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文檔簡介

ICS

CCS

SDYYXH

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/SDYYXHXX—2023

基于斑馬魚模型的藥物早期心臟毒性快速

評價方法

Arapidmethodforevaluatingearlycardiotoxicityofdrugsusingzebrafishmodel

-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

山東省醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會??發(fā)布

T/SDYYXHXX—2023

基于斑馬魚模型的藥物早期心臟毒性快速評價方法

1范圍

本文件規(guī)定了基于斑馬魚模型的藥物早期心臟毒性評價的方法原理、受試物、儀器設(shè)備、試驗(yàn)準(zhǔn)備、

試驗(yàn)步驟、保證試驗(yàn)有效性的條件、判定步驟、數(shù)據(jù)處理與試驗(yàn)報告等內(nèi)容。

本文件適用于基于斑馬魚模型的藥物早期心臟毒性的評價。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

斑馬魚zebrafish

模式動物的一種,常用于教學(xué)和科研。生物分類學(xué)上屬于脊椎動物門、硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、

斑馬魚屬、斑馬魚種。

3.2

Tg(cmcl2:EGFP)品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(cmcl2:EGFP)straintransgeniczebrafish

實(shí)驗(yàn)室常用斑馬魚品系,心臟被綠色熒光標(biāo)記。

3.3

仔魚larva

性腺發(fā)育尚未成熟的斑馬魚。

3.4

受精后小時數(shù)hourspost-fertilization(hpf)

斑馬魚胚胎體外受精后的小時數(shù)。

3.5

10?%致死濃度10%lethalconcentration(LC10)

受試物導(dǎo)致10%受試魚死亡的濃度。沒有心跳判定為死亡。

3.6

心率heartrate

心臟每分鐘搏動的次數(shù)。

3.7

SV-BA距離SV-BAdistance

SV-BA距離是指靜脈竇(SV)和動脈球(BA)之間的距離。

3.8

心室短軸縮短率ventricularfractionalshortening(FS)

心室短軸縮短率(FS)=[心室舒張末期內(nèi)徑(Dd)-心室收縮末期內(nèi)徑(Ds)]/Dd。

3.9

射血分?jǐn)?shù)ejectionfraction

每搏輸出量占心室舒張末期容積的百分比,稱為射血分?jǐn)?shù)。

3.10

每搏輸出量strokevolume

舒張末期容積與收縮末期容積之差,即為每搏輸出量。

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4方法原理

斑馬魚的心血管系統(tǒng)在解剖結(jié)構(gòu)和生理功能方面與哺乳動物相似,心臟由心房和心室構(gòu)成,房室之

間存在瓣膜,且其心臟的發(fā)育及基因調(diào)控機(jī)制等也與人類相似。受精后48h,靜脈竇、心房、心室發(fā)育

完成,心臟通過舒縮實(shí)現(xiàn)泵血功能。斑馬魚胚胎通體透明,心臟形態(tài)和心跳可在顯微鏡下直接觀察,可

快速、無創(chuàng)獲取斑馬魚心率、心包面積、SV-BA距離、射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率、每搏輸出量等心功能評

價相關(guān)指標(biāo)。因此,以斑馬魚為試驗(yàn)動物,應(yīng)用熒光顯微成像等技術(shù),以心率、心包面積、SV-BA距離、

射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率、每搏輸出量等為檢測指標(biāo),可對藥物的早期心臟毒性進(jìn)行快速定量分析。

