/LNaOH條件下，DNA不水解，而RNA完全水解。

原因：RNA中C’2-OH的存在，促進(jìn)了磷酸酯鍵的水解。

DNA穩(wěn)定，保留和傳遞遺傳信息。

RNA是DNA的信使，完成任務(wù)后迅速降解。二、核酸的水解3、核酸的酶解RNA水解酶RNaseDNA水解酶DNase核酸外切酶核酸內(nèi)切酶（限制性核酸內(nèi)切酶:特異性的水解核酸中某些特定堿基順序部位。)三、核酸的紫外吸收堿基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm有較強(qiáng)的光吸收，λmax=260nm。1.鑒定純度純DNA，A260/A280＝1.8（1.65-1.85）。若大于1.8，表示污染了RNA或DNA降解。純RNA，A260/A280＝2.0。若有雜蛋白或苯酚，則A260/A280明顯降低。2.增色效應(yīng)：變性后DNA對(duì)260nm紫外光的吸收率（A260）比變性前明顯增加，這種現(xiàn)象稱為增色效應(yīng).天然狀態(tài)的DNA在完全變性后，紫外吸收(260nm)值增加25－40%，而RNA變性后，約增加1.1%。3.含量計(jì)算1.0OD相當(dāng)于：50ug/mL雙螺旋DNA或：40ug/mL單鏈DNA（或RNA）或：20ug/mL核苷酸四、核酸的變性、復(fù)性1.核酸的變性（denaturation）與變性因素核酸的變性是指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過(guò)程。核酸的變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級(jí)結(jié)構(gòu)保持不變。核酸變性的因素:溫度升高、酸堿度改變、甲醛和尿素等。A260值增加粘度下降浮力密度增大分子量不變2.DNA變性后的表現(xiàn)3.DNA的熱變性和解鏈溫度（Tm）DNA的熱變性過(guò)程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將DNA的變性達(dá)到50%時(shí)的溫度稱為DNA的熔解溫度（meltingtemperature,Tm),Tm也稱解鏈溫度或DNA的熔點(diǎn)。

一般DNA的Tm值在70-85

C之間影響DNA的Tm值的因素：

A.DNA均一性

B.G-C含量與Tm值成正比(G-C)%=（Tm-69.3）×2.44C.離子強(qiáng)度:離子強(qiáng)度越高，Tm越高。4、核酸的復(fù)性變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開(kāi)的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱為復(fù)性。將熱變性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性（一般低于Tm20-25℃），這一過(guò)程也叫退火（annealing)。分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越快。DNA復(fù)性1.DNA分離純化

真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或鹽（1mol/LNaCl），不溶于0.14mol/L

的NaCl中。利用此性質(zhì)，可將DNP與RNA核蛋白分開(kāi)，提取出DNP。

DNA核蛋白可用水飽和酚抽提，去除蛋白質(zhì)。還可用氯仿-異戊醇去除蛋白質(zhì)。第五節(jié)核酸的研究技術(shù)一、核酸的分離純化2.RNA的分離純化（mRNA的分離、純化）用0.14mol/LNaCl使DNP沉淀，RNA核蛋白（RNP）在上清液中。去蛋白：鹽酸胍、苯酚等。

注意：必須防止RNA酶對(duì)RNA的破壞。玻璃器皿高溫焙烤，塑料器材高壓滅菌，DEPC水處理。二、限制性核酸內(nèi)切酶

1.限制修飾作用：I、II、III類限制性內(nèi)切酶

I和III類:雙功能酶（甲基化修飾＋切割）II類:兩種酶組成雙元系統(tǒng)識(shí)別長(zhǎng)度4－8個(gè)核苷酸，且具有回文結(jié)構(gòu)三、核酸的凝膠電泳1.瓊脂糖電泳分離200bp-50kb片段DNA2.PAGE電泳分離5-500bp小片段DNA。

EB（溴化乙錠）（1）它的基本步驟為：①設(shè)計(jì)一對(duì)引物。②優(yōu)化反應(yīng)體系。③選擇熱循環(huán)溫度。④鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。（2）工作原理：以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板3’末端相互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，沿模板鏈延伸直至