5受試物

5.1受試物配制

5.1.1水溶性藥物:斑馬魚培養(yǎng)水直接溶解配制成檢測溶液。

5.1.2非水溶性藥物:選用有機(jī)溶劑、乳化劑或分散劑等進(jìn)行助溶,制備成均勻分散的懸濁液或乳濁

液。

5.2受試物準(zhǔn)備量

5.2.1固態(tài)受試物檢測用量10?mg~50?mg。

5.2.2液態(tài)受試物檢測用量30?mL~50?mL。

5.2.3半固態(tài)受試物檢測用量20?mg~100?mg。

5.2.4半液態(tài)受試物檢測用量20?mL~100?mL。

5.3受試物相關(guān)信息

5.3.1受試物的名稱、性狀、批號、規(guī)格、生產(chǎn)日期、保存條件、保質(zhì)期。

5.3.2受試物為單體成分時,還需要提供該成分相應(yīng)的化學(xué)信息,包括分子量、分子式、分子結(jié)構(gòu)。

5.3.3提供受試物理化性質(zhì),包含如下信息:

a)在水中或其它溶劑中的溶解性;

b)在水中和光中的穩(wěn)定性;

c)溫度對受試物穩(wěn)定性的影響。

6儀器設(shè)備

6.1分析天平。精度0.0001g。

6.2體視熒光顯微鏡。

6.3圖像采集系統(tǒng)。

6.4恒溫光照培養(yǎng)箱。精度±1℃。

6.5斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)。配備溫控裝置,水循環(huán)和過濾裝置。

6.6水質(zhì)監(jiān)測設(shè)備。pH計(jì)、溶解氧測定儀、鹽度計(jì)。

6.7試驗(yàn)容器。玻璃或聚苯乙烯容器。如受試物可能吸附于聚苯乙烯容器時,應(yīng)選用惰性材料(如玻

璃)來減少吸附。

7試驗(yàn)準(zhǔn)備

7.1受試斑馬魚

發(fā)育至48hpf綠色熒光蛋白EGFP標(biāo)記心臟的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(cmcl2:EGFP)胚胎,使用脫膜劑(配

置方法見附錄A)去除包被斑馬魚的外部卵膜。

7.2斑馬魚培養(yǎng)水

7.2.1斑馬魚培養(yǎng)水使用存放24h以上并經(jīng)曝氣處理的去離子水配制,內(nèi)含5mmol/LNaCl、

0.17mmol/LKCl、0.4mmol/LCaCl2和0.16mmol/LMgSO4。

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7.2.2斑馬魚培養(yǎng)水配制方法:用分析天平稱取14.658gNaCl、0.633gKCl、2.425gCaCl2和4.06g

MgSO4·7H2O,加入1000mL純凈水配制成50×斑馬魚培養(yǎng)水。量取20mL的50×斑馬魚培養(yǎng)水,加入

980mL純凈水,配制成1×斑馬魚培養(yǎng)水。

7.2.3pH值保持在6.5~8.0,水的硬度(以CaCO3計(jì))為10mg/L~250mg/L,溶解氧濃度不低于6.0mg/L。

注:此培養(yǎng)水為斑馬魚提供最適生存水環(huán)境。

7.3試驗(yàn)溶液配制

7.3.1加入受試物后,試驗(yàn)溶液pH值在6.5~8.0之間,不需調(diào)節(jié)試驗(yàn)溶液的pH值。

7.3.2如果加入受試物后試驗(yàn)溶液的pH值小于6.5或大于8.0,重新配制,調(diào)節(jié)受試物貯備液的pH

值,使其接近加入受試物前稀釋水的pH值。用于調(diào)節(jié)pH值的物質(zhì)不應(yīng)使儲備液的濃度明顯改變,也不

應(yīng)與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或產(chǎn)生沉淀。

7.3.3非水溶性受試物,添加有機(jī)溶劑、乳化劑或分散劑提高受試物溶解度和試驗(yàn)溶液的均勻度。受

試物試驗(yàn)溶液中助溶劑濃度不得超過100mg/L。

8試驗(yàn)步驟

8.1試驗(yàn)分組

試驗(yàn)設(shè)置空白對照組、陽性對照組和受試物組,如使用助溶劑,增設(shè)1個溶劑對照組。

8.2空白對照組設(shè)置

隨機(jī)挑取發(fā)育至48hpf的心臟熒光標(biāo)記的健康Tg(cmcl2:EGFP)品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚,置于24孔板中,

每孔含10尾仔魚和2mL斑馬魚培養(yǎng)水。

8.3溶劑對照組設(shè)置

隨機(jī)挑取發(fā)育至48hpf的心臟熒光標(biāo)記的健康Tg(cmcl2:EGFP)品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚,置于24孔板中,

每孔含10尾仔魚和2mL助溶劑溶液。助溶劑溶液濃度為受試物組使用助溶劑的最高濃度。

8.4陽性對照組設(shè)置

隨機(jī)挑取發(fā)育至48hpf的心臟熒光標(biāo)記的健康Tg(cmcl2:EGFP)品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚,置于24孔

板中,每孔含10尾仔魚和2mL烏頭堿溶液,烏頭堿溶液濃度為10μM。

8.5受試物組設(shè)置

隨機(jī)挑取發(fā)育至48hpf的心臟熒光標(biāo)記的健康Tg(cmcl2:EGFP)品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚,置于24孔

板中,每孔含10尾仔魚和2mL受試物溶液(配制方法見7.3),受試物試驗(yàn)溶液濃度需<LC10(沒有

心跳特征的斑馬魚界定為死亡),試驗(yàn)時根據(jù)需要設(shè)置多個受試物濃度組。。

8.6暴露條件

空白對照組、溶劑對照組和受試物組斑馬魚靜置于28.5℃±1℃的恒溫光照培養(yǎng)箱,連續(xù)暴露24h。

注:暴露期間禁止喂食。

8.7心率檢測

暴露結(jié)束,體視顯微鏡下計(jì)數(shù)斑馬魚15秒心跳次數(shù),并計(jì)算心率。

8.8心包面積和SV-BA距離檢測

暴露結(jié)束,體視熒光顯微鏡下拍照,并測量心包面積以及SV-BA距離。

8.9射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率和每搏輸出量檢測

暴露結(jié)束,倒置熒光顯微鏡下拍攝斑馬魚心跳視頻,并提取心室舒張末期和收縮末期圖片,測量心

室短軸和長軸長度,計(jì)算射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率和每搏輸出量。

9保證試驗(yàn)有效性的條件

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9.1每孔內(nèi)斑馬魚密度小于5尾/mL。

9.2水溶性受試物可配制成澄清溶液,非水溶性受試物可選用有機(jī)溶劑進(jìn)行助溶。

9.3斑馬魚圖像采集時,各組間拍照參數(shù)一致。

10判定標(biāo)準(zhǔn)

10.1各試驗(yàn)組暴露完成后至少90%仔魚存活,否則對應(yīng)試驗(yàn)組結(jié)果無效。

10.2受試物組與空白對照組相比,斑馬魚心率、射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率或每搏輸出量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著

減?。≒<0.05),或斑馬魚心包面積、SV-BA距離顯著增加(P<0.05),此時試驗(yàn)結(jié)果可作為受試物

具有心臟毒性的支持證據(jù),但不替代人體功能檢測。

11數(shù)據(jù)處理

11.1統(tǒng)計(jì)參數(shù):斑馬魚心率、心包面積、SV-BA距離、射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率、每搏輸出量。

11.2統(tǒng)計(jì)分析方法:方差分析(ANOVA),輔助以T-test檢驗(yàn),分析各試驗(yàn)組間的差異。

12試驗(yàn)報告

試驗(yàn)報告包含下列內(nèi)容:

a)受試物——物理屬性、物理/化學(xué)特性;

b)受試斑馬魚——學(xué)名、品系、來源、發(fā)育階段、受精卵收集方法及后續(xù)處理;

c)試驗(yàn)條件:

1)光照周期;

2)試驗(yàn)設(shè)計(jì)(試驗(yàn)容器及其平行的數(shù)目,每個平行中的仔魚數(shù)量);

3)制備儲備液的方法;若使用助溶劑,應(yīng)給出其成分和濃度;

4)斑馬魚培養(yǎng)水特性:pH值、硬度、溫度、溶解氧濃度;

5)試驗(yàn)容器內(nèi)的水質(zhì):pH值、硬度、溫度、溶解氧濃度;

6)喂食情況。

d)試驗(yàn)

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